Baja tensin de Oxgeno en cultivo prolongado Necesario o conveniente?

Jess Zulategui Eraso Hospital Virgen del Camino Estudio Mdico Navarro (EMN) Pamplona
jfzulategui@hotmail.com jesus.zulategui.eraso@navarra.es

Antecedentes
Los embriones de varias especies de mamferos, incluido la humana, no estn expuestos a concentraciones in vivo que excedan el 8% La tensin de O2 en oviducto y tero oscila entre el 8% y el 2% Yedwab et al. 1976
Bayatt-Smith et al. 1991 Fisher y Bavister. 1993

Varios estudios en animales han demostrado que el cultivo in vitro a baja tensin de O2, mejora el desarrollo y la capacidad de gestacin
Harlow and Quinn. 1979 Yuan et al. 1991 Leoni et al 2007

Metabolismo embrionario
Desarrollo temprano
Est bajo control de protenas maternas Baja produccin de protenas Uso de piruvato y aminocidos no esenciales Activacin del desarrollo embrionario Sntesis proteica Rpida elaboracin de membranas celulares y organelas Aumenta la demanda energtica y se incrementa la sntesis de ARN y ADN Uso de la glucosa y aminocidos esenciales como fuente de energa y precursosres para la produccin de pentosas

Desarrollo avanzado

Estudios de tensin de O2 in vivo

Mono rhesus Fisher. 1993 Hamnster Ratn Rata

x x x

Maas.1976
Mastroiani. 1965 Mitchell. 1968 Kaufman. 1994

Condiciones de cultivo
Concentracin del aire atmosfrico Concentracin del cultivo tradicional con O2 atmosfrico Cocentracin del cultivo con baja tensin de O2
89% N2 5-6% CO2 5-6% O2?? 79% N2 5-6% CO2 20% O2
79% N2 0.03% CO2 20% O2

Gases y cultivo celular

O2 N 2 CO2

O2 N 2 [CO2] + H2O

e-

O2
+

H2

CO3H + H
ATP

H2O

ROS

Efecto fisiolgico de los gases

N2 es inerte a presiones normales ( 1atm) CO2 efecto regulador del pH al pasar a CO3H2 en disolucin O2 necesario para la respiracin celular en los primeros estadios de desarrollo y mantener el pH en algunos medios de cultivo
Botenkoe et al. 2012

Generacin de especies reactivas de O2 (ROS)

Importancia del O2
El oxgeno molecular (O2) es uno de los gases ms importantes de la Tierra, constituye el 21% de la atmsfera, 89% del peso del agua de mar y al menos 47% de la corteza terrestre La mayor parte de los seres vivos utilizan el O2 para respirar y obtener energa A partir de esta molcula se forman molculas ms reactivas conocidas como especies reactivas de oxgeno (ROS)
Superxido (O2-) Hidroxilo (OH) Perxido de hidrgeno (H2O2) Oxiradicales (O2 singulete y doblete).

Debido a su funcin primordial de produccin de energa qumica, la mitocondria es la mayor productora de ROS

Formacin de las ROS

Rotura del mRNA materno Hipoxia Hipoxantina Xantina XO

NADPH
Xantina Ac rico

GSHRED GSH GSSG

GPX

NADPH

O2+ e- O2Complejo I,III Citocromo p450 NADOH oxidasa

MnSOD

H2O2
Fe III

H2O

NO ONOO

Fe 2+

OH

GSH
8-Nitrosoglutatin

O2
Lpidos Proteinas ADN

Efecto de las ROS

Reguladores metablicos
Reguladores de factores transcripcionales Mediadores en la proliferacin y diferenciacin celular Reguladores de la moleculas de adhesin y en apoptosis

Dao celular
Estrs oxidativo Dao irreversible del ADN Dao a lpidos y proteinas Activacin de la apoptosis Cambios en la expresin gnica Cambios en la estabilidad y permeabilidad de las membranas celulares

Bloqueo embrionario Malformaciones congnitas

Burton et al. 2002 Catt. 2000 Botenkoe et al. 2012

Formacin de las ROS

Rotura del mRNA materno Hipoxia Hipoxantina Xantina XO

NADPH
Xantina Ac rico

GSHRED GSH GSSG

GPX

NADPH

O2+ e- O2Complejo I,III Citocromo p450 NADOH oxidasa

MnSOD

H2O2
Fe III

CAT

H2O

NO ONOO

Fe 2+

OH

GSH
8-Nitrosoglutatin

O2
Lpidos Proteinas ADN

Soluciones
Aadir antioxidantes al medio de cultivo
Taurina, lactato, Piruvato, Vitaminas. Accin limitada No evitan el dao al ADN

Quelantes
Reducen la formacin de hidroxilos Accin no especfica La quelacin excesiva puede inactivar varios procesos catalticos

Soluciones
CULTIVO A BAJA TENSIN DE OXGENO

Condiciones de cultivo
Concentracin del aire atmosfrico Concentracin del cultivo tradicional con O2 atmosfrico Cocentracin del cultivo con baja tensin de O2
89% N2 5-6% CO2 5-6% O2?? 79% N2 5-6% CO2 20% O2
79% N2 0.03% CO2 20% O2

Estudios de tensin de O2 in vitro

Ratn
Harlow. 1979 Batt. 1991 Yuan. 2003 Karja. 2004 Leoni. 2007

Cabra

Bovino

Porcino
divisin,blastocisto =morfologa, divisin

x x x x x

apoptosis, divisin blastocisto, fragmentacin ADN blastocisto

 Mejores tasas tras FIV/ICSI Aumento de RNV del 30% al 32-43% No encuentra diferencias en las tasas de gestaciones mltiples, aborto y malformaciones congnitas

Cultivo de embriones en observacin

OVODON Blastocistos criopreservados 17/52 (32,7%)

PROPIOS 20/73 (27,4%)

GESTACIN Criotransferencia 15/52 (46,9%)

IMPLANTACIN 17/55 (30,9%)

Transferencia D3
Cook 6% O2 Gestacin Implantacin 13/26 (50%) 17/51 (33,3%) Labotec 20% O2 13/28 (46,43%) 16/53 (30,2%)

Conclusiones
Clara relacin entre la concentracin de O2 y niveles de ROS Evitar las ROS favorece el desarrollo embrionario Baja tensin de O2 es conveniente en cultivo D2-3 Baja tensin es necesario en cultivo D5-6

Conclusiones
La tensin de O2 del tero bastante menor que la concentracin de los incubadores tri-gas Es posible que la calidad de los blastocistos mejoren con un cultivo a partir del D2 inferior al 5%