AULA PRTICA 01.

Colorao Bacteriana Simples e Diferencial de Gram

1.

Introduo Existe um grande nmero de corantes para uso em Microbiologia, os quais podem ser classificados com base nas suas estruturas moleculares complexas. Uma classificao mais prtica se baseia no comportamento qumico do corante: cido, bsico ou neutro. Um corante cido ou ani!nico" # aquele cu$a carga el#trica do on corado # negati%a& um corante bsico ou cati!nico" apresenta, no on corado, uma carga el#trica positi%a. 's corantes neutros so complexos salinos de um corante cido mais um corante bsico. 's corantes cidos coram, em geral, os compostos bsicos da c#lula, enquanto os corantes bsicos conferem sua cor aos componentes celulares cidos. ( colorao das bact#rias pela aplicao de uma nica soluo corante # c)amada de colorao simples. ' esfregao # coberto com um corante durante um tempo especificado, depois do que a l*mina # la%ada em gua corrente e de%idamente seca. (s c#lulas se coram, em geral, de maneira uniforme. +om alguns organismos, contudo, especialmente com o a,ul de metileno, alguns gr*nulos existentes no interior da c#lula podem aparecer corados mais intensamente do que o resto da c#lula,indicando que a entidade qumica presente nos gr*nulos tem maior afinidade pelo corante do que o resto do organismo. 's m#todos de colorao so muito importantes em bacteriologia, pois facilitam a %isuali,ao das bact#rias ao microsc-pio -ptico. (lguns m#todos so denominados de diferenciais, isto # permitem a classificao das bact#rias em .grupos/. Um m#todo diferencial muito importante em bacteriologia # o M#todo de +olorao de 0ram classifica a maioria das bact#rias em 0ram positi%as ou 0ram negati%as". ( +olorao de 0ram tornou1se um m#todo til e rpido para a a%aliao dos poss%eis agentes etiol-gicos en%ol%idos em meningites bacterianas, derrames articulares, pericrdios, pleurais, corrimento uretral para a pesquisa de gonococo, e entre outros. 2 o ponto de partida da identificao de bact#rias, classificando1as quanto 3 morfologia cocos, bacilos, etc..." e seu comportamento frente aos corantes 0ram1 positi%os ou negati%os". ( diferenciao das bact#rias neste m#todo decorre da capacidade da bact#ria de resistir a remoo do complexo corante iodopararrosanilina por uma soluo de descorante org*nico soluo de lcool etlico, soluo de acetona, soluo 4:4 de lcool1acetona". ' complexo corante iodopararrosanilina # formado a partir da reao do corante cristal %ioleta com o iodo da soluo de lugol utili,ada como mordente do m#todo.

(s bact#rias que ret5m o complexo corante reao positi%a" se apresentam coradas em roxo cor do complexo corante cristal %ioleta1iodo" so c)amadas de .0ram positi%as/. (s que no conseguem reter o complexo corante, reao negati%a, se apresentam coradas em rosa cor do +ontra1+orante 6 safranina ou da fucsina de 7ie)l18eelsen diluda" so denominadas de .0ram negati%as/.

2.

Objetivos 9raticar as t#cnicas corretas de preparao de um esfregao microbiano& : Executar o M#todo de +olorao de 0ram.

3.

!teri!is Reagentes 1 ;oluo de cristal %ioleta <=& 1 ;oluo aquosa de iodo lugol"& 1 Mistura lcool absoluto descorante"& 1 ;oluo de fucsina fenicada diluda ou safranina& : Outros Materiais 1 ;uspenso bacteriana& 1 ?*minas& 1 ?amnulas opcional"& 1 (la de inoculao& 1 >ico de >usen& 1 9inas 1 Microsc-pio 1 @leo de imerso.

".

Pro#edi$entos A - Preparao do esfregao 4. Aetirar uma l*mina de %idro de microscopia limpa e desengordurada" do recipiente& <. ;ecar com auxlio de um fol)a de papel toal)a& B. Craar, com um lpis de cera, uma lin)a trans%ersal a cerca de 4D mm da borda da l*mina&

E. +oloque sobre a l*mina uma gota de gua, no caso da cultura estar em meio de s-lido, ou uma gota da pr-pria cultura, se ela esti%er em meio lquido neste caso, % direto para o item D". D. Coque le%emente a ponta de uma ala de transfer5ncia sobre o crescimento bacteriano numa placa de 9etri. F. Cransfira o material da ponta da ala c#lulas bact#rias" para a gota sobre a l*mina. G. +om o auxlio da ala de transfer5ncia, faa um esfregao, espal)ando a gota pela l*mina, em formas de crculo. H. Ieixe secar ao ar e anote, com o lpis dermogrfico, o lado da l*mina no qual se encontra o material e a identificao da bact#ria. J. Kixe as c#lulas na l*mina passando a superfcie inferior da mesma B %e,es por uma c)ama.

B Colorao Simples 4. +ubra o esfregao com soluo de cristal %ioleta por 4 minuto. <. ?a%e bem com gua corrente. B. +ubra o esfregao com lugol por 4 minuto. E. Aetire o excesso de lugol e, mantendo a l*mina inclinada, e la%e1a delicadamente com gua destilada.

C - Colorao de Gram 4. +ubra o esfregao com soluo de cristal %ioleta por 4 minuto. <. ?a%e bem com gua corrente. B. +ubra o esfregao com lugol por 4 minuto. E. Aetire o excesso de lugol e, mantendo a l*mina inclinada, pingue lcool at# que no desprenda mais corante da preparao. D. ?a%e imediatamente na gua corrente. F. +ubra o esfregao com safranina L,<D= contra1corante" por 4 minuto. G. ?a%e em gua corrente.

4G. Ieixe a l*mina secar bem ao ar eMou seque1a com papel absor%ente no esfregue o papel na l*mina, somente coloque1o por cima do material fixado para absor%er a umidadeN".

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i#ros#)*io +*ti#o !n,'ise dos Resu't!dos

4. 'bser%e ao microsc-pio -ptico, na ob$eti%a de EO para centrali,ar sua l*mina& <. (ltere a ob$eti%a para 4LO e ELO. (note o que est sendo obser%ado& B. +om o auxlio de -leo de imerso 4 gota" obser%e o material em ob$eti%a de 4LLO. E. (p-s anotar todos os resultados morfologia, cor, se as bact#rias apresentam1 se unidas ou no, etc." limpe delicadamente as lentes ob$eti%as caso elas ten)am tocado na l*mina.

-. Observ!o

10. ///////////////////// ///////////////////

"0. ////////////////////

100.

0. Inter*ret!o Co'or!o si$*'es1 bact#rias de colorao a,uis. Co'or!o 2i3eren#i!' de 4r!$1 >act#rias de colorao a,uis so consideradas 0ram 9ositi%as. >act#rias de colorao rosas ou a%ermel)adas so consideradas 0ram negati%as.

5. Re3er6n#i!s