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La citometra en el laboratorio mejora la tasa de hijo en casa?

PG.1

Alberto Pacheco Castro alberto.pacheco@ivi.es

Tendencia actual:

Prot. estimulacin suaves


Transferencia nico embrin

Calidad ovocitaria

Receptividad endometrial

Calidad seminal ?
Calidad embrionaria
PG.2

Diagnstico y mtodos seleccin seminal

Swim-up
(1984)

Gradiente densidad
(1986 )

Espermatozoides mviles Densidad celular especfica

Gran heterogeneidad Diagnstico a veces confuso

PG.3

Factor masculino

TRA: ICSI

Seleccin fisiolgica

PG.4

Citometra de flujo
Tcnica de anlisis celular, basada en la deteccin de luz tras pasar las clulas por un haz de luz

Analizador
PG.5

+ Separador (sorter)

Composicin de un citmetro de flujo

PG.6

Composicin de un citmetro de flujo

PG.7

Composicin de un citmetro de flujo

PG.8

Composicin de un citmetro de flujo

PG.9

Composicin de un citmetro de flujo

PG.10

Composicin de un citmetro de flujo

PG.11

Morfologa celular
Forward scatter Side scatter

Tamao celular

Complejidad estructural externa e interna

PG.12

Compuestos fluorescentes

LASER

Ventaja: anlisis simultneos


PG.13

Qu aplicaciones puede tener la


citometra en el estudio de la infertilidad masculina?

PG.14

Parmetros seminales
- A multicenter study evaluating the flow cytometric-based kit for semen analysis. Shai S et al, 2005

Anlisis de: - Concentracin (partculas) - Movilidad (rodamina) - Vitalidad DCFDA) - Leucos (anti CD45) - Anticuerpos (anti IgA)

Menor variabilidad y mayor precisin


- Flow cytometric evaluation of sperm parameters in relation to fertility potential. Guillan L et al, 2005

- A new multiparameter flow cytometric method for human semen analysis. Perticarari S et al, 2007
PG.15

Estrs oxidativo e infertilidad masculina

PROBLEMAS: El estudio por luminiscencia no elimina factor leucocitario PG.16 de tratamientos con antioxidantes: seminograma y fragmentacin Anlisis

ROS intracelular: datos IVI Madrid


Estudio directo: ROS intracelular

N = 58
r 0,574

- DHE

(Aitken RJ et al 2007) 2012)


CM-H2DCFDA
1 00 ,0 0

L in e a

- H2-DCFDA (Martinez MJ et al

VAR00 0 02 = 5 9,2 0 + -1,2 9 * fra g R-Squa re = 0,2 5


7 5,0 0

5 0,0 0

Rapidez de anlisis (30 min) Bajo coste (< 1 euro/test)

2 5,0 0

0 ,00

0 ,00

1 0,0 0

2 0,0 0

3 0,0 0

4 0,0 0

Movilidad

80,00 A A 60,00 A A AA A 40,00 A AA A A A A A A A A A A A AA A A A A A A A A A A A A A A A A A

r 0,352
DHE
A A A A AA A A A A A A A A A A A

80, 00

dhe = 4 0 ,67 + -0 ,23 * b R-S qua re = 0 ,1 1

rr 0,286 0,496

L i ne a

60, 00

DHE

40, 00

20,00

20, 00

0,00
0,0 0

0,00

50,00

100,00

150,00
0,0 0 21, 25 42, 50 63, 75 85, 00

Concentracin

PG.17

Movilidad

Estrs oxidativo y fragmentacin ADN: datos IVI Madrid

V AR0 00 0 1 = 2,0 5 * frag


75,00

R 0,458

L i ne a r Re gre s si o n th rou g h th e O rig i n


dhe = 2 0 ,80 + 0 ,74 * fra g
80,00

L i ne a

R-S qua re = 0 ,1 4

R 0,526

C M -H 2D C FD A

60,00

50,00

dhe

40,00

25,00

20,00

0,00

0,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

Fra gmentacin

Fra gmentacin

La eficacia de los tratamientos con antioxidantes pueden monitorizarse tambin de manera directa con estudio de estrs oxidativo intracelular
PG.18

Estrs oxidativo y potencial de membrana mitocondrial

DiOC6: 3,3-dihexyloxacarbocyanine iodide

Rapidez de anlisis (45 min)


Gran sensibilidad

Otros compuestos:
JC-1: 5,5,6,6-tetrachloro-1,1, 3,3-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide (Espinoza JA et al, 2008)
PG.19

Potencial de membrana mitocondrial: datos IVI Madrid


DiOC6: 3,3-dihexyloxacarbocyanine iodide
dic = 53 ,42 + -1 ,1 2 * fra g
80,00

L i ne a r Re gre ssi o n

R-S qua re = 0 ,3 4

dic = 29 ,31 + 0,3 6 * bs R-Squa re = 0 ,16

R 0,852

L i ne

60,00

99,17

D ioc6

D IO C6

79,33

40,00

59,50

39,67

20,00

19,83

0,00
0,00

0,00

15,00

30,00

45,00

0,00

23,75

47,50

71,25

95,00

Fragmentacin

Movilidad

El estudio del potencial de membrana mitocondrial est muy relacionado con la movilidad espermtica: astenozoospermias !!
PG.20

Fragmentacin de ADN espermtico

CONTROVERSIA EN LOS DATOS

Diferentes tipos dao


Dao hebra sencilla Dao hebra doble

Diferentes tcnicas
SCD (Fernndez et al, 2002) COMET (Morris et al, 2002) TUNEL (Sailer et al, 1995)

Diferente origen
Intrnseco (apoptosis, ROS, ) Extrnseco (frmacos, iatrognico,)

TUNEL y citometra flujo - T realizacin y anlisis: 1hora - Resultado sobre 20.000 cls
PG.21

Parmetros seminales y fragmentacin de ADN


N = 778 (fragmentacin con seminograma) Rango = 1% - 67% spz fragmentados Media fragmentacin: 13,95%
Concentracin (mill/ml) (r = -0,41)

Movilidad (%)
(r = -0,385)

Total mviles progresivos


(r = -0,387)

Morfologa (%)

Fragmentacin alterada en 9% de muestras con concentracin y 7% movilidad normal PG.22

Fragmentacin de ADN e infertilidad

PG.23

Fragmentacin ADN espermtico

80 70 60 50 40 30 20 10 0 <20% >20%

*
ICSI FIV

FERTILIZATION RATE ICSI <20 ICSI >20 FIV <20 FIV >20 Total

Mean 74,168 73,663 63,759 51,443 67,152

Std. Deviation 23,9506 23,7812 28,5573 20,0236 26,0629

N 33 13 33 13 92

DNA FRAGMENTATION INDEX

* = p < 0,05

Utilidad clnica - Nos permite escoger mejor el tratamiento - Cambio de mtodo de seleccin espermtica (MACS)
PG.24

Deteccin de Anexina-V y MACS


Externalizacin de PS Ca2+ Marcaje con Anexina V Microbeads

Ha funcionado el MACS?
Marcaje Anexina-V FITC: 15 min
Muestra fresco 47 % Tras capacitacin 26 % MACS 3 %

PG.25

Anexina V y MACS
Es segura la tcnica MACS?
A
x=51,4

N = 30
x=75 x=45,1 x=67*

B
x=53,8

x=25,1 x=19

x=23,9

x=13,6*

Progresivos

x=29,1*

x=33,8*

AnexinaV

x=0,6

Fresco t0

Fresco t24
x=82,9

Rem t0

Rem t24

MACS MACS t0 t24

Fresco t0

Fresco t24
x=26

Rem t0

Rem t24

MACS MACS t0 t24

C
x=27,2

D Fragmentacin

x=28,4

x=34,9*

ERO

x=13

x=26,6 x=17,5 x=16,7

x=17,8

x=14,7*

x=23,8*

PG.26

Fresco Fresco t0 t24

Rem t0

Rem t24

MACS MACS t0 t24

Fresco t0

Fresco t24

Rem t0

Rem t24

MACS MACS t0 t24

Anexina V y MACS
Indicacin MACS: Muestras con fragmentacin elevada

CICLOS CON OVOCITOS PROPIOS


Edad materna Fragment. (%) Tasa emb transferidos Tasa gestacin (%) Tasa aborto clnico (%)

MACS (n = 51 ) CT (n = 31 )

35,7 35,4

25,1 26,8

2,1 2,2

58 36,5

18 39

CICLOS CON OVOCITOS DONANTE


Edad materna Fragment. (%) Tasa emb transferidos Tasa gestacin (%) Tasa aborto clnico (%)

MACS (n = 45 )
CT (n = 37 )
PG.27

39,2
39,5

23,9
24,7

1,8
1,9

68,6
41,5

14
26

Anlisis de condensacin de cromatina y ploida


Lazaros L et al. 2011

Estudio de condensacin cromatina: Naranja acridina (20 min incubac)


Grupo A1: <65% spz maduros Grupo A2: >65% spz maduros

Estudio de haploida: Ioduro de propidio (inmediato)


Grupo B1: <16% tasa total aneuploidia Grupo B2: >16% tasa total aneuploidia

Sperm flow cytometric parameters are associated with ICSI outcome. Lazaros L et al. RBM online, 2013
PG.28

Otras aplicaciones
Peroxidacin lipdica (reactivo: BODIPY C11)
Analysis of lipid peroxidation in human spermatozoa using BODIPY C11. Aitken RJ et al. Mol Hum Reprod 2007.

Metilacin del ADN espermtico (reactivo: anticuerpo anti m5c)


Influence of global sperm DNA methylation on IVF results. Benchaib M et al. Hum Reprod 2005.

Determinacin de calcio intracelular (reactivo: Fluo3, Indo1)


Determination of human sperm calcium uptake mediated by progesterone may be useful for evaluating Unexpalined sterility. Guiojalas L et al. Fertil Steril 2004.

Reaccin acrosmica (reactivo: PSA, anti prot interna acrosomal)


Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Martn FC et al. Fertil Steril 2012.

Marcadores funcionales: CatSper calcium channel


The CatSper calcium channel in human sperm: relation with moltility and involvement in Progesterone-induced acrosome reaction. Tamburrino L et al. Hum Reprod 2014. PG.29

Citmetros separadores (sorter)

Reactivo: Hoechst 33342

PG.30

Conclusin
Fragmentacin ADN Apoptosis temprana Potencial membrana

ROS intracelular

Reaccin acrosmica
Prot unin zona pelcida

Mayor diagnstico seminal + Utilizacin nuevas tcnicas de seleccin

Mejora de las tasas de nio en casa?


PG.31

Mensajes para casa

La citometra de flujo permite el estudio del nmero, morfologa, fenotipo y funcin celular.

Es mucho ms exacta que las tcnicas de estudio seminales actuales, y permite el anlisis de 20.000 -30.000 clulas en pocos minutos. Se pueden estudiar mltiples carctersticas funcionales contaminacin de otros tipos celulares), de manera simultanea. (sin

La mayor parte de las tcnicas requieren un bajo tiempo de realizacin por lo que pueden realizarse antes de la TRA.

PG.32

CONTACTO:

alberto.pacheco@ivi.es

GRACIAS POR SU ATENCION!

PG.33