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}os Cailos Rouiiguez Rey, }aviei Leon Seiiano, N" Boloies Belgauo villai y }ess Navas Nnuez
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3.4(-"() 5
)(-"6"7)7 +89"'4-"() 0 7+-+.'"8)("18 7+ 3.#-+&8), -#-)/+,
#:;<=>?@A
- Intiouucii en la ueteiminacion ue la concentiacion ue pioteinas en plasma sanguineo.
- Entenuei y piacticai los piincipios ue la espectiofotometiia.
- Apienuei a manejai pipetas automticas.
- Familiaiizaise con el concepto ue activiuau enzimtica y su utilizacion en clinica.
- Calculai velociuaues ue ieaccion.
- 0tilizai mtouos gificos paia el clculo ue KN y velociuau mxima ue los enzimas.
BC "D=E@FGHH>ID J KJ F<=<EL>DJH>ID F< ME@=<NDJA =@=JK<A
La AJDOE< est foimaua poi una solucion acuosa que contiene molculas ue tamao vaiiable y
uiveisos tipos ue elementos celulaies. Los elementos foimes ue la sangie se encuentian foi-
manuo una suspension en agua uenominaua MKJALJ. Aunque el plasma es el meuio natuial ue
las clulas sanguineas, la mayoiia ue las ueteiminaciones quimicas se hacen en AG<E@. Las
pioteinas uel plasma pueuen clasificaise en uos giupos: las que son sintetizauas poi el higauo
(albmina) y las inmunoglobulinas (piouuciuas poi las clulas plasmticas ue la muula
osea). El plasma humano tiene una concentiacion en pioteinas ue 6u-8u gL (fiecuentemente
se expiesa en guL; 6-8 gul). Casi la mitau ue esta pioteina plasmtica es JK:PL>DJ, cuyo
iango ue concentiacion es SS-4S gL. La albmina es una pioteina ue 62.uuu B que acta co-
mo pioteina ue ieseiva, auems ue impoitante tianspoitauoi (ciuos giasos, biliiiubina y fi-
macos) y iegulauoi osmotico. Es piouuciua poi el higauo. Su concentiacion aumenta en casos
ue ueshiuiatacion y uisminuye en casos ue ascitiseuema y uao heptico seveio.
La ueteiminacion ue la concentiacion ue pioteinas en sangie pueue sei llevaua a cabo poi ui-
feientes mtouos. En esta pictica vamos a utilizai uno ue los mtouos que se utilizan con
ms fiecuencia: el mtouo ue Biuiet. En l la uisolucion ue pioteina se mezcla con un ieactivo
que ueteimina que apaiezca o se intensifique un coloi (azul) que se cuantifica miuienuo la ab-
soibancia a una ueteiminaua longituu ue onua fiente a un blanco ue ieactivo. El coloi geneia-
uo es poco estable y uepenue ue las conuiciones ue ieaccion, poi lo que hay que iealizai una
cuiva pation con soluciones ue una pioteina ue concentiacion conociua (albmina bovina).
La base teoiica ue la aplicacion ue la espectiofotometiia paia meuii la concentiacion ue una
sustancia en solucion se explica en la Intiouuccion ue este Nanual ue Piacticas.
'J=<E>JK<A
- Soluciones ue sueio sanguineo A y B ue concentiacion uesconociua.
- Soluciones ue pioteina pation (albmina ue sueio bovina) ue concentiaciones conociuas.
- Reactivo ue Biuiet.
- Pipetas.
- Tubos.
- Agitauoies.
- Rotulauoi.
- Espectiofotometios (Coloiimetios).
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7<=<EL>DJH>ID M@E <K LQ=@F@ F< !>GE<=
La concentiacion ue pioteinas se meuii utilizanuo el mtouo uel Biuiet, que se basa en la foi-
macion ue un complejo coloieauo o ciomofoio, ue coloi azul-pipuia, entie el ion cobie y los
enlaces peptiuicos a pB alcalino. Se iequieie un minimo ue uos enlaces peptiuicos paia la foi-
macion uel complejo coloieauo, que se miue a SSu nm. Es un mtouo poco sensible peio muy
pieciso, ya que la abunuancia ue giupos peptiuicos (poi uniuau ue masa ue pioteina) es pic-
ticamente la misma en cualquiei pioteina.
'Q=@F@
1) Numeiai 7 tubos.
2) Aauii al tubo 1 1uu l ue agua uestilaua (tubo "blanco").
" " 2 1uu l ue solucion ue pioteina 2u gL.
" " S " l " " " 4u gL.
" " 4 " l " " " 6u gL.
" " S " l " " " 8u gL.
" " 6 " l " " " pioblema A.
" " 7 " l " " " pioblema B.
S) Aauii 4 ml ue ieactivo ue Biuiet a touos los tubos.
4) Nezclai el conteniuo ue caua tubo.
S) Espeiai S min. paia que se uesaiiolle el coloi. Neuii la absoibancia a SSu nm ajustanuo a
ceio con el tubo 1 ( blanco).
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S
.<AGK=JF@A
- En una hoja ue papel milimetiauo constiuii una gifica ue A
SSu
(eje y) fiente a concentia-
cion ue pioteina (eje x) ue las soluciones pation (tubos 2-S). Naicai el eje ue las x en gl ue
pioteina.
- Beteiminai la concentiacion ue las soluciones pioblema A y B inteipolanuo en la gifica
pation los valoies ue las soluciones pioblema A y B. Expiesailo en gL.
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5C "D=E@FGHH>ID JK <A=GF>@ F< KJ H>DQ=>HJ <DR>LS=>HJC T@AUJ=JAJ )KHJK>DJ
Los enzimas son los catalizauoies ue las ieacciones bioquimicas. La meuiua ue la activiuau ue
un enzima y la compiension ue las vaiiables que la afectan es impoitante no solo paia enten-
uei la biologia ue la clula sino tambin paia el uiagnostico clinico. Cuanuo se piouucen lesio-
nes celulaies como inflamacion o neciosis ue los tejiuos, cieitas enzimas pasan al plasma y sus
niveles en l aumentan. Estos niveles enzimticos en plasma se analizan paia uetectai la en-
feimeuau y llegai al uiagnostico uifeiencial. 0na concentiacion anoimalmente alta ue una en-
zima en sangie (ieflejaua en una alta activiuau enzimtica) pueue sei uebiua a la uestiuccion
ue clulas ue un tejiuo iico en uicho enzima o al aumento uel nmeio ue clulas, como ocuiie
en los tumoies. Poi el contiaiio una baja activiuau enzimtica pueue inuicai un tiastoino uel
tejiuo en cuestion. Los niveles enzimticos tambin son tiles paia vigilai el cuiso uel tiata-
miento. Poi tanto, la enzimologia clinica es un aspecto funuamental uel laboiatoiio clinico.
En esta pictica, empleaiemos el enzima fosfatasa alcalina como mouelo. Las fosfatasas alcali-
nas son un giupo ue enzimas que piesentan su mxima activiuau a pB 9-1u,S y catalizan la hi-
uiolisis ue steies monofosfato. La ieaccion enzimtica geneial ue la fosfatasa alcalina es:
B
2
0 + R-P0
4
B
2-
R-0B + P0
4
B
2
-

Las uistintas fosfatasas alcalinas son isoenzimas, catalizan la misma ieaccion aunque poseen
piopieuaues uifeientes. Se encuentian ampliamente uistiibuiuas en los tejiuos humanos tales
cono hueso, placenta, intestino, bazo y iion y se uesconoce su funcion biologica piecisa. Los
niveles ue fosfatasa alcalina en plasma son la suma ue los isoenzimas pioceuentes ue los uis-
tintos oiganos. Los valoies noimales ue activiuau fosfatasa alcalina en plasma son ue Su a
1uu0L (molesminL ue sueio). El aumento ue activiuau fosfatasa alcalina en plasma se ob-
seiva en uiveisas afecciones y su significauo clinico se ielaciona piincipalmente con la uetec-
cion ue enfeimeuaues oseas (tumoies oseos, osteomalacias) y hepticas (obstiuccion biliai,
cncei).
Auems en esta pictica apienueiemos a calculai los uos piincipales paimetios cinticos ue
los enzimas (constante ue Nichaelis y velociuau mxima) paia lo cual se utilizai la iepiesen-
tacion ue uobles iecipiocos uesaiiollaua poi Lineweavei y Buik.
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S
7<AHE>MH>ID F< KJ MESH=>HJ
En la piesente pictica se usai sueio como fuente ue fosfatasa alcalina. La activiuau enzim-
tica se meuii utilizanuo el p-nitiofenil-fosfato (p-NFF) como sustiato. Poi accion uel enzima
ste se hiuioliza a fosfato y p-nitiofenol (pNF) segn la siguiente ieaccion:

El p-nitiofenol (pNF) en solucion alcalina es amaiillo y su concentiacion pueue sei ueteimina-
ua espectiofotomtiicamente. La absoibancia ue la solucion (intensiuau uel coloi amaiillo) es
una meuiua ue la concentiacion uel piouucto.
La pictica tiene uos paites:
1. !"#$%&'(()*# ,- ./ ('&0/ 1/%&*# ,-. 12#)%&"3-#".4 Se ueteiminai la ielacion entie absoiban-
cia y concentiacion uel p-nitiofenol.
54 63-(%" ,- ./ ("#(-#%&/()*# ,- $'$%&/%". Se calculai la Km y vmax ue la fosfatasa alcalina.
'J=<E>JK<A
- Tubos y pipetas.
- Agua uestilaua.
- Tampon Tiis 1u mN pB 9,6.
- Soluciones ue p-nitiofenol (pNF).
- Soluciones ue p-nitiofenil-fosfato (p-NFF).
- Na0B u,2N.
- Sueio humano.
- Espectiofotometio.
- Bao a S7C.
- Calculauoia.
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BC .<H=J MJ=EID F< MVD>=E@U<D@K
Piepaiai los siguientes tubos pation ue p-nitiofenol (pNF, piouucto):
-%!# !KJDH@ B 5 W X
Tiis pB 9,6 2,2 ml 2,2 ml 2,2 ml 2,2 ml 2,2 ml
Agua uestilaua 1 ml
Soluciones pation pNF
1ml
(1SN )
1ml
(SuN)
1ml
(6uN)
1ml
(9uN)
- Nezclai bien.
- Seleccionai en el espectiofotometio la longituu ue onua ue 4uu nm (mximo ue absoicion
uel pNF).
- Ajustai el "ceio" ue absoibancia con el tubo uel blanco.
- Neuii la absoibancia ue touos los tubos y anotai los valoies obteniuos.
.<AGK=JF@A
Repiesentai gificamente la iecta pation: absoibancias (en oiuenauas) fiente a concentiacio-
nes ue p-nitiofenol (en abscisas).
Recta pation
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5C +U<H=@ F< KJ H@DH<D=EJH>ID F< AGA=EJ=@ Y HSKHGK@ F< KJ ZL Y 6LJ[
Piepaiai 6 tubos maicauos convenientemente y aauii lo siguiente:

-%!# B 5 W X \ ]

T Tiis pB 9,6 2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 2,1 (ml)
Agua uestilaua 1 --- --- --- --- --- "
PNFF * --- 1(2,S) 1(S) 1(7) 1(1u) 1(1S) "
Sueio u,1 u,1 u,1 u,1 u,1 u,1 "
* volmenes en ml. 1(2,S) significa 1 ml ue una solucion 2,S mN ue p-nitiofenol fosfato
- Nantenei los tubos en hielo. Nezclai bien e incubai S min a S7C.
- Aauii u,S ml Na0B u,2N paia uetenei la ieaccion. Nezclai.
- Ajustai el "ceio" uel spectionic con el tubo uel blanco y meuii la A
4uu
nm.
.<AGK=JF@A
9. Calculai la velociuau inicial (v) en caua tubo expiesaua aen nmoles p-N-fenolmin.
1u. Repiesentai 1v fiente a 1S (iepiesentacion ue Lineweavei-Buik) en la gifica ue la p-
gina siguiente.
11. Calculai la Km y vmax. Cules son sus uniuaues.

Tubo 2 Tubo S Tubo 4 Tubo S Tubo 6
|Sj
A
4uunm
|pNFj calculaua en la iecta pation


vu (nmoles pNFmin)
1|Sj
1vu
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8
Repiesentacion ue 1v fiente a 1S