EXTRACCIN DE ADN A PARTIR DE TEJIDO MUSCULAR DE BOCACHICO Prochilodus magdalenae,

Rada Juvinao Liliana Mercedes, liliradaju@hotmail.com, Javier, johana Universidad del Magdalena, estudiantes de Maestra Acuicultura

RESUMEN Teniendo en cuenta el protocolo de Extraccin de ADN (cido desoxirribonucleico), utilizado en los laboratorios de gentica del programa de Ingeniera Pesquera de la Universidad del Magdalena, se aplic este proceso a partir de tejido muscular de Bocachico (Prochilodus magdalenae) almacenado en alcohol al 90% a una temperatura de -20C, se esteriliz el lugar de trabajo e instrumentos con el fin de realizar el procedimiento sin alterar o desnaturalizar la molcula de ADN, para una luego ser comprobada en el procedimiento de electroforesis por los estudiantes de Maestra en acuicultura de la UNIMAG.

PALABRAS CLAVES: Extraccin de ADN, Bocachico (Prochilodus magdalenae), tejido muscular, centrifugar, desnaturalizacin.

INTRODUCCIN El cido desoxirribonucleico o ADN (DNA) es la molcula que guarda el cdigo gentico de todas las clulas. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehculo de su cdigo gentico, la cual es transmitida de generacin en generacin, sustentando la base de la herencia. Su estructura es utilizada para saber qu sectores de la molcula son responsables de la codificacin de protenas, las cuales cada una es responsable del desarrollo y funcionamiento del individuo. Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de nucletidos, donde cada nucletido est constituido por un azcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada y un grupo fosfato. Cada base nitrogenada puede ser una purina (adenina=A y guanina=G) o una pirimidina (timina=T y citosina=C). Estructuralmente, el ADN es una doble hilera de nucletidos, los cuales se unen entre s a Figura 1. Estructura de ADN travs de puentes de hidrgenos. Cada base nitrogenada de una
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hilera tiene una base complementaria en la otra. (Figura 1).

Lo que distingue a un nucletido de otro es la base nitrogenada, y por lo tanto la secuencia del ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases. La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la informacin gentica. Por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser AATCGTC y su secuencia complementaria es TTAGCAG.

La molcula de ADN est ubicada en los ncleos de las clulas (Figura 2) y su extraccin se convierte en la principal herramienta para el estudio gentico de las especies. El proceso de extraccin implica una serie de pasos, que dependiendo del mtodo empleado pueden variar los reactivos utilizados en cada uno Figura 2. Ubicacin de la molcula de ADN

En general se han propuesto diferentes mtodos, que dependiendo del tipo de tejido fuente se aplican o no. Para el tejido muscular se tienen el de formol-cloroformo, el de sales y los kits comerciales de extraccin. Cada uno tiene su ventaja sobre el otro, pero lo importante es tener en cuenta los factores econmicos y el tiempo.

MATERIALES Y MTODOS rea de estudio. La cuenca del Ro Ranchera, est localizado en la vertiente nororiente de la Sierra Nevada de Santa Marta (SNSM) en el pramo de Chiriguana a una altitud de 3,875 m.s.n.m. y una longitud de 248km aproximadamente hasta el mar caribe. Figura 1, departamento de La Guajira, Colombia (Mojica et al.,2013).

Materiales. 5 Muestras de tejido muscular de peces, Bistur, tubos ependorf de 1.5 l esterilizados, Solucin lisis, Proteinasa K, embolo, incubadora(bao de mara) , un vortex, Cloruro de sodio (NaCl), microcentrifuga, micropipetas, Alcohol etlico al 70%, Alcohol isoproplico, Alcohol etlico absoluto y al 75%, Buffer TE, y Homogenizadores, RNAsa, [5M], autoclavada, Una aguja de diseccin, 5 cajas de Petri, Papel absorbente.
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Agua bidestilada y

Figura 1. Mapa de localizacin del ro Ranchera en La Guajira, Colombia.

Extraccin de ADN. Se tom Aproximadamente 1 a 5 mg de tejido muscular de Bocachico (Prochilodus magdalenae), el cual se fragment cuidadosamente con la ayuda de un bistur y se deposito en un tubo ependorf de 1.5l previamente esterilizado, posterior se adicion 300l de solucin lisis y 1l de protenasa K, la cual se homogeniz cuidadosamente con la ayuda un embolo. Las muestras se llevaron a Incubar a 65C por lo menos durante 15 min. El tubo se llevo a agitar con ayuda de vortex durante 25 segundos, al cual se le adicion 300l de NaCl [5M] y se agit en el vortex durante 10 segundos. Los cuales fueron llevados a centrifugar a 17.000 rpm. durante 15 minutos. Se transfiri 450l del sobrenadante a un tubo nuevo previamente esterilizado, el otro tubo con los residuos de protenas se descarto. Al tubo con el sobrenadante se adicion 600l de alcohol etlico absoluto el cual se agit por 30-40 veces. Este se llevo a incubar por lo menos durante 1 hora a -20C y centrifugar a 14.000 rpm. durante 10 minutos. Se retir el alcohol etlico absoluto cuidadosamente sin agitar el tubo. Este paso puede hacerse por decantacin o con la ayuda de una
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micropipeta. Posteriormente se adicion 500l de alcohol etlico al 70 y se llevo a centrifugar a 10.000 rpm. durante 2 minutos para ayudar a limpiar bien el tubo. Se retira el alcohol etlico al 70% cuidadosamente. Este paso puede hacerse por decantacin o con la ayuda de una micropipeta. Se deja secar el tubo completamente y se adiciona 45l de solucin TE buffer y 1l de RNAsa se incuba a 37C durante 30 minutos. Para almacenar el ADN extrado a una temperatura de -20C. RESULTADOS Se realiz la extraccin de ADN de un total de 12 muestras de tejido muscular de Prochilodus magdalenae, utilizando los equipos del laboratorio de gentica de la Universidad del Magdalena, esto resultados se llevaran a una comprobacin por geles de agarosa por medio de mtodo de electroforesis. DISCUSIN Durante el protocolo de extraccin de ADN de se utiliz protenasa K, la cual es una enzima que degrada las protenas1 y membranas celulares liberando el ADN al medio, se incuba la solucin de extraccin a 65C debido a que es la temperatura de activacin necesaria para que la protena se degrade, cambie la polaridad y se rompa; la consecuencia que podra traer el proceso de omisin de la fase de incubacin, no se degradaran las histonas y por lo tanto no se desempaquetaran la ebras de ADN, hecho que evita la replicacion por PCR; por otro lado las DNAsas autolticas degradaran la cadena. El mecanismo qumico por el cual la molcula de ADN es insoluble en etanol produce la precipitacin este proceso es refrigerado debido a que menor temperatura menor solubilidad y precipita mejor la molcula, por otro lado lo que hace precipitar el ADN en etanol es la baja polarida de mismo con respeto al agua, por lo que se interrumpe la trasmisin de cargas entre el agua y los fosfatos de ADN, lo que provoca una deshidratacin del material. La manera de comprobar si el material extrado es ADN es a travs de tinciones, entre los mtodos que estn disponibles Tincin de
Feulgen, Nitrato de plata, Bromuro de etidio, Hoechst. El mtodo vara dependiendo de la clula o

tejido desde donde se necesita extraer las bacterias, levaduras o clulas de plantas tiene diferentes estructura celular lo cual determina en escoger el protocolo. La concentraciones de ADN y si este esta contaminado se pueden observar en la electroforesis segn la coloracin de las bandas el reactivo

Siendo de vital importancia la degradacin de las histonas(protenas para el empaquetamiento del ADN en cromosomas) y las enzimas DNAsas que tienen la capacidad de romper la cadena de ADN y por lo tanto puden evitar un correcto anlisis del mismo,

PROPUESTA Dado que las membranas celulares (plasmtica y nuclear y dems) presentan proporciones importantes de fosfolpidos, se recomienda la adicin de fosfolipasas con el fin de realizar una ptima degradacin de las membranas. Adicionalmente la adicin de sales Biliares optimizara la accin de las fosfolipasas. Al anterior se recomienda realizarse antes de la adicin e incubacin con protenasa K.

. Existen otras tcnicas que podran utiizarse que podran ser; Tcnica de extraccin de DNA de leucocitos (tcnica de miller) - Mtodo wizard (promega, usa) PCR - Ultra centrifugacin Espectrofotometra - Tcnica de sedimentacin de cidos nucleicos AGRADECIMIENTOS Laboratorio de Gentica de UNIMAG, Docente Juan Carlos Narvez Barandica, monitores y personal en general

BIBLIOGRAFA 1. 2. Gerald karp. Biologa celular y molecular. ED McGrawHill 1998. Pg. 727-730. Robert A. Wallace, Jack L. King, Gerald P. Sanders. Biologa Molecular y Herencia. 1a edicin. Editorial. Trillas. Mxico 1991: pgina 97,