Biotecnologia

BIOTECNOLOGIA ITCA
martes, 7 de febrero de 2012
PRESENTACION DEL CURSO

SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CD. ALTAMIRANO
PRESENTACION DEL BLOG DEL DOCENTE
QUE PRESENTA: FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA NUMERO DE CONTROL:70
CD. ALTAMIRANO, GRO. MEXICO, FEBRERO 07 DEL 2012
INTRODUCCION El programa de Biotecnologa Aplicada abarcar el estudio biotecnologico, desde su nacimiento, revisando los hechos mas relevantes, revisando las etapas o eras biotecnologicas y las perspectivas futuras, en la unidad II y la Unidad III estaremos inmersos en el cultivo de tejidos vegetales, en estas unidades aprenderemos que es un medio de cultivo, prepararemos soluciones stock, prepararemos medios, esterilizamos y sembraraemos in vitro plantas de nuestra eleccion, espero poder ver diferentes tipos de cultivo in vitro y adaptacion a a campo. En las dos ultimas unidades nos asomaremos a las biotecnologias de tercera genearcion,estudiandolas tecnicas del ADN Recombinante y aplicaciones modernas, usaremos exposiciones grupales e individuales.
OBJETIVO
Adquirir los conocimientos, proyectar sus alcances y conocer las limitaciones en la aplicacin de tcnicas biotecnolgicas, en la propagacin vegetal, Transformacin bacteriana, vegetal y animal, diagnostico y mejoramiento.
METODOLOGIA
El presente documento ser presentado de manera cronologica, publicando los avances en clases, los cuales deran acordes al programa tematico (que se expondr al comienzo de cada unidad), asi mismo se expondran las tareas, investigaciones y practicas hechas, asi como graficas de aprovechamiento estudiantil al final. las entradasseran organizadas por unidad, con anotaciones al final de cada clase y conclusiones al concluir cada una.
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2012 (8) o febrero (8) 2. 1. 5. Preparacin y manejo de soluciones stock

2. 1. 4. Componentes del medio de cultivo 2.1.3.GENERALIDADES DE MEDIOS CTV 2.1.2 MATERIALY EQUIPO DE LABORATORIO 2.1.1. EL LABORATORIO UNIDAD II. PROGRAMA TEMATICO

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BIOTECNOLOGIA ITCA
PROGRAMA TEMATICO
BIOTECNOLOGIA APLICADA UNIDAD I. INTRODUCCION 1.1. Generalidades 1.1.1. Resea histrica de la biotecnologia 1.1.2. Bitecnologia de primera segunda y tercera generacion 1.1.3. Importancia: Econmica, Ecolgica y Agronmica. 1.2. terminologa general de la biotecnologa
UNIDAD II. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
2.1 Medios de cultivo 2. 1. 1. reas del laboratorio de cultivo de tejidos. 2. 1. 2. Material y equipo de laboratorio 2. 1. 3. generalidades de los medios de cultivo 2. 1. 4. Component. del medio de cultivo 2. 1. 5. Preparacin y manejo de soluciones stock. 2. 1. 6. Preparacin de los medios de cultivo. 2. 2. Esterilizacin 2. 2.1. Tipos de esterilizacin 2.2.2. Factores que intervienen en el proceso de esterilizacin.
2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos
2.3.1. Etapas del cultivo de tejidos 2.3.2. Seleccin de plantas madres 2.3.3. Explante 2.3.4. Siembra del explante 2.3.5. Condiciones de incubacin 2.3.6. Cambios fisiolgicos del explante 2.3.7. Trasplante al sustrato
UNIDAD III Tecnicas In Vitro En El Cultivo De Tejidos Vegetales 3.1. Generalidades 3.2. Micropropagacin 3.3. Plantas libres de patgenos 3.4. Tcnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento 3.4.1. Produccin de haploides: cultivo de anteras y ovulos 3.4.2. Variacin somaclonal 3.4.3. Fusin de protoplastos 3.4.4. Aplicacin agrobiologica 3.5 Conservacion In Vitro
3.5.1. aspectos importantes en la conservacin in Vitro 3.5.1.1. Regeneracion 3.5.1.2. Variabilidad 3.5.1.3. Estabilidad genetica 3.5.1.4. Estrategias 3.5.2. Metodos de conservacin 3.5.2.1. Factores que limitan el crecimiento 3.5.2.2. Supresin del crecimiento 3.5.2.3. Cryoconservacion del germoplasma Unidad IV. DNA Recombinante 4.1. Transformacin de organismos 4.2. Corte y union de molculas de ADN 4.2.1. enzimas de corte 4.2.2. enzimas de union 4.2.3. clonacion de genes 4.2.4. Vectores de clonacion 4.2.5. Tecnologa de ADN Recombinante en la agricultura 4.2.5.1. Plantas transgnicas 4.2.5.2. animales transgnicos 4.3.legislacin
4.4. Bioetica y revolucion biotecnologica
Unidad V. Tecnicas de diagnostico molecular biotecnologico
5.1. Tcnicas basadas en PCR y/o electroforesis 5.2. Southern 5.3. Northern 5.4. marcadores moleculares AFLP RAPD MICROSATELITES SECUENCIAS MITOCONDRIALES SECUENCIAS RIBOSOMALES Otros
Fuentes de informacin.
1. Doods, H.J. and W.R. Ioron 1990. Experiment in Plant Tissue culture edition Cambridge University Pres, USA. 2. Lindsey K. and M. G. Jones 1992. Biotecnologia Vegetal agrcola. Ediciones Acribia, Espaa. 3. Natell S.H. Mathews I. and Mckee R.A. 1995. Principles of plant Biotechnol. 4. Old. R.W. and Primrose S.B. 1987. Principios de manipulacin Gentica. 1 Ed. Acribia Espaa. 5. Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa Espaa.

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BIOTECNOLOGIA ITCA
domingo, 19 de febrero de 2012
2. 1. 5. Preparacin y manejo de soluciones stock

2. 1. 5. Preparacin y manejo de soluciones stock En palabras sencillas= soluciones concentradas de nutrientes La formulacin de las sales minerales que se emplea para un medio en particular (ej. Murashige y Skoog (MS, 1962)). Debido al elevado nmero de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentracin, resulta ms prctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto hace ms rpida la futura preparacin de medios y minimiza los errores (debidos a las numerosas pesadas de cantidades muy pequeas).
INSTITUTO TECNOLGICO DE CD. ALTAMIRANO LICENCIATURA EN BIOLOGA BIOTECNOLOGIA APLICADA PRCTICA No.2. 1. PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRES 2. INTRODUCCION La clula vegetal para su metabolismo requiere elementos esenciales, los cuales le permiten completar su ciclo normal de vida; algunos los requieren en cantidades mayores, por lo que se llama macroelementos, ellos son: C, H, O, N, P, K, Ca, Mg y S; y los que requiere en menores cantidades, llamados microelementos; como son; Fe, Mn, Cu B, Mo, Zn, y Cl. En el cultivo de tejidos vegetales estos elementos se agrupan en compuestos orgnicos e inorgnicos con un grado de reactivo especifico, los cuales deben ser disueltos en agua. En ocasiones se requieren concentraciones muy bajas de alguno de ellos, por lo que es necesario preparar soluciones a una elevada concentracin y a partir de esta diluirla hasta la concentracin requerida. Para facilitar la preparacin es necesario tener estndares de concentracin conocida, soluciones madres. Existen varias formas de expresar la cantidad de los compuestos en una solucin. Los principales son: porcentaje (%), molaridad (M) y partes por milln (PPM). Para que los tejidos establecidos in vitrorespondan a la diferenciacin (callo, organognesis) se requiere que el medi de cultivo los contenga. Algunos de las presentaciones que contienen estos elementos son incompatibles qumicamente (reaccionan entre si) y no se solubilizan, por lo que es necesario agruparlos por afinidad qumica. En esta practica realizaremos la preparacin de las soluciones madre, patrn o estndar. 3. OBJETIVOS
Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Qumica y Bioqumica. Manejar las tcnicas bsicas a travs del uso adecuado de reactivos. Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo. 4. MATERIALES Y EQUIPO
Vasos de precipitados de 250 ml (3 por equipo) Probeta graduada de 500 ml (1 por equipo) Vidrios de reloj Esptula Magneto Varilla de vidrio Termmetro Frascos de 500ml ambar con tapa 5. REACTIVOS
Componente NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 Na2 EDTA FeSO4.7H2O H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Glicina Tiamina - HCl Piridoxina HCl Acido Nicotinico MyoInositol Sacarosa Agar-Agar
Agua destilada 6. METODOLOGIA.
Cantidad en mg/l 1650 1900 440 370 170 37.3 27.8 6.2 22.3 8.6 0.83 0.25 0.025 0.025 2.00 0.10 0.50 0.50 100 30000 6000
Se organizaran los estudiantes en seis grupos de trabajo, cada grupo prepara una solucin madre stock de Murashige & Skoog MS.
El grupo No. 1 prepara la solucin de Nitratos, que consiste en pesar: 41.25 g de NH4NO3 y 47.5g de KNO3, se disuelven las sales en un matraz volumetrico usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml, para esto se usa agua destilada y desionizada (Sln. 100X). El grupo No. 2 prepara la solucin de sulfatos, que consiste en pesar: 9.25 g de MgSO47H2O, 0.5575 g de MnSO44H2O, 0,215 g de ZnSO47H2O y 0.6 mg de CuSO45H2O, se disuelven las sales en un matraz volurnetrico usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml, para esto se usa agua destilada y desionizada. (Sln. 100X). Estas soluciones deben guardarse congeladas.
El grupo No. 3 prepara la solucin de Halgenos, que consiste en pesar: 11 g de CaC122H2O, 0.02 g de KI y 0.0006 g de CoCl26H2O, se disuelven en un matraz volumtrico usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml. Se usa agua destilada y desionizada (Sln. 100X). El grupo No. 4 prepara la solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos, que consiste en pesar: 4.25 g de KH2PO4, 0.155 g de H3B03 y 0.00625 g de Na2MoO42H2O, se disuelven en un matraz volumtrico usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml. Se usa agua destilada y desionizada (Sln. 100X). El grupo No. 5 prepara la solucin de Quelatos, que consiste en pesar. 0.6962 g de FeSO47H2O y 1.0324 g de Na2EDTA2H2O, se disuelve primero el FeSO47H2O en 50 ml de agua; separadamente se disuelve el Na2EDTA2H2O en 50 ml de agua, calentando un poco a bao de Maria; se mezclan ambas soluciones; agitan bien y se dejan enfriar. Se completan con agua destilada hasta obtener 250 ml, Esta solucin se mantiene en la oscuridad, (Sln. 100X); Ademas pesar 10 gr. de Miomositol y disorverlo en un matraz volumetrico El grupo No. 6 prepara la solucin de Orgnicos, que consiste en pesar. 2.5 g de Myo-inositol, 0.0025 de Tiamina, 0.0125 g de Piridoxina, 0.05 g de glicina y 0.0125 g de cido nicotnico, se disuelven en un matraz volumtrico usando cerca de 150 ml y luego se afora a 250 ml. Se usa agua destilada y desionizada (Sln. 100X). La solucin de Orgnicos debe ser preparada para usarse en Un lapso de tiempo no superior a 2 meses, las dems pueden mantenerse hasta 4-5 meses.
7. RESULTADOS Y DISCUSION Hacer un informe escrito de las actividades desarrolladas, con fotografas y clculos realizados. -Por que es importante la realizacin de las soluciones stock? -Que otras opciones de combinacin de reactivos se pueden usar para el MS? 8. BIBLIOGRAFIA Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa Espaa.
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2. 1. 4. Componentes del medio de cultivo

2. 1. 4. Componentes del medio de cultivo Componentes de un medio de cultivo: Sales inorgnicas Fuente de carbohidratos Reguladores de crecimiento Vitaminas Aminocidos Complejos organicos Reguladores de crecimiento vegetales Antioxidantes Material de soporte Agua
El xito de la aplicacin de la tecnologa del cultivo de tejidos in vitro depende del grado de entendimiento de los requerimientos nutrimentales que tienen las clulas, tejidos u rganos. No obstante, el xito o fracaso est relacionado con el origen o naturaleza del inculo (meristemos, embriones, races, anteras, hojas, ovarios, protoplastos y clulas en suspensin, callos y endospermo). Puche y Rodriguez (2000) mencionan que Haberllandt (1902) estudi el efecto de los componentes inorgnicos en el crecimiento del girasol y tejidos tumorosos de tabaco; segn Burkholder y Nickell (1949) el efecto de los iones inorgnicos en agallas de acedera y Nitsch y Nitsch (1956-1957) muestran que las sales inorgnicas reducen el crecimiento del girasol tuberoso remolacha azucarera, De acuerdo a los efectos mayores o menores que causen en los tejidos, podemos distinguir que un medio de cultivo est formado por componentes esenciales y no esenciales. Se consideran esenciales a la mezcla de compuestos qumicamente definidos y que se ha denominado como medio basal o sinttico y est constituido por una parte inorgnica y otra orgnica; los elementos inorgnicos combinan macroelementos con microelementos y la parte orgnica est formada por una fuente de carbono y energa, vitaminas aminocidos y reguladores del conocimiento. Adicionalmente se emplean compuestos naturales de composicin no definida y sustancias anitoxidantes.
NUTRIMENTOS INORGANICOS Los minerales son muy importantes en la vida de la planta; para un crecimiento sano y vigoroso se requiere de la presencia de compuestos inorgnicos que se agrupan en macro y micronutrimentos. Macronutrimentos Son los que se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxgeno (O) e hidrgeno (N), aminocidos, Vitaminas, protenas y cidos nucleicos.
Comnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se aade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles (Gamborg y Jerry, 1981) fsforo (P) empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentracin de fosfato en solucin puede detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, adems de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cistena, metionina o glutation. La deficiencia de azufre da por resultado una etiolacin; magnesio (Mg) es componente fundamental de la molcula de clorofila; el calcio (Ca) es parte importante integral de la membrana celular, adems confiere proteccin a la membrana contra los efectos deletreos de los metales pesados, salinidad y pH muy bajos; usualmente se adiciona como cloruro de calcio (CaCl2 2H2O)m nitrato de calcio (Ca (NO3)2) y menos comnmente como fosfato triclcico ( Ca 3 PO4); fsforo y el potasio como el catin mayor y se adiciona en la forma de KNO3, KI, KCI Y K2 PO4. En trminos general fsforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento. Sin embargo, existe un antagonismo entre el Ca y el Mg. Cuando la concentracin de Mg+ es alta, se requiere tambin alta Ca+. La concentracin comparativa es a menudo ms importante que la concentracin absoluta de iones. Micronutrimentos Segn Puche y Rodrguez (2000), Los micronutrientes o elementos menores se aaden en concentracin micromolar. Los elementos menores son seis, a saber: Fierro (Fe), zinc (Zn), manganeso (Mn), cobre (Cu), cobalto (Co), boro (B) y molibdeno (Mo) que forman parte de la estructura de algunas protenas vegetales, o vitaminas de inters bioqumico-fisiolgico. De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen en la sntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los ms esenciales, junto con el boro y el fierro; adems tiene importancia de la fotosntesis en donde interviene en la conservacin de la ultraestructura de los cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas peroxidasa que permiten la oxidacin del cido indolactico en las clulas vegetales. Doershug y Miller (1967) mencionan que la omisin reduce el nmero de brotes en cotiledones de lechuga. Asimismo su adicin en alta concentracin puede compensar la carencia del Mo en raz de jitomate (Hannay y Street, 1954). En ocasiones el manganeso puede remplazar al magnesio, en algunos sistemas enzimticos (Hewitt, 1948). El zinc, particularmente, participa en el desarrollo normal del sistema radical del jitomate (Eltinge y Reed, 1940). Cobre forma parte de enzimas oxidasas que estn involucradas en la oxidacin e hidroxidacin de compuestos fenlicos, cido abscsico y dopamina (Lerch, 1981). El fierro y molibdeno juntos forman parte de la estructura de las enzimas nitrogenasa y nitrato reductasa (Lerch, 1981). Algunas veces el Zn se aade con un quelato (EDTA). El boro tiene su efecto ms importante en inducir el crecimiento del tejido diferenciado e indiferenciado. En dicotiledones, la deficiencia de boro frecuentemente permite un aumento en el crecimiento de cambium; asimismo, la deficiencia propicia una depresin de las citocininas lo que trae como consecuencia un incremento en la concentracin endgena de las AUXINAS y de tal manera que en un sistema de raz deficiente de boro, aparentemente hay una inhibicin de la raz por un exceso de auxina (Odhnoff, 1957, Whittington, 1959). El cobalto se encuentra en la estructura de anlogos de la vitamina B que es invo lucrada en la sntesis de los cidos nucleicos (Fries, 1962). El fierro es requerido para la formacin de cido
aminolevulnico y protoporfiringeno que son precursores temprano y tardo de la clorofila, respectivamente; adems es un componente de las protenas ferredoxinas cuya funcin es como transportador de electrones en fotosntesis. El fierro se usa como FeSO4 o FeCl2, pero en valores superiores de pH 5.2 se precipita como Fe(OH)2, tal como ocurre en el cultivo de raz de jitomate, ocasionando deficiencia de fierro. En el cultivo de tejidos no se observ deficiencia de Fe, por lo que algunas sustancias, como quelatos pudieron penetrar en las clulas. El tartrato frrico a pH 6.0 y el EDTA-Fe a pH 7.2 son en la forma en que se les usa. En medios lquidos, el citrato frrico o el tartrato frrico es utilizado en lugar del FeCl. Recientemente investigadores utilizan el Fe en forma de citrato, tartrato o de EDTA-Fe. En los inicios de los experimentos del cultivo de tejidos, fue incierta la naturaleza de los microelementos esenciales; sin embargo, Knudson (1922) incorpora el Fe y Mn exitosamente para la germinacin de semillas de orqudeas no simbiticas. Otros elementos menores agregados al medio Nobecourt (1937) fueron Cu, Co, Ti, y Be. Heller (1953) observa la deficiencia de los minerales, en callos de zanahoria previamente crecidos en medio Gautheret, causa la muerte del tejido, cuando se hacen 3 a 5 transferencias a un medio sin Fe, B, Mn, Zn o Cu. En el cuadro 1, se presenta la concentracin de los componentes, tanto macro como micronutrimentos, de diferentes medios de cultivo.
Complementos orgnicos Se consideran complementos microorgnicos a los compuestos orgnicos que se han llamado as por que el crecimiento y en general la morfognesis se ven mejorado.
Los complementos microorgnicos se agrupan en: Vitaminas Aminocidos Complejos naturales de composicin qumica indefinida Reguladores del crecimiento
Vitaminas Las vitaminas son consideradas como factores alimenticios secundarios requeridos por los animales en pequeas cantidades. Sin embargo, estas sustancias, que normalmente sintetizan las plantas, son tambin empleadas por ellas para su crecimiento y diferenciacin con papeles catalticos en el metabolismo. Cuando las clulas de plantas superiores son cultivadas in vitro , las vitaminas son necesarias para el crecimiento llegando a ser su ausencia o nivel de concentracin, un factor limitante. No obstante, estas necesidades dependern de la especie. Las vitaminas que son adicionadas ms usualmente como parte del medio sinttico son: tiamina-HCl, cido nicottico, piridoxina-HCl, biotina, cido flico, cido pantotnico, riboflavina. Generalmente, los requerimientos de las clulas, tejidos u rganos vegetales de vitaminas, son cubiertos por la adicin externa, sin embargo, los tejidos pueden obtenerlas a partir de los complejos orgnicos de composicin indefinida como en agua de coco, extracto de levadura, jugos de frutas, aguamiel. An cuando las plantas in situ son capaces de sintetizar sus propias vitaminasButenko (1986) menciona que tejidos de zanahoria pueden llegar a habituarse. Tiamina (B1) La Tiamina es esencia para el crecimiento. Es fotoestable, pero durante la esterilizacin por autoclave se descompone en pirimidina y tiazol; sin embargo, la mayora de los tejidos son capaces de sintetizar tiamina a partir de los productos de su descomposicin. En la naturaleza, especialmente los cereales aparecen libre y en concentraciones relativamente elevada. Piridoxina (B6) Es termo y fotoestable. Se localiza en semillas de cereales y no se considera esencial para la mayora de las plantas in vitro. Quiz el papel ms importante en su participacin, bien conocida, en la sntesis de purinas y pirimidinas y por lo tanto en el metabolismo de los cidos nucleicos.
Acido nicotinico Tambin se le llama niacina. Es foto y termoestable. Su principal funcin es ser coenzima de las enzimas que se conoce como deshidrogenasas que catalizan las reacciones de oxido-reduccin (NAD, NADP Y NADH o NADPH). Riboflavina
Es termoestable, pero fcilmente se descompone a la luz. A bajas concentraciones (90.01 mg.l-l) promueve el crecimiento en callos habituados de zanahoria, pero sin efecto en la oscuridad. Concentraciones de 10-50mg.l-1 inhiben completamente el crecimiento en la luz y promueve el crecimiento en la oscuridad (Butenko, 1968). La riboflavina aparece en la naturaleza como un constituyente de las flavinas coenzimas: flavin mononucleotido (FMN) y flavin adenina dinucletida (FDA). La riboflavina es termoestable por lo que no se descompone fcilmente (cuadro 1-3). Galston, Bonner y Baker (1953) sealaron que las diferencias de crecimiento en la luz y oscuridad de brotes blanquiscos o etiolados de chcharo eran causados por la activacin del AIA por la riboflavina. Acido pantotcnico Es termoestable, por lo tanto, puede ser esterilizado en autoclave junto con el medio nutricional Estimula el crecimiento de levaduras, en sauce llorn y Juniperas (Morel, 1946; Gautheret, 1958). Se encuentra en la naturaleza como componente de la coenzima A. Sin embargo, no es una vitamina esencial. Biotina No es esencial y probablemente promueve el crecimiento del cambio en inculo de sauce llorn (Gautheret, 1959). La biotina sirve como factor de crecimiento de las levaduras y algunas bacterias. Unida a su enzima especfica, se relaciona ntimamente con reacciones de carboxilizacin. carboxilacin carboxilacin conjugada y transcarboxilacin
Acido flico No es esencial y se descompone con el calor en soluciones cidas. En la oscuridad inhibe el crecimiento de los tejidos, mientras que en la luz lo promueve. Reinert y White (1956) mostraron que el cido flico inhibe el crecimiento de tejidos de pino. Se considera como vitamina en funcin de coenzima.
Aminocidos Los aminocidos representan, para las clulas, una fuente efectiva e inmediata de nitrgeno, puesto que se pueden incorporar al metabolismo mucho ms rpido que el nitrgeno inorgnico, an cuando ambas fuentes se encuentran en el mismo medio (Thom et al., 1981), sin embargo, su incorporacin al medio de cultivo es bastante discutido. Es conocido que su empleo esta en funcin del balance adecuado de la relacin NH4/NO3 que es usualmente suministrado como NO3-, NH4, NO3, NH4Cl, etc. Generalmente la inclusin de estos compuestos nitrogenados orgnicos es necesaria solamente cuando se inicia la formacin de callo, se consideran como estimulantes o requeridos durante la proliferacin celular (Gamborg y Jerry 1981). Tienen efecto notable sobre el desarrollo de tejidos vegetales cuando son usados en combinacin, mientras que empleando uno solo no se muestra afecto. Alguno tiene efecto antagnico entre ellos, as es el
caso de la fenilalamina y tirosina (Anderson, 1976), la leucina y valina, la isoleucina y valina , la arginina y lisina sobre el crecimiento de raz del embrin de la avena bajo cultivo. En tejido de tabaco el efecto antagnico se observa con la isoleucina, valina y treonina. Los aminocidos son usados como constituyentes de compuestos de composicin qumica indefinida o bien por adicin directa. De esta manera, se encuentran en casena hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina, etc. Los aminocidos que se emplean directa y ms comnmente son L-glicina, Lglutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, cido glutmico. L-hidroxiprolina, L-alanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957) sealan que las formas L de los aminocidos son ms adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son txicas. Adems, las formas racmicas son mejores para el desarrollo de tejidos que las formas puras -L de aminocidos. Se han sealado efectos diferentes al usar ismeros de aminocidos, por ejemplo: -L alanina es ms fcilmente asimilado que la B-alanina. El cido aminobutrico no puede ser utilizado como fuente de nitrgeno, pero puede remplazar completamente a los nitratos. La inhibicin del crecimiento por algunos aminocidos slo ocurre por causa de inhibicin sinttica del nitrato reductasa. Este crecimiento puede ser recuperado usando arginina como el aminocido desnhibidor, la arginina tiene tambin efecto de restablecer el crecimiento de races inhibidas en compuestas; adems de acelerar la formacin de yemas en tejidos de tallo de tabaco. La urea tambin puede ser usada como una fuente de nitrgeno, en vez de aminocidos. An cuando la mayora de los investigadores sealan que si el medio de cultivo tiene la fuente de amonio o nitrato adecuado, los aminocidos no son esenciales (Gamborg, et. al.,1976). Tambin es cierto que la adicin posiblemente depende del origen del tejido; adems de que su incorporacin es requerida para diversos objetivos. De acuerdo con Steward y Caplin (1951), la glicina o mezcla de aminocidos en forma de casena hidrolizada se requieren para el mantenimiento de clulas indiferenciados (callo). Murashige y Skoog (1962) Gamborg (1966) sealan que la adicin de la casena hidrolizada incrementa la divisin celular en tabaco, frijol y maz, respectivamente. Nitsch et. al. (1970) confirma que agregar nitrgeno en forma de NH estimula el crecimiento de callo en pera o manzana; pero aumenta cuando el medio se complementa con asparagina, glutamina u otro aminocido. A pesar de que la presencia de nitrgeno orgnico es muy importante para la organognesis, se considera esencial para la embriognesis. Adems de la casena hidrolizada, la Lglutamina ha demostrado ser promotor del desarrollo embrionario. En ocasiones, puede sustituir a la casena hidrolizada (Litz, 1982). Filner (1978) indica que en clulas XD de tabaco, el nitrgeno orgnico, particularmente la arginina acta positivamente en la sntesis de protenas. En embriones inmaduros de vainilla, el aceleramiento de la maduracin es estimulada por la adicin al medio de sulfato de adenina y L-glutamina (Parra y Gonzlez, 1989 y Gonzlez et. al. 1990) Es difcil definir si el papel de los aminocidos es esencia o no; sin embargo, la adicin de la casena hidrolizada puede prevenir o inclusive asegurar la fuente de nitrgeno, ante la posible deficiencia de la fuente de amonio o nitrogeno inorgnico o como Li et. al., (1989) seala que la ausencia de aminocidos, principalmente prolina, ocasiona degeneracin de plntulas de Pachystachys lutea cultivadas in vitro. Carbohidratos
La sacarosa y la glucosa se utilizan en el cultivo de tejidos de muchas especies. La fructuosa, maltosa, celabiosa, rafinosa y otras, se les usa como fuente de carbono para algunas variedades de tejidos. Para la mayora de los tejidos en cultivo es sacarosa la mejor fuente de carbohidratos (2-5%), de manera que el mximo aumento en peso fresco en los tejidos cultivados del endospermo del sorgo se obtiene con 2% de sacarosa, y el mximo de peso seco a 8%. Varios informes sealan que la sacarosa se hidroliza activamene a fructuosa y glucosa por la invertasa de la pared celular. As por ejemplo, la sacarosa, callosidades de zanahoria, desaparece del medio de cultivo en dos das. La dextrina, pectina y almidn son aprovechados por la callosidades de Sequoia y el almidn soluble es aprovechado por callosidades del endospermo del maz o de Juniperus. Las carbohidrasas hidrolizan el almidn, maltosa o rafinosa en monosacridos. La combinacin de algunos carbohidratos no son tiles para el crecimiento de tejidos vegetales como fuente nica de carbono. Los cidos orgnicos ms efectivos, como el cido succnico, cido ctrico y cido fumrico, desarrollan slo de un 25 a 50% del crecimiento comparado con un tejido cultivado en el cual la fuente de carbono es la sacarosa Bouriquet (1958) sugiere que los cidos orgnicos actan sinergticamente a bajas concentraciones del 2,4-D.
Reguladores del crecimiento Los reguladores de crecimiento se dividen en auxinas, citocininas, giberelinas y retardantes e inhibidores del crecimiento y son naturales y sintticas. Auxinas naturales De acuerdo con su naturaleza, el cido indolactico (AIA) es la nica auxina natural que se localiza en las zonas de crecimiento. Tiene la peculiaridad de ser descompuesto por la luz, por lo que no es conveniente utilizarlo en cultivo en suspensin. Por ser hormona natural, su desaparicin del tejido es muy rpido ya que en las plantas se encuentran las enzimas oxidasas de la que hidrolizan a la hormona de manera que su efecto es suave y de poca duracin. Auxinas sintticas Son auxinas sintticas del cido naftalenactico (ANA), cido 2,4 diclorofenoxiactico y cido indolbutrico (AIB). La primera y la tercera hormona forman parte de los productos que se utilizan como enrizadores. Los tejidos aislados de plantas y las callosidades en subcultivos, requieren de auxinas. Los que no las requieren son los callos habituados y los tejidos tumorales. Para el cultivo de callosidades se usan de 0.1 a 5.0 mg/l de AIAy para la diferenciacin de rganos se ha sealado a menudo que es necesario reducir la concentracin de la auxina. El AIA o el ANA son mejores que el 2,4-D para la induccin de la organizacincelular. Si se usa 2,4-D en muchas especies de plantas trendrn la tendencia a la formacin de callos, por lo que si se desea inducir la formacin de rganos, se necesita cambiar el 2,4-D por otra auxina como el AIA o bien bajar la conentracin.
Citocininas
Citocininas naturales son: Zetina que se extrae del endospermo del maz y 6 issopentanil adenina (2iP) que se aisla de Clostridium Tumerfaciens que produce un sobre crecimiento de los tejidos. Algunos tipos de tejidos requieren esencialmente citocininas, principalmente en el fenmeno de la organognesis; por ejemplo, los callos de soya o de la mdula de tabaco (var Wisconsin #38). Sin embargo, no todos los tejidos requieren citocininas, aunque algunas crecen bien en su presencia, stas no son esenciales. Citocininas sintticas son: 6-benciladenina (6 BA) o tambin conocida como bencilanimopurina (6 BAP); la cinetina (K) tambin conocida como 6-furfiril aminopurina (FAP). La 6-benciladenina se utiliza en concentraciones de 1.01-1.0 mg/l. Tambin se emplea la zeatina o isopentil adenina como sustancias de naturaleza citocintica. Acido giberlico El cido giberlico no se usa connmente para el cultivo de callo. En ocasiones se adiciona al medio para inducir alargamiento del tallo, pero no es comn su uso. Acidos nucleicos y compuestos con base de cidos nucleicos El ADN, ADN hirolizado no tiene efecto en tejidos bajo cultivo, pero el ERN estimula el crecimiento de callos de tabaco, maravilla y Rumex el efecto del ARN puede ser demostrado en presencia de citocinas. El uracilo, citosina, guanina, xantina y timina no son efectivos para los callos de zanahoria. Sin embargo, la cinetina y el extracto de zanahoria, que tiene actividad de citocinina, tienen el efecto de estimular el crecimiento cuando se usan con una mezcla de aminocidos. Por otro lado, la guanina, timina y citosina inducen la formacin de organos en tejidos de tabaco. La mezcla de una citocinina y cido ortico induce el desarrollo de la inflorecencia de Plumbago ndica. Substancias naturales Las substancias naturales de las plantas ampliamente usadas son: de agua de coco (10-20%), extractos de levadura (EL) y se emplea en concentraciones de 0.01-0.05%, casena hidrolizada (CH) se emplea desde 0.01% a 1.0% y extracto de malta (EM) que se adiciona desde 0.1 0.5% tambin se usa peptona, jugo de tomate, pepino, del endospermo inmaduro de maz y cido casaamino. Estas sustancias son por lo general, termoestables. La adicin del endospermo inmaduro de coco a los medios nutrimentales promueve el crecimiento de tejidos de diversas plantas. Cuando se usa extracto de levadura se debe tener cuidado en las diferentes calidades de los extractos, ya que de estos depende la certeza de los datos. En el caso del cido casaamino, el efecto de ste podr definir si es por hidrlisis cida por descomposicin enzimtica. De las sustancias naturales de plantas, se analiz el agua de coco. Las sustencias efectivas son estables y se les dividi en relacin a sus principales componentes, en tres fracciones; mezca de aminocidos y amidas; mo inositol y d-sorbitol en la fraccin neutral y la difenil urea y leuco antocianina en la fraccin activa, las cuales a su vez estn unidas por carbones activos. El efecto del agua de coco es el resultado total de estos tres. Sin embargo, el agua de coco es una mezcla muy compleja cuyos componentes y
concentraciones son muy variables, dependiendo de la estacin del ao y sitio de la colecta. Del endospermo inmaduro de maz se aislan la zeatina, una de las citocininas, que puede ser un acelerador en el endospermo. La actividad de esta citoocinina tambin se encuentra en semillas inmaduras de lupino, en extracto de levadura y agua de coco. Agar El agar es un gel que se extrae de algas marinas y que por sus caractersticas fsicas se emplea para solidificar el medio bsico, cuando ses trabaja con cultivo estsacionario slido o semi-slido. Un buen agar es aquel que: a. Hierve a 100 C y que solidifica a 45 C, aproximadamente. Esta caracterstica le confiere estabilidad a cualquier temperatura de incubacin. b. No es digerido por enzimas vegetales. c. No reacciona con los constituyentes del medio de cultivo Hay diferentes grados o tipos de agares y generalmente se le considera como buen soporte del inculo; sin embargo, datos proporcionados por compaas elaboradoras de agar comercial consignan que contiene pequeas cantidades de tiamina, biotina y minerales, por lo que no es conveniente utilizarlo indiscriminadamente. Al respecto, White (1953) sugiri que el agar tiene un papel mutrimental, de tal manera que aporta y los tejidos son capaces de utilizar. Romberger y Tabor (1971) consideraron que mientras sea menos puro, se pueden encontrar iones, polisacridos sulfanatados, cidos grasos de cadena larga, que son capaces de inhibir el crecimiento bacteriano, pero que an se desconoce que efecto puede inducir en tejidos vegetales. Existen indicios que el vigor y peso seco se incrementa cuando se usa Difco agar purificado, comparativamente al empleo de Difco Noble agar o Difco bacto agar, ste produce resultados intermedios. De acuerdo a Debergh (1983), el agar puede contener Ca, Mg, K y Na (cuadros 1-6 y 1-7) de manera que se altera la formulacin nutrimental del medio de cultivo. Es posible que para el caso de la micropropagacin comercial no sea requerido el agar altamente purificado y de esa forma abaten los costos. La concentracin de agar en los medios de cultivo slidos es variable y depende de la calidad , pero usualmente es de 0.7-1.5%. Los medios que tienen altas concentraciones de sales requieren de un porcentaje alto de agar. Dependiendo de la concentracin del agar y el pH, ser la dureza del medio. Cuando el medios es duro, el crecimiento del inculo se hace muy lento. Por otro lado, diversos estudios sealan que concentraciones menores de 1 gL, de agar es determinante para inducir vitrificacin (formacin de hojas suculentas y frgiles) durante la fase II de la micropropagacin. Merck ha elaborado gelrite (phytagel), que a pesar de ser ms caro que el agar agar, tienen la ventaja de emplearse en cantidades menores (0.5 - 2.0g), lo que ha motivado que muchos laboratorios lo estan usando. Adems, tiene la caracterstica de que al enfriarse es transparente, aspecto importante para la observacin del inculo, durante la micropropagacin. Existen otras opciones de agentes solidificantes, pero algunos por sus caractersticas fsicas, no endurecen o hierven a las temperaturas que se requieren para su empleo en el cultivo de tejidos, por ejemplo: La gelatina tiene su punto de ebullicin a 25C, aproximadamente. Para el caso del
cultivo de protoplastos, algunos autores han empleado alginatos que aunque tiene las ventajas de formar gel cuando se adiciona o se licua por la presencia de algn agente quelante o citrato de sodio. Presenta desventajas, como ser altamente termoinestable con los cationes bivalentes, ocasionado una eliminacin de nutrientes (Button y Botha, 1975). Sin embargo, Sigma sabiendo que el agar puede tener algn efecto sobre el crecimiento del tejido in vitro, ha desarrollado diferentes tipos de agentes solidificantes buscando proporcionar un mayor nmero de opciones que se adapten a las necesidades del investigador, investigaciones o especies vegetales. Estos productos se caracterizan por tener diferentes grados de pureza y costos, importantes factores en cualquier investigacin u operacin de produccin. REFERENCIAS APUNTES TOMADOS DE: PUCHE A., F. Y RODRIGUEZ P., L. 2000. CURSO-TALLER CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. ITA-25DGETA. MEXICO. 152P
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MIRCOLES, 25 DE ABRIL DE 2012
BIOTECNOLOGIA ITCA
jueves, 9 de febrero de 2012
2.1.2 MATERIALY EQUIPO DE LABORATORIO
EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES (CTV)
MATERIALES E INSTRUMENTAL
Para el desarrollo de la investigacin y docencia, en el campo del cultivo de tejidos, se requieren de materiales que permitan la preparacin de frmulas nutrimentales con el objetivo de cultivar tejidos, rganos y clulas vegetales in vitro . Ya se que ustedes organizaran esta informacion por rea y sus materiales yequipo, yo lo abordare de manera mas global y aqui se tratar entonces de enumerar cuales son los aparatos y cristalera que son ms comnmente utilizados para el cultivo de tejidos vegetales y aunque es claro que existen ms y no se mencionaran. A continuacin se presentarn los diferentes materiales que se encuentran en un laboratorio que desarrolla actividades en el campo mencionado.
CRISTALERA
La cristalera de uso ms comn para el cultivo de tejidos se selecciona de la que se utiliza en experimentos qumicos o de microbiologa; sin embargo, poco de este material est diseado especialmente por investigadores. Se utiliza bastante material de vidrio en la preparacin de medio de cultivo y en la siembra de tejidos vegetales. El material que se seleccione deber ser de alta calidad, resistente a altas temperaturas y a cidos y no liberar sustancia alguna, especialmente aqulla que es utilizada en la conservacin de soluciones madres.
TUBOS DE ENSAYO
Se utilizan muy frecuentemente en cultivos con pequeas cantidades de soluciones o bien para diversos tipos de medios. En cultivos que se mantienen en rotacin o en agitacin, para los medios lquidos, se utilizan tubos de ensayo, as como tambin en los medios slidos. Los tubos de ensayo utilizados para cultivo de tejidos son ms cortos y ms anchos. Normalmente las dimensiones de los tubos de ensayo son de 2.0 x 15.0 cm, 2.5 x 15.0 cm o de 2.5 x 9.0 cm, aunque en el cultivo de rganos (experimentos sobre induccin de rganos) a partir del cultivo de tejidos y en la induccin floral se emplean tubos especficos que son de mayor longitud y dimetro (2.5 x 20.0 cm). Para cubrir la boca los tubos de ensayo, una vez que se les ha cultivado, se usan los materiales siguientes: algodn no absorbente, papel aluminio o de poliestireno, poliestireno K-resina, tapas de plstico, tapones de hule y de polipropileno.
MATRACES ERLENMEYER Estos matraces se usan para preparar medios de cultivo slidos o lquidos; en la preparacin de medios de cultivo. Se usan matraces de capacidad de 50, 125, 300 y 500 ml; de 1 y 2 litros dependiendo del volumen de trabajo, se tendr la cantidad requerida de matraces. Para cultivo en matraces son ms fciles para su manejo los de 50 y 125 ml de capacidad; cuando los matraces y los tubos de ensayo tienen un mismo dimetro, se facilita ms el hacer tapones para cubrirlos. Un dimetro de 25 mm es suficiente para operar dentro de ambos. Aunque por supuesto, en el cultivo masivo de tejidos, tanto en medio slido como lquido, se requieren dimensiones ms grandes en los matraces.
CAJAS DE PETRI
Las cajas de petri no slo se utilizan para hacer cultivos en medios slidos, tambin para germinar semillas esterilizadas o bien para esterilizar tapones de hule, filtros de nylon o de acetato de celulosa, que se usa para esterilizar soluciones orgnicas e inorgnicas y para guardar papel filtro. Comnmente se utilizan cajas de petri de 6, 9 y 12 cm de dimetro. Para la germinacin de semillas son ms convenientes las de mayor anchura. Estas cajas de petri debern tener un ajuste firme entre la tapa y tapa. Generalmente se emplean cajas petri de vidrio, aunque en la actualidad se estn fabricando de polipropileno. Estas son deshechables.
BOTELLAS PARA CULTIVO Para propsitos de cultivar plantas en condiciones in vitro, se utilizan botellas cilndricas o cuadradas, que pueden ser las botellas de whisky, ron, brandy, etc., que son resistentes a altas temperaturas y que son muy apropiadas para los medios de cultivo slido. Generalmente tienen una tapa rosca y se les puede conservar fcilmente en una posicin vertical u horizontal. Las botellas cuadradas pueden colocarse unas sobre de otras, de tal forma que no ocupen mucho espacio, y las cilndricas no requieren de canastillas especiales para guardarse. Uno de los recipientes ms empleados para el cultivo de tejidos es el frasco para alimento de bebes (Gerber) que aparte de ser til, es fcil de conseguir, muy barato y no ocupa mucho espacio en la cmara de incubacin. En algunas casas comerciales pueden conseguir recipientes de polipropileno o de policarbonato, que adems de ser prctico requieren de poco espacio; sin embargo, tienen el inconveniente de tener un costo alto. La condicin ms favorable es tener el costo ms bajo posible tanto en lo referente a investigacin, enseanza y obviamente cuando desarrollamos tecnologa para fines comerciales.
BOTELLAS PARA REACTIVOS Y SOLUCIONES MADRE Se requieren muchas botellas de polipropileno de 50 ml, 100 ml, 500 ml para guardar soluciones madre o para hacer soluciones de varios reactivos. Las botellas oscuras son usadas para evitar la multiplicacin de hongos y bacterias o oxidacin causadas por la luz. Las botellas de polipropileno como se utilizan para conservar bajo congelacin compuestos de composicin indefinida, como el agua de coco, soluciones hormonales o compuestos orgnicos termoinestables.
PIPETAS, GOTEROS, PROBETAS Y MATRACES Para la preparacin de diversas soluciones para la elaboracin de los medios bsicos para el cultivo de tejidos vegetales se requiere de la cristalera siguiente: Pipetas graduadas: de 1, 2, 5 y 10 ml Goteros con pera de goma de 10 ml Probetas graduadas: de 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ml Matraces volumtricos: de 500 y 1000 ml Matraces aforados: de 50, 100 y 250 ml
VASIJAS DE VIDRIO PARA LA DISTRIBUCIN DE MEDIO DE CULTIVO Para la distribucin de un volumen de medio de cultivo se pueden usar diferentes formas, por ejemplo vasijas de vidrio, embudos grandes con tubos de hule y pinzas de compresin, columnas de vidrio con boca de salida o botellas de inyeccin de Linger o simplemente recipientes de aluminio, como jarras. Cuando por alguna razn no se cuenta con los accesorios adecuados para servir el medio de cultivo, como improvisacin se usa el embudo grande de vidrio con tubo de hule en el extremo del tallo y pinzas de compresin para controlar el volumen de salida del medio de cultivo.
INSTRUMENTOS Y APARATOS Para el cultivo de tejidos hay pocos aparatos e instrumentos diseados especialmente para este propsito. Sin embargo, se pueden escoger varios instrumentos mdicos, as como tambin muchos aparatos de microbiologa.
FILTROS Y ESTERILIZADORES Recientemente se han usados membranas de stercelulosa para propsitos de esterilizacin de lquidos. Se tienen muchos tipos de membranas de acuerdo al tamao de los poros. Para esterilizacin se deben escoger aquellos que tengan poros de menor tamao que 0.25 micras. Estas membranas se consiguen en el mercado con el soporte y otros aparatos adaptables. Se les conoce bajo varios nombres como: Filtro Millipore, Filtro Galman de membrana, Filtro Toyo de membrana, etc.
Normalmente estos filtros se pueden esterilizar en autoclave a una atmsfera de presin durante 15 min., la esterilizacin por ms tiempo o esterilizacin seguidas no afecta la membrana. Se sugiere que al utilizar estos filtros de membrana se sigan las recomendaciones indicadas por los fabricantes.
CMARA DE FLUJO LAMINAR Para la realizacin de investigacin y docencia en un laboratorio de cultivo de tejidos se requieren condiciones de aspsia, por lo que se emplea la cmara de flujo laminar que inyecta el aire ultrafiltrado y esterilizado que permita la manipulacin de los tejidos sin que se presenten problemas de contaminacin por microorganismos como hongos y bacterias, no solamente cuando se hace la inoculacin, sino cuando se sirve medio de cultivo a frascos que, por motivos de la tcnica, se tengan que esterilizar previamente. De acuerdo al flujo del aire, las cmaras son horizontal o vertical y se tienen tres presentaciones, en cuanto al tamao; 0.60m, 1.20 m y 1.80m. Algunas veces se encuentran complementadas con llave para gas y para extraccin de aire (vaco).
HORNOS PARA SECADO Estos hornos se usan especialmente para el secado del material de vidriera lavado y para la esterilizacin de instrumentos usados para el cultivo. Para la esterilizacin por secado, la temperatura que se debe conservar es de 140C durante 4h o bien a 150C 180C por una hora, por lo que se requiere de un termostato que sea preciso. Sin embargo, la esterilizacin por este proceso no es recomendable para cristalera de medicin de precisin, como probetas, pipetas, debido a que el vidrio sufre dilatacin por el calor, lo que altera los volmenes que se miden.
Las pesadas en seco de clulas o tejidos cultivados se hacen despus del secado al vaco en un horno de vaco. Para este propsito muchas compaas venden elctricos de vaco con termostato.
AUTOCLAVES Las autoclaves esterilizan con vapor de presin y tienen dos sistemas de calentamiento: a base de gas o de electricidad. Los modelos de autoclave son de tipo horizontal o vertical. La esterilizacin de algodn, gas, papel para envoltura (aluminio, manila), filtros Seitz, millipore, pipetas probetas, matraces aforados, agua y medio de cultivo se hace en autoclave.
REFRIGERADOR Y CONGELADOR
Clulas, tejidos y soluciones madres, se deben de conservar a bajas temperaturas y para ello se requiere un refrigerador. Por otro lado, algunas de las vitaminas o compuestos de composicin qumica indefinida, como el agua de coco, requieren de ser mantenidas en congelacin, sobre todo en aquellos lugares de clima cliente. Para experimentos en pequea escala, un refrigerador comn con un pequeo congelar es suficiente.
BALANZAS La preparacin del medio requiere de realizar el pesaje con precisin de todos los componentes que lo integran con precisin y de acuerdo al tipo y a la cantidad del constituyente que se agregue al medio, as ser el tipo de balanza que se emple. Existe una gran diversidad de este equipo, sin embargo, hay dos tipos de balanza que son muy usuales en el laboratorio: granatarias y analticas, ambas de precisin
TORSIN O GRANATARIA Las balanzas granatarias ms frecuentes son: -De doble y triple barra -Electrnica con platillos superior Las balanzas de torsin tienen una capacidad de 100 a 200 g, y sirven para pesar en gramos de sustancias cultivadas. La precisin de 0.1g, es suficiente para estos experimentos. qumicas o clulas
BALANZAS ANALTICAS En el mercado se tienen diferentes modelos, sin embargo, por lo menos existen 3 tipos de aparatos: - De platillo metlico, cuyo sistema de pesaje depende de material de cuarzo
- Electrnica con platillo fijo en el interior del equipo
-.Electrnica con el platillo en el exterior del aparato
Estas balanzas tiene una capacidad de 100 a 160g, y una precisin de 0.1mg, lo cual es muy til para pesar cantidades pequeas de hormonas, vitaminas y otros microelementos.
CUIDADOS Para lograr un pesaje adecuado sobre todo exacto, se deben observar algunas precauciones indispensables para su buen funcionamiento, como son:
Las balanzas deben estar colocadas sobre una mesa estable, dura y nivelada que impida que las vibraciones y corrientes de aire afecten las pesadas.
Deben estar ubicadas en un lugar limpio
Nunca deben estar sobrecargadas
Nunca debe pesarse directamente sobre el platillo; para tal efecto hay que emplear recipientes ligeros o papel.
Checar continuamente que la balanza este nivelada. En el caso que no lo est, centrar la burbuja con el nivel del aparato.
Evtese desplazarlas del lugar donde fue ubicada en el rea de balanzas, de manera que no se afecte su mecanismo.
MEDIDORES DE pH Para ajustar el pH de los medidores de cultivo se utilizan indicadores de papel y qumicos, pero lo ms conveniente es usar un potencimetro con electrodos de vidrio. El potencimetro no slo se usa para medir el pH de los medio al prepararse, sino tambin para medir el pH de los medios durante el perodo de incubacin. Recientemente se usan aparatos con control automtico de pH para los cultivos en suspensin.
DESTILADOR El agua exenta o con una cantidad mnima de metales pesados es una condicin primordial en el cultivo de tejidos vegetales, Muchos investigadores utilizan agua bidestilada o tridestilada, hecha en destiladores de vidrio de alta calidad o bien combinado el proceso de destilacin por smosis inversa y desmineralizacin. La preparacin. La preparacin de soluciones madre, medios de cultivo, lavado de cristalera, etc., requiere de grandes cantidades de agua, por lo que es necesario tener un destilador grande de metal, tomando en cuenta que el agua obtenida as, contiene una pequea cantidad de iones de metales pesados, condicin que afecta el desarrollo de las clulas en cultivo. Para la obtencin de agua tambin se puede usar un desionizador despus de haberse obtenido el agua en un destilador metal.
Adicionalmente, si se necesita agua completamente exenta de sales, se debe redestilar en su destilador de vidrio de alta calidad.
AGITADOR MAGNTICO Este es un aparato fundamental para la preparacin de los medios de cultivo. Su uso permite la mezcla de los constituyentes del medio durante la elaboracin de las soluciones madre o bien en la preparacin del medio definitivo. Tambin existen diversos modelos, pero su funcionamiento se limita a dos aspectos, agitar, lo cual permite mezclar el soluto con el solvente y con sistema de calentamiento, lo que facilita la disolucin de algunos compuestos que requieren calor para entrar en solucin. El nmero de revoluciones oscila entre 60 hasta 1800 rpm. El nmero de plazas varia de acuerdo al modelo, pero los hay desde un espacio hasta 6.
Complementariamente, se emplean barras magnticas que son las encargadas de realizar la agitacin de las substancias. Las hay de diferente tamao y dimetro; con o sin costilla.



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2.1.3.GENERALIDADES DE MEDIOS CTV

2. 1. 3. generalidades de los medios de cultivo Definicion: Un medio de cultivo es una preparacin o solucin qumicamente definida, donde un explante (con las condiciones de asepsia y cuidado neesario) expresa su potencial intrnseco.
Las plantas que crecen en la naturaleza tienen tres fuentes esenciales para su nutricin. Los nutrientes minerales los obtienen, junto con el agua, desde el suelo a travs del sistema radical. El dixido de carbono atmosfrico es utilizado en el proceso de la fotosntesis para proveer carbono como fuente bsica de energa; por ltimo, el cuerpo de la planta, utiliza los carbohidratos y nutrientes para sintetizar las vitaminas y sustancias de crecimiento esenciales para su crecimiento y desarrollo normal. Los requerimientos para que un tejido vegetal crezca in vitro, en general, son similares a aquellos de las plantas intactas creciendo en la naturaleza. Sin embargo, en la mayora de los casos slo se
cultivan tejidos aislados o una parte pequea de los rganos de la planta; estos tejidos u rganos aislados carecen de la capacidad para sintetizar sus propios carbohidratos, la mayora de las vitaminas, y las sustancias de crecimiento vegetales. Por lo tanto, todas las sustancias que necesitara una planta intacta en la naturaleza deben ser suministradas artificialmente a los tejidos cultivados. El establecimiento y crecimiento exitoso de un tejido vegetal in vitro, generalmente esta determinado por la naturaleza del explante, por la composicin del medio nutritivo, y varios factores ambientales (luz, temperatura, etc.).



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mircoles, 8 de febrero de 2012
2.1.1. EL LABORATORIO
2.1 Medios de cultivo
2. 1. 1. reas del laboratorio de cultivo de tejidos. 2.1.1. AREAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES (CTV) Es el rea donde realizaremos el cultivo in vitro, normalmente esta organizada en cuartos o compartimentos separados, la cantidad, organizacin y disposicin de los mismos vara dependiendo cada laboratorio, y la finalidad del mismo: docencia, investigacin o produccin comercial o una mezcla de ellos. Independiente de la finalidad del laboratorio, podemos ubicar ciertas reas que son comunes: -AREA DE RECEPCION: o sala de recibo, donde el estudiante, investigador o trabajador puede cambiarse de ropa, guardar pertenecas, sentarse con una compu o descansar un rato, es comn que tenga un bao, mesa, silla, un escritorio con computadora. Se considera un rea negra. -AREA DE REACTIVOS: opcional. Es un rea (o un gabinete) donde guardamos las sales y otros reactivos que usamos en el CTV. -AREA DE LAVADO: es aquel lugar donde lavamos los explantes cuando vienen del exterior, asi como platos, frasco y material que se us para preparar los medios. Compuesto minimo con una tarja o fregadero, agua abundante y estantes de secado. -AREA DE PREPARACION DE MEDIOS: En esta rea se preparan los medios de cultivo, debe ser un rea espaciosa con mesas suficientes para la produccin, con puertas separndola de las otras reas, aqu encontramos el material de cristalera necesario para hacer diluciones y aforos (matraces, vasos de precipitado, botellas, probetas, pipetas, etc) en diferentes tamaos, asi mismo balanzas granatarias y de precisin, medidores de pH, parrillas de calentamiento y frascos de cultivo. Es recomendable que se encuentre climatizada. Se considera un rea gris. -AREA DE ESTERILIZACIN. Los medios de cultivos preparados y envasados, deben ser estrilizados en un autoclave, de preferencia esta debe estar en un rea separada. Las autoclaves pueden ser horizontales y verticales o pequeas tipo olla express. -AREA DE SIEMBRA: (INOCULACION, TRASFERENCIA)Es un rea donde extremamos la asepsia, se considera un rea blanca donde encontramos las cmaras de siembra (o campanas) que proporcionan un flujo de aire esteril para que podamos hacer la trasferencia asptica del explante al medio de cultivo (siembra). Debe haber suministro de gas, luz y aire acondicionado.
-AREA DE CRECIMIENTO: (INCUBACION, ESTERIL) tambin es un rea blanca, donde llevamos los medios sembrados con explantes para su crecimiento, debe proveer todas las condiciones para un ptimo crecimiento: luz adecuada, normalmente luz blanca fluorescente; temperatura ptima, un aire acondicionado soluciona esto, y una humead relativa mas bien baja. es comn encontrar algn equipo como mesas de agitacin, o cuartos oscuros (dependiendo el experimento).
-AREA DE RUSTICACION: (ADAPTACION, ACLIMATACION), es un rea fuera del laboratorio, normalmente una casa malla, con posibilidad de controlar la cantidad de luz de forma progresiva y la humedad relativa tambien, el objetivo es ENDURECER las plantitas producidas in vitro y que estn aptas para desarrollarse en el ambiente natural.



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UNIDAD II.
INTRODUCCION
En esta unidad vamos a estudiar las bases del cultivo de tejidos vegetales, veremos sobre la nutricion de las plantas,la fisiologia de las mismas y aplicaremos todo en el cultivo de tejidos, alistate porque vas a cultivar explantes in vitro, tendras que adquirir nuevos conocimientos, recordar lo que sepas de fisiologia y aplicar muchas "formulas" de tus cursos de quimica. uno de losproductos que espero que logremos es instalar asepticamente plantas y que estas crezcan apropiadamente.
OBJETIVO
Conocer el laboratorio, material y equipo mnimo indispensable en la preparacin de los medios de cultivo. Conocer las diferentes tcnicas de esterilizacin y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las caractersticas adecuadas para la seleccin, manejo del explante para la siembra, as como las condiciones de incubacin.



Datos personales
BIOTECNOLOGIA ITCA
UNIDAD II.
INTRODUCCION
En esta unidad vamos a estudiar las bases del cultivo de tejidos vegetales, veremos sobre la nutricion de las plantas,la fisiologia de las mismas y aplicaremos todo en el cultivo de tejidos, alistate porque vas a cultivar explantes in vitro, tendras que adquirir nuevos conocimientos, recordar lo que sepas de fisiologia y aplicar muchas "formulas" de tus cursos de quimica. uno de losproductos que espero que logremos es instalar asepticamente plantas y que estas crezcan apropiadamente.
OBJETIVO
Conocer el laboratorio, material y equipo mnimo indispensable en la preparacin de los medios de cultivo. Conocer las diferentes tcnicas de esterilizacin y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las caractersticas adecuadas para la seleccin, manejo del explante para la siembra, as como las condiciones de incubacin. Publicado por FRANCISCO PUCHE en 17:57 Enviar por correo electrnicoEscribe un blogCompartir con TwitterCompartir con Facebook



Datos personales
2.3.7 TRASPLANTE AL SUSTRATO

20/04/12
2.3.7 TRASPLANTE AL SUSTRATO En el momento en que se extraen los explantes enraizados de los frascos, estn poco adaptados a crecer en un invernculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiracin y prdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecacin del explante. crecer en ambientes tan hmedos tambin suele implicar la falta de una cutcula con cera bien desarrollada, que representa la barrera fsica para evitar la prdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. las plntulas recin enraizadas son sensibles a los cambios ambientales y esto va a depender del xito o el fracaso Mediante aclimatizacion (endurecimiento) entre 4-8 semanas Paulatina y secuencialmente Se controla la luz desde el 20% hasta el 100% Sustrato en las 2 primeras semanas riega ms 25% Hr se mantiene desde 100 normal Se mantiene con nebulizacin Normal se cortan las races de las plantas in vitro .
1. 2. 3. 4. 5. li
ll li j literatura citada www.biotecnologia.culitivo de tejidos vegetales.com

Publicado por helmer martinez c. en 07:13 No hay comentarios: Enviar por correo electrnicoEscribe un blogCompartir con TwitterCompartir con Facebook
MARTES, 24 DE ABRIL DE 2012
2.3.6 CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE

19/04/12 2.3.6 CAMBIOS FISIOLGICOS DEL EXPLANTE
cambios fisiolgicos o sensibilidad, que se expresa como una cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con esterada frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales. La variabilidad fisiolgica en los cultivos de clulas vegetales es la ms fcil de aplicar, debido a la rpida reversibilidad del cambio producido. Los explantes recin enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el xito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatacin. En esta etapa las plantas sufrirn cambios de diferente tipo que permitirn la adaptacin de las mismas a vivir en condiciones naturales.
Los cambios fisiolgicos tambin dependen la adaptacin al medio ambiente, ya que implica la humedad relativa y es de un 70%, esto lleva a la evaporacin y transpiracin de agua en la planta, funcin que realizan (epidermis,
parnquima y estomas) esto para la regulacin del agua tanto entrada como salida; cuando se presenta calor y aire o viento seco es menos viable la adaptacin de la planta al sustrato y principalmente al medio. literatura citada www.lamolina.edu.pe/agronomia/dhorticultura/html/.../chau.doc
2.3.5 CONDICIONES DE INCUBACION

18/04/12 2.3.5 CONDICIONES DE INCUBACION Para las condiciones ambientales de incubacin es conveniente que los cultivos sean incubados en ambientes controlados, en lo que se refiere a la luz y a la temperatura, etc. Se menciona que para que una planta crezca naturalmente necesita de 5,000 a 8,000 Lux, para un cultivo de tejido vegetal y se necesita 2,000 a 2,500 Lux la cual es una cierta medida de luz natural; por el cual se establece una temperatura de 18-25C. Por otro lado la fase gaseosa es nula o es muy poca, ya que la concentracin de CO2 al medio ambiente debe ser de 0.03%. La humedad relativa es la que se encuentra dentro del frasco, presentndose en pequeas gotas adheridas en la pared del mismo, y representa el 100% de la humedad. Cabe mencionar que la humedad in vitro es diferente a la del ambiente natural. En ocasiones se puede presentar un fenmeno llamado vitrificacin este se presenta con el hinchamiento por el exceso de agua en el explante de la planta, y es cuando los tejidos se han sometido en una humedad no factible para los explantes y requiere de una regulacin. Con el paso del tiempo los explantes en subcultivo pierden el poder vegetativo (mutacin) y aumenta las mutaciones (variacin somaclonal). literatura citada www.inia.gob.pe/boletin/BCIT/.../cultivos_de_tejidos_in_vitro.htm
DOMINGO, 22 DE ABRIL DE 2012
2.3.4 SIEMBRA DEL EXPLANTE

18/04/12 2.3.4 SIEMBRA DEL EXPLANTE Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, clulas sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas . El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagacin depende de la especie con la que se est trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir mltiples clones de una forma o variedad con caractersticas especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es til para la produccin de plntulas con una determinada caracterstica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variacin semi natural, es posible obtener nuevas lneas de cultivo. Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferacin de contaminantes biolgicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante y compiten con el mismo deteriorndolo y hacindolo inservible para cultivo Los explantes desinfectados son trasladados a una cmara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizar la transferencia a un medio de cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante est en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cmara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo. Una vez que los explantes luego de algunas semanas en la cmara de crecimiento han desarrollado algunas races y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos ms difciles de la tcnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de
manera heterotrfica (del medio de cultivo) y el estrs de adaptacin a las condiciones de vivero es muy fuerte Un porcentaje de las plntulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece ya en condiciones normales y al cabo de una semanas est lista para ser trasladada al campo de cultivo.
literatura citada http://cultivodevegetales.blogspot.mx/2010/09/explantes.html

MIRCOLES, 18 DE ABRIL DE 2012
2.3.3 EXPLANTE
16/03/12 2.3.3 EXPLANTE Tejido removido de un organismo y transferido para su crecimiento a un medio artificial de nutrientes La eleccin de un Explante apropiado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos, dicha eleccin en parte est determinada por el objetivo a estudiar y la especie vegetal involucrada. El tamao del Explante es otro aspecto que se debe tener en cuenta para el establecimiento de los cultivos; cuanto ms grande sea, mayores son las posibilidades de obtener proliferacin callosa; existe un tamao mnimo para la proliferacin, el efecto del tamao del Explante puede apreciarse en cualquier sistema de cultivo e independientemente de la fuente de donde proviene; su importancia ha sido sealada en cultivos de meristemos, anteras, suspensiones celulares, embriones y protoplastos.
literatura citada http://biotec-esp2011.blogspot.mx/2011/11/establecimiento-de-cultivos-de-tejidos.html

2.3.2 SELECCION DE PLANTAS MADRES

16/03/12 2.3.2 SELECCIN DE PLANTAS MADRES
La seleccin de la planta madre es muy importante, ya que las plantas que van a obtener son idnticas al progenitor (propagacin asexual). Si la planta madre se encuentra enferma, sera deseable conocer el virus especifico presente, pues as las condiciones de cultivo varan, aplicndose termoterapia o simplemente cultivo de meristemos. El tamao del inculo tambin es importante, pues se tienen meristemos que miden de 0.01 a 0.1 mm de dimetro, y pices de tallo que miden de 0.1 a 0.3 mm de dimetro; generalmente el nmero de plntulas libres de virus producidas es inversamente proporcional al tamao del meristemo o pice cultivado. Por ltimo, es importante sealar que el medio de cultivo es un factor esencial, ya que en l juegan un papel vital los requerimientos nutricionales, hormonales y ambientales, especficos de la especie que estemos cultivando; stos deben de ser semejantes a los que se tienen en condiciones naturales. literatura citada http://www.monografias.com/trabajos12/aplicult/aplicult.shtml
2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

12/03/12 2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explanto y termina con la obtencin de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuacin: Eleccin de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparacin y seleccin de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patgenos, deficiencias o estrs). Establecimiento: consiste en la desinfeccin de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptacin al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raz o embrin somtico, segn se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirn ventajosamente con el explanto
Multiplicacin: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneracin del nmero de plantas necesarias. Enraizamiento: es el proceso de induccin de la formacin de races con el fin de convertir alos brotes o embriones somticos en plntulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que slo contenga auxinas. Esta operacin se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solucin concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosntesis para obtener la energa necesaria para desarrollarse y formar las races. Rusticacin: es el paso de aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algn sustrato inerte. El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatacin se logren simultneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantos, asegurando as una conexin vascular, continua entre el vstago y la raz. literatura citada http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_de_tejidos_vegetales
2.3 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS

09/03/12 2.3 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS El establecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro es una tcnica de la Biotecnologa que comprende al conjunto de tcnicas que permiten la manipulacin biolgica de clulas u rganos vivos, con fines de mejoramiento gentico, desarrollo de productos medicinales, investigacin cientfica entre otros. Se afirma que la tcnica de cultivo de tejidos vegetales se origin en el siglo pasado con el reporte del cultivo indefinido de tejidos vegetales de zanahoria (Daucus carota L.) y tabaco (Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii L.) ambos se lograron simultneamente, por primera vez, en 1939 en Francia por Gautheret y Nobecourt y en Una plntula del rbol de hule (Hevea brasiliensis Mll.) desarrollndose en un cultivo in vitro. (Foto CIRAD Francia) EE UU por White. Ambos grupos de investigacin describieron por primera vez la induccin de tejido desdiferenciado (tumores y callos) en estos cultivos y su subsecuente diferenciacin en nuevas plantas. C ello se tuvo por primera vez la capacidad para manipular y potenciar o exacerbar la capacidad multiplicativa de los vegetales bajo condiciones de laboratorio y sin pasar por procesos sexuales, proceso al que se le denomin multiplicacin in vitro. El cultivo de tejidos in vitro comprende, en su acepcin amplia, un heterogneo grupo de tcnicas mediante las cuales un explante (parte separada de un vegetal) se cultiva aspticamente en un medio de composicin qumicamente definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. literatura citada http://biotec-esp2011.blogspot.mx/2011/11/establecimiento-de-cultivos-de-tejidos.html
MARTES, 17 DE ABRIL DE 2012
practica subcultivo (siembra de material ya establecido in-vitro)

25/03/12 INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO BIOTECNOLOGIA APLICADA EN LA BIOLOGA
SUBCULTIVO (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN-VITRO) QUE PRESENTA: ALFREDO ORTIZ MARTNEZ YOLANDA E. MORENO HERNNDEZ HELMER MARTNEZ CASARRUBIAS MA. ALEYDA LPEZ HARRISON
ELIDENE PREZ QUINTANA LAURA ORTEGA TORRES LIC. BIOLOGA CD. ALTAMIRANO, GUERRERO. MXICO. MARZO 23 DEL 2012
AGRADECIMIENTOS
A dios por permitirnos seguir adelante con cada uno de nuestros propsitos con respecto a nuestra carrera, ya que en momentos difciles siempre est para apoyarnos cuando ms lo necesitamos. A nuestros padres ya que sin su apoyo incondicional no estaramos ahora estudiando una licenciatura y la manera de animarnos a seguir estudiando para tener un futuro mejor. A nuestros hermanos que, siempre estn all en las buenas y malas para ayudarnos y darnos nimos de seguir luchando y seguir adelante para cumplir con cada uno de nuestros objetivos. A los que integran este equipo: Alfredo, Yolanda, Helmer, Ma. Aleyda y Elidene, Laura ya que sin la unin y el trabajo en equipo de llevar a cabo esta prctica seria ms tedioso el realizar dicha prctica. A nuestra escuela el IT de Cd Altamirano por facilitarnos el espacio para llevar a cabo cada uno de los procedimientos de investigacin y aprendizaje que se requieren en dicha asignatura, as como el material y equipo de laboratorio que se utiliza en el transcurso de cada prctica. Al M.C. Francisco Javier Puche Acosta por ser nuestro motor de aprendizaje ya que sin su apoyo, la prctica sera muy difcil de llevarla a cabo.
RESUMEN
La presente prctica tuvo como objetivos el manejo apropiado del material vegetal en cmara de flujo y la asimilacin de habilidades en la siembra. Usualmente el cultivo de tejidos in vitro consiste en aislar una porcin de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones fsicas y qumicas apropiadas para que las clulas expresen su potencial de regenerar una planta nueva. Dentro de los puntos bsicos importantes para llevar a cabo dicha prctica para obtener resultados factibles fueron los siguientes: se lavaron los explantes con agua estril y cloralex para desinfestar y as obtener explantes limpios de microorganismos que pudiesen contaminar el medio de cultivo as como el explante, se esteriliz a flama los materiales a utilizar para el sembrado con el fin de eliminar la presencia de microorganismos, cabe mencionar que la esterilizacin form parte central de la prctica pues se tuvo que tener las condiciones de asepsia para evitar al mximo la propagacin de microorganismos no deseados.
ABSTRACT
This practice aimed to proper handling of plant material flow chamber and the assimilation of skills in planting. Usually the in vitro tissue culture is to isolate a portion of the plant (explant) and artificially provide physical and chemical conditions appropriate for the cells to express their potential to regenerate a new plant. Among the important points to carry out this practice to obtain feasible results were as follows: the explants were washed with sterile water and Cloralex to disinfect and clean obtain explants of microorganisms that might contaminate the culture medium and the explant a flame sterilized materials to be used for seeding in order to eliminate the presence of microorganisms, it is noteworthy that the central sterilization formed practice because it had to be aseptic conditions in order to minimize the spread of microorganisms desired.
NDICE
I. II. III. Antecedentes.. 5 - 6 Definicin del problema.7 Objetivos...8 3.1 General 3.2 Especifico Justificacin..9 Fundamento terico10 - 12 Materiales y mtodos..13 Resultados....14 - 18 Conclusiones y recomendaciones....19 Fuentes consultadas...20
IV. V. VI. VII. VIII. IX.
I. ANTECEDENTES
La historia del cultivo in vitro de tejidos vegetales se remonta a unos 200 aos, con la "Teora de la Totipotencia" formulada por Schwann y Schleiden (1838). A partir de esta teora naci el cultivo de tejidos y clulas vegetales. Un siglo despus, Nobcourt, Gautheret y White (1939) consiguieron el primer cultivo de tejidos vegetales autntico in vitro. A partir de se entonces y con los descubrimientos de las fitohormonas auxina y citoquinina (1955), el desarrollo en este campo ha sido meterico. El cultivo in vitro de define como "El cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estriles, de plantas, semillas, embriones, rganos, explante, tejidos, clulas y protoplastos de plantas superiores" (Pierick, 1990). En 1926 dos cientficos japoneses descubrieron un compuesto hormonal, actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudricin en plntulas de arroz. El efecto que
produca dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los tallos, sin desarrollo proporcional de la raz. Actualmente se le atribuyen otros efectos como la induccin de germinacin en semillas, brotacin en algunos tubrculos como la papa. El primero en cultivar tejidos vegetales con xito fue White en 1934, quien logr cultivar pices de races de tomate en medios enriquecidos con sales, azcares y levadura. Demostr adems, la sustitucin de levadura por tres vitaminas del grupo B: Tiamina, Piridoxina y Niacina. En 1939 Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultneamente la formacin de una masa de clulas parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en s el despegue de las tcnicas de cultivo in vitro. Un factor importante en el desarrollo de las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la divisin celular (efecto citocinnico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tena un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).
Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la seleccin, cruzamiento, control de enfermedades y produccin en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales. La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigacin sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combin con las tcnicas bsicas de microbiologa por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estriles para la produccin de microorganismos e identificacin. Desde estas dos fuentes provino la tecnologa por la cual las plantas u rganos de plantas se pueden multiplicar en gran nmero, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeos trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estril.
II. DEFINICIN DE PROBLEMA

La presencia de microorganismos en el material utilizado para cultivo in vitro son el principal factor que pudiese contaminar el medio de cultivo y hacer radicalmente morir a los explantes sembrados.
III. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general Manejo apropiado del material vegetal en cmara de flujo. La asimilacin de habilidades en la siembra. 3.2 Objetivos especficos
Manejar adecuadamente los explantes para su posterior siembra. Conocer las condiciones de asepsia para evitar la contaminacin y propagacin de microorganismos que reduzcan la probabilidad de que explantes tengan un crecimiento ptimo.
Manejar adecuadamente el proceso de esterilizacin de materiales a utilizar para la siembra de explantes in vitro.
IV. JUSTIFICACIN
La presente prctica se llev a cabo con la nica finalidad de conocer la tcnica de cultivo in vitro, as como los procedimientos para realizarla. Cabe mencionar que la tcnica consiste en aislar una porcin de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones fsicas y qumicas apropiadas para que las clulas expresen su potencial intrnseco o inducido. Sin duda alguna el emplear esta tcnica es muy importante pues tiene la ventaja de producir cantidades mximas de plantas e irlas multiplicando con solo extraer un nuevo explante. Es una manera optima de propagar grandes cantidades de plantas, tomando en cuenta las condiciones de asepsia para evitar que el cultivo in vitro pueda contaminarse por la presencia de microorganismos no deseados. La enseanza y el conocimiento ya manejado son influyentes pues es de gran utilidad que el alumno conozca la perfeccin cada uno de los procesos llevados a cabo en cuanto a la tcnica de cultivo in vitro. Acadmicamente contribuye a que no solo estudiantes conozcan la importancia, ventajas y desventajas de la tcnica de cultivo in vitro, sino para que este sea utilizado como tema central de la biotecnologa para llevar a cabo proyectos, investigaciones que se realicen dentro del campo de estudio de biotecnologa, podemos mencionar que es una tcnica que no slo el docente como biotecnologo debe conocer sino que toda la docencia que tiene a su cargo la carrera de biologa debe conocer cules son las nuevas tcnicas para propagar plantas para que tengan conocimiento extenso sobre la biotecnologa.
V. FUNDAMENTO TERICO
El cultivo in vitro consiste en tomar una porcin de una planta (a la que se denominar explante, como por ej. el pice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrin, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estril (usualmente gelificado, semislido) donde se regenerarn una o muchas plantas. El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una tcnica de reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir de un pequeo segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estmulo por medio de variables fsicas y qumicas controladas en un medio de cultivo. La formulacin del medio cambia segn se quiera obtener un tejido des diferenciado (callo), crecer yemas y races, u obtener embriones somticos para producir semillas artificiales. El xito en la propagacin de una planta depender de la posibilidad de expresin de la potencialidad celular total, es decir, que algunas clulas recuperen su condicin meristemtica. A tal fin, debe inducirse primero la des diferenciacin y luego la re diferenciacin celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formacin de las races adventicias en el enraizamiento de estacas, la formacin de yemas adventicias. Uno de los factores ms importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfo gentica deseada es la composicin del medio de cultivo. No existen dudas que en todo intento de propagacin vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carcter del proceso de diferenciacin depende del genoma de la especie, y que est regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiolgico del rgano, tejido o clula puesta en cultivo. Sin embargo, tambin se sabe que ese balance puede
ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la accin de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micro propagacin de una planta. Para llevar adelante el cultivo in vitro, se necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de esterilidad, como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estril, protegiendo as que se desea trabajar. Adems, se necesita un soporte para el explante, que puede ser slido o lquido, y que est conformado por algn agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales que ayudarn a obtener una planta o un rgano en particular, a partir del explante elegido. A diferencia de las tcnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagacin de grandes volmenes de plantas en menor tiempo; as como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la tcnica es de gran utilidad en la obtencin de plantas libres de patgenos; plantas homocigotas, en la produccin de plantas en peligro de extincin, en estudios de ingeniera gentica, etc. El enorme potencial que posee esta metodologa ha propiciado que en los ltimos 25 aos se haya incrementado el nmero de laboratorios de cultivo de tejidos en el pas para la produccin comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estn utilizando como una alternativa viable en sus programas de produccin.
Las nuevas tecnologas han aumentado los mtodos a travs de los cuales las plantas se pueden propagar de manera vegetativa. El cultivador debe decidir que mtodo utilizar su eleccin depender de la velocidad con la que las nuevas plantas se precisen. Una de las alternativas es la utilizacin de las tcnicas de cultivo in vitro de tejidos vegetales. El cultivo in vitro de tejidos vegetales es una definicin genrica que incluye el cultivo de protoplastos, de clulas, de tejidos, de rganos y de plantas. Estos diferentes tipos de cultivos tienen como factor comn el crecimiento en condiciones estriles en un medio nutritivo, generalmente gelificado, y en condiciones ambientales controladas de (temperatura y luz), y por tanto ptimas. La micropropagacin (propagacin clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los mtodos biotecnolgicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura, ya que se la usa en la produccin masiva de especies hortcolas, aromticas, medicinales, frutcolas, ornamentales y forestales. En la actualidad, una gran variedad de plantas se encuentran en peligro de extincin y para tratar de solucionar este problema se han establecido alternativas de conservacin in situ con la declaracin de parques nacionales, naturales, se reserva y bancos de germoplasma. Sin embargo, esta alternativa por s misma resulta ineficiente para algunas especies con semillas recalcitrantes o estara amenazada por desastres naturales, plagas y patgenos. Es por ello que el cultivoin vitro sirve de soporte para coadyuvar a tan ardua conservacin con el resguardo de material clonal por largo tiempo y en un rea relativamente pequea. Los tipos de colecciones in vitro son tres. Uno es el de crecimiento continuo de las colecciones bajo condiciones normales, por medio de una tcnica de cultivo in vitroestndar. El segundo es un crecimiento lento (slow growth), a travs de procedimientos de retardacin. Esto ltimo se puede lograr reduciendo la
temperatura y/o la luz, induciendo estrs osmtico, la desecacin, reduciendo los nutrimentos esenciales en el medio, o incorporando retardadores de crecimiento.
VI. MATERIALES Y MTODOS

6.1 Material necesario para llevar a cabo el cultivo in vitro
Para realizar el cultivo in vitro se necesitaron pinzas, bistures, cajas de Petri, explantes que para este caso lo fue de la planta Manihot esculenta, campana de flujo, alcohol al 70 y 96 %, cloralex, agua estril, frascos de vidrio con su previo medio de cultivo. Sin duda alguna los materiales otorgan ese punto esencial para llevar a cabo cada uno de los procedimientos necesarios para llevar a cabo el cultivo in vitro de plantas. Tomando en cuenta la asepsia y esterilizacin dentro del cultivo in vitro, pues siempre se debe de tomar en cuenta al mximo la esterilizacin de aquellos materiales como pinzas y bistures para poder lograr una higiene adecuada para realizar la siembra del explante en el medio de cultivo.
6.2 Procedimiento para realizar el cultivo in vitro de plantas

Lo primero que se realizo fue desinfectar los explantes con una mezcla de agua estril y cloralex dejando pasar 5 minutos, una vez que pasaron los 5 minutos estos fueron lavados dos veces: el primer lavado se realizo por 1 minuto en agua estril y el segundo lavado se realizo por 5 minutos de igual manera en agua estril y una vez transcurrido el tiempo en cada uno de los lavados este era desechado, posteriormente se tomo con una pinza previamente esterilizada el explante y se coloc en caja de Petri para cortar aquellas partes que estaban quemadas por el cloralex y all mismo con el bistur esterilizado se cortaron las yemas axilares, es decir, los explantes que seran a sembradas en el medio de cultivo, seguidamente los explantes fueron sembrados con ayuda de una pinza la cual se flameaba en cada momento que se realizaba la siembra con el fin de desinfectar y no inducir a que los medios de cultivo se contaminaran, finalmente los frascos fueron sellados con plstico en la parte de la tapadera con el fin de evitar contaminacin.
VII. RESULTADOS
7.1 Cultivo de tejidos in vitro
Para llevar a cabo el cultivo de tejidos in vitro lo primero que se realiz fue esterilizar con alcohol al 70% la campana de flujo para eliminar los microorganismos que pudiesen estar presentes en esta. Posteriormente la persona que se dedic al cultivo in vitro se mantuvo en condiciones ptimas de asepsia para no contaminar los medios de cultivo ni los explantes. Seguidamente se realizaron los siguientes pasos: En un frasco con agua estril y cloralex se agregaron los explantes por 5 minutos haciendo movimientos para desinfestarlos bien. Una vez pasados los 5 minutos se les retiro a los explantes la mezcla de agua estril con cloralex
Posteriormente se realizo el primer lavado de explantes con agua estril por 1 minuto y seguidamente el segundo lavado por 5 minutos con el fin de retirar la mezcla de agua estril y cloralex que pudiese haber quedado Una vez que estos fueron lavados se procedi a cortar aquellas partes que se quemaron con el cloralex, una vez retiradas las partes quemadas se corto con ayuda de un bistur y con la pinza previamente esterilizados a flameo, cada una de las yemas axilares del explante Las yemas axilares obtenidas fueron sembradas al medio de cultivo con ayuda de pinza previamente esterilizada, siendo un total de 12 explantes sembrados Finalmente una vez que los explantes fueron fueron sembrados, se sello con plstico alrededor de la tapa del frasco con el fin de evitar la contaminacin del medio de cultivo y por ende de los explantes.
Fig. 1- a) agregado de cloralex al agua estril para desinfectar los explantes deManihot esculenta, b) preparando los explante para realizar los dos lavados: uno por 1 minuto y el segundo por 5 minutos con el fin de retirar el exceso de
cloralex, c) medio de cultivo con el respectivo explante contaminado por hongos, d) medio de cultivo con el respectivo explante contaminado por bacterias, e) medios de cultivo con sus respectivos explantes libres de hongos y bacterias.
7.2 Cultivos de tejidos in vitro excentos y no excentos de contaminacin por microorganismos

La falta del lugar apropiado para llevar a cabo dicha prctica fue el principal factor por el que 8 de 12 medios de cultivo en los que se cultivo el tejido de Manihot esculenta se contaminaron, mostrando as una cantidad de 5 medios de cultivo contaminado por hongos y 3 medios de cultivo contaminados por bacterias. Cabe mencionar que no slo influyo el hecho de que la campana de flujo estuviese en malas condiciones sino que en la observacin macroscpica que se observo sobre aquellos medios de cultivo contaminados se pudo ver claramente que las bacterias que se encontraban justamente en lo que era el explante indicaba de alguna manera que el explante al ser cultivado ya se encontraba infestado por este tipo de microorganismo.
7.3 Calculo en porcentaje total contaminados por microorganismos
de
medios
de
cultivos
Porcentaje total de medios de cultivo contaminados por hongos 12 ---------- 100% 5 ----------- x (5) (100) 500 X= ------------ = ------ = 41.6% 12 12
Porcentaje total de medios de cultivo contaminados por bacterias 12 ---------- 100% 3 ----------- x (3) (100) 300 X= ------------ = ------ = 25% 12 12 Porcentaje total de medios de cultivo libres de hongos y bacterias
12 ---------- 100% 4 ----------- x (4) (100) 400 X= ------------ = ------ = 33.3% 12 12 Representacin grafica de resultados obtenidos DATOS Medios de cultivo Contaminacin por hongos contaminacin por bacterias Libres de hongos y bacterias Porcentaje total 41.6 % 33.3 % 25 %
VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

El conocimiento y manejo adecuado de cada uno de los procedimientos para realizar el cultivo in vitro es de importancia para no tener errores en cuanto al manejo y siembra de explantes. El cultivo de explantes vegetales es de gran importancia en cuanto a la biotecnologa y la industria, pues por medio del cultivo in vitro se pueden obtener masivas propagaciones de plantas. Se debe de tomar en cuenta que si no se tienen los conocimientos previos y la eficacia de realizar la metodologa adecuada para el cultivo in vitro, tomando en cuenta que la asepsia es indispensable para evitar contaminacin, y si no hay buen manejo de asepsia esta se ver reflejada en aquellos cultivos in vitro que se encuentren contaminados. Se debe de tener buenas prcticas y conocimientos sobre cmo manejar los tejidos vegetales ya que estos estn expuestos a contaminarse. El uso de buenos espacios para realizar el manejo y preparacin de cultivo de tejidos in vitro, hacen de alguna manera la prctica ms eficaz. El conocimiento adecuado sobre el manejo de las condiciones de asepsia y esterilizacin para la preparacin de cultivo de tejidos in vitro contribuye a realizar una prctica ms sencilla y sin errores.
IX. FUENTES CONSULTADAS

Abdelnour Ana & Escalant Jean Vincent. 1994. Conceptos bsicos del cultivo de tejidos vegetales. Ventajas de los cultivos in vitro y factores que intervienen en el cultivo de tejido. Pg. 7-8 Medina Ricardo, Faloci Mirta & colaboradores. Variabilidad Isoenzimtica de plantas de arroz (Oryza sativa L.) regeneradas In viro a partir de callos. Argentina. http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt/agrarias/a-001.pdf M. Roca William, Mroginski Luis A. 1993. Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cultivo in vitro. Colombia. Pg. 20-25
Pginas web consultadas

Consejo argentino para la informacin y el desarrollo de la biotecnologa. 2007. http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1 &note=56 Cultivo in vitro en especies del gnero Pinus.http://www.ilustrados.com/tema/395/Cultivo-vitro-especies-generoPinus.html Historia de cultivo de tejidos. 2007. http://natalymosquera.blogspot.mx/ Segretin Maria Eugenia. Los cultivos celulares y sus aplicaciones (cultivos de clulas vegetales). http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf
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2012 (26) helmer martinez o abril (11) 2.3.7 c. TRASPLANTE AL Ver todo SUSTRATO mi perfil 2.3.6 CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE 2.3.5
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mircoles, 25 de abril de 2012
2.3.7 TRANSPLANTE AL SUSTRATO

2.3.7 TRANSPLANTE AL SUSTRATO
BIBLIOGRAFIA: ANEL MOJICA MACEDO. APUNTES TOMADOS EN CLASE. Publicado por ANNY MOJICA en 19:20 No hay comentarios: Enviar por correo electrnicoEscribe un blogCompartir con TwitterCompartir con Facebook

Los cambios fisiolgicos dependen mucho de las condiciones en que se encuentre la planta, y se expresa como un cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales, algunos de los cambios que sufren las plantas al ser sometidas a diferentes condicion son:
BIBLIOGRAFIA: ANEL MOJICA MACEDO. APUNTES TOMADOS EN CLASE.
Publicado por ANNY MOJICA en 18:49 No hay comentarios: Enviar por correo electrnicoEscribe un blogCompartir con TwitterCompartir con Facebook
2.3.5. CONDICIONES DE INCUBACIN

2.3.5. CONDICIONES DE INCUBACIN Son muchas las condiciones y factores que afectan la capacidad de supervivencia de los explantes, su establecimiento, su habilidad para reproducirse, de regeneracin son varias algunas de las que se deben de tomar en cuenta son las siguientes:
BIBLIOGRAFIA: Luz Marina Montoya.H. Cultivo De Tejidos Vegetales. Editorial EALON. Pag. 13-24.
2.3.4 SIEMBRA DEL EXPLANTE
BIBLIOGRAFIA: ANEL MOJICA MACEDO. APUNTES TOMADOS EN CLASE Y EXPERIENCIA EN PRACTICAS REALIZADAS CON ANTERIORIDAD. Publicado por ANNY MOJICA en 15:30 No hay comentarios: Enviar por correo electrnicoEscribe un blogCompartir con TwitterCompartir con Facebook
lunes, 16 de abril de 2012
2.3.3 EXPLANTE
2.3.3 EXPLANTE
El concepto de explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, races, ptalos, etc.). Con excepcin de los vulos y el polen, los explantes estn constituidos por tejidos y/o clulas somticos. Cuando de extrae un explante de la planta se debe tener en cuenta el tamao, la fuente, la edad fisiolgica del mismo. Bibliografa: http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Manual%20c%20in%20v.pdf
2.3.2 SELECCION DE PLANTAS MADRE

2.3.2 SELECCION DE PLANTAS MADRE
Bibliografia: http://www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/lb/ad/2004/ad_38 2.pdf


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2012 (24) o abril (8) 2.3.7 TRANSPLANTE AL SUSTRATO 2.3.6 CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE 2.3.5. CONDICIONES DE INCUBACIN 2.3.4 SIEMBRA DEL EXPLANTE 2.3.3 EXPLANTE 2.3.2 SELECCION DE PLANTAS MADRE 2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS 2.3 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS o marzo (5) o febrero (11)
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lunes, 5 de marzo de 2012
2.2 ESTERILIZACIN
2.2.1 TIPOS DE ESTERILIZACIN
2.2.2 FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACIN
BIBLIOGRAFA: http://es.wikipedia.org/wiki/Esterilizacin_(microbiolog%C3%ADa)#M.C3.A9todos_qu.C3.ADmicos. 04/03/12, 2:00 PM
Publicado por ANNY MOJICA en 18:02

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2012 (24) o abril (8) o marzo (5) PRACTICA No.4 SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL... PRACTICA No.3 PREPARACIN DE MEDIOS PARA EL CULTI... 2.2 ESTERILIZACIN TAREA 1. MEDIOS DE CULTIVOS DEFINIDOS E INDEFINI... PRACTICA No.2 PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRES o febrero (11)
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viernes, 2 de marzo de 2012
TAREA 1. MEDIOS DE CULTIVOS DEFINIDOS E INDEFINIDOS

SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
TAREA 1. MEDIOS DE CULTIVOS DEFINIDOS E INDEFINIDOS
QUE PRESENTA: ANEL MOJICA MACEDO LICENCIATURA EN BIOLOGA

CIUDAD ALTAMIRANO, GRO. 2 DE MARZO DEL 2012.
OTROS MEDIOS DE CULTIVO QUIMICAMENTE DEFINIDOS
Publicado por ANNY MOJICA en 04:13 Enviar por correo electrnicoEscribe un blogCompartir con TwitterCompartir con Facebook


2012 (24) o abril (8) o marzo (5) PRACTICA No.4 SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL...
PRACTICA No.3 PREPARACIN DE MEDIOS PARA EL CULTI... 2.2 ESTERILIZACIN TAREA 1. MEDIOS DE CULTIVOS DEFINIDOS E INDEFINI... PRACTICA No.2 PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRES
o febrero (11)
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jueves, 1 de marzo de 2012
PRACTICA No.2 PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRES SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA
PRACTICA No.2 PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRES
PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA LIC EN BIOLOGIA VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258) Diana Vely Garca Banderas (08930286) Anel Mojica Macedo (08930287) Mayra Alejandra Nambo Prez (08930349) Berenice Rub Prez Snchez (08930354) Cd. Altamirano, Gro. Mxico. 27 de Febrero del 2012
PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRES

Yeka_rys@hotmail.com; diana_v_eli@hotmail.com; anel_m89@hotamail.com; may_anp1307@hotmail.com; melisa992@hotmail.com
RESUMEN
La presente prctica se realizo en el laboratorio de usos mltiples del Instituto Tecnolgico de Cd. Altamirano Gro. Cuyo objetivo fue conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Qumica y Bioqumica, as como manejar las tcnicas bsicas a travs del uso adecuado de reactivos. Para lo cual se requiri vasos de precipitados, probetas, agua destilada, frascos mbar y reactivos para preparan las distintas soluciones, en nuestro caso se trabajo con la solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos, para ello se pesaron 4.25 g de KH2PO4, 0.155 g de H3B03 y 0.00625 g de Na2MoO42H2O, posteriormente se disolvieron en matraz a 100 ml y por ultimo se aforo a 200 ml con agua destilada. Por lo que se obtuvo una solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos concentrada a 100X, la cual fue etiquetada y guardada a 4 0C. As, esta prctica ser de gran utilidad para la preparacin de medios de cultivo, ya que estas soluciones se encuentran concentradas a 100X y su manejo ser ms fcil y apropiado. Palabras clave:medio de cultivo, reactivos, solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos
Abstract
Thispracticewas held intheMultipurposeLaboratoryTechnological Institute of CiudadAltamiranoGro.Aims to better understandthe different components ofculture mediumand the nature ofChemistry and Biochemistry, and manage the basic techniquesthroughproper use ofreagents. Whichwas requiredforbeakers, test tubes,
distilled water, ambervialsand reagents forpreparingthe various solutions, in our case we workedwith the solution to200mlwith ofphosphates, boratesand distilled water. molybdates, Soas for in100mlflaskand to itweighed4.25 finallydiluted obtain gofKH2PO4,0.155gand0.00625gH3B03Na2MoO42H2Osubsequentlydissolved
asolutionofphosphates,boratesandconcentratedMolybdates100X,whichwas labeledand stored at40C.Thus, this practice will be usefulfor the preparation ofculture media,as these solutionsare concentratedat 100Xand its handlingiseasy andappropriate. Keywords:culture media, reagents, solution ofphosphates, boratesand molybdates.
NDICE
Pg.
Antecedentes.....................5 Definicin del problema..................6 Objetivos........................7 Justificacin.........................8 Fundamento terico.....................9 Materiales y Mtodos....................13 Resultados.........................20 Conclusiones y Recomendaciones............21 Fuentes consultadas..................22 Anexos.........................23
I.
ANTECEDENTES
Un mtodo de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentracin que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentracin final del medio. Su ventaja no estriba slo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino tambin la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos estn tan diluidos en la solucin final, que la pesada que habra que hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de las balanzas de precisin. Las soluciones madre se conservan en frigorfico y en bote topacio durante algunos meses, desechndose ante cualquier seal de precipitacin. Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminocidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el
agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solucin. En el caso de las hormonas es mejor preparar una solucin madre de cada una de ellas y medir volmenes determinados y congelarlos en un frigorfico de 4 estrellas.
II.
DEFINICIN DEL PROBLEMA
Para la preparacin de soluciones madres (medio de cultivo) se debe cumplir con una serie de normas, esto es para cualquier combinacin ya que si no se cumplen como se debe el resultado no ser exitoso, sino un total fracaso y de ser as nuevamente se realizara la preparacin del medio de cultivo. Es por ello que se debe tener un orden y sobre todo mucha concentracin al preparar el medio, pero cabe mencionar que se requiere de un mayor nmero de balanzas analticas debido a que el laboratorio solo cuenta con 2 y 2 no son suficientes ya que se pierde tiempo al esperar que se desocupen las balanzas para continuar con el proceso de preparacin.
III.
3.1 Objetivo general
OBJETIVOS
Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Qumica y Bioqumica.
3.2 Objetivos especficos
Manejar las tcnicas bsicas a travs del uso adecuado de reactivos. Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo.
IV.
JUSTIFICACIN
Esta prctica se realiz con la finalidad de conocer los diferentes componentes de un medio de cultivo as como su naturaleza qumica y bioqumica aunado a esto nos ayudo aprender a determinar los valores y la composicin de una solucin Stock, ya que se debe medir cuidadosamente en trminos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentracin, debido a que durante el desarrollo de cualquier trabajo experimental relacionado con la propagacin in vitro de explantes vegetales, el uso de soluciones Stock se hace indispensable, ya que estas comprenden el balance nutricional de los componentes de un medio de cultivo por lo que es necesario conocer los procedimientos para su elaboracin.
V.
FUNDAMENTO
TERICO
5.1 MEDIO PARA CULTIVAR MATERIAL VEGETAL Son muchos los elementos de un medio para cultivar material vegetal in vitro:
Sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como macronutrientes Vitaminas tales como rivoflavina, tiamina, piridoxina, acido nicotnico, acido pantotenico, biotina y acido flico
Aminocidos tales como L-glutamina, asparagina y cistena Hexitoles como mio-inositol Hormonas y reguladores de crecimiento Fuente de carbono Agente gelificante 5.2 SOLUCIONES MADRE Estas soluciones tienen una concentracin que suele ser de 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentracin final del medio. Su ventaja no estriba solo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino tambin la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos estn diluidos en la solucin final, que la pesada que habra que hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de las balanzas de precisin.Las soluciones madre se conservan en frigorfico y en bote topacio durante algunos meses, desechndose ante cualquier seal de precipitacin. Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales. Aminocidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solucin; Enel caso de las hormonas es mejor preparar una solucin madre de cada una de ellas y medir volmenes determinados y congelarlos en frigorficos de 4 estrellas Las soluciones deben prepararse con mucho cuidado y precisin. Las sales deben pesarse en una balanza granataria (precisin= 0.01 g) y en la balanza analtica se pesaran las vitaminas y reguladores de crecimiento (precisin = 0.0001 g).La conservacin de las soluciones madres se har de 4-5 C. en el refrigerador, es recomendable no prolongar por ms de tres meses la conservacin de las soluciones madres de sales minerales. Las que contengan vitaminas y sustancias de crecimiento estables podrn conservarse un mximo de 4 semanas. 5.3 FORMULACIONES PARA PREPARACION DE SOLUCIONES MADRE
Sales minerals MS (g/l)
(NH4 )NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 FeSO4.7H2O Na2EDTA. 2H2O
1.650 1.900 0.440 0.370 0.170 0.0278 0.0372
MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Mioinositol Tiamina HCl Acido nicotnico PiridoxinaHCl Glicina
0.0169 0.0086 0.0062 0.00083 0.00025 0.000025 0.000025 0.100 0.0001 0.0005 0.0005 0.002
5.4 NORMAS GENERALES A LA HORA DE PESAR Comprobar los clculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre estn expresados para un litro Leer las caractersticas del reactivo que se va a pesar. Algunos son txicos por inhalacin o en contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones. Desde 0.01 g se utilizar la balanza granataria. Para valores inferiores la balanza de precisin. Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se est haciendo la pesada. Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza. Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que est limpia y seca. Es una precaucin que evita la contaminacin de los reactivos Hay que tener la precaucin de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tom. 5.5 NORMAS GENERALES A LA HORA DE PREPARAR LAS DISOLUCIONES
Si la disolucin se va a remover con un agitador mecnico el mejor recipiente es un vaso de precipitados. Si la agitacin es manual, suele ser mejor un erlenmeyer. Antes de empezar a aadir los solutos se deber poner un 70% del volumen total de agua Cuando una disolucin incluya ms de un reactivo, estos se aadirn uno a uno y teniendo la precaucin de no aadir uno hasta que el otro est totalmente disuelto. Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer. Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren los siguientes datos: Tipo de solucin. Ej. Macro de MS
Grado de concentracin. Ej 100 X (100 veces ms concentrada que la solucin final) Componentes con frmula y peso en g/l Fecha de preparacin.
VI.
MATERIALES Y MTODOS
Lapractica tuvo lugar en el laboratorio de usos mltiples perteneciente al Instituto Tecnolgico de Cd. Altamirano. Para poder dar inicio con los procedimientos de esta, primeramente se organizaron lo estudiantes en seis grupos de trabajo, cada grupo prepararon una solucin madre stock de Murashige&Skoog MS. Nuestro equipo trabajo en la preparacin de la solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos; la prctica se desarrollo de la siguiente manera: 6.1Clculos Para Determinar Los Gramos Necesarios De La Solucin De Fosfatos, Boratos Y Molibdato Se Realizaron previamente los clculos necesarios para determinar los gramos exactos que se utilizaron de la solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos.
REACTIVOS COMPONENTES KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4.2H2O NOMBRE Fosfato Monopotsico cido Brico Molibdato De Sodio Dihidratado CANTIDAD EN g/L 0.170 0.062 0.00025
Preparar 200 ml de solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos a una concentracin de 100x 1)Fosfato Monopotsico. KH2PO4 La cantidad utilizada en g/L de este componente es 0.170, esta se multiplic por la concentracin que fue 100x y nos dio como resultado 17g / L. Posteriormente se realizaron clculos mediante una regla de tres
para determinar cuantos gramos utilizaramos para un volumen de 200 mL, se realiz el siguiente procedimiento: 17 g X 1000 mL 200 mL
(200 mL)(17 g) = 1000 mL
3400 g/mL = 3.4g 1000 mL
Teniendo en cuenta que se utilizan 17g para un litro (el cual es equivalente a 1000 mL) a una concentracin de 100x se multiplico el volumen que bamos a emplear 200 mL por 17g y se dividi en 1000 mL obteniendo como resultado 3.4g, este mismo procedimiento se utilizo para los siguientes dos reactivos. 2) cido Brico. 6.2g X H3BO3 1000 mL 200 mL
(200 mL)(6.2 g) = 1000 mL
1200 g/mL = 1.24 g 1000 mL
3) Molibdato De Sodio Dihidratado. Na2MoO4.2H2O 0.025 g X (200 mL)(0.025 g) = 1000 mL 1000 mL 1000 mL 200 mL 5 g/mL = 0.005g
6.2 Procedimiento en laboratorio para la preparacin de la solucin de Fosfatos, Boratos Y Molibdatos. Una vez que se obtuvieron las cantidades de cada componente se procedi en el laboratorio a buscar cada uno de ellos en el rea de reactivos, posteriormente se peso la cantidad que necesitaramos de cada componente en la balanza analtica, se pes 3.4 g de KH2PO4,1.24 g de H3B03 y 0.005 g de Na2MoO42H2O.
Figura 1. Bsqueda e identificacin de fosfatos,
Boratos y Molibdatos.
Figura 2. Componentes de la solucin de cada componente de la solucin
Figura 3. Pesado de KH2PO43.4 g.
Figura 4. Pesado de H3B03 1.24 g.
Figura 5. Pesado de Na2MoO42H2O 0.005 g Contando ya con el peso exacto de cada uno de los componentes, en un matraz de Erlenmeyer se verti 100 mL de agua destilada, despus se agreg cada uno de los componentes, para tener la seguridad de que no quedaran residuos de las sales en los contenedores donde se pesaron se agreg aproximadamente 10 mL de agua para enjuagarlo y se incorporo al matraz, con ayuda de una pipeta se revolvi la solucin hasta que las sales se disolviera perfectamente en el agua destilada. Se vaci en una probeta graduada y se afor a 200 mL, finalmente se verti en una botella color mbar previamente etiquetada con los siguientes datos: nombre de la solucin madre, concentracin y volumen de la misma, nombre del equipo y fecha de preparacin, esta se tap y se refriger a una temperatura de 9 C.
Figura 6.Vertido de agua destilada en un matraz de Erlenmeyer a un volumen aproximado de 100 mL.
Figura 7. Agregado de un componente
de la solucin en agua destilada.
Figura 8. Enjuagado del contenedor
del componente.
Figura 9. Dilucin de los componentes
Figura 10.Vaciado de la solucin
Figura 11. Aforado en probeta a 200 de Fosfatos, Boratos y Molibdatos.
Figura 12. Vertido de solucin madre de Fosfatos, Boratos y Molibdatos en una botella color mbar
VII.
RESULTADOS
Una vez calculados los gramos a pesar para la solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos se obtuvo lo siguiente:
REACTIVOS COMPONENTES KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4.2H2O NOMBRE Fosfato Monopotsico cido Brico Molibdato De Sodio Dihidratado CANTIDAD EN g/L 3.4 g 1.24 g 0.005 g
As que una vez disueltos se obtuvo un solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos concentrada a 100X y lista para la preparacin de medios de cultivo vegetales (MS).
Figura 13. Solucin deFosfatos, Boratos y Molibdatos (100X)
VIII.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
De acuerdo a los resultados de la presente practica se concluye que para obtener los resultados esperados se debe pesar correctamente los reactivos, disolverse en menos agua de la que se pretende aforar esto porque si disolvemos exactamente la cantidad de agua con la que se va aforar a la hora de enjuagar el recipiente la cantidad de agua es mayor y los resultados ya no son los esperados.
De acuerdo a lo antes mencionado se recomienda que los reactivos se acomoden de forma correcta de acuerdo a la sales que estos contengan como nitratos, sulfatos, quelatos, halgenos, etc. esto para encontrar ms rpido los reactivos y no perder tiempo en ello ya que el tiempo de prcticas es muy corto y debe aprovecharse.
IX.
FUENTES CONSULTADAS
v Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa Espaa v http://www.rena.edu.ve/cuartaEtapa/quimica/Tema3.html v http://www.veterinaria-online.com.ar/libros-gratis/preparacion-de-medios-de-cultivo-doc.html v http://florescienciayalgomas.blogspot.com/2009/07/cultivo-in-vitro-preparacion-de.html
X.
ANEXO
En la prctica realizada nos dimos cuenta que el laboratorio de biotecnologa no cuenta con suficientes balanzas analticas las cuales son esenciales para pesar las sustancias a utilizar en los medios de cultivo.
Fig. 1 Balanza analtica Otro aspecto importante es que en el anaquel no se encuentran ordenadas las sustancias, es por ello que se recomienda que se ordenen de manera alfabticamente.
Fig. 2 anaqueles


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BIOTECNOLOGA
sbado, 11 de febrero de 2012
UNIDAD II.
INTRODUCCIN El cultivo de tejidos, como tcnica, consiste esencialmente en aislar una porcin de la planta denominada explante y de manera artificial proporcionarle las condiciones fsicas y qumicas apropiadas para que las clulas expresen su potencial intrnseco o inducido. Los cultivos se deben mantener libres de contaminacin microbiana por lo que es necesario implementar procedimientos de asepsia y esterilizacin. La investigacin en cultivo de tejidos puede cubrir desde una investigacin bsica sobre los procesos bioqumicos y morfolgicos de la diferenciacin celular hasta la que se realiza en aquellos laboratorios que se dedican a la investigacin aplicada en la propagacin clonal, y mejoramiento gentico de plantas. OBJETIVO Conocer el laboratorio, material y equipo mnimo indispensable en la preparacin de los medios de cultivo. Conocer las diferentes tcnicas de esterilizacin y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las caractersticas adecuadas para la seleccin, manejo del explante para la siembra, as como las condiciones de incubacin. Publicado por ANNY MOJICA en 22:02


2012 (24) o abril (8) o marzo (5) o febrero (11) 2.1.6 Preparacin de los medios de Cultivo
2.1.5 Preparacin y manejo de soluciones Stock 2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO 2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PRACTICA No.1 RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABOR... 2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO 2.1 MEDIOS DE CULTIVO UNIDAD II. PRESENTACIN DEL CURSO TEMARIO PORTADA
Datos personales
BIOTECNOLOGA
PORTADA
SEP
SNEST
DGEST
INSTITUTO TECNOLGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
UNIDAD II
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
QUE PRESENTA: ANEL MOJICA MACEDO 08930287 CARRERA: LIC. BIOLOGA
Ciudad Altamirano, Gro. Mxico. Febrero del 2012

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BIOTECNOLOGA
TEMARIO
BIOTECNOLOGA APLICADA
UNIDAD I. INTRODUCCIN
1.1.
Generalidades
1.1.1. Resea histrica de la biotecnologa 1.1.2. Biotecnologa de primera segunda y tercera generacin 1.1.3. Importancia: Econmica, Ecolgica y Agronmica. 1.2. terminologa general de la biotecnologa
2.1 Medios de cultivo 2. 1. 1. reas del laboratorio de cultivo de tejidos. 2. 1. 2. Material y equipo de laboratorio 2. 1. 3. generalidades de los medios de cultivo 2. 1. 4. Componentes del medio de cultivo 2. 1. 5. Preparacin y manejo de soluciones stock. 2. 1. 6. Preparacin de los medios de cultivo. 2. 2. Esterilizacin 2. 2.1. Tipos de esterilizacin
2.2.2. Factores que intervienen en el proceso de esterilizacin. 2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos 2.3.1. Etapas del cultivo de tejidos 2.3.2. Seleccin de plantas madres 2.3.3. Explante 2.3.4. Siembra del explante 2.3.5. Condiciones de incubacin 2.3.6. Cambios fisiolgicos del explante 2.3.7. Trasplante al sustrato
UNIDAD III. TCNICAS IN VITRO EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
3.1. Generalidades 3.2. Micropropagacin 3.3. Plantas libres de patgenos 3.4. Tcnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento 3.4.1. Produccin de haploides: cultivo de anteras y vulos 3.4.2. Variacin somaclonal 3.4.3. Fusin de protoplastos 3.4.4. Aplicacin agrobiologica 3.5 Conservacin In Vitro 3.5.1. aspectos importantes en la conservacin in Vitro 3.5.1.1. Regeneracin 3.5.1.2. Variabilidad 3.5.1.3. Estabilidad gentica 3.5.1.4. Estrategias 3.5.2. Mtodos de conservacin
3.5.2.1. Factores que limitan el crecimiento 3.5.2.2. Supresin del crecimiento 3.5.2.3. Cryoconservacion del germoplasma
UNIDAD IV. DNA RECOMBINANTE
4.1. Transformacin de organismos 4.2. Corte y unin de molculas de ADN 4.2.1. enzimas de corte 4.2.2. enzimas de unin 4.2.3. clonacin de genes 4.2.4. Vectores de clonacin 4.2.5. Tecnologa de ADN Recombinante en la agricultura 4.2.5.1. Plantas transgnicas 4.2.5.2. animales transgnicos 4.3.legislacin 4.4. Biotica y revolucin biotecnolgica
UNIDAD V. TCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR BIOTECNOLGICO
5.1. Tcnicas basadas en PCR y/o electroforesis 5.2. Southern 5.3. Northern 5.4. marcadores moleculares AFLP RAPD MICROSATELITES
SECUENCIAS MITOCONDRIALES SECUENCIAS RIBOSOMALES Otros

2 comentarios:
1. LEND11 de mayo de 2013 14:33 Tienes todo el contenido del temario, o la gua. tengo que meterme un pual para un entrevista de trabajo. Responder
2. LEND11 de mayo de 2013 14:34 Tienes todo el contenido del temario, o la gua. tengo que meterme un pual para un entrevista de trabajo. leivin778@gmail.com Responder


2.1.5 Preparacin y manejo de soluciones Stock 2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO 2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PRACTICA No.1 RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABOR... 2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO 2.1 MEDIOS DE CULTIVO UNIDAD II. PRESENTACIN DEL CURSO TEMARIO
PORTADA
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BIOTECNOLOGA
TEMARIO
BIOTECNOLOGA APLICADA
UNIDAD I. INTRODUCCIN
1.1.
Generalidades
1.1.1. Resea histrica de la biotecnologa 1.1.2. Biotecnologa de primera segunda y tercera generacin 1.1.3. Importancia: Econmica, Ecolgica y Agronmica. 1.2. terminologa general de la biotecnologa
2.1 Medios de cultivo 2. 1. 1. reas del laboratorio de cultivo de tejidos. 2. 1. 2. Material y equipo de laboratorio 2. 1. 3. generalidades de los medios de cultivo 2. 1. 4. Componentes del medio de cultivo 2. 1. 5. Preparacin y manejo de soluciones stock. 2. 1. 6. Preparacin de los medios de cultivo. 2. 2. Esterilizacin 2. 2.1. Tipos de esterilizacin 2.2.2. Factores que intervienen en el proceso de esterilizacin. 2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos 2.3.1. Etapas del cultivo de tejidos 2.3.2. Seleccin de plantas madres 2.3.3. Explante 2.3.4. Siembra del explante 2.3.5. Condiciones de incubacin 2.3.6. Cambios fisiolgicos del explante 2.3.7. Trasplante al sustrato
UNIDAD III. TCNICAS IN VITRO EN EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
3.1. Generalidades 3.2. Micropropagacin 3.3. Plantas libres de patgenos 3.4. Tcnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento 3.4.1. Produccin de haploides: cultivo de anteras y vulos
3.4.2. Variacin somaclonal 3.4.3. Fusin de protoplastos 3.4.4. Aplicacin agrobiologica 3.5 Conservacin In Vitro 3.5.1. aspectos importantes en la conservacin in Vitro 3.5.1.1. Regeneracin 3.5.1.2. Variabilidad 3.5.1.3. Estabilidad gentica 3.5.1.4. Estrategias 3.5.2. Mtodos de conservacin 3.5.2.1. Factores que limitan el crecimiento 3.5.2.2. Supresin del crecimiento 3.5.2.3. Cryoconservacion del germoplasma
UNIDAD IV. DNA RECOMBINANTE
4.1. Transformacin de organismos 4.2. Corte y unin de molculas de ADN 4.2.1. enzimas de corte 4.2.2. enzimas de unin 4.2.3. clonacin de genes 4.2.4. Vectores de clonacin 4.2.5. Tecnologa de ADN Recombinante en la agricultura 4.2.5.1. Plantas transgnicas 4.2.5.2. animales transgnicos 4.3.legislacin 4.4. Biotica y revolucin biotecnolgica
UNIDAD V. TCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR BIOTECNOLGICO
5.1. Tcnicas basadas en PCR y/o electroforesis 5.2. Southern 5.3. Northern 5.4. marcadores moleculares AFLP RAPD MICROSATELITES SECUENCIAS MITOCONDRIALES SECUENCIAS RIBOSOMALES Otros

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1. LEND11 de mayo de 2013 14:33 Tienes todo el contenido del temario, o la gua. tengo que meterme un pual para un entrevista de trabajo. Responder
2. LEND11 de mayo de 2013 14:34 Tienes todo el contenido del temario, o la gua. tengo que meterme un pual para un entrevista de trabajo. leivin778@gmail.com Responder


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BIOTECNOLOGA
PRESENTACIN DEL CURSO

INTRODUCCIN El presente curso de Biotecnologa Aplicada pretende exponer un amplio contenido de los conocimientos para el estudio de las diferentes tcnicas de cultivo que permitan mejorar la eficiencia en la propagacin vegetal, transformacin bacteriana, vegetal y animal, diagnostico y mejoramiento genetico, iniciando con el desarrollo histrico y la
implementacin de los conceptos bsicos ms utilizados en el estudio biotecnolgico. As mismo se realizar un reconocimiento del material, equipo y reactivos en el laboratorio indispensables para la preparacin de los medios de cultivo, se aprender a manejar adecuadamente las tcnicas en cultivo de tejidos vegetales, que servirn para sembrar plantas in vitro. Esto nos permitir conocer la importancia y desarrollo de la ingeniera gentica la cual constituye la Biotecnologa.
OBJETIVO
Adquirir los conocimientos y conocer las limitaciones en la aplicacin de tcnicas biotecnolgicas, para contribuir con el desarrollo regional aplicando tcnicas agrobiotecnolgicas de vanguardia en la propagacin vegetal, transformacin bacteriana, vegetal, animal, diagnostico y mejoramiento.
METODOLOGA
El presente curso ser presentado de manera cronolgica, se publicaran los avances en clases de acuerdo al temario de estudios, de la misma manera se subirn las investigaciones, reportes de prcticas de laboratorio, tareas y exmenes realizados al trmino del estudio de cada unidad, se realizar una conclusin de lo aprendido al concluir cada una.


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BIOTECNOLOGA
mircoles, 15 de febrero de 2012
2.1 MEDIOS DE CULTIVO

2.1 MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es una formulacin qumicamente definida donde los explantes vegetales encuentran las condiciones idneas para desarrollar su potencial intrnseco.
2. 1. 1. REAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS
El laboratorio es un lugar dotado de los medios necesarios para realizar investigaciones, experimentos, prcticas y trabajos de carcter cientfico, tecnolgico o tcnico; el laboratorio de cultivo de tejidos debe disponer de una infraestructura mnima y especializada, as como de reas especificas destinadas al establecimiento, crecimiento y multiplicacin de las plantas, entre otras, que nos permitan realizar las prcticas de manera ordenada y organizada. Las reas o secciones principales en las que se puede dividir un laboratorio son:
REA DE OFICINA: aqu se ubica el mobiliario de oficina como escritorios, archivos y almacenamientos de datos, los libros de referencia y control de laboratorio, as como equipo de computacin y clculo.
REA DE REACTIVOS: es el rea donde se guardan todos los componentes qumicos como sales, reguladores de crecimiento entre otros los cuales se utilizan para la preparacin de los medios de cultivo para vegetales.
REA DE PREPARACIN DE MEDIOS: es utilizada principalmente para preparar los medios de cultivo, debe de contar con un espacio destinado para el almacn de materiales de vidrio, plstico y reactivos qumicos. El material que se encuentra en este espacio incluye mesas de trabajo o experimentacin, vitrinas, estanteras, espacio para la el equipo de refrigeracin, incubadora y cmara de crecimiento.
Equipo y material utilizado en el rea de preparacin:
REA DE LAVADO: debe tenerse un rea de lavado de materiales, la misma debe ser amplia, contar con un lavabo con agua caliente y fra, asi como con un estante de secado.
REA DE ESTERILIZACIN: debe existir una espacio para el autoclave vertical u horizontal, el tamao de este depender del volumen del material que se procese. Esta rea debe incluir espacio para estufas, secadoras y un lavadero de agua fra y caliente.
Equipo y material utilizado en el rea de lavado y esterilizacin:
REA DE TRANSFERENCIA: (SIEMBRA, INOCULACIN), esta rea requiere de los mas altos niveles de asepsia, ya que es aqu donde se realiza el trabajo de excisin, inoculacin y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. De contar con una instalacin de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo presin, estos deben ubicarse alejados de las puertas y corrientes de aire para lograr l vida til de los filtros.
Equipo y material utilizado en el rea de trasferencia:
REA DE INCUBACIN: es donde permanecen los medios sembrados con explantes para su desarrollo y crecimiento. El rea de incubacin debe proporcionar un buen control de la temperatura (20-28C) , la iluminacin, la cual puede ser variable y la humedad relativa. El rea de estar libre de agentes contaminantes para que no intervengan en el crecimiento
del cultivo. En esta rea se debe controlar la temperatura, para lo cual se puede hacer uso de aparatos de aire acondicionado, para evitar el recalentamiento.
Equipo y material utilizado en el rea de incubacin:
REA DE OBSERVACIN Y EXMEN: el objetivo principal de esta rea es realizar observaciones peridicas de los cultivos, por lo cual el material que encontraremos en esta rea sern microscopios ( estreo, compuesto, invertido y otros).
Equipo y material utilizado en el rea de observacin y exmen:
REA DE RUSTICACIN: una vez que se regeneran las plantas en el rea de incubacin se pueden aclimatar o acondicionar, para posteriormente trasplantar en macetas, bandejas o camas apropiadas, estas operaciones se pueden llevar acabo en casa de malla o invernaderos donde se puedan controlar los diferentes parmetros como la cantidad de luz, humedad relativa, temperatura entre otros con la finalidad de que las plantas que se produjeron de manera in vitro se desarrollen ptimamente y estn aptas para su desarrollo y adaptacin al medio natural .
REAS DE CURANTENA Y CONTROL FITOSANITARIO: es el rea de recepcin de las muestras o plantas destinadas a la limpieza clonal, el rea de cuarentena debe estar separada del resto del laboratorio, pero cerca al rea de control fitosanitario la cual se encarga de realizar las pruebas necesarias para comprobar la sanidad del material vegetal, especialmente de enfermedades causadas por virus, bacterias y hongos.
BIBLIOGRAFA ROCA, M.W. 1991, CULTIVO DE TEJIDOS EN LA AGRICULTURA FUNDAMENTOS Y APLICACIONES, EDIT. XYZ, CALI COLOMBIA. PAGINAS. 3-7.
2 comentarios:
1. Marlene Mendez15 de junio de 2013 09:12
me sirvio de mucho para mi trabajo graciias por tu ayuda...

Responder
2. diseo experimentales25 de junio de 2013 16:12
muy bueno tu blog me va servir para prepararme para el examen de titulacion de la carrera de agronomia gracias
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BIOTECNOLOGA
lunes, 20 de febrero de 2012
2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
Para el desarrollo de la investigacin y docencia, en el campo del cultivo de tejidos, se requieren de materiales que permitan la preparacin de frmulas nutrimentales con el objetivo de cultivar tejidos, rganos y clulas vegetales in vitro. Es muy importante que los materiales y equipos de uso comn en el laboratorio se identifiquen por su nombre correcto y uso especifico que tiene cada uno, pero mas importante es saber manejarlo correctamente en el momento oportuno, teniendo en cuenta los cuidados y normas especiales para el uso de aquellos que as lo requieran. Los instrumentos y tiles de laboratorio estn constituidos de materiales diversos y se clasifican de la siguiente manera:
MATERIAL DE VIDRIO
El instrumental de vidrio usado para realizar investigaciones o reacciones qumicas debe ser fabricado con materiales resistentes a la accin de los agentes qumicos. Se utiliza bastante material de vidrio en la preparacin de medio de cultivo y en la siembra de tejidos vegetales. El material que se seleccione deber ser de alta calidad, resistente a altas temperaturas y a cidos y no liberar sustancia alguna, especialmente aqulla que es utilizada en la conservacin de soluciones madres. El vidrio corriente no sirve para la fabricacin de instrumentos de laboratorio por ser muy frgil y vulnerable a los agentes qumicos y fsicos. Por tal razn se construyen de cristal de vidrio, pudiendo ser este de vidrio grueso o delgado.
INSTRUMENTOS Y APARATOS
Para el cultivo de tejidos hay pocos aparatos e instrumentos diseados especialmente para este propsito. Sin embargo, se pueden escoger varios instrumentos mdicos, as como tambin muchos aparatos de microbiologa.
BIBLIOGRAFA:
ROCA, M.W. 1991, CULTIVO DE TEJIDOS EN LA AGRICULTURA FUNDAMENTOS Y APLICACIONES, EDIT. XYZ, CALI COLOMBIA. PAGINAS. 7- 10.
http://es.scribd.com/doc/3246492/Material-de-laboratorio


2012 (24)
o abril (8) o marzo (5) o febrero (11) 2.1.6 Preparacin de los medios de Cultivo
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BIOTECNOLOGA
PRACTICA No.1 RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABORATORIO
SNEST
DGEST
PRACTICA No.1
RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA LIC EN BIOLOGIA VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258) Diana Vely Garca Banderas (08930286) Anel mojica macedo (08930287) Mayra Alejandra Nambo Prez (08930349) Berenice Rub Prez Snchez (08930354)
Cd. Altamirano, Gro. Mxico. 20 de Febrero del 2012.
RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

Yeka_rys@hotmail.com; diana_v_eli@hotmail.com; anel_m89@hotamail.com; may_anp1307@hotmail.com; melisa992 @hotmail.com
RESUMEN
La presente prctica se realizo en el laboratorio de cultivo de tejidos del Instituto Tecnolgico de Cd. Altamirano con el objetivo de conocer las diferentes reas y equipos bsicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio, para lo ello se hizo un recorrido por el laboratorio, describiendo donde se encontraba cada rea y los materiales y equipos que hay en cada una de ellas. El resultado de esto fue conocer como est organizado el laboratorio de cultivo de tejidos as como las funciones de las reas, que reactivos se encuentran en ellas y cul es el cuidado, manejo y mantenimiento de las reas. Con esto se puede concluir que al conocer todo el funcionamiento de este laboratorio se podrn realizar las prcticas de manera adecuada y esto har que se tengan los resultados deseados.
Palabras clave: Laboratorio, cultivo de tejidos vegetales, reactivos
INDICE
Pg. Antecedentes..4 Definicin del problema....5 Objetivos...6 Justificacin.7 Fundamento terico..8 Materiales y Mtodos.14 Resultados..16 Conclusiones y Recomendaciones.24 Fuentes consultadas.25 Anexos26
I.
ANTECEDENTES
El laboratorio es un lugar dotado de los medios necesarios para realizar investigaciones, experimentos, prcticas y trabajos de carcter cientfico, tecnolgico o tcnico; est equipado coninstrumentos de medida o equipos con que se realizan experimentos, investigaciones o prcticas diversas, segn la rama de la ciencia a la que se dedique. Tambin puede ser un aula o dependencia de cualquier centro
docente, acondicionada para el desarrollo de clases prcticas y otros trabajos relacionados con la enseanza. Su importancia, sea en investigaciones o a escala industrial y en cualquiera de sus especialidades (qumica, dimensional, electricidad, biologa, etc.), radica en el hecho de que las condiciones ambientales estn controladas y normalizadas, de modo que se puede asegurar que no se producen influencias extraas (a las conocidas o previstas) que alteren el resultado del experimento o medicin: control. De igual forma garantiza que el experimento o medicin es repetible, es decir, cualquier otro laboratorio podra repetir el proceso y obtener el mismo resultado: normalizacin. La historia de los laboratorios est influida por la historia de la medicina, ya que el hombre, al profundizar acerca de cmo es su organismo, ha requerido el uso de laboratorios cada vez ms especializados para poder demostrar cientficamente y de manera practica como se llevan acabo los diferentes procesos fisiolgicos de los seres vivos.
II.
El laboratorio requiere de reas especficas para cada uno de los materiales y equipos, ya que cabe mencionar que algunos de estos no estan en un espacio adecuado. Pero sobre todo hace falta que se refuerce de materiales para contar completamente con un laboratorio bien equipado ya que debido a ciertas razones econmicas la escuela no cuenta con el apoyo necesario para su obtencin de estos. Por lo tanto es necesario buscar una solucin para que los materiales se ubiquen en reas de acuerdo a su funcin, teniendo su propio lugar correspondiente.
III. OBJETIVOS
Conocer las reas del laboratorio de cultivo de tejidos
3.2 Objetivos especficos
Conocer las diferentes reas y equipos bsicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. Conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio
IV.
JUSTIFICACION
Esta prctica se realizo con la finalidad de reconocer el material de laboratorio que se utilizara en esta unidad temtica, es de gran importancia reconocer e identificar los diferentes instrumentos o herramientas de laboratorio, ya que de esta manera seremos capaces de utilizarlos adecuadamente y tambin de llamarlos por su nombre y conocer su utilidad, tambin es importante mencionar que el laboratorio puede ser dividido en diferentes reas como son rea de preparacin, rea lavado, siembra, crecimiento y aclimatacin, cabe mencionar que el laboratorio no est divido por reas y que no presentas los equipos necesarios que pueden llagar a utilizarse.
V.
FUNDAMENTO TEORICO
V.I Cultivo de tejidos vegetales

El punto de partida para el cultivo de tejidos es la iniciacin. Este es el proceso por el cual se trae material vegetal in vivo en un medio de cultivo estril. Requiere la diseccin microscpica de la planta bajo condiciones estrictamente higinicas con el propsito de transferir su punto de crecimiento o tejido que crece activamente (los tejidos meristemticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estril sin introducir microorganismos contaminantes. Las clulas y tejidos que crecern y se desarrollarn desde este inicio depender de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las clulas conformarn una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarn presentes otras estructuras reconocibles como tallos, rganos, races, bulbos u otros rganos. El cultivo de tejidos vegetales, es una tcnica de reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir de un pequeo segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estmulo por medio de variables fsicas y qumicas controladas en un medio de cultivo.
V.II Crecimiento de tejido vegetal

Estos tejidos in vitro estn ahora dentro de un microcosmos estril de un recipiente de vidrio o de plstico; y son protegidos del medio exterior no estril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecer oportunamente a una velocidad mucho ms rpida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarn y matarn a los tejidos; Con el propsito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es cultivar los tejidos, deben darse adems ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio lquido. Ellos tambin necesitarn de un suministro
de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, tambin posiblemente algunas vitaminas, azcares como fuente de energa y un cocktail de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Es conveniente preparar este medio ambiente nutricional incorporando estos compuestos qumicos dentro del gel o lquido, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando este medio de cultivo ya sea dentro del recipiente para cultivo o en uno separado.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz, pero a intensidades muy bajas, mucho ms que la de la luz solar. La acumulacin en las plantas de la energa de los carbohidratos provendr de los azcares agregados al medio, ms que de la fotosntesis, de manera que son innecesarios unos altos niveles de luz.
V.III reas de laboratorio de cultivo de tejidos

El laboratorio de cultivo de tejidos vegetales debe tener reas para las diferentes funciones que en l se desarrollen entre ellas estn:
rea de preparacin.- utilizada para preparar los medios de cultivo, la cual debe tener un espacio para poner los materiales de vidrio, plsticos y reactivos
rea de lavado.- debe incluir un lavadero con agua caliente y fra, su fuente de agua debe tener alto grado de pureza y debe tener basureros para depositar el material vegetal, inorgnico y de vidrio que sea desechado
rea de esterilizacin.- debe tener espacio para la autoclave la cual puede ser pequea o grande segn el volumen del material que se procese. Tambin debe incluir espacio para estufas y secadores
rea de transferencia.- se realiza el trabajo de excisin, inoculacin y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. En esta rea se demandan altos niveles de limpieza por lo que se debe tener gabinetes de flujo laminar
rea de incubacin.- esta rea debe contar con un buen control de la temperatura, iluminacin y humedad relativa; se instalan estantes para colocar los cultivos, adems de que esta rea debe tener buena distribucin de aire
rea de observacin.- su objetivo es realizar observaciones peridicas de los cultivos tanto en medios semislidos como en lquidos. En esta se encuentran los microscopios
rea de crecimiento.- las plantas generadas en el rea de incubacin se pueden acondicionar y luego trasplantar en masetas estas se pueden llevar a cabo en casas de malla o invernadero dependiendo de las condiciones donde se ubique el laboratorio
V.IV Equipo de laboratorio

En el rea de preparacin: refrigerador, balanzas (una macrobalanzas y una de precisin), potencimetro, plancha elctrica con agitador magntico, frascos (125, 250 y 500 ml), botellas y material de vidrio o plstico
En el rea de lavado y esterilizacin: Autoclave manual o automtico, destilador de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plstico de vario tamaos, recipientes de plstico grandes, estufas para esterilizacin y secado.
En el rea de trasferencia: gabinete de flujo laminar, microscopio de diseccin con luz incidente y instrumentos de diseccin: cuchillas, mangos para cuchillas, aguja de diseccin, pinzas, tijeras, navaja de afeitar
Tambin se necesitan frascos con alcohol, mechero de alcohol, mascas, guantes, marcadores a prueba de agua, bandejas, y taco para basuras.
En el rea de incubacin: un cuarto con temperatura, iluminacin y humedad relativa controladas; estanteras con iluminacin para los cultivos, bandejas, termmetros de mxima y mnima y gradillas para tubos de varios tamaos.
En el rea de examinacin: microscopio estereoscopio, microscopio compuesto, lentes de aumentos, y elementos ptico complementarios.
En el rea de crecimiento en vivo: macetas, suelo, bandejas, cmaras de alta humedad
V.V Requerimientos para una buena tcnica de cultivo de tejidos
Uno de los requisitos bsico para el xito de la tcnica de cultivo de tejidos es mantener los cultivos libres de microorganismos contaminadores: Los Tejidos: Puede ser til la inclusin de fungistticos y bacteriostticos en el medio de cultivo; el sulfato de gentamicina, la penicilina y el sulfato de estreptomicina (10 a 50 mg/litro), son algunos de los productos de amplio espectro que se pueden usar. El tratamiento de las plantas donantes del explante por medio de altas temperaturas (35 a 40oC) tambin es efectivo para la obtencin de segmentos de tejido libres de bacterias y hongos sistmicos. Los instrumentos: los instrumentos de trabajo se deben esterilizar antes de usarlo. Lo ms aconsejable es trabajar con varios juegos de las misma herramientas y mantener la asepsia de las que se han usado, colocando es los instrumentos en alcohol etlico al 70% de 2 a 3 minutos, y flamendolos. El exterior de los recipientes de cultivo: existe la posibilidad de que, durante el tempo trascurrido entres la esterilizacin de los recipientes con los medios de cultivo y el momento de usarlo se localicen en su exterior ciertos contaminadores, de tal manera que se mantenga estril solo el interior de los tubos; por lo tanto, se debe flamear obligatoriamente la boca de cada tubo antes y despus de sembrar el explante. El investigador: El investigador es una fuente primaria de contaminadores.
El uso de batas de laboratorio y de guantes limpios y la proteccin del cabello, la boca y la nariz reducen la contaminacin. Las batas limpias y las mascaras son necesarias sobe todos cuando se trabaja en un laboratorio de flujo laminar de aire. Es esencial que los investigador se limpie bien las manos y los brazos (lavndolo con jabn y agua y enjugndolo con alcohol al 70%) antes de iniciar una seccin de trabajo.
VI. MATERIALES Y MTODOS

Esta prctica se llev a cabo el da lunes 13 de febrero del ao en curso a partir de las 7: 00 a 8:00 A.M. en el laboratorio de microbiologa, dicha prctica lleva por nombre reconocimiento del laboratorio de cultivo de tejidos. Antes de realizar la prctica los materiales requeridos para llevarla a cabo fueron: una cmara fotogrfica la cual es para tomar evidencias de dicha prctica, un lpiz con que anotar y una libreta para anotar. Durante esta prctica una vez contando con el material a ocupar, lo primero que se realizo fue una pequea definicin por parte del docente de lo que es un laboratorio, y los materiales que se deben encontrar dentro de l. Pues bien, posteriormente estando dentro del laboratorio se mencion que este debe contar principalmente con mesas las cuales sirven para la preparacin de los medios de cultivo, dichas mesas se encuentran distribuidas en una rea adecuada para trabajar que estan ubicadas de la entrada hacia al frente. Adems tambin cuenta con una rea de transferencia y siembra, est contando principalmente con una cmara de flujo laminar. Una vez observada el rea de transferencia y siembra, se hizo un pequeo recorrido en donde al lado izquierdo de las mesas se mostr la olla de presin para la esterilizacin de los materiales que se utilizan en las prcticas, materiales tales como son: cajas de Petri, matraz Erlen Meyer, vasos de precipitados y materiales que se puedan esterilizar mediante la olla de presin. Dando unos cuantos pasos ms hacia al fondo nos encontramos con el rea de esterilizacin en donde se observ el autoclave vertical.
Saliendo del rea de esterilizacin se mostr el refrigerador en el cual contiene algunas soluciones concentradas como son las vitaminas y hormonas, mencionando que no es el rea adecuada donde est ubicado ya que esta donde se encuentra dentro de lo que es el rea de lavado. A un costado del refrigerador se localiza el rea de cristalera en donde pues sin duda alguna van todo material de cristal. Mencionando algunos as como lo son los tubos de ensayo, probetas, cajas de Petri porta objetos y cubre objetos. Continuando con el recorrido se mostr el rea de reactivos, en donde pues ms que nada como su nombre lo dice se encuentra gran variedad de reactivos, adems de eso se encuentran tambin los microscopios y estereoscopios los cuales son de gran utilidad para la observacin de las muestras. Una vez estando en dicha rea se hizo un parntesis para dialogar sobre un mueble que se encuentra ubicada en esa rea, esta conversacin se hizo con el motivo de ver la forma de que ese muebla se convierta en una vitrina para darle uso adecuado. Tambin dicho laboratorio cuenta con un rea de lavado y escurridores para escurrir el material una vez que este se ha dado una limpieza.
Finamente una vez que se termin la observacin, se discuti sobre cul sera el lugar apropiado para el rea de incubacin tomando en cuenta los factores fsico-qumicos. Y Se dio fin a esta prctica.
VII. RESULTADOS
Los resultados de esta prctica fueron satisfactorios ya que durante el recorrido que se puedo observar, reconocer e identificar, cada una de las reas del laboratorio as como los diversos materiales, reactivos y equipos de uso comn existentes en cada una de ellas, adems se defini y describi el uso del material. Dentro del laboratorio se reconocieron las siguientes reas: REA DE PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS: se utiliza principalmente para preparas los medios de cultivo, cuenta con mesas de trabajo para la elaboracin de los mismos. Para trabajar adecuadamente se deben mantener libres de cualquier contaminante por lo cual antes de su uso se deben esterilizar, estas mesas tienen integrada un rea de lavado, tubos conductores de gas y agua. Cuenta con una balanza analtica la cual nos permitir realizar con precisin el pesado de los reactivos a utilizar, as como con un refrigerador, este se utiliza para guardar y mantener en buen estado los medios de cultivo.
Figura 1. Mesa de trabajo.
Figura 2. Alanaza analtica.
Figura 3. Refrigerador.
REA DE REACTIVOS: se encuentran localizados en estantes, algunos se encuentran junto al material de cristalera. Dentro de los reactivos podemos encontrar compuestos inorgnicos como sales y compuestos orgnicos entre los mas importantes tenemos los reguladores de crecimiento ( auxinas, citocininas y giberelinas ), vitaminas, carbohidratos y aminocidos los cuales son primordiales para el crecimiento de las plantas en un cultivo in vitro. En esta rea se debe tener mucho cuidado al hacer una seleccin de los reactivos a utilizar en determinada practica, ya que de caso contrario los resultados que se obtengan no sern los deseados y se har uso intil de estos, algunos de ellos o en su mayora son muy costosos por tal razn se debe tener total precaucin a la hora de su utilizacin.
Figura 4. Estante de reactivos.
REA DE LAVADO Y ESTERILIZACIN: esta rea cuenta con varios lavaderos con agua fra no se cuenta con agua caliente, existe jabn y esponjas para el lavado de materiales, as como con escurridores y charolas metlicas y de plstico que se utilizan para colocar el material despus del lavado. Para la esterilizacin se utiliza la autoclave pequea (olla de presin) y hay en existencia autoclaves verticales las cuales tienen mayor capacidad para material, se cuenta con una estufa.
Figura 5. rea de lavado y escurridores de material.
Figura 6. olla de presin y estufa.
Figura 7. Autoclave Vertical.
REA DE TRANSFERENCIA Y SIEMBRA: en esta rea se realiza el trabajo de excisin, inoculacin y transferencia de los explante a los medios de cultivo, el material que se observ en esta rea es la campana de flujo laminar la cual esta diseada para extraer eficientemente txicos, nocivos y otros materiales dainos del rea de trabajo y de esta manera evitar la contaminacin a la hora de la siembra, ya que esta actividad demanda los mas altos niveles de limpieza ambiental. Antes del uso de la campana de flujo laminar se debe desinfectar con alcohol y algodn. Se localizan tambin microscopios y estereoscopios los cuales nos ayudaran en la funcin de seleccionar los mejores explantes vegetales mediante la observacin de sus caractersticas microscpicas, para poder realizar la siembra del mejor.
Figura 9. Campana de flujo laminar. REA DE INCUBACION Y CRECIENTO: el rea de incubacin o crecimiento aun no se encuentra totalmente estructurada ya que debido a que este laboratorio era de usos mltiples, no exista suficiente espacio, ni el lugar con las condiciones adecuadas para esta rea. Por lo que se opto por elegir y acondicionar un espacio donde se pudiera tener ms eficiencia en el control ambiental (temperatura, iluminacin, humedad relativa y aislamiento) para el ptimo crecimiento de los explantes en el medio cultivo.
Figura 10. Espacio a acondicionar para rea de incubacin y crecimiento.
REA DE OFICINA: dentro del rea de oficina se observ un escritorio, equipo de computo y archivos de documentos relacionados con el las practicas de laboratorio. Normatividad del laboratorio Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad. Utilizar una bata y tenerla siempre bien abrochada, as proteger la ropa y cuerpo de algn derrame de sustancia peligrosas y dems accidentes. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material.
Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por su pared. Cuando se quiera diluir un cido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: cido sobre agua. Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco.
Es indispensable cumplir con cada una de las normas establecidas anteriormente para poder llevar acabo la practica de una manera adecuada y segura. Ya que de esta manera se podrn evitar accidentes y obtener mejores resultados en cuanto al uso de las diferentes reas que constituyen el laboratorio.
VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
De acuerdo a lo encontrado en el laboratorio de usos mltiples del Instituto Tecnolgico de Cd. Altamirano se puede deducir que este no cuenta con todas las reas adecuadas para realizar cultivos de tejidos vegetales, esto debido a que no se cuenta con el suficiente espacio, equipamiento y los reactivos y sustancias existentes no se encuentran ordenadas de una forma adecuada, adems de que las condiciones en este no son controladas por ejemplo la intensidad de la luz y la temperatura, factores que resultan muy importantes en el cultivo de tejidos. Se pudo observar que en el rea de preparacin, lavado y esterilizacin no hay mucho problema porque se ajusta a las necesidades, mientras que el rea de incubacin aun no se encuentra definida ya que cultivos que se han realizado se colocan solamente en reas estratgicas para su incubacin, hecho que puede ser muy significativo en el desarrollo de algn explante.
Una vez mencionado la anterior podemos recomendar futuras alternativas o propuestas para ser realizadas en un tiempo no muy lejano ya que pueden ser muy tiles para la realizacin de prcticas futuras. Como ya se dijo el rea de incubacin es el principal
problema en el laboratorio, as que como el rea donde se encuentran los reactivos y sustancias es la mas apartada del laboratorio y por lo tanto menos transitada se recomienda establecer el rea de incubacin en ese cuarto, claro no es necesario desalojarlo en su totalidad, solo es cuestin de realizar un espacio en la parte del fondo para colocar un anaquel en ese lugar, otra opcin puede ser la compra e instalacin de laminas de acrlico a una pequea vitrina, para incubar dentro los futuros cultivos de tejidos vegetales. Es recomendable traer material de vidrio como botellas de litro color mbar para guardar las soluciones que se puedan preparar.

BOTTI, C. I. 1992. La produccin de plantas in vitro. Guayaquil (Ec.), PROEXANT AGRIDEC/ CHEMINICS. HURTADO, D. V. ; MERINO, M. E. 1988. Cultivo de tejidos vegetales. 1 reimpresin. Mxico, Trillas S. A. 132 p. PIERIK, R. L. M. 1990. Cultivo in vitro de plantas superiores. Trad por Luis Ayerbe Mateo Sagasta. Madrid, Mundi Prensa. 326 p. ROSELL C. H; VILLALOBOS, V. M. 1990. Fundamentos tericos prcticos del cultivo de tejidos vegetales. Roma, FAO. 112 p. VILLALOBOS, V. M. 1990. Fundamentos tericos prcticos del cultivo de tejidos vegetales. Mxico, Colegio de Postgrado Centro gentico.
X.
ANEXOS
Debido a que en la prctica realizada se encontr con que no se cuentan con las reas de laboratorio requeridas para el cultivo de tejidos vegetales es recomendable adquirir el siguiente material para acondicionar el rea de incubacion:
Figura 1. Anaquel de 6 charolas. Anaquel con entrepaos de 1. 00 x 40cm y 4 postes de 2. 20cm, buen calibre, resistentes y aguantadores en color gris cuyo precio es de 370.00 en el D.F Tambin seria de gran utilidad la compra de lminas de acrlico para el acondicionamiento de un estante para la incubacin de cultivos.


2012 (24) o abril (8)
o marzo (5) o febrero (11) 2.1.6 Preparacin de los medios de Cultivo

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BIOTECNOLOGA
2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo se puede determinar, como solucin o formulacin qumicamente definida, donde un explante encuentra las condiciones adecuadas para desarrollar su potencial intrnseco. Las clulas vegetales requieren gran variedad de nutrimientos orgnicos e inorgnicos, para desarrollarse, ambos nutrimentos se requieren en dos niveles: uno macro y otro micro. El primer objetivo en la preparacin de un medio de cultivo es suministrar los nutrimentos minerales en concentraciones adecuadas. Se debe
incluir macro elementos ( C, H, O, P, K, N, S, Ca Y Mg ) y los microelementos ( B, Zn, Mn, Cu, Mo, Fe, Cl ).
Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo in vitro de clulas, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones y lograr la micropropagacin, etc. Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y especficos cuya presencia y concentracin estar en dependencia del objetivo que se persiga en su utilizacin. As, los medios de cultivo pueden ser lquidos o tener un soporte slido, tienen sustancias minerales, vitaminas, aminocidos, azcares, fitohormonas, etc.
BIBLIOGRAFA
ROCA, M.W. 1991, CULTIVO DE TEJIDOS EN LA AGRICULTURA FUNDAMENTOS Y APLICACIONES, EDIT. XYZ, CALI COLOMBIA. PAGINAS. 43 - 45
http://natalymosquera.blogspot.com/


2.1.5 Preparacin y manejo de soluciones Stock 2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO 2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PRACTICA No.1 RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABOR... 2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO 2.1 MEDIOS DE CULTIVO UNIDAD II.
PRESENTACIN DEL CURSO TEMARIO PORTADA
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2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las clulas vegetales puedan desarrollarse con normalidad, entre sus componentes encontramos:
SALES INORGNICAS Macronutrientes
Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.
Nitrgeno (N): forma parte de aminocidos, vitaminas, protenas y cidos nucleco.
Magnesio (Mg): es parte de la molcula de clorofila y de los ribosomas.
Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento.
Fosforo (P): Forma parte de las molculas que almacenan y transfieren la energa qumica de los cidos nucleicos, de este depende la energa celular.
Potasio (K): Desempea un papel importante en la regulacin osmtica y en la actividad enzimtica.
Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminocidos.
Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halfilas y en plantas cuyos productos fotosintticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (Garca, 2000).
Micronutrientes
Estos micronutrientes son importantes en las clulas vegetales, ya que al adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeas permite que las sales madres sean mas eficaz para el medio de cultivo.
Hierro (Fe): forma el ncleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.
Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa
Manganeso (Mn): induce a la sntesis de clorofila, se requiere para la formacin del O2 en la fotosntesis.
Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica, involucrado en la sntesis de bases nitrogenadas como el uracilo. Cobre (Cu): permite la oxidacin respiratoria final, esta ligado al proceso de lignificacin.
Zinc (Zn): requerido para la oxidacin e hidroxilacin de compuestos fenolicos.
Cobalto (Co): componente de la vitamina B12
Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolucin del O2 en la fotosntesis. (Garca, 2000).
FUENTES DE CARBONO
Normalmente para el cultivo in vitro de clulas, tejidos u rganos es necesario adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosntesis o incluso en oscuridad.
La sacarosa es la ms utilizada para propsitos de Micropropagacion.
Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aqu es convertida rpidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa. El azcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar adecuado para la Micropropagacin en muchos casos. Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales:
Son fuentes de energa. Mantienen en el medio un potencial osmtico determinado.
VITAMINAS
La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero aparentemente lo hacen en cantidades infraptimas. Para lograr un buen crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o ms vitaminas. La tiamina (B1) es la que ms se utiliza y se la considera un ingrediente esencial. Otras vitaminas tambin han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in vitro, como son: pidiroxina (B6), cido nicotnico (B3), pantotenato clcico (B5).
AMINOCIDOS
Los aminocidos son usados como constituyentes de compuestos de composicin qumica indefinida o bien por adicin directa. De esta manera, se encuentran en casena hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina, etc. Los aminocidos que se emplean directa y ms comnmente son L-glicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, cido glutmico. L-hidroxiprolina, Lalanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957) sealan que las formas L de los aminocidos son ms adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son txicas.
REGULADORES DE CRECIMIENTO
Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o ms sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces tambin Giberelinas o cido ascrbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro de tejidos y rganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varan considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endgenos de estos reguladores, as como con la finalidad del cultivo in vitro.
El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto Se ha demostrado que la clase y concentracin de dichas sustancias interactan con el genoma de la planta. (Montoya, 1991)
Auxinas
Son utilizadas principalmente para la diferenciacin de races y la induccin de callo. Las ms utilizadas son:
IBA: (cido indol-3-butrico) = diferenciacin de races ANA: (cido naftalenactico) = diferenciacin de races IAA: (cido indolactico) = Prolongacin de explantes 2,4-D: (cido diclorofenoxiactico) = induccin de callos.
Citoquininas
Promueve la divisin celular y la induccin de yemas adventicias en callos y rganos. Brotacin. Las Citoquininas ms usadas son: BAP: (bencilamino purina) Kinetina 2-ip (isopentenil-adenina). (Generalmente son diluidas con cido clorhdrico o hidrxido de sodio).
Giberelinas
Su funcin principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor (pierde el 90% de su actividad despus del autoclavado)
Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayora de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas.
Acido abscsico
El cido abscsico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduracin de embriones, y en cultivos de clulas en suspensin facilita la sincronizacin de la divisin celular.
AGAR
El agar es un gel que se extrae de algas marinas y que por sus caractersticas fsicas se emplea para solidificar el medio bsico, cuando ses trabaja con cultivo estsacionario slido o semi-slido. AGUA Es el elementos indispensable ya que se utiliza para para aforar al volumen que se requiera.
BIBLIOGRAFA: http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf
2 comentarios:
1. FRANCISCO PUCHE25 de febrero de 2012 14:54 vas atrasada en un par de temas...y publicar ty practica
muy buen trabajo, bien organizado. Responder
2. ANNY MOJICA25 de febrero de 2012 22:13 PROFE LA PRACTICA LA SUBI EL 21 DE FEBRERO Responder

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2.1.5 Preparacin y manejo de soluciones Stock

Se denomina solucin madre o stock a composiciones concentradas de nutrientes las cuales estn formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al elevado nmero de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentracin, resulta ms prctico preparar soluciones madre o
"stocks" concentrados. Esto hace ms rpida la futura preparacin de medios y minimiza los errores, ya que La composicin de una solucin se debe medir en trminos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentracin.
Componentes de soluciones madres o stock que en conjunto con otros elemento ( sacarosa, phytagel y hormonas de crecimiento) conforman un medio de cultivo MS.
Ejemplo De Los Clculos De Una Solucin Stock. Preparar 200 ml de solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos a una concentracin de 100x.
Fosfato Monopotsico. KH2PO4 La cantidad utilizada en g/L de este componente es 0.170, esta se multiplica por la concentracin que es 100x da como resultado 17 g / L. Despus se realizan clculos mediante una regla de tres para determinar cuantos gramos utilizaran para un volumen de 200 mL, se lleva acabo el siguiente procedimiento:
17 g X
1000 mL 200 mL
(200 mL)(17 g) = 1000 mL
3400 g/mL = 3.4 g 1000 mL
cido Brico. H3BO3
6.2 g X
1000 mL 200 mL
(200 mL)(6.2 g) = 1000 mL
1200 g/mL = 1.24 g 1000 mL
Molibdato De Sodio Dihidratado. Na2MoO4.2H2O 0.025 g X 1000 mL 200 mL
(200 mL)(0.025 g) = 1000 mL
5 g/mL = 0.005 g 1000 mL
Despus de que se tienen los clculos, en el laboratorio, estos se pesan en la balanza analtica , se disuelven de uno en uno en agua destilada en un matraz de Erlenmeyer a un volumen de 100 mL, despus se afora en una probeta graduada a un volumen de 200 mL, se vierte en una botella color mbar y se guarda en refrigeracin. BILIOGRAFA:
* Solucin stock/solucin madre esl.proz.com Quimica/ciencias/ ing.quim. 8:00 pm 25/02/12

portugus
al
espaol..


2012 (24) o abril (8) o marzo (5) o febrero (11)
2.1.6 Preparacin de los medios de Cultivo

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lunes, 27 de febrero de 2012
2.1.6 Preparacin de los medios de Cultivo

2.1.6 Preparacin de los medios de Cultivo Entre los factores ms importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfolgica deseada en un cultivo de tejido in vitro, es la composicin del medio de cultivo. El medio de cultivo est conformado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarn a obtener, una planta completa, o un rgano vegetal en particular, a partir del explante elegido (en condiciones de asepsia) y algn agente gelificante. Ejemplo: Preparar 400 mL De Un Medio MS (1x), partiendo de soluciones concentradas de sales y orgnicos a 100x, aadiendo 30g / L de sacarosa y 2.7g /
L de Phytagel. Aadiendo 0.5 ppm / L De A.N.A a una concentracin de 1000 ppm.
Este mismo procedimiento es el que se lleva acabo para todas ( 2) solucin de sulfatos, 3) solucin de quelatos 4) solucin de Po, Bo y Mo, 5) solucin de halgenos y 6) solucin de orgnicos) las soluciones por lo que no es necesario repetirlo.
7) A.N.A V2 = V1.C1/C2 V2 = (400 mL)(0.5 ppm) 1000ppm V2 = 0.2 mL 8) PHYTAGEL (2.7 g)(400 mL)/ 1000 mL = 1.08 g
Estos posteriormente se esterilizan y quedaran aptos para el cultivo in vitro vegetal.
Bibliografa: http://www.google.com.mx/imgres?q=frascos+con+medios+de+cultivo&.com

Se denomina solucin madre o stock a composiciones concentradas de nutrientes las cuales estn formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al elevado nmero de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentracin, resulta ms prctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto hace ms rpida la futura preparacin de medios y minimiza los errores, ya que La composicin de una solucin se debe medir en trminos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentracin.
Componentes de soluciones madres o stock que en conjunto con otros elemento ( sacarosa, phytagel y hormonas de crecimiento) conforman un medio de cultivo MS.
Ejemplo De Los Clculos De Una Solucin Stock. Preparar 200 ml de solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos a una concentracin de 100x.
Fosfato Monopotsico. KH2PO4
La cantidad utilizada en g/L de este componente es 0.170, esta se multiplica por la concentracin que es 100x da como resultado 17 g / L. Despus se realizan clculos mediante una regla de tres para determinar cuantos gramos utilizaran para un volumen de 200 mL, se lleva acabo el siguiente procedimiento: 17 g X 1000 mL 200 mL (200 mL)(17 g) = 1000 mL cido Brico. H3BO3 6.2 g X (200 mL)(6.2 g) = 1000 mL 1000 mL 1000 mL 200 mL 1200 g/mL = 1.24 g 1000 mL = 3.4 g 3400 g/mL
Molibdato De Sodio Dihidratado. Na2MoO4.2H2O 0.025 g X (200 mL)(0.025 g) = 1000 mL 1000 mL 200 mL 5 g/mL = 0.005 g 1000 mL
Despus de que se tienen los clculos, en el laboratorio, estos se pesan en la balanza analtica , se disuelven de uno en uno en agua destilada en un matraz de Erlenmeyer a un volumen de 100 mL, despus se afora en una probeta graduada a un volumen de 200 mL, se vierte en una botella color mbar y se guarda en refrigeracin. BILIOGRAFA: * Solucin stock/solucin madre esl.proz.com portugus al espaol.. Quimica/ciencias/ ing.quim. 8:00 pm 25/02/12

2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las clulas vegetales puedan desarrollarse con normalidad, entre sus componentes encontramos: SALES INORGNICAS Macronutrientes Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas. Nitrgeno (N): forma parte de aminocidos, vitaminas, protenas y cidos nucleco. Magnesio (Mg): es parte de la molcula de clorofila y de los ribosomas. Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento. Fosforo (P): Forma parte de las molculas que almacenan y transfieren la energa qumica de los cidos nucleicos, de este depende la energa celular. Potasio (K): Desempea un papel importante en la regulacin osmtica y en la actividad enzimtica. Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminocidos. Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halfilas y en plantas cuyos productos fotosintticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (Garca, 2000). Micronutrientes Estos micronutrientes son importantes en las clulas vegetales, ya que al adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeas permite que las sales madres sean mas eficaz para el medio de cultivo. Hierro (Fe): forma el ncleo del citocromo y parte de la ferrodoxina. Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa Manganeso (Mn): induce a la sntesis de clorofila, se requiere para la formacin del O2 en la fotosntesis.
Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica, involucrado en la sntesis de bases nitrogenadas como el uracilo. Cobre (Cu): permite la oxidacin respiratoria final, esta ligado al proceso de lignificacin. Zinc (Zn): requerido para la oxidacin e hidroxilacin de compuestos fenolicos. Cobalto (Co): componente de la vitamina B12 Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolucin del O2 en la fotosntesis. (Garca, 2000).
FUENTES DE CARBONO Normalmente para el cultivo in vitro de clulas, tejidos u rganos es necesario adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosntesis o incluso en oscuridad. La sacarosa es la ms utilizada para propsitos de Micropropagacion. Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aqu es convertida rpidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa. El azcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar adecuado para la Micropropagacin en muchos casos. Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales: Son fuentes de energa. Mantienen en el medio un potencial osmtico determinado. VITAMINAS La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero aparentemente lo hacen en cantidades infraptimas. Para lograr un buen crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o ms vitaminas. La tiamina (B1) es la que ms se utiliza y se la considera un ingrediente esencial. Otras vitaminas tambin han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in vitro, como son: pidiroxina (B6), cido nicotnico (B3), pantotenato clcico (B5). AMINOCIDOS Los aminocidos son usados como constituyentes de compuestos de composicin qumica indefinida o bien por adicin directa. De esta manera, se encuentran en casena hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina, etc. Los aminocidos que se emplean directa y
ms comnmente son L-glicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, cido glutmico. L-hidroxiprolina, L-alanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y Lcisteina. Nitsch y Nitsch (1957) sealan que las formas L de los aminocidos son ms adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son txicas. REGULADORES DE CRECIMIENTO Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o ms sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces tambin Giberelinas o cido ascrbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro de tejidos y rganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varan considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endgenos de estos reguladores, as como con la finalidad del cultivo in vitro. El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto Se ha demostrado que la clase y concentracin de dichas sustancias interactan con el genoma de la planta. (Montoya, 1991) Auxinas Son utilizadas principalmente para la diferenciacin de races y la induccin de callo. Las ms utilizadas son: IBA: (cido indol-3-butrico) = diferenciacin de races ANA: (cido naftalenactico) = diferenciacin de races IAA: (cido indolactico) = Prolongacin de explantes 2,4-D: (cido diclorofenoxiactico) = induccin de callos. Citoquininas Promueve la divisin celular y la induccin de yemas adventicias en callos y rganos. Brotacin. Las Citoquininas ms usadas son: BAP: (bencilamino purina) Kinetina 2-ip (isopentenil-adenina). (Generalmente son diluidas con cido clorhdrico o hidrxido de sodio). Giberelinas Su funcin principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor (pierde el 90% de su actividad despus del autoclavado)
Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayora de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas. Acido abscsico El cido abscsico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduracin de embriones, y en cultivos de clulas en suspensin facilita la sincronizacin de la divisin celular. AGAR El agar es un gel que se extrae de algas marinas y que por sus caractersticas fsicas se emplea para solidificar el medio bsico, cuando ses trabaja con cultivo estsacionario slido o semi-slido. AGUA Es el elementos indispensable ya que se utiliza para para aforar al volumen que se requiera.
BIBLIOGRAFA: http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf
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Un medio de cultivo se puede determinar, como solucin o formulacin qumicamente definida, donde un explante encuentra las condiciones adecuadas para desarrollar su potencial intrnseco. Las clulas vegetales requieren gran variedad de nutrimientos orgnicos e inorgnicos, para desarrollarse, ambos nutrimentos se requieren en dos niveles: uno macro y otro micro. El primer objetivo en la preparacin de un medio de cultivo es suministrar los nutrimentos minerales en concentraciones adecuadas. Se debe incluir macro elementos ( C, H, O, P, K, N, S, Ca Y Mg ) y los microelementos ( B, Zn, Mn, Cu, Mo, Fe, Cl ). Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo in vitro de clulas, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones y lograr la micropropagacin, etc. Los medios de cultivo tienen una
serie de componentes generales y especficos cuya presencia y concentracin estar en dependencia del objetivo que se persiga en su utilizacin. As, los medios de cultivo pueden ser lquidos o tener un soporte slido, tienen sustancias minerales, vitaminas, aminocidos, azcares, fitohormonas, etc. BIBLIOGRAFA
ROCA, M.W. 1991, CULTIVO DE TEJIDOS EN LA AGRICULTURA FUNDAMENTOS Y APLICACIONES, EDIT. XYZ, CALI COLOMBIA. PAGINAS. 43 - 45
http://natalymosquera.blogspot.com/


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BIOTECNOLOGA
jueves, 8 de marzo de 2012
PRACTICA No.3 PREPARACIN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
SEP
SNEST
DGEST
PRACTICA No.3
PREPARACIN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA
LIC. EN BIOLOGA
VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana Vely Garca Banderas (08930286) Anel Mojica Macedo (08930287) Mayra Alejandra Nambo Prez (08930349) Berenice Rub Prez Snchez (08930354)
Cd. Altamirano, Gro. Mxico. 27 de Febrero del 2012.
PREPARACIN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES RESUMEN

La presente prctica se realizo en el laboratorio de microbiologa del Instituto Tecnolgico de Cd. Altamirano Gro. Cuyo objetivo fue conocer la forma de preparacin del medio de Murasshine y Skoog para el cultivo de tejidos vegetales. Para lo cual se utiliz balanza, vasos de precipitados, agitador magntico, y magneto, potencimetros, frascos limpios para almacenar soluciones, sales y reactivos para preparar las soluciones concentradas y el medio MS, phytagel, hidrxido de sodio y cido Clorhdrico para ajustar el pH. En un vaso de precipitados con 100 ml de agua se le agrego 3.5 ml de cada solucin posteriormente se agreg 10.5 g de sacarosa para ser aforado a 350 ml en una probeta, posteriormente se vaco a un vaso de precipitados y se ajusto el pH a 5.72 agregando cido Clorhdrico, una vez ajustado se agreg 1.05 g de phytagel y se dejo ebullir en el agitador magntico, por ultimo se dejo enfriar el medio de cultivo y se vaco a los frascos, los cuales fueron guardados en el refrigerador.
Palabras clave: Medio de Murasshine y Skoog, phytagel, cido Clorhdrico.
PREPARATIONOFMEDIAFORPLANTTISSUE CULTURE Abstract

Thispracticewas performed in themicrobiologylaboratoryInstituto Tecnolgico de Cd. Altamirano Gro.Aims to better understandhowMurasshinepreparingand Skoogmediumforplant tissue culture.Whichwas usedforbalance, beakers, magnetic stirrer, and Magneto, potentiometers, clean jarsto storesolutions, salts and reagents to preparestock solutions andMS medium,Phytagel, sodium hydroxide andhydrochloric acidfor pH adjustment. Inabeaker with100mlof water wasadded3.5 mlof each solutionthenwas added10.5 gof sucrose tobegraduatedto 350 mlin a test tube,subsequentlyvacuumtoa beakerandthe pHwas adjustedto 5.72addinghydrochloric acid,once adjusted1.05 gwas addedand allowedPhytagelboilon the magnetic stirrer, finally allowed to coolthe culture mediumandvacuumflasks,which werestoredin refrigerator.
Keywords: Middle of Murasshine and Skoog, Phytagel, Hydrochloric Acid.
NDICE
Pg.
Antecedentes.5 Definicin del problema.......6 Objetivos........7 Justificacin......8 Fundamento terico.....9 Materiales y Mtodos......13 Resultados....20 Conclusiones y Recomendaciones........21 Fuentes consultadas....22 Anexos...23
I.
ANTECEDENTES
El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigacin de botnicos y fisilogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la seleccin, cruzamiento, control de enfermedades y produccin en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.
La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigacin sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combin con las tcnicas bsicas de microbiologa por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estriles para la produccin de microorganismos e identificacin. Desde estas dos fuentes provino la tecnologa por la cual las plantas u rganos de plantas se pueden multiplicar en gran nmero, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeos trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estril.
El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una tcnica particularmente difcil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos estn hoy en da prcticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibiticos, los medios de composicin definida, las instalaciones aspticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras estriles), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas). Los avances tcnicos y la aparicin de un buen nmero de compaas comerciales de suministro de medios, sueros, equipo y lneas celulares han hecho del cultivo celular una tecnologa con buena reproducibilidad (Reina, 2003). El cultivo de tejidos, como tcnica, consiste esencialmente en aislar una porcin de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones fsicas y
qumicas apropiadas para que las clulas expresen su potencial intrnseco o inducido. Es necesario adems adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminacin microbiana (Roca &Mroginski).
II.
En esta presente prctica se busca preparar medios para tejidos vegetales, debido a que es necesario aprovechar lo que la materia y el laboratorio nos permite a travs de experimentos para desarrollar nuestras inquietudes. Cabe mencionar que se requiere conocer exactamente la cantidad de cada uno de los compuestos que hay en el medio, es por ello que se debe conocer paso por paso la preparacin del medio.
III. OBJETIVOS
Conocer la forma de preparacin de los medios de Murasshine y Skoog y B5 (o de Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales
3.2 Objetivos especficos Comprender la funcin de cada uno de los componentes de un medio de cultivo Comprender la importancia que tiene la preparacin de los medios para tejidos vegetales.
IV. JUSTIFICACIN
Esta prctica se realizo con la finalidad de conocer los componentes de los medios de cultivo as mismo como la cantidad que se requiere de cada uno de las sustancias utilizadas en la preparacin de estos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos, o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
V. FUNDAMENTO TEORICO
5.1 MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos, estos medios son esenciales en el laboratorio por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegurar la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido, se parte de un medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le aaden organismos) y a continuacin incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axnico o puro contiene un nico tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores.El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios. Sedisuelve completamente a 100C y se solidifica al enfriarse a 40C. (Clavell, 1992).
5.2 CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO
De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
Lquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulacin.
Semislidos: Contienen 0.5% de agar en su formulacin. Slidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulacin. De acuerdo a su composicin, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
Definidos: es aqul medio de cultivo del cual se conoce su composicin exacta. Son muy utilizados en estudios fisiolgicos. Los medios mnimos son medios definidos que nicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse ptimamente.
Complejos: es aqul del cual no se conoce la composicin exacta del medio. Amenudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras,extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composicin qumica exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. en ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin qumica definida cualitativamente y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin.
De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:
Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepcin de los que se quieren cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos.
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. no contienen ningn tipo de sustancia con actividad antimicrobiana, permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos, o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados), generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.(Gutirrez, 2001).
5.3 ASPECTOS PARA PREPARAR DE MEDIOS DE CULTIVO
prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.
utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica adecuada.
utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin. Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.(Gutirrez, 2001)
5.4 ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que seale el fabricante, generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8 C, a menos que el medio requiera alguna condicin diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerradospara evitar su deshidratacin. Cuando se usa tapn de algodn se debe colocar por encima una envolturade papel (Craft). (Dugas, 1999).
VI. MATERIALES Y METODOS

La practica tuvo lugar en el laboratorio de Microbiologa perteneciente al Instituto Tecnolgico de Cd. Altamirano. Para la preparacin de 350 mL de medio M.S partiendo de soluciones concentradas de sales y orgnicos a 100 x, aadiendo 30 g / L de sacarosa y 3 g / L de phytagel, se llevo acabo la siguiente metodologa. Primeramente se realiz un flujo para saber la cantidad exacta que se agregaran de cada una de las soluciones stock y los componentes como sacarosa y phytagel.
PREPARACIN DE UN MEDIO DE CULTIVO M.S FLUJO SOLUCIN DE NITRATOS SOLUCIN DE SULFATOS SOLUCIN DE QUELATOS SOLUCIN DE Po Bo Mo SOLUCIN DE HALOGENOS SOLUCIN DE ORGNICOS SACAROSA PHYTAGEL L 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 30 g 3.0 g 350 ML 3.5 mL 3.5 mL 3.5 mL 3.5 mL 3.5 mL 3.5 mL 10.5 g 1.05 g
Posteriormente se colocaron las seis soluciones stock sobre la mesa del centro del laboratorio, al lado derecho de cada botella que contena la solucin, se encontraba una pipeta correspondiente a cada una de ellas.
Figura 1. Soluciones stock concentradas a 100 x.
En un vaso de precipitados de 500 mL o un litro, se coloc 100 mL de agua (bonafont), despus con la pipeta correspondiente se agreg 3.5 mL de cada una de las seis soluciones stock (Solucin de Nitratos, Solucin de Sulfatos, Solucin de Quelatos, Solucin de Po Bo Mo, Solucin de Halgenos y Solucin de Orgnicos).
En un vaso de precipitados de 500 mL o un litro, se coloc 100 mL de agua (bonafont), despus con la pipeta correspondiente se agreg 3.5 mL de cada una de las seis soluciones stock (Solucin de Nitratos, Solucin de Sulfatos, Solucin de Quelatos, Solucin de Po Bo Mo, Solucin de Halgenos y Solucin de Orgnicos).
Figura 2. Toma de 3.5 mL de stock.
Figura 3. Adicin de 3.5 m de solucin stock a 100 mL de agua.
solucin
Posteriormente se adicion la sacarosa, de la cual se pesaron previamente 10.5 g en la balanza analtica, con una pipeta se removi hasta que esta se disolviera perfectamente. Despus en una probeta de 500 mL se afor a 350 mL, se realiz un lavado del vaso de precipitados para evitar que quedaran residuos de los componentes del medio.
Figura 4. Adicin de la sacarosa.
Figura 5. Aforado a 350 mL.
Una vez aforada la solucin se verti nuevamente en el vaso de precipitados para medir el pH el cual deba de estar en un rango de 5.7 a 6.0, empleando el potencimetro. En caso de que obtuviramos un pH bajo, se le agregara NaOH
hidrxido sdico de lo contrario si el pH sobrepasara 6.0 se agregara HCL cido clorhdrico 0.1 N.
Figura 6. Medicin de pH.
Posteriormente se le agreg un magneto al medio y se procedi a calentar en una parrilla calefactora con agitacin magntica, a una temperatura de 50 a 70 C, se midi la temperatura con un termmetro y una vez alcanzada se agreg 1.05 g de phytagel, esto se hizo poco a poco para evitar que se formaran grumos.
Figura 7. Solucin dispuesta sobre la parrilla calefactora.
Figura 8. Toma de la temperatura.
Figura 9. Adicin del phytagel.
Ya que se implemento el phytagel se incremento la intensidad de calor hasta que hirviera. Despus en frascos de cultivo se verti el medio M.S, con mucho cuidado ya que estaba caliente, tomando la medida de un frasco llenado con agua, al trmino de llenado de estos se taparon, sellaron cinta plstica y se mantuvieron en refrigeracin.
Figura 10. Procedimiento del llenado , sellado y refrigeracin de los frascos con el medio de cultivo M.S.
VII.
RESULTADOS
Para preparar 350 ml de medio MS partiendo de soluciones stock de sales y orgnicos a 100X, se aadieron 30 g/l de sacarosa y 3 g/l de phytagel. Clculos necesarios: Para las soluciones
V1 C1 = V2 C2
V2=V1 C1/C2
V1 = 350 mL
V2 = 350 mL . 1 X/ 100 X
C1=1 X
V2 = 3.5 mL
V2=?
C2 =100 X
Para la sacarosa
30 g ------------- 1000 mL
X---------------- 350 mL
X= 10.5 g de sacarosa
Para el phytagel
3 g ----------------- 1000 mL
X ------------------ 350 mL
X= 1.05 g de phytagel
Se midi el pH el cual se encontraba muy acido y se ajusto con la ayuda del acido clorhdrico hasta 5.72.
Figura 11. Ajuste de pH
De los 350 ml del medio Murasshine y Skoog se obtuvieron 15 frascos de 23 ml para el cultivo de tejidos vegetales, los cuales fueron puestos bajo refrigeracin.
Figura 12. Frascos con medio de cultivo.
Figura 13. Refrigeracin de frascos.
VIII.
Conclusin:
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
De acuerdo con lo realizado en la presente prctica se concluye que es de gran importancia preparar adecuadamente los medios de cultivo, aadir la cantidad de solucin exacta y disolverla correctamente para obtener los resultados esperados; adems de que observamos que la solucin stock es mas acida
Recomendaciones:
De acuerdo a esta prctica se recomienda que potencimetro este calibrado ya que se pierde tiempo en tratar de calibrarlo, que para la posterior practica se le apliquen reguladores de crecimiento al medio de cultivo ya que en esta prctica no se agregaron.

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales (2da edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela Sofa Gutirrez de Gamboa, Octubre 2001. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C 3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf
Dugas Beverly Tratado de Enfermera Prctica Nueva Editorial Interamericana Mxico, 1999. http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-Medios-deCultivo
Biotecnologa Vegetal (cultivo de tejidos, manual )Gonzalez, Cruz, Camarillo, Silos. 2000. SEP. 133p. La Ingeniera Gentica y sus Aplicaciones. Pellon. Acribia. 1986. Mexico. 237 p. Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering. Nair. Infinity Science Press. India. 2008. 791 p. http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf
X. ANEXOS
Es necesario que el laboratorio cuente con medidores de pH debido a que con los que cuenta el laboratorio no se encuentra en buenas condiciones y no estn calibrados correctamente.
Figura 14. Medidores de pH.


2012 (24) o abril (8) o marzo (5) PRACTICA No.4 SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL...
PRACTICA No.3 PREPARACIN DE MEDIOS PARA EL CULTI... 2.2 ESTERILIZACIN TAREA 1. MEDIOS DE CULTIVOS DEFINIDOS E INDEFINI... PRACTICA No.2 PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRES
o febrero (11)
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BIOTECNOLOGA
lunes, 26 de marzo de 2012
PRACTICA No.4 SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)

SEP SNEST DGEST
PRACTICA No.4
SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
PROFESOR: FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA
LIC. BIOLOGIA
VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258) Diana Vely Garca Banderas (08930286) Anel Mojica Macedo (08930287) Mayra Alejandra Nambo Prez (08930349) Berenice Rub Prez Snchez (08930354)
Cd. Altamirano, Gro. Mxico. 23 de marzo del 2012.
SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN VITRO)
RESUMEN
La presente prctica se realiz en el laboratorio de microbiologa del Instituto Tecnolgico de Cd. Altamirano, Gro. Cuyo objetivo fue conocer el manejo
apropiado del material vegetal en cmara de flujo, as como la asimilacin de habilidades en la siembra. Para lo cual se utiliz papel higinico, pinzas, bistures, cajas de Petri estriles, tapabocas, mechero, alcohol al 70% y 100% y agua destilada. Se prepar la cmara de flujo laminar desinfectando con alcohol en su interior, posteriormente el material vegetal y los medios preparados se transfirieron en la cmara, despus se esteriliz el material vegetal con alcohol y agua y posteriormente se sac en una caja de Petri donde se dividi en partes pequeas, posteriormente se sembr el material vegetal en cada uno de los frascos de medios de cultivo sellndolos completamente cada uno, una vez que se sellaron fueron guardados en un anaquel para su optimo crecimiento.
Palabras clave: material vegetal, cmara de flujo laminar, medios de cultivo, siembra.
SUBCULTURE (PLANTING MATERIALANDESTABLISHEDIN -VITRO) SUMMARY
Thispracticewas conducted in themicrobiology laboratory of theTechnological Institute of CiudadAltamirano, Guerrero. Aims to better understandthe proper handlingofplant materialflow chamberand theassimilationof skillsin planting.Whichwas usedfortoilet paper, forceps, scalpels,sterilePetri dishes, masks, cigarette, alcohol 70% and 100% and distilled water.Was prepared inthelaminarflow chamberdisinfectedwith alcoholin its interior,andsubsequentlythe plant materialprepared mediawere transferredinto the chamber,afterthe plant materialwas sterilizedwith alcohol andwater and thenpulledinaPetri dishwhichwas dividedinto small parts, thenthe plant materialwas plantedineachculture mediabottlescompletelysealing themeachoncesealedwere kepton a shelfforoptimalgrowth.
Keywords: Plant material, laminar flow chamber, culture media, plant.
NDICE
Pg.
I.Antecedentes.5 II.Definicin del problema......7 III.Objetivos...8 IV.Justificacin........9 V.Fundamento terico...10 VI.Materiales y Mtodos.......15 VII.Resultados y discusin.........22 VIII.Conclusiones y Recomendaciones....25 IX.Fuentes consultadas.......26 X.Anexos....27
I.ANTECEDENTES
El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una tcnica de reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir de un pequeo segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles
o millones de plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estmulo por medio de variables fsicas y qumicas controladas en un medio de cultivo. A diferencia de las tcnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagacin de grandes volmenes de plantas en menor tiempo; as como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la tcnica es de gran utilidad en la obtencin de plantas libres de patgenos; plantas homocigotas, en la produccin de plantas en peligro de extincin, en estudios de ingeniera gentica, etc. El enorme potencial que posee esta metodologa ha propiciado que en los ltimos 25 aos se haya incrementado el nmero de laboratorios de cultivo de tejidos en el pas para la produccin comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estn utilizando como una alternativa viable en sus programas de produccin (Kite, L., 1983)
La dcada de los 70 puede considerarse la dcada prodigiosa del cultivo in vitro en Espaa. De esta poca saldrn los lderes que sern los responsables de los grupos ms consolidados del cultivo in vitro. Lderes que, de alguna forma y porque la historia as lo quiso, completan su formacin en las dos escuelas del cultivo in vitro de entonces. De una parte, destaca el Dr. White en USA que, en 1934 publica el cultivo indefinido de la raz de tomate; por otra, merece mencin especial Gautheret, en Francia que, en 1939 publica por vez primera el cultivo indefinido de callos de zanahoria. Las dos escuelas ut ilizan el cultivo in vitro como herramienta de trabajo pero mientras los americanos tratan de utilizarla como una metodologa para resolver problemas reales que les preocupan, la escuela europea trata de utilizar el cultivo in vitro como una herramienta que le permita conocer aspectos fundamentales de la histodiferenciacin celular. En aquella poca las diferencias eran tan notables que mientras los europeos cerraban sus tubos de cultivo con algodn y papel de estao (que era como se le llamaba entonces al actual albal) los americanos lucan en sus gradillas el colorido multicolor de los famosos Kap-uts de Bellco (Antonio Ballester, 1999). En octubre de 1994, se inici la operacin de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el Colegio Profesional de Bilogos del Estado de Veracruz A.C. con la finalidad de desarrollar tcnicas para la propagacin de especies vegetales de inters ecolgico y econmico. En enero de 1995, se iniciaron las labores de siembra de tejidos en especies ornamentales de inters econmico en la regin. A la par de estas actividades, se ha hecho promocin del proyecto en los medios de comunicacin locales con el fin de dar a conocer al pblico las ventajas de utilizar la tcnica mencionada para la propagacin de plantas ornamentarles difciles de obtener por los mtodos tradicionales., (Davies R.D. et al, 1980) La totipotencialidad celular fue enunciada como teora por Gottlieb Haberlandt en 1902, quien propuso que todas las clulas vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas. Haberlandt no lleg a demostrar su hiptesis debido a que no pudo lograr la divisin celular ya que los medios de cultivo que empleaba no incluan reguladores del crecimiento debido a que esos compuestos eran desconocidos en ese momento. Recin en 1934, Philip White pudo mantener, en forma ilimitada, el crecimiento de races en medios lquidos a partir de pices del tallo de tomate. Al mismo tiempo se identific el cido indol actico (AIA), que posibilit el mantenimiento indefinido de callos de zanahoriay tabaco in vitro. Posteriormente se descubri el efecto de la leche de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Folke Skoog yCheng Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulacin qumica en la parte area y en la raz.
Trabajos posteriores en callos de la misma especie, con el agregado de cintica, la primera citocinina descubierta, permitieron demostrar que la diferenciacin de brotes, races o de ambos, estaba regulada por el balance de auxinas y citocininas (Mroginski, Sansberro y Flaschland, 2010)
II. DEFINICION DEL PROBLEMA

En esta presente practica se realizo la siembra de los explantes de yuca de manera adecuada para que no se contaminen con bacterias y hongos y se puedan desarrollar las plntulas de manera libre y logre crecer para extraerlo y cultivarlo nuevamente a un medio de cultivo in vitro. Cabe mencionar que se requiere mucho cuidado al realizar la siembra de los explantes ya que si no se realiza una buena siembra el cultivo se contaminara esto debido a que es posible que el explante traiga una cepa de hongo o bacteria o que el cloro utilizado no fue muy eficiente.
III. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL Conocer la forma de establecer un medio de cultivo y la forma de sembrar los explantes en el medio de cultivo. OBJETIVOS ESPECIFICOS Conocer el manejo apropiado del material vegetal en cmara de flujo Yuca: Manihot esculenta). Asimilacin de habilidades en la siembra.
IV. JUSTIFICACION
Esta prctica se realizo con la finalidad de saber cmo sembrar un explante ya que debido a esto se realizara en un medio de cultivo en el cual ser sembrado un explante de yuca (Manihot esculenta) con la finalidad de que logre crecer libre de enfermedades. La siembra se realizo en la campana laminar la cual se preparo y fue desinfectada con alcohol al 70 para estar libre de contaminantes y se desarrollen los expalntes.
V. FUNDAMENTO TEORICO
5.1 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, clulas, tejidos u organos, se cultiva aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Estas tcnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagacin, propagacin rpida de clones, eliminacin de virus y enfermedades, produccin dehaploides, aislamiento y utilizacin de protoplastos, cultivo de embriones, produccin de fitoquimicos, ingenieria genetica, mutacin y seleccin celular, produccin de semillas sinteticas y estudios bsicos de anatoma, desarrollo, fisiologa y nutricin vegetal. (Flaschland, 2010). El cultivo de tejidos se inicia con la diseccin microscpica de la planta bajo condiciones estrictamente higinicas con el propsito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estril sin introducir microorganismos contaminantes. Las clulas y tejidos que crecern y se desarrollarn a partir del explante original depende de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las clulas conformarn una masa aparentemente desorganizada, conocida como callos, en otros estarn presentes otras estructuras reconocibles como tallos,raices, bulbos u otros rganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estril de un recipiente de vidrio o de plstico, protegidos del medio exterior no estril. Es esencial mantener la esterilidad del medio
ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecer oportunsticamente a una velocidad mucho ms rpida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarn y matarn a los tejidos. Con el propsito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es cultivar los tejidos, deben proveerse adems ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio lquido. Los tejidos tambin necesitarn de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, tambin posiblemente algunas vitaminas, azcares como fuente de energa y una mezcla de hormonas vegetalesque se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulacin en las plantas de la energa de los carbohidratos provendr de los azcares agregados al medio de cultivo, ms que de la fotosintesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz. (Neumann, K.H. 1997). 5.2 BASE BIOLGICA La reproduccin asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las clulas de una planta poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningn tipo de fusin de clulas sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencia celular y es caracterstica de un grupo de clulas vegetales conocidas como clulas meristematicas, presentes en distintos rganos de la planta. La potencialidad de una clula diferenciada (una clula de conduccin, epidrmica) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciacin alcanzado por esa clula, pero puede revertirse parcial o completamente segn las condiciones de cultivo a las que se la someta. El xito en la propagacin de una planta depende de que se logre la expresin de la potencialidad celular, es decir, de que algunas clulas recuperen su condicin meristemtica. Para ello debe inducirse primero la desdiferenciacin y luego la rediferenciacin celular. En condiciones naturales, un proceso de este carcter sucede durante la formacin de las races adventicias en el enraizamiento de estacas, la formacin de yemas adventicias o cuando se busca la propagacin de cualquier planta. Entre los factores ms importantes para lograr la respuesta morfogentica deseada se encuentra la composicin del medio de cultivo. En todo intento de propagacin vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carcter del proceso de diferenciacin est regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiolgico del rgano, tejido o clula puesta en cultivo. Sin embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la accin de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores de crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagacin de una planta. (Haberlandt, G. 1902).
5.3 ETAPAS DEL PROCESO El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explante y termina con la obtencin de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuacin:
Eleccin de la planta y/o tejido donante de explantes. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparacin y seleccin de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patgenos, deficiencias o estrs). Establecimiento: consiste en la desinfeccin de los explantes (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptacin al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raz o embrin somtico, segn se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirn ventajosamente con el explante. Multiplicacin: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneracin del nmero de plantas necesarias.
Enraizamiento: es el proceso de induccin de la formacin de races con el fin de convertir a los brotes o embriones somticos en plntulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que slo contenga auxinas. Esta operacin se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solucin concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosntesis para obtener la energa necesaria para desarrollarse y formar las races. Rusticacin: es el paso de aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algn sustrato inerte. El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatacin se logren simultneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantes, asegurando as una conexin vascular, continua entre el vstago y la raz. (Hicks G.S. 1980). 5.4 TIPOS DE MORFOGNESIS
En condiciones de cultivo in vitro, las clulas somticas pueden regenerar embriones o bien, brotes, races y/o flores. La embriognesis somtica y la organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrin cigtico sin que medie la fertilizacin de las gametas, mientras que por organognesis pueden obtenerse tallos, races o flores. Estos rganos se obtienen a partir de una clula o de un grupo de clulas a travs de un complejo proceso denominado regeneracin. La regeneracin comprende diferentes fases que se suceden de manera similar tanto para la organognesis como para la embriognesis somtica. Estas fases se denominan adquisicin de la competencia; fase de induccin y fase de realizacin. En la primera fase, las clulas no responden al estmulo organognico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciacin. En la segunda fase o fase de induccin, las clulas son receptivas al estmulo morfognico y hay una relacin directa con el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar. En la fase de realizacin, la clula sufre las sucesivas divisiones para formar el rgano determinado. A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formacin de nuevos rganos de manera directa, sin la formacin de callo. Si la formacin es de brotes, races o flores se denomina organognesis directa. Si en cambio se induce la formacin de embriones somticos, este proceso se denominar embriognesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin de callos o suspensiones celulares. La diferenciacin de rganos a partir de callos, denominada morfognesis indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides. (Banner, J. 1936).
VI.MATERIALES Y MTODOS
La presente prctica tuvo lugar en el Instituto Tecnolgico de Cd. Altamirano, en el laboratorio de Microbiologa.
Se inicio con la desinfeccin de la campana de flujo laminar con alcohol preparado anteriormente al 70%. Los materiales vegetales y los medios preparados se introdujeron en la cmara, las manos se desinfestaron con alcohol al 70 %, despus de secarlas completamente, se inici con el trabajo dentro de la cmara, la superficie de los recipientes con medio de cultivo se limpiaron con papel higinico impregnado con alcohol (normalmente no se utiliza algodn, puesto que se llena de polvo fcilmente).
Figura 1. Desinfeccin de la campana de materiales de flujo laminar. medios en el rea de trabajo.
Figura
2. Introduccin y
Previamente se prepar cloralex al 2 % en un frasco, donde posteriormente se introdujeron los explantes dentro con ayuda de las pinzas, permanecieron ah durante 5 minutos, se agitaba peridicamente.
Figura 3. Preparacin de cloralex al 2 %. explantes.
Figura 4. Desinfestacin de
Figura 5. Explantes vegetales en cloralex al 2%.
Se colocaron dos frascos con agua y un frasco con alcohol del 96%, los cuales se utilizaron para el lavado. La pinza que se utiliz anteriormente para poner los explantes en el frasco del cloralex se mete en el frasco del alcohol al 96%, se flameo para eliminar algn tipo de hongo o bacteria, y se dej enfriar en un frasco vaco, esto se llev a cabo al trmino de ser utilizado un material como pinza o bistur.
Figura 6. Frascos con agua estril. material.
Figura 7. Desinfeccin de
Figura 8. Frasco portador de materiales desinfectados.
Ya transcurridos los 5 minutos, en un vaso de precipitados se verti el cloro que contenan los explantes y se realiz el lavado con agua estril, se mantuvieron ah durante un minuto, transcurrido ese tiempo se verti el agua al vaso de precipitados y se inici con el lavado de 5 minutos, se retiro el agua nuevamente, terminado esto, se retiraron los frascos que fueron utilizados para mantener limpia el rea de trabajo.
Figura 9. Lavado de explantes con agua estril.
Despus se coloc el frasco de alcohol, el mechero y los frascos con pinzas y bistur, en este orden para evitar accidentes a la hora de la esterilizacin.
Figura 10. Orden del material para evitar accidentes. Se utiliz una caja de Petri estril, se empez a trabajar en una tapa de esta, obtuvimos dos explantes con ayuda de las pinzas y con el bistur se cortaron los extremos los cuales fueron daados por el cloro, posteriormente se diseccionaron los explantes para que cada yema o brote quedaran separados, una vez que se termino, se esterilizaron las pinzas y se colocaron en un el frasco vaco, se tomaron otras fras.
Figura 11. Obtencin y diseccin de explantes vegetales.
Se tomo el frasco del medio de cultivo, se quito el sello y tapa la cual se puso sobre otra tapa de un frasco para evitar contaminacin, se tomo un explante con las pinzas y se coloco en el medio con cuidando que este quedara dentro del mismo y la direccin de los pices hacia arriba de lo contrario se obstruira su crecimiento, este procedimiento fue el mismo para el cultivo de explantes en el medio de 14 frascos.
Figura 12. Siembra del explante vegetal en el medio de cultivo
Una vez culminada la siembra se sellaron los frascos y colocaron en el rea de crecimiento.
Figura 13. Frasco sellado y listo para instalarse en el rea de crecimiento.
VII. RESULTADOS Y DISCUSION

Se cultivaron 15 explantes in vitro de Manihot esculenta, de los cuales 5 se contaminaron por hongos en la superficie inferior del explante, lo cual se puede atribuir a que el explante se encontraba contaminado por alguna cepa de hongo o que el cloro ya no era eficiente, pero este factor no perjudico los brotes foliares en el explante.
Figura14. Explantes sembrados invitro.
Figura 15. Crecimiento foliar del explante.
Figura 16. Crecimiento de explantes.
En la siguiente figura se puede observar el grado de colonizacin por parte del hongo, observndose como las hifas han alcanzado a distribuirse en toda la superficie del frasco.
Figura 17. Explantes contaminados.
El 33 % de los explantes sembrados in vitro han sido contaminados por la presencia de un hongo. Segn Bregmann y Moon lograron un mayor nmero de brotes en diversas especies de Paulownia al utilizar reguladores de crecimiento, lograron incrementar el nmero de brotes cuando los explantes incluan parte del peciolo. Por otra parte Kadkade y Seibert encontraron que se mejoro la eficiencia tanto para el crecimiento en callo como para la organognesis al exponer los cultivos a la luz roja durante cinco minutos todos los das.
VIII.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Conclusiones: Debido a lo realizado ya antes mencionado en la presente practica se concluye que si la siembra de material in vitro se realiza de forma asptica: esterilizando el material a utilizar, desinfectndose las manos con alcohol, los resultados son favorables, es decir el material cultivado no se infecta de hongos o bacterias; tambin se concluye que probablemente la planta que se utilizo ( manihot
esculenta) estuvo contaminada debido a que el primer da despus de la siembra se presento un micelio alrededor del explante. Recomendaciones: La forma de colocar los frascos en la campana de flujo laminar debe ser frasco con alcohol- mechero - frascos con pinzas para un mejor manejo de material que se utilice.
Todo el material a utilizar debe esterilizarse y estar cubierto con papel o aluminio para evitar que este se contamine.
Se recomienda que solo se encuentren dos personas: uno para que se encargue de sembrar el material in vitro y el otro para que lo apoye pasndole el material esto para evitar que se infecten los medios de cultivo.
IX.FUENTES CONSULTADAS
Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland. 2010. Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. En: Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II, Argenbio, INTA. pags.: 70-84. Antonio Ballester, 1999 http://digital.csic.es/bitstream/10261/3975/1/ secivtv.pdf
Kite, L. (1983), Plant from Test Tubes: an Introductions to Micropropagation. Timber Press Oregon U.S.A.
Davies R.D. et al, (1980). Proceeding of the Fourth John Innes Symposium the Plant Genoma and Second.
X. ANEXOS Se adquiri un anaquel de cinco laminas para adecuar el rea de incubacin cerca de la campana de flujo laminar y a un lado de la ventana para recibir la poca luz sola que entra.
Figura 18. Anaquel.
Debido a que la luz solar no es la suficiente para todos los niveles del anaquel se requiere hacer la compra de una lmpara para que todos los explantes reciban la misma intensidad de luz.
Figura 19. Lmpara


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BIOTECNOLOGIA ITCA

martes, 7 de febrero de 2012

PRESENTACION DEL CURSO

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CD. ALTAMIRANO

PRESENTACION DEL BLOG DEL DOCENTE

QUE PRESENTA: FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA NUMERO DE CONTROL:70

CD. ALTAMIRANO, GRO. MEXICO, FEBRERO 07 DEL 2012

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UNIDAD II. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos

Unidad V. Tecnicas de diagnostico molecular biotecnologico

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2. 1. 5. Preparacin y manejo de soluciones stock

2. 1. 4. Componentes del medio de cultivo

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MIRCOLES, 25 DE ABRIL DE 2012

2.1.2 MATERIALY EQUIPO DE LABORATORIO

EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES (CTV)

- Electrnica con platillo fijo en el interior del equipo

-.Electrnica con el platillo en el exterior del aparato

Deben estar ubicadas en un lugar limpio

Nunca deben estar sobrecargadas

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2.1.3.GENERALIDADES DE MEDIOS CTV

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2.1 Medios de cultivo

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