Microscopia Eletrnica em Biologia

Mrcia Attias Instituto de Biofsica UFRJ

O que um microscpio eletrnico?

Um pouco de histria

A descoberta dos eltrons

J.J.Thomson (1856-1940)
Pesquisador que descobriu Os eltrons e por isso ganhou o prmio Nobel

Ampola de Crooks: o m Apontado pela seta, capaz de desviar o feixe de eltrons (luz Verde)

O primeiro Microscpio eletrnico

O primeiro microscpio de Transmisso e o esquema De sua fabricao

Ernest Ruska (1906-1988) Foi um dos pesquisadores que desenvolveram os princpios da microscopia eletrnica

Uma das primeiras Imagens biolgicas obtidas no Microscpio Eletrnico de transmisso: A bactria Pneumococus

Natureza ondulatria da luz e dos eltrons

Os eltrons, assim como a luz, se propagam em ondas. As ondas de luz possuem um comprimento de onda maior ( esquerda) e no conseguem interagir com objetos muito pequenos. Os eltrons (acima) possuem um comprimento de onda muito menor, e so alterados pela interao com objetos pequenos como a bolinha vermelha.

Os dois tipos de microscpio eletrnico em comparao com o microscpio ptico

Microscpio ptico (luz)

transmisso

varredura
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Como se forma a imagem no microscpio eletrnico de transmisso?

Eltron transmitido

Eltron barrado

Alguns eltrons so barrados pela amostra

Outros eltrons passam pela amostra

Pergunta: O que pode deter um eltron? Resposta: um tomo

No desviado

desvio elstico

desvio inelstico

Aqui o eltron foi barrado

Aqui o eltron foi transmitido

Imagens da carapaas de uma alga diatomcea

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Vista geral do MET por fora...

Fonte dos eltrons

Insero das amostras

Painel de controle Tela de observao

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E por dentro

Os eltrons saem do filamento, este arame em forma de V

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O Microscpio eletrnico grande ou pequeno? Compare com o tamanho da pessoa e tire suas concluses...

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Amostras biolgicas e o ME
Clulas: Frgeis Hidratadas Muito espessas para o feixe de eltrons Ambiente no interior do ME: vcuo e calor

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Porque as clulas no podem ser observadas vivas no Microscpio Eletrnico

No pode haver gua na coluna do microscpio As clulas tm de ser resistentes ao feixe As clulas precisam apresentar contraste As clulas tm de ser cortadas em fatias finas
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Fixao de amostras

Fixar matar a clula preservando sua estrutura Fixadores qumicos: glutaraldedo, formaldedo, tetrxido de smio Fixao fsica: congelamento

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Coletando a amostra

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Fixando a amostra

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Infiltrao em resina
Em seguida, o fluido de transio ser substitudo por uma resina lquida. Resina no estado lquido Este processo feito gradualmente ao longo de 24 horas.

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 Quando as amostras estiverem completamente infiltradas na resina elas sero distribudas em forminhas e levadas estufa...

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Na estufa a resina se solidificar. Os blocos contendo as amostras podem ser retirados e desenformados.

48 horas 60oC

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Em seguida, os blocos so preparados para serem cortados em fatias ultrafinas.

Nmero de identificao

amostra
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Ultramicrotomia

As amostras precisam ser cortadas em sees ultrafinas para que o feixe de eltrons possa atravess-las. Isto feito num ultramicrtomo 22

brao

bloco

espelho dgua
diamante

O bloco preso no brao do instrumento. A cada oscilao do brao, h um pequeno avano. Ao passar pelo gume de diamante da faca, uma fina fatia flutua sobre o espelho dgua
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Os cortes flutuam sobre um espelho dgua

Olhando atravs da lupa, vemos as fatias e o gume da faca

Cortes ultrafinos (60 a 100 nm)

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Os cortes so recolhidos em telas de cobre

Cada tela tem 3 mm de dimetro ! Nela cabem dezenas de cortes. Cada corte pode conter muitas clulas!

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A grade ento inserida no microscpio eletrnico de transmisso

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membrana

ribossomas mitocndrias retculo endoplasmtico rugoso

Em aumentos maiores (cerca de 20.000X)

complexo de Golgi

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ncleo

hepatcito

Retculo Endoplasmtico Rugoso

Complexo de Golgi

mitocndria

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