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Universidad Autnoma de Tamaulipas Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Dr.

Norberto Trevio Zapata

Determinacin de la presencia de virus y bacterias en camarones silvestres en la desembocadura del Ro Tigre- Laguna de San Andrs, Tamaulipas
TESIS como requisito parcial para la obtencin del grado de

Maestro en Ciencias Veterinarias y Zootcnicas


Presenta

Dinorah Yareth Vargas Cruz

Asesores:

Dr. Gabriel Aguirre Guzmn Dr. Jess Genaro Snchez Martnez MC. Mara de la Luz Vzquez Sauceda

Cd. Victoria, Tam.

Agosto 2011

CONTENIDO I. INTRODUCCIN ...................................................................................................... 3 II. ANTECEDENTES .................................................................................................... 4 2.1 Pesquera del camarn ............................................................................................. 5 2.2 CARACTERSTICAS GENERALES DEL CAMARN .................................... 5 2.2.1 Ciclo de vida ........................................................................................................... 6 2.3 Enfermedades y diagnstico .................................................................................... 7 III. JUSTIFICACIN .................................................................................................. 10 IV. OBJETIVOS ........................................................................................................... 11 4.1 Objetivo general ...................................................................................................... 11 4.2 Objetivos especficos ............................................................................................... 11 V. METODOLOGA .................................................................................................... 12 5.1 rea de estudio ....................................................................................................... 12 5.2 Toma de muestra .................................................................................................... 13 VI. RESULTADOS PARCIALES .............................................................................. 16 VII. BIBLIOGRAFA...18

I. INTRODUCCIN El crecimiento de la produccin pesquera a nivel mundial se debe a las pesqueras secundarias y a la acuacultura, constituyendo los crustceos uno de los recursos de mayor importancia dentro de las pesqueras mundiales. Mxico posee una gran diversidad y se encuentra entre los veinte pases ms importantes del mundo debido a su produccin acucola, siendo la captura de camarn una de las actividades
pesqueras de mayor relevancia por su valor comercial y por sus niveles de produccin.

La pesca impulsa el desarrollo regional, sobre todo en la zona noreste del pas. La Laguna San Andrs en Tamaulipas es un importante ecosistema costero; posee importantes recursos pesqueros y es considerada una lagunas costera de gran relevancia social y econmica en el Golfo de Mxico y en la regin Tamaulipeca debido a sus pesqueras de camarn y porque en ella se encuentran casi todas las granjas de camarn cultivado existentes en la zona.

Diferentes virus y bacterias han sido reportados a nivel mundial como importantes agentes causantes de enfermedades en camarn, generando mortalidades que pueden llegar al 100% de prdida de 3 a 10 das, despus de producirse la infeccin. Al ocupar Tamaulipas un sitio importante en la produccin de camarn, es de gran importancia realizar estudios sobre la presencia de virus y bacterias en las poblaciones de camarones silvestres, con el fin de establecer estrategias encaminadas a determinar sus efectos y su posible control.

II. ANTECEDENTES 2.1 Pesquera del camarn La pesquera del camarn se inici en 1922 en el Pacfico mexicano y en 1947 en el litoral del Golfo de Mxico, pero se considera que inici como una pesquera industrializada reservada a las Sociedades Cooperativas de Produccin Pesquera a partir de 1940 (Cifuentes, 1999). Las entidades federativas con mayor captura de camarn son Sinaloa, Sonora, Campeche, Nayarit, Chiapas, Oaxaca y Tamaulipas (FIRA, 2003).

Los litorales del Golfo y el Caribe alcanzaron su mayor nivel en 1994 (con 392 mil 310 toneladas) y en el 2003 (295 mil 625 toneladas). De hecho en 2003 aportaron cerca del 19% del volumen total de la captura nacional. Esta regin es menos productiva que la del Pacfico, debido principalmente a que sus aguas son ms clidas, transportan menor cantidad de nutrientes, y, adems, presentan mayores problemticas ambientales derivadas de los impactos de las actividades agropecuarias y petroleras que se practican en la regin (Carranza-Edwards, 2004). A pesar de lo anterior Tamaulipas es uno de los principales estados en la pesquera de camarn, ocupando el tercer lugar a nivel nacional y el primero en el Golfo de Mxico (CONAPESCA, 2003). La Sonda de Campeche es una de las principales reas camaroneras, tiene una plataforma con una pendiente de poca profundidad: los 200 metros se alcanzan a ms o menos 200 millas nuticas de la costa y, como el fondo es arenofangoso, resulta ideal para la pesca del camarn (Cifuentes, 1999). En Tamaulipas y norte de Veracruz, la pesquera se sustenta casi en su totalidad en la captura del camarn caf Farfantepenaeus. aztecus, aportando el 69% del total de la captura en el litoral (9% Veracruz y el restante 60% Tamaulipas) (INP, 2003). La pesquera de estos organismos adems de desarrollar

en la zona marina se realiza tambin en la Laguna Madre y en la Laguna de San Andrs, esta ltima se encuentra ubicada entre los municipios de Aldama y Altamira (Fig. 1). El complejo hdrico de la Laguna San Andrs-Rio Tigre alberga adems a la mayora de las granjas de camarn que hay en todo el estado de Tamaulipas a 2219'49'' Latitud N y a 2359'23'' Longitud W 9745'40'' a 9806'10'' en el estado de Tamaulipas. Esta laguna tiene 8,300 Ha de espejo de agua, aproximadamente y recibe aportes de los ros Tigre y Barberena, y se comunica con el Golfo de Mxico a travs de la boca Barra de Chavarra (SEMARNAP, 2000).

Debido a su diversidad biolgica, el rea de San Andrs-Ro Tigre representa una fuente importante de produccin y alimentacin de las diferentes especies silvestres de tortugas marinas, aves playeras, canoras y de ornato, as como especies pisccolas. Alberga tambin rea de manglares y pastos marinos en donde se refugian y encuentran alimento diversas especies. La desembocadura del Ro Tigre y la intrusin de agua salina en la Laguna de San Andrs, crea un ecotono muy interesante en el cual existe una alta diversidad de especies vegetales y animales.

La parte continental de esta regin es importante por la presencia de endemismos como tuzas, aves y especies de plantas propias del noreste. Se reportan especies en peligro como el ocelote, el loro tamaulipeco y la tortuga lora. La vegetacin presente es la de selva baja caducifolia con vegetacin secundaria, vegetacin halfila como el pastizal salino de zacahuiste Spartina sp. y manglares.

2.2 CARACTERSTICAS GENERALES DEL CAMARN


2.2.1 Ciclo de vida

Los camarones pertenecen a la familia de los peneidos (Penaeidae) y en su estado adulto viven en mar abierto, donde se reproducen y alcanzan una talla de entre 15 y 20 cm de largo.

El ciclo de vida de los camarones es similar entre las diferentes especies, el desove se lleva a cabo en alta mar a diversas profundidades y en diferentes pocas del ao dependiendo de la especie. Estos crustceos liberan sus huevos fertilizados (de 500,000 a 1,500,000 por hembra) al mar entre 10 y 80 m de profundidad; eclosionan aproximadamente en cinco horas liberando una larva nauplio que se mantiene con los restos de la yema, posteriormente pasa a un estadio de protozoea y finalmente mysis, durante estas fases se alimentan de plantas y animales microscpicos. Estas larvas se mueven con las corrientes hacia las aguas costeras y las bocas de las lagunas costeras, donde arriban en forma de postlarvas, aproximadamente tres semanas despus del desove, con tallas entre 6 a 14 mm de longitud total. Las postlarvas penetran a las lagunas costeras y abandonan la vida planctnica para asentarse en el fondo en sus reas de crecimiento (Monroy et al.)

IS

E S

T
MAR

Fig. 1.- Ciclo de vida del camarn.

A R IN O

2.3 Enfermedades y diagnstico

Histricamente las enfermedades infecciosas en la acuicultura, han sido responsables de considerables prdidas y en ocasiones el colapso de algunas industrias debido, por ejemplo, la industria camaroncola de Taiwn en 1987, la China en 1992 y de Ecuador en 1994, las prdidas han sido estimadas en billones de dlares (ChvezSnchez et al., 2004). Adems de quedar afectada la produccin de camarn por enfermedades, se deteriora perceptiblemente la economa y detiene la produccin

pesquera en muchos pases del mundo (Chvez-Snchez et al., 2002). En Mxico han sido graves las prdidas econmicas debido a los virus Necrosis hipodrmica y hematopoytica infecciosa (IHHNV) en los 80s, la aparicin del virus del sndrome de Taura (TSV) en 1994, y el virus sndrome de mancha blanca (WSSV). Exista la creencia que los productos acuticos que se producan provenientes del mar, ros, lagos y lagunas naturales, no presentaban contaminacin biolgica que pudieran atentar contra su salud. Sin embargo, los numerosos casos de intoxicacin y de enfermedades por el consumo de productos acucolas contaminados, con diversas bacterias (Vibrio cholera, V. parahaemoliticus, Aeromonas, Salmonella) han sido factores importantes para la elaboracin de una serie de regulaciones a nivel internacional relacionadas con la inocuidad. Muchas de las enfermedades infecciosas del camarn tienen etiologa viral y normalmente ocurren cuando el camarn est bajo presin ambiental debido a valores altos y bajos de algunos parmetros fisicoqumicos como temperatura, salinidad, pH, oxgeno, alimentacin o alta densidad en el cultivo (Aguirre-Guzmn &Ascencio-Valle, 2000). Sin embargo, la deteccin rpida y precisa de los agentes etiolgicos permite la prevencin de la diseminacin de las enfermedades (Unzueta-Bustamente et al., 1998).

Es por ello que se requiere informacin actualizada de las enfermedades infecciosas presentes en el pas, sus caractersticas, los signos, los mecanismos de introduccin, dispersin, como las estrategias para evitar su introduccin al sistema y mtodos de control, incluyendo tcnicas de deteccin y diagnsticos. La IHHNV es causada por un virus miembro de la familia Parvoviridae (Bonami et al., 1990; Hizer et al., 2002; Tang et al., 2003; Withyachumnarnkul et al., 2006). Este virus fue descubierto en 1981 en Hawii y causando mortalidades por arriba del 90% en Litopenaeus stylirostris (Tang, et al., 2003). Las infecciones naturales con este virus han sido reportadas en L. stylirostris, L. vannamei,L. occidentalis, F. californiensis, Penaeus monodon, P. semisulcatus y Marsupenaeus japonicus (Tang et al., 2003). Bajas prevalencias de este virus han sido detectas en poblaciones silvestres de L. setiferus, F. aztecus y F. duorarum en Tamaulipas y Campeche, as como en L. vanammei cultivado en Tamaulipas y Yucatn, sugiriendo as su presencia en las porcin correspondiente del Golfo de Mxico (Lamela et al., 2004). Tanto los camarones juveniles y adultos pueden ser afectados por este virus. Sin embargo los juveniles son los ms susceptibles a esta enfermedad y se pueden observar muertes masivas en esta etapa de crecimiento (Lamela et al., 2004). La enfermedad de la mancha blanca es causada por un virus del gnero Whispovirus de la familia Nirmaviridae. Esta enfermedad ha sido reportada en

Tailandia, Taiwn y China, posteriormente en Amrica en las costas del Pacfico (Snchez-Martnez et al., 2007). Esta es una enfermedad letal donde la mortalidad alcanza hasta un 90 y 100% en un periodo de 3 a 10 das despus de la aparicin del primer signo de la enfermedad (Dupuy et al., 2004). Estudios realizados durante 1999 y 2000 en las costas de Tamaulipas, principalmente en Matamoros, Laguna Madre, Soto

la Marina y Tampico reportan la ausencia de este virus, as como en Veracruz y Campeche (Chvez-Snchez et al., 2002) La NHP afecta principalmente los cultivos de camarones en Latinoamrica; la contaminacin por esta bacteria en granjas de camarones genera una mortalidad de hasta un 90% (Aguirre-Guzmn & Ascencio-Valle, 2000). La contaminacin por esta bacteria en granjas de camarones genera una mortalidad de hasta un 90% (Aguirre-Guzmn & Ascencio-Valle, 2000) durante los primeros 30 das despus de haberse presentado los signos clnicos (Martnez-Crdova, 1999). La salinidad y la temperatura son factores medioambientales que influyen en la presencia de NHP, observndose epidemias de NHP en camarones despus de periodos de elevada salinidad y temperatura (Vicent & Lotz, 2007). Para la deteccin de estas enfermedades existen numerosas tcnicas de diagnstico para determinar el causante que provoca la enfermedad, siendo la PCR la tcnica que brinda mejores resultados en cuanto a tiempo se refiere, siendo esto vital para el diagnstico y tratamiento de una enfermedad.

III. JUSTIFICACIN

La existencia y presencia de numerosos virus y bacterias que generan enfermedades en camarones silvestres y cultivados, puede repercutir seriamente en el aprovechamiento pesquero y la produccin controlada de camarones. Al haber pocos estudios sobre patgenos virales y bacterianos en camarones silvestres en el Golfo de Mxico y al ocupar Tamaulipas el tercer lugar a nivel nacional en la produccin de camarn y el primero en el Golfo de Mxico es necesario realizar estudios sobre la presencia de virus y bacterias en las poblaciones de camarones silvestres, con el fin de establecer estrategias encaminadas a la determinacin de los efectos que pueda generar a la pesquera local de camarn y su posible control; adems de conocer la situacin actual de la presencia de los patgenos.

IV. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general Determinar la presencia de virus y bacterias patgenas en camarones silvestres en la desembocadura del Ro Tigre- Laguna San Andrs, Tamaulipas.

4.2 Objetivos especficos Determinar la presencia de los virus WSSV, IHHNV y la bacteria que causa la Hepatopancreatitis necrotizante (NHP) en camarones silvestres de la Laguna San Andrs, durante un ciclo anual de captura. Determinar la influencia de las variables ambientales de salinidad y temperatura sobre la presencia de los virus WSSV, IHHNV y la Bacteria NHP

V. METODOLOGA 5.1 rea de estudio La Laguna de San Andrs (Fig. 2), est ubicada en la Latitud N: 2219'49'' a 2359'23'' y Longitud W: 9745'40'' a 9806'10'' entre los municipios de Aldama y Altamira, en el estado de Tamaulipas, al noreste de Mxico. Esta laguna tiene 8,300 Ha de espejo de agua, aproximadamente y recibe aportes de los ros Tigre y Barberena, y se comunica con el Golfo de Mxico a travs de la boca Barra de Chavarra (SEMARNAP, 2000).

Fig. 2. Mapa de ubicacin geogrfica del rea de estudio Rio Tigre-Laguna San Andrs.

5.2 Mtodo de captura El mtodo de captura es mediante un arte de pesca llamada charanga, la cual es construida con estacas, carrizos y paos de red. Est constituida por dos barreras dispuestas en forma de V sin vrtice, que inducen al camarn hacia un matadero en

donde se localiza el yagual o bastidor desmontable. La captura se extrae por medio de una red tipo cuchara, construida con un bolso de pao de polietileno; la cuchara determina la selectividad de este sistema. Se instala en zonas someras de lagunas costeras o canales de estuarios por donde circulan corrientes de marea; su empleo solo est autorizado en los sistemas lagunarios estuarinos de Tamaulipas y del norte de Veracruz.

Fig. 3.- Esquema de una charanga usada para la captura. Fuente: Sagarpa, 2009

5.3 Toma de muestra

Se realizaron muestreos nocturnos mensuales en los 4 sitios de charangas durante los meses de enero-diciembre del 2010, exceptuando el mes de junio debido al periodo regional de veda de camarn ya establecido.

Los camarones se colectaron

mensualmente al azar, siendo un total de 24

camarones por charanga; 12 camarones para la deteccin de virus y bacterias por medio de PCR y 12 para estudios bacteriolgicos, obteniendo un total de aproximadamente

100 individuos por mes. Los camarones colectados mayores a 7cm fueron inyectados con alcohol al 70% utilizando una jeringa, aplicando la solucin en el cefalotrax y la regin abdominal. Posteriormente fueron colocados en frascos y bolsas de plstico para su estudio Molecular y Bacteriolgico respectivamente, se colocaron en hielo para su traslado al Laboratorio de Bacteriologa y de Biologa Molecular de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autnoma de Tamaulipas para su identificacin taxonmica (Prez-Farfante, 1998).

De los 12 camarones colectados por cada sitio, se hizo un pool de 4 camarones, obteniendo as un total de 3 muestras para los estudios de PCR y Bacteriologa.

Durante los muestreos mensuales se registraron las variables fisicoqumicas del agua como son salinidad y temperatura en los sitios definidos para este estudio, mediante un equipo multiaparmetros YSI

Bacteriologa

Para el estudio de Bacteriologa las muestras de camarones se maceraron y obtener una muestra homognea. Posteriormente se sembraron en los medios de cultivo de TSA, Mack, TCBS, incubndose a 26C y 37C. La identificacin de las cepas obtenidas se realiz por medio de bioqumicas convencionales.

Se analizarn los datos mediante el uso de tablas de contingencia para determinar la dependencia de la positividad del patgeno con respecto a la especie de camarn, sitio de captura y poca del ao. Para determinar las diferencias de temperatura y

salinidad con respecto al sitio de muestreo y a la poca del ao se realizar una ANOVA factorial.

Biologa Molecular Los camarones colectados preservados en etanol al 70% fueron clasificados mensualmente por gnero y especie (Prez-Farfante, 1988) realizando en grupos o pools de 4 organismos, posteriormente se extrajo el hepatopncreas y los plepodos para la extraccin de ADN.

5.4 Extraccin del ADN de los tejidos Los tejidos de los camarones de cada pool fueron macerados con la ayuda de una navaja de bistur, depositando el tejido en un tubo Eppendorf de 1.5 mL para realizar la digestin del tejido. La extraccin del ADN viral y bacteriano se realiz mediante el mtodo de extraccin del Kit comercial Wizard SV Genomic DNA Purification System (Promega, USA). El protocolo general de esta prueba consiste en agregar al tejido macerado 295 L de Mster Mix solucin de digestin el cual contiene (Nucleic Lysis Solution (200 L), 0.5 M EDTA a pH 8 (50 L), proteinasa K a 20 mg/ml (40 L), RNasa Solucin a 4mg/ml (5 L) en cada tubo de muestra), esta mezcla se incub a 55C durante toda la noche. Posteriormente se aadieron 250 L de Buffer de Lisis Wizard SV a cada muestra y se agito en Vortex, inmediatamente se pas cada muestra lisada a un tubo de micro columna con filtro, y fue centrifugada a 13000 rpm por tres minutos.

Posteriormente se elimin el lquido de elusin y al filtro que contena el tejido se le aadieron 650 L de Solucin de lavado Wizard SV (con etanol al 95%), el cual se centrifug a 13000 rpm por un 1 minuto, el lquido de elucin se desecho y se repiti tres veces ms la misma operacin para un total de cuatro lavados. Despus del ltimo lavado el lquido de elucin se desech y se centrifugo por dos minutos a 13000 rpm para secar el DNA contenido en el filtro, despus se coloc el tubo con filtro sobre un tubo nuevo de 1.5 mL, y se le aadieron 250 L de agua al tubo con filtro y

incubndose por dos minutos a temperatura ambiente. Finalmente se centrifug a 13000 rpm por un minuto, eliminndose el tubo con filtro y se guardo el ADN contenido en el tubo de 1.5 mL en congelacin a -20C hasta su uso.

RESULTADOS PRELIMINARES

De los organismos obtenidos en los cuatro puntos de muestreo durante el periodo de enero-diciembre, se obtuvieron muestras de organismos y registro de parmetros salinidad y temperatura. En las colectas mensuales se obtuvieron capturas en los meses de marzo a diciembre, mientras que los meses de enero, febrero y junio no se capturaron

organismos, siendo junio el mes de periodo de veda. En los anlisis de laboratorio correspondientes al anlisis de los organismos, las principales bacterias encontradas correspondieron a los gneros Pseudomonas, Sthapylococcus, Bacillus, Vibrio y Micrococcus. de Aeromonas,

La tabla 1, muestra las bacterias encontradas en el periodo de captura de eneroagosto.


Enero No captura No captura Febrero No captura No captura Aeromonas hydrophila Pseudomonas sp. Staphylococcus sp. Aeromonas sp. Marzo Aeromonas salmonicida Abril Aeromonas salmonicida Aeromonas salmonicida atypical Pseudomonas sp. Bacillus sp. Mayo Aeromonas hydrophila Bacillus sp. Junio Veda Veda

No captura

No captura

Aeromonas sp.

Veda

No captura

No captura

Vibrio sp.

Veda

No captura

No captura

Aeromonas hydrophila

Micrococcus sp.

Veda

No captura

No captura

Pseudomonas fluorescens

Veda

Tabla 1.- Listado de especies encontradas en el estudio bacteriolgico durante los meses de enero-junio
Julio Agosto Pseudomonas Aeromonas sp hydrophila Bacillus sp. Bacillus sp. Septiembre Octubre Staphylococcus Bacillus sp. sp. Aeromonas hydrophila Aeromonas salmonicida Noviembre Vibrio sp. Diciembre Aeromonas sobria Aeromonas hydrophila Pseudomonas fluorescens Bacillus sp.

Aeromonas hydrophila Vibrio sp.

Aeromonas sp.

Aeromonas Bacillus sp. salmonicida atypical Pseudomonas Aeromonas sp. salmonicida Aeromonas salmonicida Aeromonas hydrophila Micrococcus sp. Aeromonas hydrophila

Pseudomonas Vibrio sp. fluorescens Vibrio sp.

Aeromonas sobria

Tabla 2.- Listado de especies encontradas en el estudio bacteriolgico durante los meses de julio-diciembre.

En los registros de salinidad y temperatura se muestran en las tablas 3 y 4 respectivamente.


Parmetros salinidad sitios
1 2 3 4 Mes Ene 25,98 26,3 30,2 33 Feb 28,5 29,3 32,5 32,68 Mar 29,17 30,35 30,83 32,4 Abr 32,14 33,08 31 30,97 May 31,97 32,55 31,43 31,07 Jul 7,6 6,24 7,36 3,3 Agos 5,92 7,23 16,8 20,2 Sept 4,78 3,76 17,21 22,26 Oct 14,17 12,88 30,62 30,6 Nov 21,28 22,56 29,43 29,97 Dic 19,8 20,6 30,2 31,1

Tabla 3. Parmetros de salinidad en cuatro puntos de muestreo en los meses de enero-diciembre.

sitios
1 2 3 4

Mes Ene 19.65 19.89 20.2 20.67 Feb 20.78 20.23 20.4 20.67 Mar 21.8 21.67 21.49 21.9 Abr 27.9 27.11 24.69 25 May 28.29 28.28 28.2 27.94 Jul 31.42 31.24 30.88 30.18 Agos 32.2 31.9 33.2 33.9 Sept 30.74 29.64 30.23 29.66 Oct 27.94 28.04 24.11 23.93 Nov 26.88 26.5 25.79 25.36 Dic 20.1 20.1 19.3 20.5

Tabla 4. Parmetros de temperatura en cuatro puntos de muestreo en los meses de enero-diciembre.

Identificacin taxonmica
Cada uno de los camarones fueron identificados taxonmicamente basndose en sus caractersticas fenotpicas (rostrum, surco y espina adrostral), clasificndose por genero y especie siendo el ms abundante L. setiferus, con 320 camarones, seguido de F. aztecus, con 24 camarones; no encontrndose ningn camarn F. duorarum.

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