UNIVERSIDAD DEL MAGDALENA FACULTAD DE INGIENERA ASIGNATURA DE GENTICA

Profesor: Juan Carlos Narvez Barandica Laboratorio No. 1: Extraccin de ADN (cido desoxirribonucleico) Lugar: Laboratorio de Gentica, Hangar de Acuicultura del programa de Ingeniera Pesquera PRESENTACIN La molcula de ADN es encargada de contener toda la informacin gentica de los organismos vivos y de algunos virus, la cual es transmitida de generacin en generacin, sustentando la base de la herencia. Su estructura es utilizada para saber qu sectores de la molcula son responsables de la codificacin de protenas, las cuales cada una es responsable del desarrollo y funcionamiento del individuo. Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de nucletidos, donde cada nucletido est constituido por un azcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada y un grupo fosfato. Cada base nitrogenada puede ser una purina (adenina=A y guanina=G) o una pirimidina (timina=T y citosina=C). Estructuralmente, el ADN es una doble hilera de nucletidos, los cuales se unen entre s a travs de puentes de hidrgenos. Cada base nitrogenada de una hilera tiene una base complementaria en la otra. Por ejemplo, para adenida es timina y para citosina es guanina (Figura 1).

Figura 1. Estructura de ADN. Lo que distingue a un nucletido de otro es la base nitrogenada, y por lo tanto la secuencia del ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases. La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la informacin gentica. Por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser AATCGTC y su secuencia complementaria es TTAGCAG. La molcula de ADN est ubicada en los ncleos de las clulas (Figura 2) y su extraccin se convierte en la principal herramienta para el estudio Ncleo gentico de las especies. El proceso de extraccin implica una serie de pasos, que dependiendo del Cromosoma mtodo empleado pueden variar los reactivos utilizados en cada uno. Nucleosomas Cromatina
condensada

Figura 2. Ubicacin de la molcula de ADN

Solenoide

En general se han propuesto diferentes mtodos, que dependiendo del tipo de tejido fuente se aplican o no. Para el tejido muscular se tienen el de formol-

Cromatina descondensada

cloroformo, el de sales y los kits comerciales de extraccin. Cada uno tiene su ventaja sobre el otro, pero lo importante es tener en cuenta los factores econmicos y el tiempo. El procedimiento a implementarse en este laboratorio est basado en un kit comercial y los estudiantes interesados en utilizar los otros dos mtodos pueden contactar directamente al profesor para que le adjudique un espacio en el laboratorio e implementarlos. OBJETIVO DEL LABORATORIO El propsito de este laboratorio es inducir a los estudiantes de Ingeniera Pesquera en los procesos de extraccin de ADN nuclear libre de ARN y de protenas. MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS 1- El estudiante deber usar guantes, mientras se encuentre trabajando con ADN. 2- Todo el material de trabajo debe estar estril, a fin de evitar contaminacin. 3- El material biolgico debe ser conservado a bajas temperaturas. PROCEDIMIENTO Reactivos y equipamiento 1. Micropipetas 2. Material fungible (Puntas, gradillas de plstico, tubos de 1.5 ml.) 3. Pinzas y bistur 4. Mechero 5. Vortex 6. Microcentrifuga 7. Bao de Mara 8. Refrigerador 9. Solucin lisis 10. Proteinasa K 11. Homogenizadores 12. RNAsa 13. Cloruro de sodio (NaCl) [5M] 14. Alcohol etlico absoluto y al 75% 15. Buffer TE 16. Agua bidestilada y autoclavada 17. Papel absorbente

PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN A PARTIR DE TEJIDO NO INVASIVO: MUCOSA BRANQUIAL

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1. Agitar el hisopo fuertemente contra las paredes del tubo ependorf, con el propsito de liberar la mayor cantidad de clulas. 2. Retirar el hisopo del tubo original y ponerlo en un tubo nuevo (ependorf 1.5ml), el cual debe contener una abertura en la parte inferior y debe haberse esterilizado previamente. 3. Ubicar el tubo perforado con el hisopo dentro del tubo original, adicionar 200l de solucin lisis y agitar vigorosamente contra las paredes. 4. Centrifugar durante 2 minutos a 10.000 rpm. Eliminar el tubo perforado y conservar el original conteniendo la solucin de clulas en suspensin. 5. Resuspender las clulas en un vortex durante unos segundos. 6. Adicionar 1l de protenasa K e incubar a 56C por lo menos durante 1 hora. 7. Adicionar 400l de NaCl 5M y agitar vigorosamente con el vortex durante 10 segundos. 8. Centrifugar a 10.000 rpm. durante 5-10 minutos con el propsito de separar el ADN de las protenas y otros residuos. 9. Transferir 450l del sobrenadante obtenido a un tubo nuevo previamente esterilizado. Esta solucin contendr el ADN extrado, el otro tubo con los residuos de protenas ser descartado. 10. Adicionar 800l de alcohol etlico absoluto y agitar por inversin 30-40 veces. 11. Incubar toda la noche a -20C. 12. Centrifugar a 10.000 rpm. durante 15 minutos para la precipitacin del ADN. 13. Retirar el alcohol etlico absoluto cuidadosamente sin agitar el tubo. Este paso puede hacerse por decantacin o con la ayuda de una micropipeta. 14. Adicionar 500l de alcohol etlico al 70% para limpiar el ADN precipitado y centrifugar a 10.000 rpm. durante 2 minutos para ayudar a limpiar bien el tubo. 15. Retirar el alcohol etlico al 70% cuidadosamente. Este paso puede hacerse por decantacin o con la ayuda de una micropipeta. 16. Dejar secar el tubo completamente. 17. Agregar 45l de solucin TE buffer para resuspender el ADN. 18. Almacenar el ADN extrado a una temperatura de -20C.

PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN A PARTIR DE TEJIDO NO INVASIVO: ALETA CAUDAL

1. En un tubo ependorf de 1.5l previamente esterilizado adicionar aproximadamente 0.10.5cm2 de aleta caudal. 2. Adicionar 300l de solucin lisis y 1l de protenasa K. 3. Incubar a 65C por lo menos durante 1 hora. 4. Agitar el tubo con vortex durante 5 minutos. 5. Adicionar 300l de NaCl [5M] y agitar vigorosamente con el vortex durante 10 segundos.
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6. Centrifugar a 15.000 rpm. durante 15 minutos con el propsito de separar el ADN de las protenas y otros residuos. 7. Transferir 450l del sobrenadante obtenido a un tubo nuevo previamente esterilizado. Esta solucin contendr el ADN extrado, el otro tubo con los residuos de protenas ser descartado. 8. Adicionar 600l de alcohol etlico absoluto y agitar por inversin 30-40 veces. 9. Incubar por lo menos durante 1 hora a -20C. 10. Centrifugar a 14.000 rpm. durante 10 minutos para la precipitacin del ADN. 11. Retirar el alcohol etlico absoluto cuidadosamente sin agitar el tubo. Este paso puede hacerse por decantacin o con la ayuda de una micropipeta. 12. Adicionar 500l de alcohol etlico al 70% para limpiar el ADN precipitado y centrifugar a 10.000 rpm. durante 2 minutos para ayudar a limpiar bien el tubo. 13. Retirar el alcohol etlico al 70% cuidadosamente. Este paso puede hacerse por decantacin o con la ayuda de una micropipeta. 14. Dejar secar el tubo completamente. 15. Agregar 45l de solucin TE buffer para resuspender el ADN. 16. Adicionar 1l de RNAsa e incubar a 37C durante 30 minutos. 17. Almacenar el ADN extrado a una temperatura de -20C.

PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN A PARTIR DE TEJIDO MUSCULAR

1. Tomar aproximadamente 1-5mg de tejido muscular, fragmentarlo cuidadosamente con la ayuda de un bistur en un tubo ependorf de 1.5l previamente esterilizado. 2. Adicionar 300l de solucin lisis y 1l de protenasa K, homogenizar cuidadosamente con la ayuda un embolo. 3. Incubar a 65C por lo menos durante 1 hora. 4. Agitar el tubo con vortex durante 5 minutos. 5. Adicionar 300l de NaCl [5M] y agitar vigorosamente con el vortex durante 10 segundos. 6. Centrifugar a 15.000 rpm. durante 15 minutos con el propsito de separar el ADN de las protenas y otros residuos. 7. Transferir 450l del sobrenadante obtenido a un tubo nuevo previamente esterilizado. Esta solucin contendr el ADN extrado, el otro tubo con los residuos de protenas ser descartado. 8. Adicionar 600l de alcohol etlico absoluto y agitar por inversin 30-40 veces. 9. Incubar por lo menos durante 1 hora a -20C. 10. Centrifugar a 14.000 rpm. durante 10 minutos para la precipitacin del ADN. 11. Retirar el alcohol etlico absoluto cuidadosamente sin agitar el tubo. Este paso puede hacerse por decantacin o con la ayuda de una micropipeta.

12. Adicionar 500l de alcohol etlico al 70% para limpiar el ADN precipitado y centrifugar a 10.000 rpm. durante 2 minutos para ayudar a limpiar bien el tubo. 13. Retirar el alcohol etlico al 70% cuidadosamente. Este paso puede hacerse por decantacin o con la ayuda de una micropipeta. 14. Dejar secar el tubo completamente. 15. Agregar 45l de solucin TE buffer para resuspender el ADN. 16. Adicionar 1l de RNAsa e incubar a 37C durante 30 minutos. 17. Almacenar el ADN extrado a una temperatura de -20C. CUESTIONARIO 1. Durante el protocolo se utiliz proteinasa K, proceso en el cual se incuba la solucin de extraccin a 65C Cul cree usted que sera el fin de agregar esta enzima? Qu consecuencias podra traer para el proceso la omisin de la fase de incubacin? 2. Cul es el mecanismo qumico mediante el cual el etanol produce la precipitacin de DNA? Qu pasara si durante este proceso la solucin de extraccin no se refrigera? 3. Cmo podra asegurarse que el material extrado realmente es DNA? 4. Cul podra ser la diferencia entre protocolos usados para extraer ADN de bacterias, levaduras y clulas de plantas? 5. Cmo podra cuantificar la concentracin de ADN en la solucin final? 6. Cmo podra saber si hay protenas contaminando el ADN extrado?

PRESENTACIN DEL INFORME Este se presenta a manera de artculo cientfico siguiendo la gua de autores de la revista Intrpica, siguiendo la estructura: a. Titulo b. Autores con sus respectivas direcciones de correspondencia c. Resumen (no ms de 9 renglones) d. Palabras claves (cinco) e. Introduccin (no ms de pgina y media) f. Materiales y mtodos que incluya el rea de estudio con un mapa con escala y en tonalidades de grises, fase de campo y anlisis de informacin g. Resultados con tablas y figuras h. Discusin i. Agradecimientos j. Bibliografa Deber entregarse a la semana siguiente de la prctica, en el laboratorio de gentica molecular (Hangar de Acuicultura). Impreso y en pareja. Basado en una revisin bibliogrfica, proponga modificaciones de los pasos de extraccin suministrados en esta gua para optimizar y mejorar el proceso de extraccin. Realice un anlisis breve sobre qu mtodo de extraccin presenta mejor rendimiento de ADN en trminos de cantidad. Mencione los pros y los contras.
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MATERIALES 5 muestras de tejido muscular de peces 10 tubos de 1.5 ml esterilizados Alcohol etlico al 70% Alcohol isoproplico Bistur Una aguja de diseccin 5 cajas de Petri Papel absorbente Un bao de mara, un vortex, una microcentrifuga y micropipetas. BIBLIOGRAFA D. M. Hillis, C. Moritz y B. K. Mable (Ed), 1996. Molecular Systematics. Sinauer Associates, Inc. Publishers Sunderland, Massachusetts U.S.A. 655 pages