S. Sol, T. Pedro, H. Ferreira, C. M. P.

Rodrigues
Centro de Patognese Molecular Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa Av. das Foras Armadas 1600-083 Lisboa

Editado por Rui Gomes e Cristina Bastos

Conceitos gerais
A apoptose ou morte celular programada um acontecimento comum, tanto em situaes patolgicas, contribuindo para fenmenos de inflamao e de disfuno orgnica, como em situaes fisiolgicas, no decurso de processos de embriognese e metamorfose. As caspases so proteases que desempenham um papel central na apoptose e, consequentemente, constituem alvos farmacologicamente atractivos para a inibio e/ou potenciao da apoptose. A activao das caspases durante a apoptose ocorre por um de dois mecanismos: i) activao de receptores de morte celular; ii) perturbao mitocondrial. A inibio da apoptose poder ajudar a combater doenas inflamatrias, do tipo agudo ou crnico, enquanto que a induo da apoptose em clulas T auto-reactivas, poder proteger de doenas auto-imunes. Por fim, a induo selectiva da apoptose em clulas malignas constituir uma estratgia excelente para o tratamento de doenas cancergenas.

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A nica certeza da vida a morte! De facto, os mecanismos fisiolgicos de morte celular so essenciais como estratgia defensiva para remover clulas mutadas ou infectadas, como reposta a fenmenos de citotoxicidade ou, ainda, para um desenvolvimento embrionrio normal. Nesta batalha entre a vida e a morte, a remoo de clulas indesejveis nos organismos multicelulares ocorre por um de dois processos a necrose ou a apoptose ou, mesmo por ambos. Se no passado

os especialistas acreditavam que estes processos ocorriam independentemente um do outro, so agora reconhecidos como co-existindo em muitas situaes de sade ou de doena, sendo por vezes difcil dissoci-los. Esta dificuldade emergiu no s porque existem algumas caractersticas comuns aos dois tipos de morte celular, mas tambm porque frequente a ocorrncia de necrose e apoptose, em simultneo, na mesma clula. Torna-se, por isso, muitas vezes ambguo e problemtico distinguir com exactido estes dois processos, apesar da existncia de algumas caractersticas morfolgicas e bioqumicas diferenciadoras (Tabela 1).

Tabela 1 Caractersticas morfolgicas, bioqumicas e fisiolgicas que distinguem a necrose da apoptose

Caractersticas

NECROSE
Perda da integridade membranar Lise total da clula

APOPTOSE
No h perda da integridade membranar Agregao e marginalizao da cromatina Diminuio do volume citoplasmtico e condensao do ncleo Fragmentao da clula em corpos apoptticos Aumento da permeabilidade mitocondrial Processo altamente regulado, envolvendo activao

Morfolgicas

No h formao de vesculas Desintegrao dos organitos celulares

Perda da regulao da homeostasia inica

enzimtica Dependente de ATP Digesto no aleatria do DNA Libertao de vrios factores mitocondriais Activao da cascata de caspases Alteraes na assimetria da membrana plasmtica

Bioqumicas

No requer energia Digesto aleatria do DNA

Afecta grupos de clulas Iniciada por estmulos no fisiolgicos

Afecta clulas individuais Induzida por estmulos fisiolgicos Fagocitose por clulas adjacentes ou por macrfagos Sem resposta inflamatria

Fisiolgicas

Fagocitose por macrfagos Resposta inflamatria

Necrose ou apoptose: quando e porqu?

De um modo geral, a necrose ocorre quando existe um colapso da homeostasia celular, isto , sempre que a clula sofre variaes extremas das suas condies fisiolgicas, como a hipotermia ou a hipxia, sendo acompanhada por lise da membrana celular e subsequente libertao de componentes intracelulares para o exterior. Como consequncia deste processo catastrfico, a
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necrose provoca quase sempre inflamao. Pelo contrrio, a apoptose um processo de morte celular activo, mas silencioso, que ocorre em condies fisiolgicas, de resposta a uma variedade de estmulos fisiolgicos ou patolgicos e em que a clula participa na sua prpria destruio. Normalmente, como no h perda da integridade membranar, a apoptose no acompanhada de reaces inflamatrias drsticas. A apoptose , assim, a forma mais generalizada de morte celular, com especial relevncia para o perodo de desenvolvimento embrionrio, onde participa activamente nos processos de organognese e de involuo. Est, tambm, envolvida em processos de metamorfose relacionados com metaplasias, em quadros de alterao hormonal, como na menopausa, envolvendo clulas endometriais, nos tumores em fase de regresso ou de intensa proliferao e em muitas doenas virais. Por exemplo, quando ocorrem leses no DNA, que podem no s interromper o desenvolvimento embrionrio como ainda induzir a transformao de clulas normais, os nveis de expresso da protena p53, indutora de apoptose e, por isso, anti-tumoral, so imediatamente aumentados, desencadeando a eliminao das clulas lesadas. No entanto, e apesar do seu importante papel, a apoptose em nveis elevados pode ser tambm responsvel pelo aparecimento de inmeras situaes patolgicas, como a colestase, as doenas neurodegenerativas, o enfarte de miocrdio e o envelhecimento precoce, entre outras. Pelo contrrio, a apoptose muito reduzida em doenas auto-imunes e no cancro. Este tipo de morte celular exige, por isso, um processo de regulao muito fino, onde o destino de viabilidade ou de morte determinado pelo balano entre as protenas anti e pro-apoptticas. A percentagem de erro na regulao da apoptose dever ser, ento, igual a zero, para que a clula no siga o caminho indesejado.

Como decorre o processo apopttico?

A apoptose, por vezes tambm designada de morte celular programada, caracteriza-se pela ocorrncia de vrias alteraes morfolgicas nas clulas afectadas, nomeadamente ao nvel da simetria dos folhetos fosfolipdicos da membrana, condensao e agregao da cromatina e fragmentao nuclear, terminando com a formao de corpos apoptticos. Estas alteraes morfolgicas so o reflexo de uma sucesso de acontecimentos bioqumicos que culminaram na activao de uma famlia de proteases de cistena, conhecidas como caspases, as quais possuem especificidade para resduos de cido asprtico. As caspases, uma vez activadas, clivam uma variedade de protenas e substratos importantes para a viabilidade celular, numa funo considerada de execuo, sendo as proteases envolvidas designadas de caspases executoras.

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As caspases residem na clula sob pro-formas inactivas, sendo, na maioria dos casos, activadas por clivagem proteoltica. Esta activao consiste na remoo do pro-domnio aminoterminal e na clivagem do polipptido restante, resultando numa subunidade grande e numa subunidade pequena, que constituiro a enzima funcional. A via maioritria de activao das caspases executoras processa-se segundo a aco de outras proteases, designadas de caspases iniciadoras, requerendo estas a ajuda de protenas adaptadoras, as quais se ligam aos motivos de interaco proteica localizados ao nvel dos pro-domnios. A ligao do adaptador promove, assim, a activao das caspases iniciadoras que, de seguida, podem clivar e activar as caspases executoras. As molculas adaptadoras estabelecem, deste modo, a ponte entre os eventos de sinalizao e a activao das caspases, definindo duas vias gerais para a apoptose mitocondrial e a via dos receptores de morte (ver Figura 1 e Caixa). a via

Estmulo apopttico (ligando)

Receptor de morte

Estmulo apopttico
Membrana plasmtica

Bax
Adaptador Pro-caspase-8

Bcl-2 ou Bcl-xL

Mitocndria

Clivagem da Bid Citocromo c Caspase-8 Caspase-9

Pro-caspase-3 Pro-caspase-9 Apaf-1

Caspase-3
Clivagem da polimerase poli(ADP-ribose)

Apoptose

Figura 1 Apoptose mediada pela via mitocondrial, pela via dos receptores de morte ou, ainda, pela convergncia de ambas.

Exemplos de doenas que resultam de elevados nveis de apoptose

Doenas Hepticas Numa grande variedade de doenas hepticas, como os carcinomas ou as doenas virais e imunolgicas, foram observadas alteraes morfolgicas e bioqumicas caractersticas de um
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processo de morte celular por apoptose. Parece, tambm, claro que a acumulao de cidos biliares hidrfobos no interior do hepatocito poder desempenhar um papel central nas leses hepticas durante a colestase, a qual ocorre em muitas doenas hepticas crnicas incluindo a cirrose biliar primria, a obstruo maligna e iatrognica dos ductos biliares e a atrsia biliar. A toxicidade induzida pelos cidos biliares hidrfobos foi durante muito tempo caracterizada pelo aumento de volume do hepatocito, destruio da membrana plasmtica e libertao dos constituintes celulares, tendo tal poder citotxico sido atribudo capacidade detergente daqueles compostos. Hoje, acredita-se que os cidos biliares hidrfobos, essenciais para a absoro intestinal de gorduras, so tambm capazes de induzir a morte celular por apoptose no tecido heptico in vivo, bem como em culturas primrias de hepatocitos de rato e em linhas celulares de hepatoma humano. A induo da apoptose pelos cidos biliares hidrfobos parece envolver a libertao de citocromo c, como resultado de stress oxidativo, o qual por sua vez aumenta a actividade de caspases especficas, resultando na fragmentao de DNA. Esta activao das capases pode, ainda, estar associada induo da protease cistena catepsina B, que tem um papel importante como enzima efectora durante a apoptose. Foi tambm recentemente descrita uma via dependente da activao do Fas, onde os cidos biliares hidrfobos parecem actuar como indutores importantes. Contrariamente aco txica dos cidos biliares hidrfobos, o cido ursodeosoxiclico um forte inibidor da apoptose, por prevenir a libertao mitocondrial de citocromo c, inibindo a subsequente activao das caspases e a clivagem da polimerase poli-(ADP-ribose). A famlia de protenas Bcl-2 tambm expressa no fgado. A este nvel, a Bcl-2 capaz de inibir a apoptose por prevenir a oxidao dos constituintes celulares como o DNA, para alm de impedir a maturao e libertao de corpos apoptticos suprimindo a activao das caspases. Por outro lado, a protena Bax pode ligar-se ao megaporo de transio da permeabilidade mitocondrial, juntamente com o translocador do nucletido adenina, aumentando a permeabilidade da membrana da mitocndria e desencadeando a morte celular. Doenas Neurodegenerativas A morte prematura de clulas neuronais tem sido muitas vezes associada ao aparecimento de doenas neurodegenerativas, como as doenas de Alzheimer, de Parkinson e de Huntington. No crebro de um doente de Alzheimer encontram-se mltiplas placas senis, que contm um ncleo de substncia amilide predominantemente constitudo pelo pptido -amilide, rodeado por clulas mortas. Segundo muitos investigadores, a deposio de -amilide no crebro desencadeia a

apoptose por activao de uma caspase iniciadora, conduzindo leso cerebral que est na origem dos sinais e sintomas da doena. Na doena de Parkinson, por outro lado, ocorre um
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decrscimo progressivo do nmero de clulas que constituem uma estrutura nervosa designada por substncia negra e que produzem dopamina. Estas clulas morrem naturalmente em todas as pessoas, mas terminam o seu ciclo de vida a um ritmo muito mais acelerado nos doentes parkinsnicos, manifestando-se a doena quando apenas restam 20% das clulas iniciais. Muitos investigadores constataram que a doena de Parkinson tambm est associada a elevados nveis de apoptose, onde o stress oxidativo e a mitocndria parecem estar envolvidos. Esta doena pode, em alguns casos, ser hereditria ou pode, ainda, ser o resultado da aco txica de substncias que existem no ambiente e que entram na composio de colas, tintas, petrleos, entre outros. Esta ltima convico assenta na descoberta do xenobitico MPTP, com uma estrutura semelhante ao paraquat presente nos herbicidas e pesticidas, o qual provoca, quer in vitro quer in vivo, morte celular por apoptose e sintomas semelhante aos da doena de Parkinson. Por ltimo, na doena de Huntington ocorre uma perda progressiva de neurnios especficos na regio do estriado, com correspondente decrscimo das capacidades motoras e cognitivas do indivduo. Neste caso a sequncia expandida de poliglutamina presente na protena huntingtina, sintetizada pelos doentes, que parece induzir alteraes mitocondriais, stress oxidativo e apoptose, responsveis pela patognese da doena. A fragmentao do DNA tambm tem sido observada nas clulas do estriado destes doentes sugerindo, novamente, que os elevados nveis de apoptose podero estar na origem da doena. Por outro lado, a administrao a ratos de cido 3-nitropropinico provoca apoptose no estriado, induzindo alteraes neuroqumicas e anatmicas caractersticas da doena de Huntington. Utilizando este modelo animal tem sido possvel demonstrar o envolvimento da mitocndria no processo apopttico desencadeado na doena de Huntington.

Qual a estratgia a seguir para controlar nveis desajustados de apoptose?

Actualmente, existem vrios estudos em curso na rea da apoptose, cujo objectivo a identificao de molculas alvo sobre as quais se dever actuar farmacologicamente, no sentido de impedir o processo de doena. Uma das ideias ser a de utilizar os antagonistas dos receptores de morte, assim como os inibidores de capases, na expectativa de prevenir a apoptose em doenas inflamatrias ou destrutivas. Pela sua pequena toxicidade e pelas propriedades inibidoras da apoptose que apresenta, o cido ursodesoxiclico a que acima nos referimos, poder ser um meio teraputico poderoso no tratamento de doenas hepticas, neurodegenerativas ou outras, cuja patognese esteja associada a elevados nveis de apoptose. Outra via de investigao diz respeito potenciao da apoptose em clulas cancerosas, por recurso a ligandos dos receptores de morte, bem como a inibidores da expresso de protenas anti-apoptticas. Assim, este mecanismo de morte
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celular, em primeira instncia considerado anti-natura, poder tambm ser utilizado pelo organismo para impedir o crescimento de clulas que se tornaram imortais.

Apoptose mediada pela via mitocondrial

A via mitocondrial envolve membros pro-apoptticos da famlia Bcl-2 e, mais precisamente, elementos da sub-famlia BH3 (Figura 1). Estas protenas, que incluem a Bid, a Bim, a Harakiri, a Noxa, entre outras, possuem apenas um dos domnios de homologia (o BH 3) caractersticos da famlia Bcl-2. Em resposta a um estmulo, comprometem um outro conjunto de membros proapoptticos, a sub-famlia da Bax, que inclui a Bax, a Bak e, provavelmente, a Bok, que normalmente se encontram fracamente associados membrana externa da mitocndria, prevalecendo maioritariamente no citosol. A interaco entre protenas das subfamlias BH3 e Bax leva oligomerizao dos elementos do ltimo grupo, seguida de insero na membrana externa da mitocndria. Estas molculas passam, ento, a constituir canais de sada de protenas intermembranares desde a mitocndria at ao citoplasma, incluindo o citocromo c e o factor indutor da apoptose. O citocromo c, uma vez libertado, activa uma protena citoplasmtica designada de Apaf-1, a qual recruta e activa a pro-caspase-9, constituindo um complexo proteico denominado de apoptossoma. A caspase-9, na sua funo de caspase iniciadora, ir requerer e activar a caspase-3 executora, a qual degradar protenas importantes para a viabilidade celular e, tambm, outras caspases. As protenas Bcl-2 e Bcl-XL, membros anti-apoptticos da famlia Bcl-2, bloqueiam a morte celular por prevenirem a libertao das protenas intermembranares da mitocndria. No entanto, uma vez ultrapassada a fase de morte celular que envolve este organito, as protenas anti-apoptticas deixam de ter qualquer efeito na inibio da apoptose. As protenas pro-apoptticas e as anti-apoptticas pertencentes famlia Bcl-2, podem interactuar entre si atravs dos domnios de homologia BH, formando homo e heterodmeros e regular, assim, reciprocamente, as suas funes. Por outro lado, a funo das caspases executoras tambm pode ser modulada por um outro tipo de protenas, as IAPs ( inhibitor of apoptosis proteins), que se podem ligar caspase-9 e inibir a sua actividade de protease, bloqueando a este nvel o processo apopttico. Contudo, tambm a actividade destas protenas pode ser regulada por uma outra protena de nome duplo Smac/DIABLO, a qual, juntamente com o citocromo c, libertada do espao intermembranar da mitocndria durante a apoptose. A Smac/DIABLO associa-se s IAPs e inibe a sua aco, permitindo a activao da caspase-9 a partir do complexo Apaf-1 e, consequentemente, favorecendo a apoptose.

Apoptose mediada pela via dos receptores de morte

Paralelamente via mitocondrial, ocorre tambm a via dos receptores de morte, que vo desencadear a activao das caspases a partir de diferentes tipos de apoptossomas (Figura 1). Existem muitos receptores de morte, sendo os mais conhecidos, o receptor para o factor de necrose tumoral, o receptor para o ligando Fas/CD95 e, ainda, o receptor DR3. Esta via exige, sempre, que um determinado ligando interaja com o seu receptor atravs de protenas adaptadoras, como por exemplo a protena FADD ( Fas associated death domain ). Estas protenas adaptadoras requerem a presena de pro-caspases, em particular a pro-caspases8 e a pro-caspase-10, que quando clivadas activam as caspases executoras, podendo ocorrer a apoptose. Na via mediada pelos receptores de morte, a activao das caspases tambm pode ser inibida pelas IAPs.

Convergncia das duas vias

Apesar da via dos receptores de morte no exigir o envolvimento da famlia de protenas Bcl-2 ou da mitocndria, alguns investigadores apontam para que a Bcl-2 possa inibir a apoptose desencadeada por receptores de morte. O mecanismo ligado sinalizao do receptor de morte e via de inibio pela Bcl-2 surgiu com a descoberta da clivagem da protena Bid pela caspase8 a qual, por sua vez, activada a partir dos receptores de morte. Neste mecanismo, a forma truncada de Bid (tBid), que constitui a sua forma activa, direcciona-se para a membrana mitocondrial externa, constituindo ela prpria um poro e, simultaneamente, desencadeia a oligomerizao de Bax, permitindo tambm a sua insero na membrana externa da mitocndria. A protena Bax, tal como a Bid, pode formar um poro permevel a factores intermembranares. A via maioritria de apoptose ir, ento, depender no s do tipo celular, como tambm do estmulo apopttico, observando-se, muitas vezes simultaneamente, diferentes vias apoptticas na mesma clula .

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