UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN DEPARTAMENTO ACADMICO DE QUMICA E BIOLOGIA CURSO DE BACHARELADO EM QUMICA

GRUPO 02 Bruna Reis dos Santos 1304470 Bruno Roberto Reis Alves 1247123 Cleyton Nascimento Makara 1304496 Marcelo Andr Petry Pontes 1046861

EXPERIMENTO 06 Cintica da Inverso da Sacarose Catalizada pela Enzima Invertase 13/12/2013

CURITIBA 2013

1 INTRODUO

Um catalisador uma substncia que aumenta a velocidade da reao e pode ser recuperada quimicamente inalterada no final da reao. A velocidade da reao depende das constantes de velocidade das etapas elementares do mecanismo de reao. O catalisador uma substncia que aumenta a velocidade sem ser consumida na reao, fornecendo um caminho alternativo entre reagentes e produtos, com energia de ativao mais baixa do que o caminho original, que mais rpido que o mecanismo na ausncia do catalisador . As clulas vivas contm milhares de tipos diferentes de catalisadores, cada um dos quais necessrio vida. Muitos desses catalisadores so protenas chamadas enzimas. (Certas molculas de RNA tambm atuam como enzimas.) So molculas muito grandes que tem um stio ativo semelhante a uma cavidade onde a reao acontece. Uma enzima especfica em sua ao. Muitas enzimas catalisam apenas a converso de um reagente em particular para formar um produto em particular. Enzimas aumentam substancialmente as velocidades de reao, e na sua ausncia a maioria das reaes biolgicas ocorrem a velocidades insignificantes. Uma vez no stio ativo, o substrato, molcula onde a enzima atua, reage para formar um complexo enzima-substrato. Enquanto ligado enzima, o substrato convertido em produto, que em seguida liberado da enzima . Os grupos funcionais catalticos das enzimas podem interagir transitoriamente com um substrato e ativ-lo para a reao. Em muitos casos, estes grupos abaixam a energia de ativao (e, portanto, aceleram a reao) providenciando uma via de reao de energia mais baixa. A energia necessria para baixar a energia de ativao , em geral, derivada de interaes fracas, nocovalentes, entre o substrato e a enzima, acompanhada por uma pequena liberao de energia livre, o que fornece uma pequena frao da estabilidade final da interao. A energia total derivada da interao enzima-substrato chamada de energia de ligao e a maior forte de energia livre usada pelas enzimas para baixar a energia de ativao das reaes . As reaes catalisadas enzimaticamente ocorrem em condies brandas: temperaturas inferiores a 100 C, presso atmosfrica e pH quase neutro. Em contraste, geralmente uma catlise qumica eficiente requer temperaturas e presses elevadas, assim como pH extremos. As enzimas apresentam um grau de especificidade imensamente maior do que os catalisadores qumicos em relao identidade dos seus substratos (reagentes) e dos seus produtos . No caso mais simples, uma enzima liga-se ao seu substrato (em um complexo enzimasubstrato) antes de convert-lo a produto, de modo que a reao global realmente constituda de processos de primeira e segunda ordens, cada um com uma constantes caracterstica . A cintica das reaes enzimticas foi estudada pela primeira vez pelos qumicos Leonor Michaelis e Maud Menten no incio do sculo XX. A equao de Michaelis-Mentem descreve a velocidade da reao enzimtica em funo da concentrao de substrato. Eles descobriram que, quando a concentrao do substrato baixa, a velocidade de uma reao catalisada por enzima aumenta com a concentrao do substrato. No entanto, quando a concentrao do substrato alta, a velocidade da reao depende apenas da concentrao da enzima. Assim, enzimas so catalisadores biolgicos cuja funo modificar molculas de substrato e promover reaes .
2,4 5 4 3 1,2 1,2

A sacarose extrada da cana de acar e da beterraba, os monossacardeos que a compem so: -D-glicose e a -D-frutose. A hidrlise da sacarose resulta em seus dois monossacardeos constituintes, sendo utilizados por animais para a obteno de energia . A rotao especifica da sacarose +66,5. O tratamento com cido diludo faz com que a rotao decresa at atingir -20. O mesmo efeito observado na presena da enzima invertase . Estes monossacardeos se transformam em enediol em meio alcalino, que por sua vez, reduz o DNS (cido 3,5-dinitrossaliclico) a cido 3-amino-5-nitrossaliclico (ANS), enquanto que, o grupamento aldedo oxidado a cido aldnico como na Figura 1. O cido 3-amino-5-nitrossaliclico um produto de cor laranja, sendo a intensidade da colorao correspondente concentrao de acar. O processo de determinao da concentrao final da sacarose envolve a absorbncia de ANS. Esta prtica teve como objetivo realizar o estudo da cintica da inverso da sacarose catalizada pela enzima invertase. E, atravs da equao de Lineweaver-Burk, determinar a velocidade mxima, vmax, e a constante de Michaelis, Km. 2 EXPERIMENTAL
3 8 7 6

Foram aquecidos aproximadamente 200 cm

3

de gua da torneira em um bquer de

500 cm , mantendo-se a temperatura da gua prxima fervura, para utiliz-la na reao do 3,5dinitrosalicilato (DNS) com os acares dos trs procedimentos a seguir.

2.1 CURVA DE CALIBRAO

3

Foram transferidos 0,20900,0001 g de glicose para um balo volumtrico de 100,00,2 cm

e aferindo-o com gua deionizada. Numerou-se 8 tubos de ensaio de 0 8, onde foram adicionados os volumes de reagentes conforme a Tabela 1. Mediu-se os volumes de gua deionizada com uma pipeta graduada de 2,000,02 cm , da soluo de glicose com uma pipeta graduada de 1,000,01 cm e da soluo do DNS com uma pipeta volumtrica de 1,0000,006 cm .
3 3 3 3

Tabela 1: Volume dos reagentes, em cm , utilizados para o procedimento da curva de calibrao. Reagente \ Tubo Glicose 2 g.dm
*** -3 * **

0 (branco) --1,50 1,000

**

1 0,10 1,40 1,000

2 0,20 1,30 1,000

3 0,30 1,20 1,000

***

4 0,40 1,10 1,000

5 0,50 1,00 1,000

6 0,60 0,90 1,000

7 0,70 0,80 1,000

8 0,80 0,70 1,000

gua deionizada DNS

*

incerteza de 0,01 cm, incerteza de 0,02 cm,

incerteza de 0,006 cm

Aqueceram-se os tubos com os reagentes em banho-maria fervente por 5 minutos. Aps os tubos serem resfriados adicionou-se 7,500,02 cm de gua deionizada com pipeta graduada de 10,000,02 cm , medindo-se em seguida a absorbncia em 540 nm. Realizou-se a regresso linear
3 3

para obter a funo que relaciona a absorbncia medida com a concentrao do 3-amino-5nitrosalicilato (ANS), em unidades de mol.dm . 2.2 DETERMINAO DAS VELOCIDADES INICIAIS PARTE 1
-3

Foram transferidos 1,40180,0001 g de sacarose para um balo volumtrico de 50,00,1 cm . Aferiu-se o balo at o menisco com gua deionizada aps toda a sacarose ter sido dissolvida. Numerou-se 5 tubos de ensaio de 0 5, adicionando-se os volumes de reagentes conforme a Tabela 2. Mediu-se os volumes de gua deionizada com uma pipeta graduada de 2,000,02 cm , da soluo de sacarose 0,08 mol.dm
-3 3 3 3

com uma pipeta graduada de 2,000,02 cm e da soluo

3

tampo com uma pipeta volumtrica de 1,0000,006 cm .

3

Tabela 2: Volume dos reagentes, em cm , para a primeira parte do procedimento de determinao das velocidade iniciais. Reagente \ Tubo Tampo
* ** -3 *** **

0 1,000 1,30 ---

1 1,000 0,80 0,50

*** 3

2 1,000 0,60 0,70

3 1,000 0,40 0,90

4 1,000 0,20 1,10

5 1,000 --1,30

gua deionizada
*

Sacarose 0,08 mol.dm

incerteza de 0,006 cm,

3

incerteza de 0,02 cm,

incerteza de 0,02 cm

Em cada tubo foram adicionados 0,200,01 cm de soluo enzimtica com uma pipeta graduada de 1,000,01 cm , iniciando em seguida a contagem do tempo. Decorridos 5 minutos, adicionou-se rapidamente 1,0000,006 cm da soluo de DNS com o auxlio de uma pipeta volumtrica, colocando-se para aquecer, logo aps, em banho-maria fervente por 5 minutos. Aps resfriar os tubos, adicionou-se 6,500,02 cm
3 3 3

de gua deionizada com pipeta graduada de

10,000,02 cm . Mediu-se a absorbncia da soluo, j homogeneizada, em 540 nm, utilizando uma cubeta de acrlico com caminho ptico de 1 cm. A soluo proveniente do tubo 0 foi usada para definir o zero de absorbncia (branco). Utilizou-se a curva de calibrao para determinar a concentrao de ANS em cada tubo de ensaio. 2.3 DETERMINAO DAS VELOCIDADES INICIAIS PARTE 2.

Foram transferidos 9,49000,0001 g de sacarose para um balo volumtrico de 50,00,1 cm . Aferiu-se o balo at o menisco com gua deionizada aps toda a sacarose ter sido dissolvida. Numerou-se 5 tubos de ensaio de 6 10 juntamente com o branco (tubo 0), adicionando-se os volumes de reagentes conforme a Tabela 3. Mediu-se os volumes de gua deionizada com uma pipeta graduada de 2,000,02 cm , da soluo de sacarose com uma pipeta graduada de 2,000,02 cm e da soluo tampo com uma pipeta volumtrica de 1,0000,006 cm .
3 3 3 3

Tabela 3: Volume dos reagentes, em cm , para a segunda parte do procedimento de determinao das velocidade iniciais. Reagente \ Tubo Tampo
* ** -3 *** **

0 1,000 1,30 ---

6 1,000 1,00 0,30

***

7 1,000 0,90 0,40

8 1,000 0,60 0,70

9 1,000 0,30 1,00

10 1,000 --1,30

gua deionizada
*

Sacarose 0,555 mol.dm

incerteza de 0,006 cm, incerteza de 0,02 cm,

incerteza de 0,02 cm

Em cada tubo foram adicionados 0,200,01 cm de soluo enzimtica com uma pipeta graduada de 1,000,01 cm , iniciando em seguida a contagem do tempo. Decorridos 4 minutos, adicionou-se rapidamente 1,0000,006 cm
3 3

da soluo de DNS com auxlio de uma pipeta

3

volumtrica, colocando-se, logo aps, para aquecer em banho-maria fervente por 5 minutos. Aps resfriar os tubos, adicionou-se 6,500,02 cm
3

de gua deionizada com pipeta graduada de

10,000,02 cm . Mediu-se a absorbncia da soluo, j homogeneizada, em 540 nm, utilizando uma cubeta de acrlico com caminho ptico de 1 cm. A soluo proveniente do tubo 0 foi usada para definir o zero de absorbncia (branco). Utilizou-se a curva de calibrao para determinar a concentrao de ANS em cada tubo de ensaio.

3 RESULTADOS E DISCUSSO

3.1 CURVA DE CALIBRAO

-2 -3

A soluo inicial de glicose possua a concentrao de (1,1600,002)10 mol.dm . Aps a reao da soluo de DNS com a soluo de glicose, foram encontrados os valores presentes na Tabela 4 para concentrao de ANS com suas respectivas absorbncias.

Tabela 4: Valores medidos de absorbncia e de concentrao de ANS temperatura de 20C Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 [ANS] / 10 mol.dm 1,20,1 2,30,1 3,50,1 4,60,1 5,80,1 7,00,1 8,10,1 9,30,1
-4 -3

Absorbncia 0,076 0,208 0,338 0,462 0,527 0,601 0,694 0,718

A partir dos dados da Tabela 4 foi possvel construir uma curva analtica representado na Figura 3.

(a)

(b)

Figura 3: Curva de calibrao da absorbncia versus a concentrao de ANS (a) e o grfico do resduo da absorbncia versus a concentrao de ANS (b) temperatura de 20C. A partir da curva analtica foi possvel obter a equao da reta e do coeficiente de regresso linear (R ) atravs do mtodo dos mnimos quadrados. O coeficiente de correlao linear uma medida da frao da variao total em y que pode ser explicada pela relao linear entre x e y. Quanto mais prximo R estiver de 1, melhor o modelo linear explica as variaes de y. Para a curva analtica da Figura 1 o valor de R obtido foi de 0,9791 e a equao da reta dada pela Equao 1. [( )
-3 2 2 2 9

(1)

Onde C a concentrao de ANS em mol.dm e Abs a absorbncia. 3.2 DETERMINAO DAS VELOCIDADES INICIAIS PARTE 1.

A quantificao do ANS foi realizada em um espectrofotmetro UV-Visvel Varian Mod. Cary 50, no comprimento de onda de 540 nm, sendo a absorbncia diretamente proporcional concentrao na amostra analisada. Para obter a concentrao de ANS e a velocidade da reao enzimtica (v0), foram medidos no espectrofotmetro os tubos contendo as diferentes concentraes de DNS e sacarose, presentes na Tabela 5. Para o clculo da variao de concentrao da sacarose importante saliente que o volume de gua adicionada aps a adio do DNS foi alterado de 6,5 cm para 4,0 cm .
3 3

Tabela 5: Valores da concentrao de sacarose, [S]0, em 10 mol.dm , do inverso da concentrao de sacarose, [S]0 , em mol .dm , do tempo da reao, em s, da concentrao de ANS, em 10
-3 -4 -3 -1 -1 3 -4

-2

-3

mol.dm , da absorbncia, da variao da concentrao de sacarose, -[S], em 10 mol.dm , da velocidade da reao enzimtica, v0, em 10 mol.dm .s
-1 5 -1 3 -1 -6 -3 -1

e do inverso da velocidade da reao -[S] 6,60,4 8,50,5 10,00,6 10,10,6 10,70,6 11,10,7 12,30,7 13,70,8 14,10,8
-1

enzimtica, v0 , em 10 mol .dm .s, temperatura de 20C. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 10 [S]0 / 1,6380,002 2,2930,003 2,9480,004 3,6030,004 4,2590,005 6,6540,008 8,870,01 15,520,02 28,830,04 [S]0 Tempo 2991 3001 3041 3031 3151 2431 2391 2451 2431 [ANS] 4,40,3 5,70,3 6,70,4 6,70,4 7,20,4 5,60,3 6,10,4 6,90,4 7,10,4 Abs 0,383 0,493 0,582 0,585 0,623 0,485 0,535 0,598 0,615 v0 2,20,1 2,80,2 3,30,2 3,30,2 3,40,2 4,60,3 5,10,3 5,60,3 5,80,4 v0

617 445 344 273 243 152 111 6,40,8 3,50,4

4,50,3 3,50,2 3,00,2 3,00,2 2,90,2 2,20,1 1,90,1 1,80,1 1,70,1

A velocidade da reao enzimtica pode ser expressa pela Equao 2, a equao de Michaelis-Menten. ( [ ] [ ] [ ] ) (2)

Onde, kcat o nmero de renovao da enzima, Km a constante de Michaelis, [E]0 a concentrao inicial da enzima e [S]0 a concentrao inicial do substrato. Atravs dos dados da Tabela 5, pode-se obter um grfico da velocidade pela concentrao inicial de sacarose (Figura 4) onde possvel observar a curva de Michaelis-Menten.

(a) Figura 4: Curva de Michaelis-Menten dado pelas velocidades iniciais da reao da sacarose catalisada pela enzima invertase versus a concentrao da sacarose (a) temperatura de 20C.

Observando a Figura 4 possvel perceber que um aumento na concentrao do substrato causa um aumento na velocidade da reao, verifica-se tambm que para concentraes mais elevadas, a velocidade inicial aproxima-se assintoticamente de um valor mximo, mx, indicando que praticamente todas as enzimas presentes no meio esto na forma do complexo enzima substrato (ES), isso est indicado na Equao 3. [ ]

(3)

Um mtodo adequado para a determinao dos valores de max e Km, formulado por Hans Lineweaver e Dean Burk, utiliza o inverso da equao de Michaelis-Menten, de acordo com a Equao 4 [ ]
-1 -1

(4)

A Equao 4 uma equao linear na forma 0 e [S]0 , com isto ao construir o grfico de Lineweaver-Burk ou o grfico dos duplos-recprocos, a inclinao da reta ser Km.mx , a interseco no eixo 0 ser mx . Com os dados da Tabela 5, pode-se obter o grfico do inverso da velocidade versus o inverso da concentrao da sacarose como mostrado na Figura 5. O valor para coeficiente de correlao linear partir do grfico da Figura 5 foi de 0,9754, apresentando a equao da reta como na Equao 5.
-1 -1 -1

[ ]

(5)

(a)

(b)

Figura 5: Curva de Lineweaver-Burk dado pelo inverso das velocidades iniciais da reao da sacarose catalisada pela enzima invertase versus o inverso da concentrao da sacarose (a) e o grfico do resduo das velocidades iniciais versus a concentrao da sacarose (b) temperatura de 20C.

Com isto foi possvel obter os valores de mx como sendo (6,60,4).10 Michaelis e Menten Goody
11 10 -3 -3

-6 -1

mol.dm .s ,

-3

-1

obtiveram uma valor para mx de (0,780,05).10 mol.dm .min e Johnson e

-3

obtiveram (0,800,02).10

mol.dm .min . O valor da constante de Michaelis, Km, foi

-1 -2 -1 12

-3

-1

calculado como sendo (3,20,2).10 mol.L , prximo ao valor de Gscon 2,5 10 mol L . renovao do par invertase/sacarose pela equao 3.2. O valor [ ]
-1 1 -1

-2

A partir do conhecimento do valor de vm , foi possvel realizar o clculo do nmero de foi calculado levando em
12 -

considerao sua molalidade de 0,0001 kg L , massa molar da enzima invertase

3

de 135000 kg.mol
3

e 270000 kg.mol , podendo variar entre 10 e 50 kDa, e que foram utilizados 0,2 cm de invertase, em cada tubo, obtendo-se a concentrao inicial de

sendo o volume final de 2,5 cm ,

-

mol

. vm
cat [ cat .

(3.2)

chegando ao valor igual

para

As cadeias laterais dos aminocidos do stio ativo podem funcionar como cidos ou bases fracas em funes crticas que dependem da manuteno de certo estado de ionizao (pH), e em outras partes da protena, as cadeias laterais ionizveis podem ter uma participao essencial nas interaes que mantm a estrutura proteica, o que torna as enzimas dependentes de pH especficos.
[1][3]

Utiliza-se uma soluo tampo para manter o pH constante durante o processo enzimtico, devido a enzima apresentar um pH (ou uma faixa de pH) na qual a atividade cataltica mxima.
[3][4]

Aps determinado tempo, cessada a reao enzimtica atravs da adio do DNS (3,5dinitrosalicilato), alcalinizando o meio, inibindo assim a ao da enzima, j que o pH da soluo no est mais no pH de funcionamento da enzima. Alm de interromper a reao enzimtica, o DNS utilizado para determinar a converso da sacarose, pela absoro da luz no comprimento de 540 nm no espectrofotmetro UV-Visvel Varian Mod. Cary 50, temperatura de 20C.

4. CONCLUSO Foi possvel realizar o estudo da cintica da inverso da sacarose catalisada pela enzima invertase proveniente de leveduras secas (fermento de po). Tambm foi possvel a determinao da constante de Michaelis e da velocidade mxima da reao enzimtica. Utilizando a curva de calibrao previamente feita, pode-se determinar a concentrao de sacarose nas solues preparadas. Em seguida, pode-se tambm verificar o comportamento da reao em questo proposto por Michaelis-Menten, bem como o de Lineweaver-Burk, o qual utiliza um grfico inverso ao do descrito anteriormente. Foi possvel fazer a determinao dos valores da velocidade mxima, valores de mx como sendo (6,60,4).10 mol.dm .s e (3,20,2).10 mol.L para Km. O valor encontrado na literatura para Km de 0,025 mol.L . Logo, comparando-se o valor obtido experimentalmente com o da literatura tem-se um erro relativo de 28 %. Este erro pode ser decorrente do mtodo utilizado, uma vez que se trabalhou com volumes pequenos e os erros das vidrarias eram relativamente grandes. O
-1 -6 -3 -1 -2 -1

erro relativo encontrado pode decorrer tambm da enzima utilizada, uma vez que por ser um composto biolgico apresenta alta reatividade. Atravs de um grfico de resduo comprovou-se, estatisticamente, que os resultados do experimento mostraram-se efetivos, embora dois pontos no tenham seguido a mesma tendncia. Calculou-se tambm o nmero de renovao da enzima, k cat., obtendo-se o valor de 1,2.10 s e deduziu-se matematicamente que o valor numrico de v0 a metade de vmax Com todos os dados acima descritos, conclui-se que a reao da inverso da sacarose atravs da enzima invertase segue o mecanismo de Michaelis-Menten.
-1 5

5. REFERNCIAS [1] [2] LEVINE, Ira N. Physical chemistry. 6th ed. Boston: McGraw-Hill, c2009. xviii 989 p. ATKINS, P. W.; JONES, Loretta (Autor). Princpios de qumica: questionando a vida

moderna e o meio ambiente. 3. ed. Porto Alegre: Bookman, 2006. [3] [4] [5] [6] [7] LEHNINGER, Albert L. et al. Princpios de Bioqumica. 4. ed. So Paulo: Sarvier, 2006. VOET, Donald; VOET, Judith G. Bioqumica. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. PRATT, Charlotte W.; CORNELY, Kathleen. Bioqumica essencial CAMPBELL, Mary K. Bioqumica. So Paulo: Ed Artmed. 2000. VOLLHARDT, K. Peter C.; SCHORE, Neil E. Qumica Orgnica Estrutura e funo. 4ed.

Porto Alegre: Ed. Bookman, 2004 [8] MILLER, Gail Lorenz. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing

sugar. Analytical chemistry, v. 31, n. 3, p. 426-428, 1959. [9] SKOOG, Douglas A. et al. Fundamentos de qumica analtica. So Paulo: Thomson

Learning, 2006. [10] LINEWEAVER, Hans; BURK, Dean. The determination of enzyme dissociation constants. Journal of the American Chemistral Society, v. 56, n. 3, p. 658-666, 1934 [11] JOHNSON, Kenneth A.; GOODY, Roger S. The original Michaelis constant: translation of the 1913 Michaelis-Menten paper. Biochemistry, v. 50, n.39, p. 8264-8260, 2011 [12] GSCON S., NEUMANN N. P.; LAMPEN J. O. Comparative study of the properties of the purified internal and external invertase from yeast. The Journal of Biological Chemistry, v.3, p. 3338, 1981