Universidade Federal de Santa Catarina Disciplina: Biofsica CFS5111 Professora: Tnia Beatriz Creczynski Pasa T r!

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Cromatografia e Eletroforese

Cromatografia
'(todo tilizado para separar certas classes de !ist ras co!ple)as * de co!postos or+nicos e inor+nicos , entre !a fase - e se !ove e !a fase estacion.ria/ Cromatografia de troca inica 0 a t(cnica !ais tilizada para separar1 identificar e - antificar os a!ino.cidos presentes e! !a !ist ra1 por(! pode ta!2(! ser sada e! o tros casos1 co!o para separar protenas co! car+as el(tricas diferentes e !ist ras de car2oidratos/ 3ste !(todo leva e! considera45o as diferen4as no sinal e na !a+nit de das car+as el(tricas l- idas dos a!ino.cidos e! ! dado p&1 as - ais s5o previsveis a partir de se s valores de p6a e de s as c rvas de tit la45o/ 7 !(todo consiste e! to!ar ! lon+o t 2o co! partc las de resina sint(tica insol8vel e! .+ a e contendo +r pos fi)os carre+ados eletrica!ente , pode! ser resinas trocadoras de c.tions o resinas trocadoras de nions , e colocar por ci!a desta col na de resina a sol 45o de a!ino.cidos e! ! p& escol9ido/ 7 p& infl i na afinidade de cada a!ino.cido pela resina1 pois este deter!ina os estado de ioniza45o da !ol(c la/ 7s a!ino.cidos n ! !es!o p& difere! !es!o assi! nos valores de p6a dos se s +r pos :1 o - e e)plica a tend;ncia diferente de cada ! para se li+ar < resina/ $ssi!1 eles se !over5o atrav(s da col na e! velocidades diferentes/ 7s a!ino.cidos - e se !ove! !ais r.pido , o se=a1 li+a!*se < col na co! !enos for4a , s5o el dos pri!eiro1 e posterior!ente os o tros1 ent5o1 !a a !a as fra4>es s5o coletadas e se s sol tos analisados - antitativa!ente/ &. ta!2(! a Cro!ato+rafia l- ida de alto dese!pen9o1 - e ( !a !el9oria !oderna1 co! resinas !ais fortes e aparel9a!ento aperfei4oado - e o2t(! !el9ores e !ais r.pidas separa4>es/ 7 processo se d. a to!atica!ente e! ! aparel9o c9a!ado analisador de a!ino.cidos/ Cromatografia de excluso por tamanho 3ste !(todo * ta!2(! con9ecido co!o filtrao em gel , separa protenas ?o o tras s 2stncias1 co!o car2oidratos@ confor!e o ta!an9o das !ol(c las/ $ col na cont(! esferas de ! pol!ero poroso1 sendo assi!1 - ando a !ist ra proteica ( adicionada as !ol(c las !aiores passa! !ais rapida!ente e aparece! nas pri!eiras fra4>es pois n5o penetra! nos poros das esferas devido ao ta!an9oA =. as !enores1 penetra! pelos poros e de!ora! !ais a !i+rar/ Cromatografia de afinidade

3sta t(cnica separa as protenas por s a especificidades de li+a45o/ $ col na cont(! ! pol!ero ao - al est. nido ! li+ante especfico para a protena - e interessa/ $ssi!1 - ando se adiciona a !ist ra de protenas < col na as protenas indese=adas s5o transportadas pelo l- ido el ente1 e fica! retidas so!ente as protenas - e interessa! nidas aos li+antes das esferas de pol!ero/ 3nt5o esta protena de interesse ( el da por !a sol 45o contendo o li+ante livre/ Cromatografia de Adsoro 7 !(todo de cro!ato+rafia de adsor45o separa os lipdios de polaridades diferentes/ $ t(cnica consiste e! e!pacotar e! !a col na lon+a ! !aterial insol8vel e polar1 co!o a slica +el e adicionar a !ist ra de lipdios , dissolvida e! clorofBr!io/ 7s lipdios ne tros passa! direto e el e! nas pri!eiras fra4>es1 =. os lipdios polares li+a!*se ao .cido silcico , ta!2(! polar , e s5o el dos e! orde! de polaridade crescente1 pela el i45o da col na co! solventes de polaridade cada vez !aior1 co!o acetona ?lipdios polares se! car+a@ e posterior!ente !etanol ?lipdios ! ito polares1 co! car+a@/ Cromatografia de Camada Fina 0 ! !(todo se!el9ante < cro!ato+rafia de adsor45o/ U!a ca!ada fina de slica +el ?.cido silcico@ ( esparra!ada so2re !a placa de vidro/ U!a pe- ena a!ostra de lpidios dissolvidos e! clorofBr!io ( aplicada prB)i!o de !a das e)tre!idades da placa1 e esta ( !er+ l9ada e! ! vaso raso contendo !a l!ina de ! solvente or+nico especfico e sit ado no interior de !a ca!ada fec9ada sat rada co! o vapor deste !es!o solvente/ C !edida - e o solvente so2e pela placa por a45o capilar1 carre+a os lipdios co! ele/ 7s lipdios !enos polares !ove!*se !ais rapida!ente1 =. - e t;! !a tend;ncia !enor a li+ar* se ao .cido silcico - e ( polar/ Depois de separados os lipdios pode! ser detectados pela ne2 liza45o da placa co! !a sol 45o de corante ?roda!ina@1 - e se torna fl orescente - ando associada co! os lipdios1 o por e)posi45o da placa a vapores de iodo/ 7 iodo rea+e co! as d plas li+a4>es de .cidos +ra)os1 dando !a cor a!arelada o !arro! aos lipdios - e os conten9a!/ Para an.lises s 2se-Dentes1 as re+i>es contendo os lipdios - e se separara! pode! ser retiradas da placa e os lipdios rec perados por e)tra45o da slica +el co! ! solvente or+nico/ Cromatografia Gs-lquido $ cro!ato+rafia +.s l- ido separa !ist ras de derivados vol.teis dos lipdios ?o o tras !ol(c las@/ $l+ ns lipdios s5o nat ral!ente vol.teis1 !as a !aioria deles precisa ser transfor!ada e! derivados co! !aior volatividade 1 convertendo*os e! (steres !etlicos/ $1 ent5o estes (steres !etlicos de .cidos +ra)os s5o colocados na col na cro!ato+r.fica +.s* l- ido e a col na ( a- ecida para volatizar os co!postos presentes/ 7s (steres !etlicos !ais sol8veis no !aterial da col na se dissolve!1 os !enos sol8veis s5o carre+ados pela corrente de +.s 9(lio e e!er+e! pri!eiro na col na/

 Cromatografia em Papel $ cro!ato+rafia e! papel1 apesar de 9aver t(cnicas !ais !odernas1 ( ainda sada na separa45o de a!ino.cidos/ $plica*se a a!ostra a 5 c! da e)tre!idade da tira de papel de filtro/ 3ssa tira ( s spensa e! ! recipiente 9er!etica!ente fec9ado1 - e cont(! o solvente cro!ato+r.fico/ 7s solventes para separa45o de !ist ras de a!ino.cidos s5o !ist ras de .+ a1 .lcoois1 .cidos o 2ases/ E ando a !i+ra45o do solvente c9e+ar at( - ase ao fi! da fita1 esta ( seca e tratada para per!itir a vis aliza45o das !ol(c las de interesse/ &. ta!2(! a cro!ato+rafia e! papel 2idi!ensional1 e! - e tiliza*se !a fol9a de papel - adrado ao inv(s da tira/ 3 o papel ( cro!ato+rafado e! d as !ist ras de solventes/

Eletroforese
3letroforese ( o !ovi!ento de sol tos carre+ados eletrica!ente e! resposta < aplica45o de ! ca!po el(tricoA fre-Dente!ente ( sada para separar !ist ras de ons1 protenas e .cidos n cleicos/ A eletroforese na separao de protenas $ eletroforese1 e! adi45o < cro!ato+rafia1 ( ! processo i!portante para separar protenas/ Feste caso a separa45o se d. por !i+ra45o de !ol(c las e! ! ca!po el(trico/ Por(!1 9. o incoveniente de +eral!ente este !(todo inativar as protenas/ $s vanta+ens s5o - e as protenas s5o separadas e vis alizadas1 e per!itir a deter!ina45o de propriedades cr ciais de !a protena1 tais co!o o se ponto isoel(trico e se peso !olec lar apro)i!ado/ $ eletroforese de protenas ( +eral!ente realizada e! +(is feitos de pol!eros entrecr zados de poliacrila!ida1 - e f nciona co!o !a peneira !olec lar red zindo a velocidade de !i+ra45o das protenas e! propor45o apro)i!ada < !assa1 o peso !olec lar1 de cada !a delas/ Para deter!inar*se a p reza e o peso !olec lar de protenas ! !(todo tilizado faz so do deter+ente dodecils lfato ?SDS@A este li+a*se a !aioria das protenas e! - antidades proporcionais ao peso !olec lar de cada protena1 +eral!ente !a !ol(c la de SDS para dois resd os de a!ino.cidos/ E ando o SDS se li+a as protenas a confor!a45o destas (

alterada e a !aioria ad- ire a !es!a for!a1 por isso passa! a ter a !es!a rela45o entre car+a el(trica e !assa/ 3nt5o a eletroforese na presen4a de SDS separa as protenas - ase - e e)cl siva!ente por se peso !olec lar1 sendo - e os polipeptdeos !enores !i+ra! !ais r.pido/ $pBs a eletroforese as protenas pode! ser vis alisadas co! ! corante co!o o $z l de Coo!assie - e se ne a elas !as n5o ao +el/ letroforese !idimensional

0 a co!2ina45o de dois !(todos , a eletroforese e! SDS e a focaliza45o isoel(trica , e! +(is 2idi!ensionaisA conse+ indo*se assi! a resol 45o de !ist ras co!ple)as de protenas/ $ focaliza45o isoel(trica ( ! procedi!ento sado para deter!inar o ponto isoel(trico ?pG@ de !a protena1 esta2elece*se ! +radiente est.vel do p& no +el atrav(s da aplica45o de ! ca!po el(trico1 ent5o adiciona*se a sol 45o proteica e o ca!po el(trico ( reaplicado1 e assi! cada protena !i+ra at( atin+ir o p& - e ( i+ al ao se pG/ $ eletroforese 2idi!ensional separa as protenas de peso !olec lar id;ntico1 - e difere! e! se pG1 o protenas co! pG si!ilar1 por(! co! peso !olec lar diferentes/ Usa*se pri!eira!ente a focaliza45o isoel(trica1 no sentido vertical ?col na@ e depois a eletroforese co! SDS no sentido 9orizontal ?placa de +el@A assi! cada sentido indica !a diferen4a o pG o o peso !olec lar/ letroforese de "#A

0 se!el9ante a eletroforese das protenas1 apoliacrila!ida ( fre-Dente!ente sada co!o !atriz do +el para DF$s c rtos e a a+arose ( +eral!ente sada co!o !atriz de +(is para separa45o de DF$s !aiores/ S5o feitas eletroforeses paralelas de fra+!entos de DF$ +erados por cada dideso)in cleotdeo - e cria! !a escada de 2andas/ Cada 2anda corresponde a !a pop la45o de fra+!entos de DF$ de ! co!pri!ento especfico1 prod zido nas rea4>es de se-D;ncia!ento/ $ identidade da 2ase e! cada posi45o na se-D;ncia ( deter!inada a partir da raia onde !a 2anda ( o2servadaA a orde! das 2andas lidas a partir do f ndo do +el corresponde a se-D;ncia de DF$/ &o=e o se-Dencia!ento do DF$ est. a to!atizado1 sando !a varia45o do !(todo descrito anterior!ente ?!(todo de San+er@A o indicador sado para cada rea45o ( !arcado co! ! sinal fl orescente de cor diferente/ letroforese para separao de topoismeros

Topoiso!erases s5o enzi!as - e a !enta! o di!in e! o +ra de s 2enrola!ento do DF$/ 7s efeitos dessas enzi!as pode! ser de!onstrados sando*se a eletroforese e! +el de a+arose/ Usa*se !ol(c las de DF$ - e difere! no n8!ero de li+a4>es/ $s !ol(c las de DF$ s perespiraladas s5o !ais co!pactas e !i+ra! !ais r.pido - e as !ol(c las de DF$ rela)adas/ $ssi! o2serva*se as altera4>es ind zidas pelas topoiso!erases/

Bibliografia
%e9nin+er1 $/ %/ A Felson1 D/ %/ A Co)1 '/ '/ ?1HIJ@/ Principles of Bioc9e!istry/ Kort9 P 2lis9ers/ &arper/ Bio- !ica/ S(ti!a edi45o/