Vetores: Clonagem e expresso

Mota
adolfo.mot@gmail.com 27/02/2013

Contigs e consensos

Clonagem molecular
Etapa essencial para o estudo de genes de qualquer organismo com genoma mais complexo do que alguns poucos milhares de pares de bases. O objetivo isolar e produzir em grande quantidade, a seqncia de DNA de interesse. Obter um clone de DNA significa produzir, geralmente usando uma bactria como fbrica, uma quantidade suficiente do segmento de DNA em questo. O fragmento de DNA que ser clonado dever ser ligado a um plasmdeo vetor capaz de se replicar dentro da bactria. A reao de ligao entre DNAs portanto etapa fundamental do processo.

Reao de ligao de fragmentos de DNA pela enzima DNA ligase em diferentes situaes. A energia do ATP necessria para refazer a ligao covalente entre grupamento -OH (3) e o grupo fosforil (5): 3 5

Origem dos vetores de clonagem

Foram construdos a partir de segmentos escolhidos, obtidos de plasmdeos naturais de E.coli; Plasmdeos naturais variam, quanto extenso, de alguns milhares de pares de bases at mais de 100 kb; Com a crescente utilizao de antibiticos ocorreu uma verdadeira evoluo dos plasmdios alguns contendo vrios genes de resistncia s drogas; Esses plasmdeos tm sido manipulados para otimizar seu uso como vetores de clonagem:
Seu comprimento reduzido ~ 3 kb Contm basicamente as sequncias essenciais para a clonagem do DNA: origem de replicao, um gene de resistncia drogas e uma regio onde o DNA exgeno possa ser inserido

Plasmdeos codificam protenas que:

Conferem resistncia a antibiticos Conferem resistncia a metais pesados So enzimas de restrio do DNA Produzem aminocidos raros Conferem sensibilidade a agentes mutagnicos Conferem sensibilidade ou resistncia a infeco por fagos Determinam a virulncia, etc ...

Um vetor de clonagem molecular de DNA normalmente tem 3 caractersticas importantes: tem origem de replicao (ori), um marcador de seleo (como o gene de resistncia ampicilina) e uma regio na qual existam stios para enzimas de restrio teis para as manipulaes da clonagem.

ORI
Origem de replicao (replicator, replicon): uma sequncia especfica do plasmdeo, com cerca de 1000 pb, na qual tem incio a replicao do DNA. Neste local h um conjunto de elementos regulatrios envolvidos no controle do nmero de cpias do plasmdeo que sero feitas numa nica bactria.
No pBR322: replicon pMB1 cpias/clula No pBlueScript: forma mutada do mesmo replicon h h produo de 15 a 20

produo de 500 a 700 cpias/clula

O stio de clonagem de um vetor moderno uma regio que contm 5 ou mais stios de clivagem para diferentes enzimas de restrio que aparecem uma nica vez neste vetor. Genomas digeridos com estas enzimas podem ser convenientemente ligados ao vetor constituindo um inserto e resultando em uma molcula de DNA recombinante.

Otimizando a produo de plasmdeos recombinantes

fcil imaginar que aps a ligao entre o vetor e os fragmentos de DNA vamos ter muitas possibilidades:
fragmento com fragmento, vetor recircularizado, vetor com dois insertos ligados entre si, vetor ligado a um inserto (o que desejamos)

Podemos aumentar a probabilidade de obter o resultado desejado removendo os grupos fosfato da extremidade 5 do DNA do vetor tratado com a enzima de restrio:
usamos uma fosfatase

Este vetor no pode se religar mas pode aceitar um inserto que esteja com os grupos fosfato presentes na extremidade 5 - a DNA ligase liga apenas uma cadeia de cada lado e depois, dentro da bactria se faz o reparo final

Tecnologia TOPO TA

DH5-alfa Bactria Hospedeira

Blue/white screening

5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole Galactose

Blue/white screening

Vetores de clonagem muito usados:

Vetores plasmidiais: vetores para segmentos curtos, permitem clonar segmentos entre 100 a 10.000 (20.000) pares de bases (necessrios para as etapas de sequenciamento do DNA) Vetor cosmidial ou cosmdeo: vetores para segmentos de tamanho mdio, permitem clonar segmentos entre 35 a 45 milhares de pares de bases YAC ou cromossomo artificial de levedura: vetores para clonar grandes segmentos, permitem clonar fragmentos de 100.000 a 2 milhes de pares de bases.

Clonagem em cosmdeos Os

vetores cosmidiais so apropriados para a clonagem de fragmentos ainda maiores de DNA: 35 a 45 kpb; Utilizam seqncias dos vetores plasmidiais e os stios COS do fago lambda que so as seqncias reconhecidas pelas enzimas de empacotamento Nu1 e A que ao se ligarem no stio COS orientam o preenchimento do capsdeo com o genoma viral; Este sistema tambm apresenta alta eficincia de transformao na bactria.

Vetor de clonagem tipo YAC: cromossomo artificial de levedura Estes vetores permitem segmentos at 1000 Kb. Necessidade de trs seqncias de DNA: clonar de

tipos

ARS (seq de replic autnoma) origem de replicao CEN seqncia centromrica (necessria para a segregao eficiente do cromossomo)

TEL (T) seqncia telomrica (necessria replicao do DNA)

O vetor propagado em E.coli; Para a ligao do fragmento de DNA grande ovetor digerido com enzima que liberta os telmeros (T) e outra que abre o vetor no stio de clonagem (SmaI)

Vetores de expresso tpicos tm:

- Promoters que dirigem a sntese de grande quantidade de mRNA do gene que se quer expressar - Sequncias que permitam a replicao autnoma em bactria (origem de replicao) - Sequncias que codificam traos genticos que possibilitam reconhecer as clulas que contm o vetor - Sequncias que aumentam a eficincia da traduo do RNA Existem trs estratgias essenciais para expressar protenas: - Expresso em E. coli Vantagem: simplicidade e baixo custo - Expresso em sistema com baculovirus Vantagens: expresso em grandes quantidades, e as protenas frequentemente so expressas no compartimento subcelular correto e corretamente processadas. - Expresso em clulas de mamferos Vantagens: Quase sempre as protenas so expressas no compartimento subcelular correto e corretamente processadas. Difcil produzir em larga escala.

Promotor: A transcrio do gene alvo em procariotas controlada por dois sistemas bsicos: - tac promoter, reconhecido pela RNA polimerase de E. coli. - T7 promoter de bacterifago, reconhecido pela T7 RNA polimerase (este tem a vantagem de propiciar uma expresso
muito baixa na ausncia de induo Ex. de plasmdeo de expresso com este promotor: pET).

Inicialmente, o vetor com o cDNA a ser expresso propagado numa bactria que no tem o gene da T7 RNA polimerase. O plasmdeo recombinante em seguida purificado e sequenciado. Em seguida, o plasmdeo j estabelecido transferido para uma linhagem bacteriana de expresso contendo um gene da T7 RNA polimerase.

Os sistemas indutveis so os mais adequados para expresso em E. coli, porque altos nveis de protena heterloga podem ser letais para a bactria. Os vetores ideais para expresso em E. coli devem ter: - Um promotor indutvel - O sinal de trmino de transcrio - Um enhancer opcional - Um stop codon - Gene de resistncia a antibitico - Origem de replicao que determina o nmero de cpias do plasmdeo na clula.

Exemplo
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