Manual DX de Rabia

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO DE LA RABIA
Serie de Normas Tcnicas N 31 Lima - 2002
Serie de Normas Tcnicas N 31 Lima - 2002
MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. Fernando Carbone Campoverde Vice-Ministro Dr. Oscar Ugarte Ubillz INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jefe Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga Sub-Jefe Dra. Ada Cecilia Palacios Ramrez Centro Nacional de Salud Pblica Dra. Susana Zurita Macalup Directora General Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin Dr. Napolen Chvez Campoverde Director General Centro Nacional de Control de Calidad Dra. Rosa Guevara Ormeo Directora General Centro Nacional de Produccin de Biolgicos Q. F. Ricardo Valera Snchez Director General
Sub-Comit Editor Instituto Nacional de Salud Presidente Dra. Ada Palacios Ramrez Secretario Tcnico Dr. Csar Cabezas Snchez
Miembros Dr. Jorge Alarcn Villaverde Q.F. Zulema Arvalo Chong Dr. Jorge Barnaby Rodrguez Dr. Zuo Burstein Alva Lic. Ivn Gmez-Snchez Prieto Dra. Ivonne Guerrero Alva Dr. Alfredo Guilln Oneeglio Dr. Csar Nquira Velarde Dr. Enrique Prez Ramos Lic. Margarita Rodrguez Gutarra Dr. Vctor Surez Moreno Editor Dr. Leonid Lecca Garca
Portada: Frontis del local central del Instituto Nacional de Salud.
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Instituto Nacional de Salud
Manual de procedimientos para el diagnstico de la rabia
ELABORACIN: MPVM, MV Ricardo Lpez Ingunza Blgo. Ren Edgar Condori Condori Blga. Albina Daz Olivera Laboratorio de Referencia Nacional de Rabia Divisin de Virologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud
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Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

Lpez Ingunza, Ricardo Manual de procedimientos para el diagnstico de la rabia / Elaborado por Ricardo Lpez Ingunza, Rene Edgar Condori Condori y Albina Daz Olivera. Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2002. 46 p. : 30 cm. (Serie de Normas Tcnicas; 31)
1. RABIA /diagnstico 2. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS DIAGNOSTICOS I. II. III. IV. V. Lpez Ingunza, Ricardo Condori Condori, Rene Edgar Daz Olivera, Albina Instituto Nacional de Salud (Per) Per. Ministerio de Salud
ISBN 9972 - 857 - 26 - 3 (O.C.) ISSN 9972 - 857 - 28 - X (N 31) ISSN 1607 - 4904 Hecho el Depsito Legal N 1501012002-3959 Ministerio de Salud, 2002 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 431-0410 Instituto Nacional de Salud, 2002 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 471-9920 Fax 471-0179 e-mail: postmaster@ins.sld.pe Pgina Web: www.ins.sld.pe Publicacin aprobada con R.J. N 322 -2002-J-OPD/INS Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.
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II
CONTENIDO INTRODUCCIN VIRUS RBICO SECCIN 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 SECCIN 2 2.1 2.2 SECCIN 3 3.1 3.2 3.3 SECCIN 4 4.1 4.2 4.3 SECCIN 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 SECCIN 6 6.1 6.2 6.3 6.4

VII VIII
GENERALIDADES Objetivo Campo de aplicacin Responsabilidades Documentos de referencia Definiciones y abreviaturas

1 1 1 1 1 1 3 3 3 5 5 6 7
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Disposiciones Principales medidas de bioseguridad

PROCEDIMIENTOS DE OBTENCIN DE MUESTRAS Obtencin de muestras de cerebro, cerebelo y mdula de animales pequeos Obtencin de muestras de cerebro, cerebelo y mdula de animales medianos Obtencin de muestras de cerebro, cerebelo y mdula de animales grandes

CONSERVACIN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE MUESTRAS Conservacin de la muestra Embalaje Transporte

9 9 9 10

MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA Fundamento Objetivo Materiales Procedimientos de uso Procedimientos de mantenimiento

11 11 11 11 12 13 13 13 13 13 14 14 14 14 15 17 17
ENSAYOS O ANLISIS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA Resumen de los ensayos Principio y utilidad del ensayo de inmunofluorescencia directa Principio y utilidad del ensayo de inoculacin en ratones Principio y utilidad del ensayo de seroneutralizacin para la determinacin de anticuerpos antirrbicos

SECCIN 7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6

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TITULACIN DEL CONJUGADO ANTIRRBICO Explicacin del procedimiento Objetivo Equipos, materiales y reactivos Procedimiento Interpretacin de resultados Precauciones a tener en cuenta

III
SECCIN 8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 SECCIN 9 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 SECCIN 10 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 SECCIN 11 11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 SECCIN 12 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5 12.6 BIBLIOGRAFA ANEXOS ANEXO A
TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA PARA LA DETECCIN DEL ANTGENO RBICO Principio y utilidad Esquema y simbologa Fundamento Materiales y reactivos Procedimiento Interpretacin de resultados Precauciones Problemas en la fluorescencia

18 18 18 18 19 20 21 21 22 23 23 23 23 24 24 25 25 25 25 26 27 27
PREPARACIN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS Lminas control positivo y negativo Conjugado antirrbico Preparacin de solucin salina tamponada (PBS) 0,01M pH 7,2-7,4 Preparacin de suspensin de cerebro de ratn normal 20% (CRN) Preparacin de suspensin de cerebro de ratn infectado 20% (CVS)

PRUEBA BIOLGICA DE INOCULACIN EN RATONES Principio y utilidad Animales de laboratorio Materiales y equipos Procedimiento Observacin de ratones inoculados Interpretacin de resultados

PRUEBA DE SERONEUTRALIZACIN PARA LA DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTIRRBICOS Principio y utilidad Animales de laboratorio Materiales y equipos Procedimiento Interpretacin de resultados

28 28 28 28 29 31 32 32 32 32 32 34 34 35
MANTENIMIENTO DE RATONES EN EL LABORATORIO Objetivo Campo de aplicacin Materiales y equipos Cronograma Procedimiento de cambio de jaula de ratones Procedimiento de chequeo diario de ratones

DISPOSITIVO DE SUJECIN PARA CABEZAS DE LOS ANIMALES PARA LA TOMA DE MUESTRAS

36
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IV
ANEXO B ANEXO C ANEXO D ANEXO E ANEXO F ANEXO G ANEXO H
FORMULARIO PARA EL ENVO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA ANIMAL FORMULARIO PARA EL ENVO DE MUESTRAS PARA DIAGNSTICO DE RABIA HUMANA FLUJOGRAMA PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA EN LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS REGISTRO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA FICHA DE REGISTRO DE RATONES INOCULADOS PROTOCOLO DE TRABAJO PARA LA PRUEBA DE SERONEUTRALIZACIN MTODO DE REED Y MUENCH

37 38 40 41 42 43 44
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VI
INTRODUCCIN La naturaleza nos ha dado las semillas del conocimiento, pero no el conocimiento mismo. Pocas enfermedades causan tanta ansiedad y temor como la rabia. Esta enfermedad produce una encefalitis vrica aguda casi siempre mortal. La rabia se presenta en todos los continentes, con excepcin de la mayor parte de Oceana, y se puede presentar en dos ciclos: urbano y selvtico o silvestre. En el Per, se ha confirmado la presencia de ambos ciclos y la mayora de los casos humanos se debieron a mordeduras de perros rabiosos. Sin embargo, en los dos ltimos aos, los casos humanos registrados se debieron a rabia silvestre. El laboratorio ocupa un rol central en el control y prevencin de esta enfermedad. En el Per se inici el diagnstico de rabia en el ao 1938, cuando el Director del Instituto Nacional de Higiene y Salud Pblica, Dr. Telmaco Battistini, instituye el mtodo rpido de Sellers para la confirmacin histopatolgica de la rabia. Durante 25 aos este diagnstico estuvo a cargo del Dr. Oscar Rondn Salas y al retirarse, en 1961, asumi la Jefatura de la Divisin el Dr. Germn Battistini Moore quien, en 1965, contribuy a mejorar las posibilidades del diagnstico al introducir la prueba de inmunofluorescencia. Es as, que hasta la fecha se sigue empleando la prueba de inmunofluorescencia debido a que es una tcnica simple, de alta sensibilidad y especificidad y de bajo costo. Sin embargo, para el diagnstico de rabia es necesario que los resultados negativos encontrados por inmunofluorescencia sean confirmados mediante la prueba de inoculacin en ratones. Esta prueba es de mayor especificidad, aunque el perodo de duracin es considerablemente mayor que el procesamiento de la prueba de inmunofluorescencia. Por otro lado, la prueba de seroneutralizacin sirve para determinar la cantidad de anticuerpos antirrbicos presentes en sueros humanos o animales luego de las inmunizaciones preventivas. La vigilancia epidemilgica a nivel nacional necesita de la ayuda del laboratorio para obtener informacin valedera que permitan establecer programas de control a travs de las diferentes Direcciones Regionales de Salud. Por ello, es que el presente Manual de procedimientos para el diagnstico de la rabia, busca proveer a los laboratorios referenciales regionales de los procedimientos estandarizados bsicos que se emplean actalmente en el Laboratorio de Referencia Nacional de Rabia del Instituto Nacional de Salud. Estos procedimientos pueden ser implementados en los diferentes laboratorios con equipamiento bsico, un microscopio de inmunofluorescencia y animales de laboratorio. Este manual, adems de estar en concordancia con los procedimientos utilizados internacionalmente, recoge las experiencias obtenidas en nuestro laboratorio.
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VII
VIRUS RBICO Taxonmicamente, el virus de la rabia pertenece al orden Mononegavirales, familia Rhabdoviridae, gnero Lyssavirus y serotipo/genotipo 1. Los viriones tienen forma de bala con un dimetro de 75 nanmetros (nm) y un largo de 100 a 300 nm, aproximadamente. Cada partcula contiene una ribonucleocpside helicoidal rodeada de una doble capa de lpidos (Figura N 1). La superficie exterior est cubierta de proyecciones en forma de espigas de 10nm de longitud, ancladas en la doble capa de lpido. Cada virin contiene una sola cadena de ARN con cinco protenas. La ribonucleoprotena que contiene el ARN genmico est asociado a tres protenas internas: el ARN polimerasa dependiente (protena L), la nucleoprotena (N), y una fosfoprotena (M1). Estas protenas, juntamente con el ARN, forman un complejo activo de ARN, que controla tanto la transcripcin como la replicacin. Las otras protenas estructurales son la protena de membrana (M2) o matriz y la glicoprotena (G), las que forman las proyecciones de las superficies responsables de la induccin de los anticuerpos neutralizantes y de la estimulacin de los linfocitos T (Figura N 2). El virin contiene un genoma de ARN acordonado negativo y no segmentado. En este caso, la polaridad negativa indica que el genoma es incapaz de ser traducido en protenas vrales por la maquinaria celular. Consecuentemente un paso preliminar de transcripcin autnomo es necesario para producir la hebra positiva complementaria del ARN mensajero, que sucede tan pronto como la ribonucleocpside es liberada en el citoplasma. Este paso es asegurado por una enzima codificada genticamente, la ARN polimerasa ARN dependiente. El sistema nervioso perifrico es la va de transporte viral y, luego de producirse la mordedura, el virus inicia su recorrido en sentido centrpeto hasta llegar al sistema nervioso central. Despus de su replicacin en las neuronas, el virus inicia a travs de las vas nerviosas su salida hacia diferentes rganos perifricos y llega as, a las glndulas salivales y otros tejidos, dando inicio as a su propagacin a otro hospedero.
envelope protein G glycoprotein M2 matrix protein L G N M1 100 nm ribonucleocapsid N nucleoprotein M1 phosphoprotein L protein genome M2
Figura N 1. Estructura del virus rbico (Tomada de Laboratory Techniques in Rabies, 1996).
Figura N 2. Microfotografa del virus rbico, cepa Pasteur (Tomada de Laboratory Techniques in Rabies, 1996).
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VIII
SECCIN 1 GENERALIDADES 1.1 OBJETIVO Establecer las disposiciones que se deben cumplir para realizar el diagnstico del virus de la rabia utilizando los mtodos de inmunofluorescencia directa y la inoculacin en ratones, y para determinar los ttulos de anticuerpos de sueros mediante la prueba de seroneutralizacin. 1.2 CAMPO DE APLICACIN Se aplica en los laboratorios regionales referenciales o establecimientos de salud que cuenten con personal calificado, instalaciones, equipos y materiales idneos para llevar a cabo el diagnstico de rabia a partir de muestras obtenidas de personas o animales. 1.3 1.3.1 RESPONSABILIDADES Los directores o jefes de departamento o seccin de un establecimiento de salud que realizan el diagnstico de rabia, son responsables de supervisar el cumplimiento de las disposiciones contenidas en el presente manual. Los jefes de laboratorio son responsables de mantener la competencia tcnica de su personal, la idoneidad y confiabilidad de sus equipos, materiales, sustancias, reactivos e instalaciones, verificar la calidad de los resultados y supervisar el cumplimiento de las buenas prcticas de laboratorio y las medidas de bioseguridad. Los profesionales designados para realizar el diagnstico son responsables de controlar el cumplimiento de las disposiciones contenidas en este manual e informar a su jefatura inmediata superior en caso ocurran desviaciones de las especificaciones de los procedimientos establecidos. El personal asignado a los procesos descritos en el presente manual deben estar calificados en las tcnicas y mtodos de ensayo, y aplicar las medidas de bioseguridad y las buenas prcticas de laboratorio. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Larghi OP. Prueba de anticuerpos fluorescentes para rabia. Centro Panamericano de Zoonosis; 1975. Nota Tcnica N 8. Meslin F - X, Kaplan MM, Koprowski H. Laboratory techniques in rabies. Geneva:WHO; 1996. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS CRN: suspensin de cerebro de ratn normal CVS: virus estndar de desafo (challenge virus standard) de la rabia
1.3.2
1.3.3
1.3.4
1.4 1.4.1
1.4.2 1.5 1.5.1 1.5.2
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1.5.3
conjugado antirrbico: inmunoglobulinas G contra el virus de la rabia marcadas con un fluorocromo (Ejemplo: isotiocianato de fluorescena). DL50: dosis letal 50 IFD: inmunofluorescencia directa IFI: inmunofluorescencia indirecta IR: inoculacin en ratones inculo: alcuota de una muestra que es inoculada a un ser vivo u otro medio de cultivo. patgeno: cualquier virus, microorganismo o sustancia que causa enfermedad. SST: solucin salina tamponada (PBS). seroneutralizacin: prueba utilizada para determinar la cantidad de anticuerpos neutralizantes presentes en un suero ttulo viral: inverso de la dilucin de virus que produce 50% de mortalidad en los ratones inoculados. virus: nombre de un grupo de microbios que, con pocas excepciones, son capaces de atravesar filtros finos que retienen a casi todas las bacterias y son incapaces de crecer o reproducirse fuera de clulas vivas. virus calle: virus virulento de la rabia de un animal domstico que ha contrado la enfermedad en la forma habitual, por mordedura o rasguo de otro animal. virus de desafo: virus CVS que se emplea para enfrentar a los anticuerpos neutralizantes. virus fijo: virus modificado en el laboratorio, como el CVS, que posee caractersticas especiales como un perodo de incubacin corto, altamente patgeno y mantiene constante su DL50.
1.5.4 1.5.5 1.5.6 1.5.7 1.5.8 1.5.9 1.5.10 1.5.11
1.5.12 1.5.13
1.5.14
1.5.15 1.5.16
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SECCIN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1 2.1.1 DISPOSICIONES La Bioseguridad son un conjunto de medidas preventivas de sentido comn para proteger la salud y la seguridad del personal que trabaja en el laboratorio, frente a diferentes riesgos producidos por los agentes infecciosos. Las disposiciones contenidas en el Manual de Normas de Bioseguridad, Serie de Normas Tcnicas N 18 (editado por el Instituto Nacional de Salud), son aplicables para el cumplimiento del presente manual. Para establecer niveles de bioseguridad aceptables dentro del laboratorio, se recomienda manejar todas las muestras de sangre, suero o cerebro como material potencialmente infectante, es decir, capaz de transmitir agentes patgenos. Se deben aplicar las medidas de bioseguridad pertinentes, especialmente las referidas al ambiente, el personal, el vestido, las muestras y su procesamiento y la esterilizacin terminal. Es responsabilidad de la direccin del laboratorio establecer una organizacin para garantizar la seguridad en todas sus reas, mediante la aplicacin de normas y procedimientos de seguridad, claramente detallados por escrito. La administracin del establecimiento de salud debe dar las facilidades para que las normas de bioseguridad se cumplan. El virus rbico ha sido aislado de cerebro, cerebelo, saliva y terminaciones nerviosas de las cavidades nasal y oral, papilas gustativas, glndulas adrenales, pncreas, rin, msculo cardiaco, grasa parda, folculos pilosos, retina y crnea. Al obtener y procesar cualquier tipo de muestra en el laboratorio se deben tomar las precauciones universales, ya que se desconoce el tipo de agente infeccioso presente. El principal peligro es la exposicin directa del material contaminado a las membranas mucosas o piel cortada del personal, o por pinchazo accidental con una aguja con este material. PRINCIPALES MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Todo personal que trabaja en el laboratorio, sala de animales inoculados y otros ambientes que tengan contacto con el virus de la rabia debe ser vacunado con el esquema de pre-exposicin (3 dosis a los 0, 7 y 21 das utilizando la vacuna tipo CRL). Todas las muestras deben ser tratadas como altamente infecciosas para evitar posibles contaminaciones.
3 Instituto Nacional de Salud
2.1.2
2.1.3
2.1.4
2.1.5
2.1.6
2.1.7
2.1.8.
2.2 2.2.1
2.2.2
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2.2.3 2.2.4
El ingreso al laboratorio debe estar restringido Siempre debe utilizarse un mandil limpio y de mangas largas en la zona de trabajo. El guardapolvo no debe salir de la zona de laboratorio, salvo para ser lavado. No se debe pipetear con la boca Est prohibido comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicarse cosmticos en el laboratorio El cabello largo debe usarse recogido Lavarse las manos luego de quitarse los guantes y antes de salir del laboratorio Utilizar proteccin para las mucosas (mascarillas y lentes de seguridad) cuando el procedimiento pueda generar salpicaduras y/o aerosoles. Utilizar guantes descartables y opcionalmente mascarillas en el trabajo de improntas Trabajar de manera tal que se minimice la formacin de aerosoles Nunca expeler el aire de la jeringa conteniendo una suspensin de virus rbico directamente al ambiente. Las cortaduras o rasguos en las manos deben cubrirse y protegerse adecuadamente Utilizar zapatos protectores que cubran completamente los pies (No usar zapatos abiertos) El operador debe descontaminar las superficies de trabajo antes y despus de cada actividad o en caso de derrame de material contaminado. Los reactivos deben estar rotulados con letra clara, indicando la fecha de formulacin El laboratorio debe tener a disposicin un equipo de primeros auxilios Informar inmediatamente cualquier accidente al jefe del laboratorio y al comit de bioseguridad Todos los desechos del laboratorio deben descontaminarse adecuadamente antes de eliminarse, ya sea en solucin desinfectante, autoclavados (a 121 C durante 20 minutos) o incinerados. Limpiar diariamente los pisos con solucin desinfectante El personal del laboratorio seguir las instrucciones de manejo de los equipos e instrumentales, sin utilizar la fuerza o presin excesiva para evitar posibles accidentes.
2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.9
2.2.10 2.2.11 2.2.12
2.2.13 2.2.14 2.2.15
2.2.16 2.2.17 2.2.18 2.2.19
2.2.20 2.2.21
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SECCIN 3 PROCEDIMIENTOS DE OBTENCIN DE MUESTRAS El diagnstico laboratorial de rabia post mortem es realizado en muestras de cerebro y cerebelo. Sin embargo, para que el diagnstico sea correcto, la muestra debe llegar al laboratorio en buen estado, esto implica que los miembros del equipo de salud involucrados entiendan la naturaleza crtica de mantener la muestra en condiciones apropiadas. Por otro lado, para realizar el diagnstico in vivo se requiere de muestras de suero, saliva y biopsia de piel de nuca. Los resultados de las pruebas del diagnstico in vivo solo son confirmatorios cuando son positivos. 3.1 3.1.1 OBTENCIN DE MUESTRAS DE CEREBRO, CEREBELO Y MDULA DE ANIMALES PEQUEOS Objetivo Establecer y uniformizar el procedimiento de obtencin de muestras de cerebro, cerebelo y mdula de animales pequeos (murcilagos, ratones, hamsters, etc.) para realizar el diagnstico del virus rbico. 3.1.2 3.1.2.1 3.1.2.2 3.1.2.3 3.1.2.4 3.1.2.5 3.1.2.6 3.1.2.7 3.1.3 3.1.3.1 Materiales y equipos Bistur o cuchillo afilado Tijera de diseccin Pinzas diente de ratn Placa petri Guantes de ciruga Mandil Recipiente con desinfectante (solucin jabonosa) Procedimiento Sujetar con una pinza diente de ratn la piel de la parte posterior de la cabeza y realizar un corte con la tijera aperturando la piel, para luego extender el corte longitudinalmente hasta la altura de las rbitas de los ojos. Sujetar con la pinza diente de ratn la cabeza del animal tomndolo por las rbitas y penetrar por la parte posterior del crneo con la punta de la tijera, cortando alrededor del crneo. Retirar la tapa del crneo, dejando de esta manera expuesto el cerebro Con la tijera a medio abrir, levantar el cerebro cortando la base, teniendo la seguridad de incluir el cerebelo al momento de retirar la masa enceflica. Rotular la muestra con el cdigo correspondiente
5
3.1.3.2.
3.1.3.3. 3.1.3.4.
3.1.3.5.
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3.2 3.2.1
OBTENCIN DE MUESTRAS DE CEREBRO, CEREBELO Y MDULA DE ANIMALES MEDIANOS Objetivo Establecer y uniformizar el procedimiento de obtencin de muestras de cerebro, cerebelo y mdula de animales medianos (perros, gatos, etc.) para realizar el diagnstico del virus rbico.
3.2.2 3.2.2.1 3.2.2.2 3.2.2.3 3.2.2.4 3.2.2.5 3.2.2.6 3.2.2.7 3.2.2.8 3.2.2.9 3.2.2.10 3.2.3 3.2.3.1
Materiales y equipos Bistur o cuchillo afilado Mango y hoja de sierra Tijera de diseccin Pinzas diente de ratn Placa petri Frascos de plstico con tapa hermtica Guantes de jebe grueso Mandil de hule Mascarilla Recipiente con desinfectante (solucin jabonosa) Procedimiento Sujetar firmemente la cabeza del animal sobre la mesa, si fuera posible con la ayuda de algn dispositivo mecnico. Un mtodo simple consiste en utilizar una madera de 30x40x3 cm con dos agujeros, por cuyo interior se colocar un alambre que sujete firmemente el hocico del animal (Figura N 3 y Anexo A).
Figura N3. Dispositivo de sujecin simple para la obtencin de una muestra de cerebro de can
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3.2.3.2
Realizar una incisin profunda a lo largo de la lnea media del crneo, empezando por delante y encima de los ojos hasta la base del crneo o cuello, a travs de la piel, fascia y msculo. Separar la piel lo mximo posible, exponiendo los msculos temporales que estn adosados al crneo Cortar los msculos temporales y levantarlos lateralmente para exponer el crneo Realizar cuatro cortes al crneo con la sierra: un corte transversal inmediatamente por detrs de la rbita ocular, un corte transversal en la base del occipital y dos cortes longitudinales en ambos parietales uniendo los cortes anteriores. Levantar la tapa del crneo y exponer el cerebro Cortar las meninges, con ayuda de una pinza levantar el cerebro hasta llegar al bulbo y cortar a ese nivel, retirando de esta manera el cerebro. Rotular la muestra con el cdigo correspondiente OBTENCIN DE MUESTRAS DE CEREBRO, CEREBELO Y MDULA DE ANIMALES GRANDES Objetivo Establecer y uniformizar el procedimiento de obtencin de muestras de cerebro, cerebelo y mdula de animales grandes (equinos, bovinos, etc.) para realizar el diagnstico del virus rbico.
3.2.3.3 3.2.3.4 3.2.3.5
3.2.3.6 3.2.3.7
3.2.3.8 3.3. 3.3.1.
3.3.2 3.3.2.1 3.3.2.2 3.3.2.3 3.3.2.4 3.3.2.5 3.3.2.6 3.3.2.7 3.3.2.8 3.3.3. 3.3.3.1 3.3.3.2
Materiales y equipos Bistur o cuchillo afilado Tijera de diseccin Mango y hoja de sierra Pinzas diente de ratn Placa petri Guantes gruesos de jebe Mandil simple y de hule Recipiente con desinfectante (solucin jabonosa) Procedimiento Sujetar firmemente la cabeza del animal a una superficie de trabajo Realizar una incisin profunda a lo largo de la lnea media del crneo, empezando por delante y encima de los ojos hasta la base del crneo o cuello, a travs de la piel, fascia y msculo.
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3.3.3.3 3.3.3.4
Separar la piel lo mximo posible, exponiendo los huesos del crneo Realizar cuatro cortes al crneo con una sierra, asegurndose de atravesar todo el crneo: un corte transversal inmediatamente detrs de los cuernos, dos cortes longitudinales al lado izquierdo y derecho del hueso frontal y un corte transversal encima de los ojos uniendo los dos cortes anteriores. Levantar la tapa del crneo con un desarmador para exponer las meninges y el cerebro Cortar las meninges, levantar el cerebro y colocarlo en un papel absorbente limpio Retirar porciones (del tamao del cerebro de un can) de corteza, cerebelo, asta de Ammon y mdula, y depositarlas en una placa petri o en envases primarios para su envo respectivo. Rotular la muestra con el cdigo correspondiente
3.3.3.5 3.3.3.6 3.3.3.7
3.3.3.8
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SECCIN 4 CONSERVACIN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
4.1 4.1.1
CONSERVACIN DE LA MUESTRA Con el propsito de conservar la muestra por varios das y remitirla al laboratorio se proceder a depositar el cerebro y cerebelo del can en un recipiente de plstico resistente, hermtico y de boca ancha, conteniendo 50% de glicerina y 50% de solucin fisiolgica estril, agua destilada o agua hervida, en ltimo caso. En caso de animales mayores, se tomarn porciones de un tamao semejante al cerebro de un can. Las muestras de cerebro y cerebelo que se encuentren en el laboratorio, que no puedan ejecutarse el mismo da y no estn conservadas en glicerina, se podrn conservar a -20C o menor temperatura. Sin embargo, es necesario evitar congelaciones y descongelaciones repetidas ya que esto aumenta su deterioro. No usar formol, ni alcohol para la conservacin de la muestra, ya que esto hace insatisfactoria la prueba de inmunofluorescencia. EMBALAJE Para el embalaje de las muestras se deber emplear en lo posible el sistema de triple envase: Recipiente primario: recipiente de plstico, impermeable, con tapa rosca hermtica, etiquetado, que contiene el espcimen y que se envolver en material absorbente (toallas, algodn hidrfilo o celulosa) en cantidad suficiente. Recipiente secundario: recipiente resistente, impermeable, a prueba de filtraciones, que encierra y protege el (los) recipiente(s) primario(s). Cuando se colocan varios recipientes primarios dentro de uno secundario, los primarios debern ser envueltos en forma individual. Se debe usar suficiente material absorbente para proteger todos los recipientes primarios y evitar los choques entre ellos. Recipiente terciario o envoltura exterior de envo: envoltura de envo que protege el recipiente secundario de elementos externos, tales como daos fsicos, agua y de posibles manipulaciones. Debe ser de material suficientemente slido como para asegurar su proteccin (Ejemplo: caja de tecnoport forrada con cartn). A l irn adheridas las seas del destinatario y del remitente, as como los adhesivos que exija el transportista sobre su contenido: etiqueta de sustancia infecciosa o de sustancia biolgica perecedera. Adems, irn adheridos los oficios y fichas que identifican al animal, dueo, procedencia y responsable del envo. Marcado del embalaje Cada bulto de embalaje que contenga material biolgico peligroso debe estar marcado legiblemente en la parte exterior con lo siguiente: Nombre de expedicin del contenido. Ejemplo: sustancias infecciosas que afectan a humanos
4.1.2
4.1.3
4.2 4.2.1 4.2.1.1
4.2.1.2
4.2.1.3
4.2.2. 4.2.2.1
a.
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b. c. d.
Nombre, direccin del expedidor y destinatario Nombre y nmero de telfono de la persona responsable del envo Una etiqueta, en forma de diamante (100 mm x 100 mm), que en la parte inferior debe llevar escrito las palabras SUSTANCIA INFECCIOSA. Requisitos de documentacin Las muestras se enviarn individualmente rotuladas, indicando el nmero de muestra y su procedencia. Adems del oficio de solicitud de atencin, cada muestra deber poseer una ficha epidemiolgica con los datos mnimos (procedencia, especie, dueo del animal, vacunacin, nmero de muestra y nombre y nmero telefnico de la persona responsable del envo. Ver Anexos B y C). TRANSPORTE Elegir el itinerario ms directo, con el menor nmero de transbordos y esperas de trnsito. Se procurar que el envo no llegue sbado, domingo o das feriados. Es conveniente que el personal de laboratorio y el que recepcionar las muestras sepan con antelacin la procedencia y el nmero de muestras que recibirn, con la finalidad de evitar muestras perdidas o en paradero desconocido.
4.2.3 4.2.3.1 4.2.3.2
4.3 4.3.1
4.3.2
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SECCIN 5 MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA 5.1 5.1.1 FUNDAMENTO La funcin del microscopio de fluorescencia es proveer luz necesaria para excitar un colorante fluorescente y luego transmitir esta luz al observador. En inmunofluorescencia, el colorante ms utilizado es el isotiocianato de fluorescena (ITCF), debido a su gran afinidad por las protenas (globulinas). Para entender el fundamento de esta tcnica es necesario conocer el fenmeno que ocurre cuando un compuesto es irradiado con energa luminosa. Al irradiar el colorante ITCF, la energa excita las molculas, desubicando los electrones de los tomos de su ncleo central (absorcin de energa). Como el ITCF es un compuesto luminiscente, emitir nuevamente energa luminosa en forma de luz visible de una longitud de onda ms larga. Para el diagnstico de rabia se emplea este principio, utilizando un microscopio de fluorescencia que presenta una fuente de iluminacin de luz ultravioleta y mediante un sistema de lentes y filtros se amplifica la imagen de la reaccin del compuesto marcado con ITCF con el antgeno. Para realizar la observacin es necesario contar con una habitacin poco iluminada (cuarto oscuro). OBJETIVO Establecer los procedimientos a seguir para el empleo y mantenimiento del microscopio de fluorescencia 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.4 5.4.1 MATERIALES Microscopio de fluorescencia (epifluorescente) Aceite de inmersin no fluorescente (Merck) o glicerina pura Lmina control positiva (coloreada con ITCF) PROCEDIMIENTOS DE USO Antes de encender el microscopio, verificar que los objetivos y oculares estn limpios. Si es necesario, limpiar con papel lente seco. Nunca tocar los lentes con los dedos. Enchufar el microscopio y encender la fuente de poder (algunos microscopios poseen un indicador de prendido). El encendido debe realizarse de 3 a 5 minutos antes de iniciar cada sesin de lectura, para permitir que la lmpara emita energa con adecuada intensidad. Colocar la lmina porta-objeto coloreada en la platina, sin tocar el objetivo Enfocar el campo con el objetivo de 40X, utilizando el macromtrico, evitando que la lmina toque al objetivo. Con el micromtrico, enfocar para lograr una imagen clara.
5.1.2
5.1.3
5.2
5.4.2
5.4.3 5.4.4
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5.4.5
Mover el sistema, agregar aceite de inmersin no fluorescente o glicerina pura y enfocar con el objetivo de 100X. Ubicarse en el extremo superior izquierdo, recorrer la lmina a la derecha y luego hacia abajo recorriendo ordenadamente toda la lmina. PROCEDIMIENTOS DE MANTENIMIENTO El microscopio presenta una lmpara de mercurio, la cual debe encenderse en una sola sesin de lectura debido a que cada encendido equivale a 3 horas de vida de la lmpara. Cuando la intensidad de luz disminuye notoriamente es necesario cambiar la lmpara por otra, de acuerdo a los siguientes pasos: Desconectar el equipo y dejar enfriar la lmpara a temperatura ambiente (caso contrario, existe el peligro de explosin). Abrir la caja que contiene la lmpara y retirarla aflojando los tornillos ubicados en ambos lados. Coger la nueva lmpara por los extremos (sin tocar el bulbo con los dedos) y colocarla en la caja portadora ajustando en ambos lados. Cerrar adecuadamente la caja portadora. Si hubieran manchas en la superficie de la lmpara, limpiarla con un algodn embebido en alcohol. Los objetivos y oculares se limpiarn al inicio y trmino de cada sesin de lectura con bencina ligera o alcohol, para remover las manchas y/o el aceite de inmersin. Proteger el equipo contra temperaturas superiores a 50C, humedad, sustancias qumicas y contra el polvo, utilizando fundas protectoras de tela.
5.4.6
5.5 5.5.1
5.5.1.1
5.5.1.2 5.5.1.3
5.5.1.4 5.5.1.5 5.5.1.6
5.5.1.7
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12
SECCIN 6 ENSAYOS O ANLISIS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA 6.1 6.1.1 RESUMEN DE LOS ENSAYOS (Anexo D) Para el diagnstico de rabia se emplean dos pruebas de rutina: la prueba de inmunofluorescencia directa (IFD) y la prueba biolgica de inoculacin en ratones (IR). Ambas pruebas poseen una alta sensibilidad y especificidad. La prueba de IFD es una prueba rpida, con alta sensibilidad y que permite obtener resultados en unas pocas horas. Por el contrario, la prueba de IR posee una mayor especificidad, pero los resultados se obtienen en 21 das, adems que confirma el diagnstico de pruebas negativas por IFD. En la prueba de IFD es necesario titular el conjugado antirrbico, buscando encontrar la dilucin ptima de ste. De acuerdo a las recomendaciones del Comit de Expertos de Rabia de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), un diagnstico positivo en cualquiera de las dos pruebas es concluyente. La prueba de seroneutralizacin (neutralizacin del suero) en ratones es un procedimiento serolgico que se utiliza para determinar si una persona o un animal est protegido contra la rabia. PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA La IFD, debido a su rapidez y sencillez, es la primera prueba que se utiliza para el diagnstico de rabia. Si el resultado de la prueba es negativo, se proceder a realizar la inoculacin en ratones. La prueba de IFD detecta el antgeno rbico de la impronta mediante el uso del conjugado antirrbico que contiene globulinas marcadas con ITCF. 6.3 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE INOCULACIN EN RATONES La prueba de inoculacin en ratones es una tcnica sencilla, basada en procedimientos rigurosos. Esta inoculacin se realiza en ratones debido a su alta susceptibilidad al virus rbico y se manifiesta con una sintomatologa clsica (erizamiento, parlisis, postracin y muerte). Una vez muerto el animal se procede a realizar la prueba de IFD para determinar si la muestra inoculada es positiva a rabia. 6.4 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE SERONEUTRALIZACIN PARA LA DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTIRRBICOS La prueba de neutralizacin del suero en ratones es un procedimiento serolgico que se utiliza para determinar si una persona o un animal est protegido contra la rabia. Este mtodo determina la cantidad de anticuerpos presentes en el suero y se basa en la neutralizacin de una serie de diluciones de suero con una dosis constante de un virus de desafo previamente titulado. Los resultados son expresados en trminos de ttulos serolgicos, definidos como la dilucin ms elevada que neutraliza una cantidad estndar de virus.
MPR - CNSP - 010 13 Instituto Nacional de Salud
6.1.2
6.1.3
6.1.4
6.1.5
6.2
SECCIN 7 TITULACIN DEL CONJUGADO ANTIRRBICO 7.1 7.1.1 EXPLICACIN DEL PROCEDIMIENTO El Laboratorio de Referencia Nacional de Rabia del Instituto Nacional de Salud produce el conjugado antirrbico desde el ao 1996, el que es distribudo anualmente a la Red Nacional de Laboratorios. El conjugado antirrbico es un reactivo del suero de animales hiperinmunizados con vacuna antirrbica El conjugado antirrbico debe ser titulado en cada laboratorio a fin de utilizarse en la dilucin ptima que asegure un diagnstico eficiente. Para titular el conjugado antirrbico es necesario realizar diluciones seriadas. En cada dilucin se tien lminas controles positivas y negativas, las que se observan al microscopio de inmunofluorescencia buscando determinar la dilucin ptima de trabajo. Las condiciones a evaluar en un conjugado son las siguientes: Intensidad especfica: es la intensidad del brillo fluorescente Cantidad de inclusiones: capacidad de detectar la cantidad de inclusiones o pequeas partculas de virus rbico fluorescente. Coloracion de fondo: capacidad de mantener una imagen en la que exista un buen contraste OBJETIVO Determinar experimentalmente la dilucin ptima de trabajo 7.3 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.3.7 7.3.8
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7.1.2 7.1.3
7.1.4
7.1.5 7.1.5.1 7.1.5.2
7.1.5.3 7.2
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS Lminas pavonadas en un extremo (75 x 25 mm) Conjugado antirrbico Tubos 12 x 75 mm Coplin con acetona Solucin salina tamponada (PBS), pH 7,2-7,4 Suspensin de cerebro de ratn normal al 20%(CRN) Suspensin de cepa estndar de desafo al 20% (CVS) Aceite de inmersin (MERCK) ND 1,515 o glicerina pura
7.3.9 7.3.10 7.3.11 7.3.12 7.3.13 7.3.14 7.3.15 7.3.16 7.4 7.4.1
Cmara hmeda Micropipeta de 1000 L Reloj o timer Agua destilada Microscopio de inmunofluorescencia Balanza Potencimetro Incubadora de 37C PROCEDIMIENTO Leer las instrucciones del conjugado sobre el ttulo encontrado por el fabricante. El siguiente procedimiento toma las diluciones para el caso de un conjugado con ttulo 1/80. Tomar dos tubos de ensayo 12 x 75 mm y rotularlos 1/10 CRN y 1/10 CVS. De la misma manera, tomar ocho tubos de ensayo para las diluciones: 1/20, 1/40, 1/80 y 1/160. Tomar dos lminas pavonadas y rotularlas 1/10p y 1/10n. De la misma manera, tomar ocho lminas y rotularlas para las diluciones: 1/20, 1/40, 1/80 y 1/160. En cada una de las 5 lminas rotuladas (1/10p, 1/20p, 1/40p, 1/80p y 1/160p), realizar dos impresiones de un cerebro positivo a rabia. En cada una de las otras 5 lminas rotuladas (1/10n, 1/20n, 1/40n, 1/80n y 1/160n), realizar dos improntas a cada lado de la lmina de un cerebro negativo a rabia. Colocar las 10 lminas en un coplin con acetona y llevarlas al freezer (-20C) por 20 minutos Agregar 0,9 mL de CRN al primer tubo y 0,2 mL al segundo, tercero, cuarto y quinto tubo Agregar 0,1 mL de conjugado antirrbico al primer tubo con el CRN, agitar y pasar 0,2 mL al segundo tubo. Descartar el tip, agitar y tomar 0,2m L del segundo tubo y agregarlo al tercer tubo, y as sucesivamente, obteniendo de esta manera las diluciones 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 y 1/160. Proceder de la misma forma con el CVS Agregar una gota del tubo conteniendo conjugado con CRN 1/10 a la lmina marcada 1/10 en la impronta cercana al borde pavonado de las lminas positivas y negativas. Proceder de la misma forma con las otras 4 diluciones.
7.4.2
7.4.3
7.4.4
7.4.5
7.4.6 7.4.7 7.4.8
7.4.9 7.4.10
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7.4.11
Agregar una gota del tubo conteniendo conjugado con CVS 1/10 a la lmina marcada 1/10 en la impronta alejada del borde pavonado de las lminas positivas y negativas. Proceder de la misma forma con las otras diluciones. Incubar los porta-objetos en una cmara hmeda a 37C por 30 minutos Retirar las lminas y sumergirlas en PBS por 10 minutos Enjuagar con agua destilada Dejar secar los porta-objetos a temperatura ambiente (20C-25C) Colocar una gota de aceite de inmersin (sin fluorescencia) o glicerina pura y observar a 100X
0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL
7.4.12 7.4.13 7.4.14 7.4.15 7.4.16
0,1 mL
CVS
0,9 mL
0,2 mL
0,2 mL
0,2 mL
0,2 mL
Conjugado Antirrbico 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL
0,1 mL
CRN
0,9 mL 1/10
0,2 mL 1/20
0,2 mL 1/40
0,2 mL 1/80
0,2 mL 1/160
Figura N 4. Esquema de la titulacin de conjugado antirrbico

16
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7.5 7.5.1
INTERPRETACIN DE RESULTADOS La dilucin ideal de conjugado es la ms alta dilucin con una intensidad de 4+ en la impronta con CRN, una coloracin de fondo con 0+ y con una cantidad de inclusiones de 4+. En la impronta correspondiente con CVS no se deber observar fluorescencia. Si el ttulo del conjugado fuera de 1/50 se proceder a calcular la primera dilucin de almacenamiento dividiendo el denominado entre 5 (50/5=10). Se diluye entonces el conjugado 1/10 con agua destilada estril y se distribuye 300 L en frasquitos o viales conservndolos a una temperatura 20C. La siguiente dilucin ser 1/5 y para esto se utilizar 1,2 mL de CRN y CVS, logrando una dilucin final de 1/50. PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA No hay disminucin de fluorescencia en la impronta que contiene el CVS + conjugado o la impronta que contiene el CRN + conjugado. Recomendacin: Ante la presencia de precipitado o fluorescencia inespecfica, proceder a centrifugar el conjugado (5,000 x 10 minutos). Las lminas positivas se trabajarn con no ms de una semana de preparacin. Ello debido a la prdida de fluorescencia. El CRN y el CVS debern centrifugarse ligeramente antes de su utilizacin (1500 r.p.m. x 10 minutos). El CRN puede ser reemplazado por agua destilada La acetona que se emplee en las pruebas podr ser reutilizada siempre y cuando sea filtrada y no muestre una coloracin amarillenta. Los porta-objetos no debern poseer un fondo verdoso porque no ofrecen un buen contraste Se deber tener cuidado de que el CRN + conjugado no se mezcle con el CVS + conjugado La prolongada observacin microscpica de la muestra disminuye la fluorescencia. No exponer cada campo por ms de 5 segundos. Asegurar que el microscopio de inmunofluorescencia (filtros, objetivos, oculares y lmpara) est en buenas condiciones. La lmpara deber estar debidamente centrada, para esto ser conveniente utilizar un control positivo para constatar el correcto funcionamiento del microscopio. Leer el manual de instrucciones del microscopio.
7.5.2
7.6 7.6.1
7.6.2
7.6.3 7.6.4 7.6.5
7.6.6 7.6.7 7.6.8
7.6.9
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SECCIN 8 TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA PARA LA DETECCIN DEL ANTGENO RABICO
8.1
PRINCIPIO Y UTILIDAD La tcnica de inmunofluorescencia directa est basada en la reaccin antgeno-anticuerpo que ocurre al enfrentrar la impronta positiva (antgeno) con el conjugado antirrbico (anticuerpos). Esta reaccin puede ser detectada mediante la luz ultravioleta del microscopio de inmunofluorescencia.
8.2
ESQUEMA Y SIMBOLOGA
Figura N 5. Esquema de lmina de IFD para rabia
SIMBOLOS Antgeno rbico Isotiocianato de fluorescena Conjugado antirrbico
Figura N 6. Simbologa empleada en la tcnica de inmunofluorescencia
8.3 8.3.1
FUNDAMENTO Si las improntas de cerebro y cerebelo contienen virus rbico, el resultado de la prueba ser positiva
8.3.2
El antgeno est fijado y permeabilizado. Se aade una gota de conjugado antirrbico + CRN a la impronta cercana al lado pavonado y otra gota de conjugado antirrbico + CVS a la impronta alejada
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del lado pavonado. Luego, se incuba los porta-objetos a 37C por 30 minutos. Si la impronta tiene antgeno rbico, se unir el conjugado antirrbico + CRN a la impronta del lado izquierdo, formando el complejo antgeno-anticuerpo. En la impronta que contiene el conjugado + CVS no se unirn los anticuerpos a la impronta porque ya estn tomados por el CVS. Estos complejos conjugado + CVS sern retirados durante los lavados con el PBS.
CRN + conjugado
CVS + conjugado
8.3.3
La unin del conjugado antirrbico al antgeno rbico es detectada mediante la excitacin de la luz ultravioleta que se observa por la fluorescencia de color verde limn emitida por el fluorocromo (FITC). LMPARA DE MERCURIO Luz ultravioleta
Fluorescencia
CRN + conjugado
CVS + conjugado
8.4 8.4.1 8.4.2 8.4.3 8.4.4 8.4.5 8.4.6 8.4.7

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MATERIALES Y REACTIVOS Solucin salina tamponada, pH 7,2-7,4 Conjugado antirrbico diludo 1/5 con CRN al 20% Conjugado antirrbico diludo 1/5 con CVS al 20% Acetona Q.P. Aceite de inmersin (Merck) ND 1,515 o glicerina pura Porta-objetos pavonados en un extremo Pipeta de transferencia o gotero
8.4.8 8.4.9 8.5 8.5.1 8.5.1.1
Agua destilada Beaker de 1000 mL PROCEDIMIENTO Examen y lavado de la muestra Luego de desembalar y verificar la codificacin de las muestras se procede a codificar las fichas con el cdigo del laboratorio y el respectivo da de procesamiento, as como su ingreso en el registro de muestras para diagnstico de rabia (Anexo E). Si la muestra fue remitida conteniendo glicerina 50%, se proceder a realizar un lavado utilizando suero fisiolgico (solucin salina estril 0,09%). Colocar el cerebro y cerebelo en una placa petri y llevar a una mesa de trabajo Realizar con la tijera un corte longitudinal al nivel de la primera circunvolucin caudal cortando paralelamente a la lnea que divide ambos hemisferios. El corte se extender de 3 a 5 cm hacia delante, profundizndose hasta ubicar el ventrculo lateral a nivel de una estructura de color blanco nacarado en forma de cuerno, que sobresale lateralmente del suelo del ventrculo. Esta estructura es el hipocampo o asta de Ammon, que al corte transversal muestra una estructura tpica de contorno espiralado (pionono). Se realizarn dos cortes ms, uno a nivel de la corteza cerebral y otro en el cerebelo, siempre procurando coger la sustancia gris con un espesor de 3 a 4 mm. Realizar dos lminas de la corteza, asta de Ammon y cerebelo en el caso de animales menores (felinos y caninos). Para el caso de animales mayores (bovinos) se realizarn cuatro lminas de las mismas zonas, con especial inters en el cerebelo. Los cortes de cada una de las estructuras se colocan sobre una tira de papel secante o filtro y ste sobre un bajalengua. Tomar un porta-objeto limpio y colocarlo con el bajalengua, formando una cruz. Realizar dos impresiones en cada lmina procurando que la impronta no sea muy gruesa. Si la impronta fuera muy gruesa, se podr adelgazar presionando la impronta sobre el papel filtro. Colocar las lminas secas en un coplin con acetona fra (-20C) por un mnimo de 30 minutos. Una vez seca la impronta, se proceder a delinear los bordes de ambas improntas con un corrector lquido (liquid paper). Diluir el conjugado antirrbico previamente titulado 1/5 con la suspensin de CRN o agua destilada Diluir el conjugado antirrbico con la suspensin de CVS 1/5 Agregar una gota de la mezcla del CRN + conjugado a la impronta ms cercana del extremo pavonado o que contenga el cdigo.
8.5.1.2
8.5.1.3 8.5.1.4
8.5.1.5
8.5.1.6
8.5.1.7
8.5.1.8
8.5.1.9 8.5.1.10
8.5.1.11 8.5.1.12 8.5.1.13
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8.5.1.14 8.5.1.15 8.5.1.16 8.5.1.17 8.5.1.18 8.5.1.19
Agregar una gota de la mezcla del CVS + conjugado a la impronta ms alejada del extremo pavonado Llevar a la estufa a 37C por 30 minutos Lavar con solucin salina tamponada pH 7,2-7,4 y dejar reposar por 10 minutos Lavar con agua destilada Dejar secar y observar a 100X con aceite de inmersin o glicerina pura, sin colocar laminilla a la impronta La observacin de las lminas se iniciar en el extremo superior izquierdo y proseguir hacia la derecha y luego hacia abajo, asegurando la observacin ordenada de toda la impronta. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Lmina control positivo: La impronta teida con CRN + conjugado muestra un campo oscuro con clulas nerviosas, en cuyo interior o exterior, se observan estructuras redondeadas (corpsculos rbicos) o pequeos puntos de color verde limn (Figura N 7). En el lado de la impronta teida con CVS + conjugado, no deber observarse fluorescencia de color verde limn. Lmina control negativo: Ambas improntas no mostrarn ningn tipo de fluorescencia. Lminas problema: Si la lmina se asemeja al control positivo, significar que la muestra es positiva; si se asemeja al control negativo, significa que la muestra es negativa, hasta que se emita el resultado de inoculacin en ratones.
8.6 8.6.1
8.6.2 8.6.3
Figura N 7. Fotografa microscpica de una impronta de cerebro positivo a rabia marcada con conjugado antirrbico. (Fotografiada por R Lpez, Laboratorio de Referencia Nacional de Rabia)
8.7 8.7.1
PRECAUCIONES Cuando las muestras contienen glicerina 50% en agua destilada se lavar con solucin salina fisiolgica 0,09% por 5 a 10 minutos, pudindose utilizar agua destilada. Si la muestra contiene preservantes como alcohol o formol, descartarla y obtener -en lo posibleuna nueva muestra que rena las condiciones indicadas. Si la muestra est demasiado contaminada (al punto de liquefaccin), descartarla y avisar al remitente.
8.7.2
8.7.3
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8.8 8.8.1
PROBLEMAS EN LA FLUORESCENCIA La lmina control positivo de la impronta de CRN + conjugado no presenta fluorescencia. Explicacin: La lmina tiene muchos das de preparacin. En este caso es necesario volver a preparar lminas control. La impronta de CVS + conjugado presenta fluorescencia en la lmina control positivo. Explicacin: El CVS ha bajado su ttulo y ya no inhibe a los anticuerpos coloreados del conjugado. La impronta de CRN + conjugado y la del CVS + conjugado presentan fluorescencia en la lmina control negativo. Explicacin: Presencia de precipitado o fluorescencia inespecfica. Observe si la morfologa es irregular debido a las sales de fluorescena. En la lmina problema la impronta de CRN + conjugado y la del CVS + conjugado presentan fluorescencia. Explicacin: Posible contaminacin bacteriana. Observe la morfologa caracterstica de bacilos o coco bacilos. Pudiera ser tambin conjugado inespecfico que se presenta en forma de cristales. En estos casos, centrifugue el conjugado para eliminar la coloracin inespecfica.
8.8.2
8.8.3
8.8.4
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22
SECCIN 9 PREPARACIN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS 9.1 9.1.1 LMINAS CONTROL POSITIVO Y NEGATIVO Retirar un cerebro positivo y otro negativo a rabia del congelador y realizar cortes preferentemente del asta o cerebelo. Rotular 10 lminas con la indicacin Control positivo y 10 Control negativo Realizar 10 lminas con dos impresiones por lmina con el cerebro positivo y 10 con el cerebro negativo Fijar con acetona por 20 minutos a 20C Retirar las lminas de la acetona y almacenarlas congeladas en un porta-lminas de plstico, preferentemente a -70C y, de no ser posible a -20C. Se recomienda utilizar porta-objetos positivos con menos de 10 das de antigedad. CONJUGADO ANTIRRBICO Mantener el conjugado a -20C o si es posible a menor temperatura Se recomienda fraccionar el conjugado en alcuotas (300 L) para evitar que se formen precipitados inespecficos o se contamine. PREPARACIN DE SOLUCIN SALINA TAMPONADA (PBS) 0,01M, pH 7,2 7,4 Frmula (Tabla N1)
Tabla N1. Frmulas para la preparacin de solucin salina tamponada (PBS) 0,01H, pH 7,2-7,4
9.1.2 9.1.3 9.1.4 9.1.5
9.2 9.2.1 9.2.2
9.3 9.3.1
Frmula para 1 litro NaCl K2HPO4 KH2PO4 Agua destilada 9.3.2 9.3.2.1 9.3.2.2 9.3.2.3 9.3.2.4
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Frmula para 9 litros 76,5 g 13,1 g 2,04 g 9 L de agua destilada
8,5 g 1,46 g 0,23 g 1L de agua destilada
Preparacin Pesar los reactivos y colocarlos en un matraz de 1000 mL Agregar agua destilada y disolver completamente Colocar la solucin en frasco de 9 L y mezclar completamente Tomar una alcuota y medir el pH que debe estar dentro del rango 7,2 7,4
9.3.2.5
Utilizar esta solucin sin esterilizar en un lapso de dos semanas. Para almacenar por perodos mayores deber procederse al autoclavado de la solucin para evitar la formacin de hongos. PREPARACIN DE SUSPENSIN DE CEREBRO DE RATN NORMAL 20% (CRN) Sacrificar un nmero apropiado de ratones albinos suizos de 3 o 4 semanas de edad o mayores con cloroformo en un envase hermtico. Extraer los cerebros de los ratones con doble juego de tijeras y pinzas estriles Pesar los cerebros y triturarlos en un mortero estril, agregando cuatro volmenes de suero de caballo 2% en agua destilada. Este diluyente debe contener 1000 UI de penicilina y 2 mg de estreptomicina por mL. Centrifugar a 1500 r.p.m. por 10 minutos Colectar el sobrenadante y distribuirlos en viales de 2 mL Mantener la suspensin congelada o liofilizada PREPARACIN DE SUSPENSIN DE CEREBRO DE RATN INFECTADO 20% (CVS) Preparar una dilucin 1/1000 del virus CVS (cepa estndar de desafo) Inocular intracerebralmente un nmero apropiado de ratones albinos suizos de 3 semanas de edad con 0,03 mL de una suspensin del virus. Al cabo de 6 a 7 das despus de la inoculacin y cuando la mayora de animales estn postrados, sacrificarlos utilizando cloroformo. Extraer los cerebros de los ratones con doble juego de tijeras y pinzas estriles Pesar los cerebros y triturarlos en un mortero estril Agregar cuatro volmenes de suero de caballo 2% en agua destilada. Este diluyente debe contener 1000 UI de penicilina y 2 mg de estreptomicina por mL Centrifugar a 1500 r.p.m. por 10 minutos en una centrfuga refrigerada Colectar el sobrenadante y distribuirlo en viales de 2 mL Mantener la suspensin congelada o liofilizada Esta suspensin debe tener un ttulo en ratn de por lo menos 105 DL50 / 0,03mL Por razones de seguridad, esta suspensin de CVS puede inactivarse utilizando betapropiolactona
9.4 9.4.1
9.4.2 9.4.3
9.4.4 9.4.5 9.4.6 9.5 9.5.1 9.5.2
9.5.3
9.5.4 9.5.5 9.5.6
9.5.7 9.5.8 9.5.9 9.5.10 9.5.11
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24
SECCIN 10 PRUEBA BIOLGICA DE INOCULACIN EN RATONES 10.1 10.1.1 PRINCIPIO Y UTILIDAD Cuando una muestra resulte negativa o no concluyente a la prueba de inmunofluorescencia, se proceder a realizar la prueba de inoculacin en ratones. Si en la muestra a inocularse en los ratones existe virus rbico, ste se manifestar con una sintomatologa caracterstica. Posterior a la muerte de los animales, sus cerebros sern sometidos a la prueba de inmunofluorescencia directa para la deteccin del antgeno rbico. Los ratones son animales muy susceptibles al virus de la rabia, sin embargo, puede obtenerse un resultado positivo en la prueba de inmunofluorescencia y negativa en la prueba de inoculacin en ratones. Esto puede ocurrir cuando el virus no es viable pero todava es antignico o cuando la cantidad de virus es insuficiente para iniciar la infeccin. ANIMALES DE LABORATORIO Se utilizan ratones albinos suizos cepa Balb-C debido a su susceptibilidad, pureza y facilidad de criarlos en el laboratorio. Los ratones son susceptibles a cualquier edad. Sin embargo, se recomienda emplear ratones de 21 das y de 11 a 14 g de peso, por su fcil manejo en el momento de la inoculacin. Los ratones de ambos sexos tienen la misma susceptibilidad, pero no es recomendable tenerlos en una misma jaula, debido al dao que se pueden infligir al estar juntos. Es indispensable que los animales vengan de un bioterio de produccin con condiciones ptimas de crianza. Se desechar cualquier animal que tenga ectoparsitos, pelo erizado o signos de diarrea. Si los ratones han sido enviados desde lejos, es conveniente esperar por lo menos 2 das antes de la inoculacin. MATERIALES Y EQUIPOS Mortero y piln (fros) Diluyente (agua destilada, 2% suero equino, 1000 UI penicilina y 2 mg de estreptomicina / mL) Tubo de ensayo 12 x 75 Jeringa (tuberculina) de 1 mL (una jeringa por muestra) Aguja 27 x 1/2 Recipiente para descartar agujas Pinza y tijera Jaulas de ratones de metal o polipropileno con sus respectivas rejillas
10.1.2
10.2 10.2.1 10.2.2 10.2.3 10.2.4
10.3 10.3.1 10.3.2 10.3.3 10.3.4 10.3.5 10.3.6 10.3.7 10.3.8

MPR - CNSP - 010
10.4 10.4.1 10.4.2
PROCEDIMIENTO Realizar una lista de las muestras negativas a IF a inocular y otras que se hayan indicado Ingresar los nmeros de muestra en el formato (Anexo F) de registro de ratones indicando los siguientes datos: Fecha de inoculacin Fecha de trmino de prueba Resultado de la prueba de IF Luego de desembalar e identificar la muestra, lavarla con solucin fisiolgica o con agua destilada, si sta ha sido recepcionada con glicerina al 50% . Colocar en un mortero estril 0,3 g de la muestra (incluyendo asta, corteza y cerebelo) y homogenizar Agregar 1,2 mL de diluyente y homogenizar nuevamente, obteniendo una suspensin al 20% Vaciar en un tubo de ensayo 12 x 75 mL Dejar reposar por una hora en la refrigeradora, aunque tambin se pueden preparar las suspensiones la tarde anterior, dejndolo refrigerado para que el virus drene de las clulas. Centrifugar a 4C a 2000 r.p.m. por 10 minutos Mantener permanentemente las suspensiones en fro Preparacin de las jaulas para inoculacin Colocar en una jaula limpia, viruta en cantidad suficiente para que cubra el suelo de la jaula Colocar de 5 a 8 ratones albinos suizos Balb-C Colocar una etiqueta (masking-tape) con el cdigo de la muestra, la fecha de inoculacin, el da de trmino y el resultado de la IF. Inoculacin del ratn Retirar de 0,03 a 0,025 de inculo por animal Eliminar las burbujas de aire dentro de un tubo con algodn La aguja deber ir a la altura de la sien del ratn (en la frente, en el caso de ratones lactantes) Despus de inoculado, observar que una gota del inculo aparezca en el sitio de la inoculacin
10.4.2.1 10.4.2.2 10.4.2.3 10.4.3
10.4.4 10.4.5 10.4.6 10.4.7
10.4.8 10.4.9 10.4.10 10.4.10.1 10.4.10.2 10.4.10.3
10.4.11 10.4.11.1 10.4.11.2 10.4.11.3 10.4.11.4

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10.4.11.5
Observar a los ratones un mnimo de 21 das. En caso de murcilagos, se mantendrn 28 das en observacin. OBSERVACIN DE RATONES INOCULADOS Examinar diariamente los ratones desde el momento de la inoculacin Anotar cada da el nmero de ratones normales, enfermos o muertos en una ficha que quedar archivada como testimonio del experimento (Anexo F). El ratn raramente produce sntomas de rabia antes de los 5 das, contados a partir del da de la inoculacin. La muerte no se le imputar al virus de la rabia cuando sobrevenga a las 24 o 48 horas, las cules pueden ser por causa traumtica o contaminacin bacteriana. Debern sobrevivir por lo menos 3 de los 6 animales inoculados; si ste no fuera el caso, se proceder a reinocular la muestra de la siguiente manera: Retirar la muestra de la congeladora Descongelar y preparar la suspensin al 20% con el diluyente al doble de concentracin de antibitico o pasar la muestra a travs de un filtro de 0,45 micras. Anotar en el registro que se est repitiendo la muestra Si los ratones mueren nuevamente dentro de los cuatro primeros das: No haga una prueba de IF Si la muestra proviene de un equino, notificar al Laboratorio de Arbovirus y proporcionar el ratn para que se le realice la prueba de IFI para la deteccin de arbovirus. Si uno o ms ratones mueren despus de los cuatro das: Realizar la prueba de inmunofluorescencia Anotar el resultado de la prueba de inmunofluorescencia en el cuaderno de ratones inoculados y en el registro de identificacin de las muestras. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Generalmente los ratones inoculados con muestras positivas empiezan a manifestar los primeros sntomas a partir del dcimo al dcimo segundo da de inoculacin. Primero mostrarn erizamiento, seguido de parlisis progresiva, postracin y muerte. Una vez que estn postrados, se sacrifican con cloroformo en un envase hermtico y se les extrae el cerebro. Realizar la prueba de inmunofluorescencia directa para la deteccin del antgeno rbico
10.5 10.5.1 10.5.2
10.5.3
10.5.4
10.5.4.1 10.5.4.2
10.5.4.3 10.5.4.4 a. b.
10.5.4.5 a. b.
10.6 10.6.1
10.6.2
10.6.3
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SECCIN 11 PRUEBA DE SERONEUTRALIZACIN PARA LA DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTIRRBICOS 11.1 11.1.1 11.1.2 PRINCIPIO Y UTILIDAD La prueba de neutralizacin del suero en ratones es un procedimiento serolgico que se utiliza para determinar si una persona o un animal est protegido contra la rabia. Este mtodo determina la cantidad de anticuerpos presentes en el suero y se basa en la neutralizacin de una serie de diluciones de suero con una dosis constante de un virus de desafo previamente titulado. Los resultados son expresados en trminos de ttulos serolgicos definidos como la dilucin ms elevada que neutraliza una cantidad estndar de virus. El mtodo comprende tres etapas: Preparacin y titulacin del virus desafo (CVS) Seroneutralizacin del virus: preparacin del suero y las mezclas suero-virus e inoculacin en ratones Interpretacin de resultados ANIMALES DE LABORATORIO Se utilizan ratones albinos suizos, cepa Balb-C de 21 das y de 11 a 14 g de peso. Se deben tener las mismas consideraciones mencionadas acerca de los ratones en la prueba de inoculacin de ratn. 11.3 11.3.1 11.3.2 11.3.3 11.3.4 11.3.5 11.3.6 11.3.7 11.3.8 11.3.9 11.3.10 11.3.11
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11.1.3 11.1.3.1 11.1.3.2 11.1.3.3 11.2
MATERIALES Y EQUIPOS Diluyente (agua destilada con 2% suero equino) Tubos de ensayo 12 x 75 mm Gradillas para tubos 12 x 75 mm Jeringa (tuberculina) de 1mL (una jeringa por suero) con aguja 27 x 1/2 Recipiente para descartar agujas Micropipeta de 1000 L Micropipeta de 40 200 L Tips amarillos (200 L) y azules (1000 L) Jaulas de ratones de metal o polipropileno con sus respectivas rejillas Suero de referencia internacional Suero problema
11.4
PROCEDIMIENTO El principio de la titulacin consiste en realizar una serie de diluciones del virus para poder establecer en que dilucin se encuentra la dosis que produce un 50% de mortalidad de los ratones inoculados. El virus CVS se conserva en forma de suspensin al 20%, distribuda en ampollas y congeladas a temperatura baja. Cuando se va a realizar la prueba, se toma una ampolla y se descongela rpidamente bajo chorro de agua fra de cao.
11.4.1 11.4.1.1
Clculo de las dosis de desafo Suponiendo que la cepa CVS contiene 106,0 DL50 por 0,03, es decir, existe una dosis letal 50 en 0,03 mL de una dilucin de 10-6,0 del virus CVS, con sueros de personas vacunadas se emplearn diluciones de sueros a partir de 1/5, 1/25 y 1/125 y la dilucin final de virus corresponder a 20 - 50 DL50. Por ejemplo, para encontrar la dilucin de CVS que contenga 64 DL50 en 0,03 mL, se resta el logaritmo de 64 del ttulo de la preparacin del virus CVS (106,0): 64 DL50 de virus en 0,03 mL = = = log (106,0) log (64) 6,0 1,8 4,2
11.4.1.2
Como 4,2 = log 16 000, consecuentemente la preparacin de CVS habr de diluirse al 1:16 000. Sin embargo, al iniciar las diluciones se debe tener en cuenta que el CVS viene de una suspensin al 20%, esto quiere decir que ya tiene una dilucin inicial que equivale a 10-0,7 (una dilucin al 20% es igual a 1/5 y el logaritmo de 5 es 0,7). Entonces, desde esta dilucin de 10-0,7 se tiene que llegar a la dilucin de 10-4,2. Las diluciones se van haciendo desde la 10-0,7 hasta 10-3,7 en progresin decimal y para pasar de 10-3,7 a dilucin 10-4,2 se restan los logaritmos de la siguiente manera: 4,2 3,7 = 0,5
11.4.1.3
De manera inversa se obtiene el antilogaritmo de 0,5 = 3,16, el que se redondea a 3. Esto quiere decir que se necesita hacer una dilucin de 1:3 para pasar de 3,7 a 4,2. Hecho esto, se realiza tres diluciones ms (10-5,2, 10-6,2 y 10-7,2) para poder realizar la titulacin simultnea de comprobacin de las dosis letales utilizadas. Preparacin y titulacin del virus de desafo CVS Calcular la cantidad de CVS conteniendo las 64 DL50 que se necesita de acuerdo al nmero de sueros problema que tenga. De acuerdo a la dilucin que contendr 64 DL50 (para este caso la dilucin 10-4,2), rotular los tubos 12x75 mm con 10-1,7, 10-2,7, 10-3,7, 10-4,2, 10-5,2, 10-6,2 y 10-7,2. Distribuir 2,7 mL de diluyente en los tubos rotulados, a excepcin del tubo 10-4,2 al que se le colocar 2,0 mL. Tomar 0,3 mL de la ampolla de CVS recin descongelada y colocarla en el primer tubo 10-1,7, homogenizar y descartar el tip. Continuar de la misma manera con los tubos 10-2,7 y 10-3,7.
11.4.2 11.4.2.1
11.4.2.2
11.4.2.3
11.4.2.4
MPR - CNSP - 010
11.4.2.5 11.4.2.6
Tomar 1,0 mL del tubo 10-3,7 y colocarlo en el 10-4,2, homogenizar y descartar el tip. Tomar 0,3 mL del 10-4,2 y pasar al 10-5,2 , homogenizar y descartar el tip. Realizar el mismo procedimiento con el tubo de 10-6,2 y 10-7,2.
0,3 mL 0,3 mL
0,3 mL
1,0 mL
0,3 mL
0,3 mL
0,3 ml
2,7mL 10-0,7 CVS 20%
2,7 mL
2,7 mL
2,0 mL
2,7 mL
2,7 mL
2,7 mL
10
-1,7
10
-2,7
10
-3,7
10
-4,2
10
-5,2
10
-6,2
10
-7,2
Figura N 8. Esquema de dilucin del virus CVS
11.4.3 11.4.3.1 11.4.3.2
Dilucin del suero problema Inactivar los sueros a 56C por 30 minutos en Bao Mara Preparar una dilucin 1/2,5 del suero de referencia internacional, aadiendo 0,2 mL del suero a 0,3 del diluyente. Preparar diluciones al quinto con el suero de referencia a partir de la dilucin 1:2,5, hasta la dilucin 1:312,5, transfiriendo 0,2 mL de cada dilucin a 0,8 mL de diluyente (2% de suero equino en agua destilada).
0,1 mL 0,6 mL 0,6 mL 0,6mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL descartar
11.4.3.3
0,3 mL Sueros a diluir 1/2, 5
0,8 mL 1/12,5
0,8 mL 1/62, 5
0,8 mL 1/312, 5
* Al final deben quedar 0,2 mL de suero en cada tubo.
Figura N 9 Esquema de dilucin del suero de referencia y los sueros problema

30
MPR - CNSP - 010
11.4.4 11.4.4.1
Mezcla suero virus Rotular cuatro tubos 12x75 mm con 1/5, 1/25, 1/125 y 1/625 suero de referencia internacional + 32 DL50. Rotular cuatro tubos 12x75 mm con 1/5, 1/25, 1/125 y 1/625 suero problema + 32 DL50 Combinar 0,2 mL del tubo que contiene 64 DL50 (en este caso 10-4,2) con cada dilucin de los suero problema y del suero de referencia internacional que contenga 0,2 mL, logrando reducir a 32 dosis letales efectivas. Rotular cuatro tubos 12x75 mm: 32 DL50, 3,2 DL50, 0,32 DL50 y 0,032 DL50 Tomar de cada dilucin 10-4,2, 10-5,2, 10-6,2 y 10-7,2 0,2mL y combinarlo con 0,2 mL de diluyente conteniendo 20% de suero equino. Incubar en bao Mara a 37C por 90 minutos Retirar y colocarlas en una bandeja con hielo Inoculacin en ratones Colocar una etiqueta en cada jaula correspondiente a cada mezcla de suero virus Inocular 6 ratones por dilucin con 0,03 mL de cada mezcla suero-virus intracranealmente en ratones de 21 das de edad. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Anotar el nmero de ratones muertos entre los das 6 y 14 de la inoculacin (Anexo G) Utilizar la frmula de Reed-Meunch (vea el Anexo H) para calcular el punto final del 50% de mortalidad de las diluciones de virus. Esta titulacin indicar si las dosis letales utilizadas fueron las correctas. Calcular el punto final del 50% con la frmula de Reed-Meunch del suero de referencia internacional y los sueros problema. El Comit de Expertos de la OMS sobre rabia indica la necesidad de recibir inmunizacin de refuerzos cuando el ttulo baja de 0,5 UI/mL.
11.4.4.2 11.4.4.3
11.4.4.4 11.4.4.5
11.4.4.6 11.4.4.7 11.4.5 11.4.5.1 11.4.5.2
11.5 11.5.1 11.5.2
11.5.3
MPR - CNSP - 010
31
SECCIN 12 MANTENIMIENTO DE RATONES EN EL LABORATORIO 12.1 OBJETIVO Establecer y uniformizar los procedimientos de cuidado y alimentacin de los ratones que se utilizan para el diagnstico del virus rbico. 12.2 CAMPO DE APLICACIN Comprende el mantenimiento de ratones albinos suizos inoculados en el Laboratorio de Rabia 12.3 12.3.1 12.3.2 12.3.3 12.3.4 12.3.5 12.3.6 12.3.7 12.3.8 12.3.9 12.3.10 12.41 12.4.1 12.4.1.1 12.4.1.2 12.4.1.3 12.4.2 12.4.2.1
MPR - CNSP - 010
MATERIALES Y EQUIPOS Alimento balanceado especial para ratones Viruta estril Pinza simple de 20 cm Biberones Jaulas limpias Recipiente con bolsa autoclavable Mascarilla 3M Balde hermtico Cloroformo Esptula CRONOGRAMA Lunes Chequear el registro diario para determinar animales normales, enfermos y muertos Dar agua y comida a los animales Preparar jaulas limpias con agua, comida y viruta para recepcionar los ratones del da martes Martes Chequear el registro diario para determinar animales normales, enfermos y muertos
12.4.2.2 12.4.2.3
Dar agua y comida a los animales Recoger ratones del Centro Nacional de Produccin de Biolgicos del Instituto Nacional de Salud y colocar 6 en cada jaula con viruta, agua y comida Enviar ratones muertos sospechosos de rabia Mircoles Chequear el registro diario para determinar animales normales, enfermos y muertos Dar agua y comida a los animales Cambio de camas a todas las jaulas, con excepcin de las jaulas con ratones ingresados el da martes Lavado de las jaulas sucias Jueves Chequear el registro diario para determinar animales normales, enfermos y muertos Dar agua y comida a los animales Lavar los biberones Envo de ratones muertos sospechosos de rabia Inoculacin de ratones Viernes Chequear el registro diario para determinar animales normales, enfermos y muertos Eliminar ratones Lavar las jaulas de los ratones eliminados Dar agua y comida a los animales Sbado Chequear el registro diario para determinar animales normales, enfermos y muertos Dar agua y comida a los animales Limpieza y desinfeccin general del ambiente
12.4.2.4 12.4.3 12.4.3.1 12.4.3.2 12.4.3.3
12.4.3.4 12.4.4 12.4.4.1 12.4.4.2 12.4.4.3 12.4.4.4 12.4.4.5 12.4.5 12.4.5.1 12.4.5.2 12.4.5.3 12.4.5.4 12.4.6 12.4.6.1 12.4.6.2 12.4.6.3
MPR - CNSP - 010
12.5 12.5.1
PROCEDIMIENTO DE CAMBIO DE JAULA DE RATONES El cambio de jaulas de ratones se realizarn los das mircoles, con excepcin de los ratones ingresados el da martes. Tomar una jaula limpia y agregar una medida de viruta estril cubriendo el piso de la jaula Colocar la etiqueta de la jaula sucia en la jaula limpia Sacar la rejilla de la jaula sucia y transferir los animales inoculados a la jaula limpia con ayuda de una pinza. Los animales no inoculados pueden transferirse con guantes sin necesidad de pinzas Colocar la rejilla en la jaula limpia y depositar la jaula en el estante respectivo Sacar la viruta de la jaula sucia con ayuda de una esptula y colocarla en la bolsa autoclavable Llevar las jaulas sucias al lavadero y la bolsa con la viruta al incinerador o autoclave Llenar el lavadero con agua y sumerjir las jaulas Agregar detergente, mezclar y dejar remojar Enjuagar las jaulas y dejarlas secar PROCEDIMIENTO DE CHEQUEO DIARIO DE RATONES El procedimiento de chequeo diario de ratones se realiza utilizando la ficha de revisin de ratones (Anexo D).
12.5.2 12.5.3 12.5.4
12.5.5 12.5.6 12.5.7 12.5.8 12.5.9 12.5.10 12.6 12.6.1
MPR - CNSP - 010
34
BIBLIOGRAFA Instituto Nacional de Salud. Manual de normas de bioseguridad. Lima: INS; 1997. Serie de Normas Tcnicas N 18. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para la obtencin y envo de muestras (I). Lima: INS; 1997. Serie de Normas Tcnicas N 15. Larghi OP. Prueba de anticuerpos fluorescentes para rabia. Centro Panamericano de Zoonosis; 1975. Nota Tcnica N 8. Meslin F - X, Kaplan MM, Koprowski H. Laboratory techniques in rabies. Geneva:WHO; 1996. Lpez R, Fernndez R. Produccin del primer lote de conjugado antirrbico de origen caprino en el Per. Rev Med Exp 1997;14(1): 43-4. Organizacin Mundial de la Salud. Comit de Expertos sobre Rabia. Ginebra: OMS; 1992. Serie de Informes Tcnicos N 824. Velleca W, Forrester F. Laboratory methods for detecting rabies. Atlanta: CDC; 1981.
MPR - CNSP - 010
35
ANEXO A DISPOSITIVO DE SUJECIN PARA LAS CABEZAS DE LOS ANIMALES PARA LA TOMA DE MUESTRAS
Fuente: Public Health Reports 1997;92(6).
MPR - CNSP - 010
36
ANEXO B FORMULARIO PARA EL ENVO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA ANIMAL
CDIGO INS
FECHA DE RECEPCIN
1.
DATOS DEL ESTABLECIMIENTO

NOMBRE DEL ESTABLECIMIENTO DEPARTAMENTO /PROVINCIA/ DISTRITO
DIRECCIN
TELFONO/FAX
2.
DATOS DEL ANIMAL

FICHA DEL ANIMAL MUESTRA N ESPECIE EDAD
2.1.
LOCALIDAD
PROCEDENCIA
DISTRITO PROVINCIA DEPARTAMENTO
VACUNACIN: S NO SE IGNORA
CAUSA DE MUERTE DEL ANIMAL: MURI SACRIFICADO FECHA:
TIPO DE VACUNA UTILIZADA: _________________________________________________________________ OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________________________ 3. RESULTADOS DEL LABORATORIO REGIONAL Inmunofluorescencia directa:...............................................
Nota: La muestra para diagnstico de rabia es cerebro, cerebelo y mdula conservado en glicerina 50% con suero fisiolgico.
MPR - CNSP - 010
37
ANEXO C INSTITUTO NACIONAL DE SALUD FORMULARIO PARA EL ENVO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA HUMANA
CDIGO INS
FECHA DE RECEPCIN
1.
DATOS DEL PACIENTE

NOMBRES Y APELLIDOS DEPARTAMENTO /PROVINCIA/ DISTRITO
DIRECCIN
TELFONO/FAX
2. 2.1 2.2 2.3 2.4
DATOS DE LA INFECCIN Y TRATAMIENTO Exposicin al virus por: Mordedura Contacto Se ignora
Si fue mordedura: Localizacin............................................................................................................ Herida: nica Mltiple Superficial Profunda
Fecha de exposicin: Da Mes No Ao Se aplic antirrbica: ltima dosis: Da Mes Ao Da Mes Ao Si No
2.5 2.6
Tena vacunacin anterior: Fecha de 1ra dosis vacuna:
Si
2.7 2.8 3. 3.1
Nmero de dosis aplicadas: dosis:
Fecha de aplicacin del suero: Da Mes Ao
Tipo de vacuna:................................. N de Lote:........................... DATOS DE LA ENFERMEDAD Fecha de los primeros sntomas: Da Mes Ao
3.2
Fecha de muerte: Da Mes Ao
MPR - CNSP - 010
38
4. 4.1 4.2. 5. 5.1 5.2
DATOS DEL ANIMAL CAUSANTE DE LA EXPOSICIN Especie: Perro Murcilago Otro:........................................................... Observado No sabe
Condicin del animal mordedor: Huido TIPO DE MUESTRA Cerebro y cerebelo: Saliva: Suero:
Biopsia de piel:
Fecha de obtencin de muestra: Da Mes Ao
6.
DATOS DEL INFORMANTE

NOMBRE DEL ESTABLECIMIENTO SOLICITANTE
DIRECCIN
TELFONO/FAX
FECHA
FIRMA
MPR - CNSP - 010
39
ANEXO D FLUJOGRAMA PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA EN LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS
MPR - CNSP - 010
40
ANEXO E REGISTRO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE RABIA
Fecha
N muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Departamento
Provincias
Distrito
Localidad
Especie
IF
IR
IF = Resultado de inmunofluorescencia IR = Resultado de inoculacin en ratones
MPR - CNSP - 010
41
ANEXO F FICHA DE REGISTRO DE RATONES INOCULADOS
MPR - CNSP - 010
42
ANEXO G PROTOCOLO DE TRABAJO PARA LA PRUEBA DE SERONEUTRALIZACIN
PRUEBA DE: .................................................................... MUESTRA DE: ................................................................. PROCEDENCIA: ..............................................................
FECHA DE PRUEBA: ................................................. INOCULADOR: ........................................................... RESPONSABLE: ........................................................
MPR - CNSP - 010
43
ANEXO H MTODO DE REED Y MUENCH H.1. REQUISITOS PARA UTILIZAR EL MTODO DE REED Y MUENCH Nmero constante de animales por dilucin Factor dilucin constante Serie de diluciones que abarquen el 100% y 0% de animales positivos Ausencia de muertes accidentales (si estas muertes se dar preferencia al mtodo de SpearmanKarber).
En el mtodo de Reed y Muench, el punto de partida para el clculo de las diluciones finales del 50% es la dilucin que produce una mortalidad inmediatamente inferior al 50% (dilucin de partida). Para determinar la diferencia entre el logaritmo de la dilucin de partida y el logaritmo de la dilucin final al 50% (diferencia de logaritmos) se utiliza una frmula. Si la mortalidad disminuye cuando la dilucin aumenta (como sucede en las titulaciones de virus rbico), la dilucin final del 50% ser inferior a la dilucin de partida. En consecuencia, la diferencia de logaritmos ha de sustraerse del logaritmo recproco de la dilucin de partida. Por el contrario, la diferencia de logaritmos tiene que sumarse si la mortalidad se incrementa con el aumento de las diluciones. Esa diferencia, que aparece ilustrada en los siguientes ejemplos, debe tenerse en cuenta al efectuar los clculos.
H.2.
EJEMPLO DE LA TITULACIN DE UNA SUSPENSIN DEL VIRUS Dilucin del virus 10-5 10-6 10-7 Ratones Vivos Muertos 0 4 9 10 6 1 Acumulado Vivos Muertos 0 4 13 17 7 1 Mortalidad % 17/17=100 7/11 =64 1/14 =7
Total 17 7 1
Se acumulan los totales de 10-5 a 10-7 para los animales supervivientes y de 10-7 a 10-5 para los ratones que se consideran muertos por rabia. En el presente ejemplo, el factor de dilucin es 10 y la dilucin de partida (con una mortalidad inmediatamente inferior al 50%) es 10-7. La diferencia de logaritmos se calcula con la frmula: 50% - mortalidad inferior al 50% mortalidad superior al 50% - mortalidad inferior al 50% Segn el ejemplo: 50 7 x 1 = 0,75 64 7
MPR - CNSP - 010 44 Instituto Nacional de Salud
x logaritmo del factor dilucin
Teniendo en cuenta que en este ejemplo la mortalidad disminuye al aumentar la dilucin, la ltima dilucin positiva al 50% es inferior a la dilucin de partida y para el clculo se sustrae la diferencia de logaritmos del siguiente modo: Log (recproco de la dilucin final del 50%) = log (recproco de la dilucin de partida) diferencia de logaritmos = log 107 0,75 Log (dilucin final del 50%) = 6,25
De aqu, ttulo DL50 H.3.
= 10-6,25
EJEMPLO DE LA TITULACIN DE UN SUERO ANTIRRBICO Supngase que un protocolo tpico de titulacin de un suero antirrbico da los siguientes resultados:
Dilucin del suero 10-2,7(1:500) 10-3 (1:1000) 10-3,3 (1:2000) 10-3,6 (1:4000) 10-3,9 (1:8000)
Ratones Supervivientes 5 4 1 1 0
Muertos 0 1 4 4 5
Totales acumulativos Supervivientes Muertos 11 0 6 1 2 5 1 9 0 14
Mortalidad % 0/11 = 0 1/7 = 14 5/7 = 71 9/10 = 90 14/14 = 100
En este ejemplo, el factor de dilucin es 2 y la dilucin de partida (mortalidad inferior al 50%) es 10-3. Con la misma frmula del ejemplo anterior, la diferencia de logaritmos es: 50 14 x 0,301 = 0,19 71 14 Como en este caso la mortalidad aumenta con la dilucin, la dilucin final del 50% ser ms elevada que la dilucin de partida y para calcular se sumar la diferencia de logaritmos del siguiente modo: Log (recproco de la dilucin final del 50%) = log (recproco de la dilucin de partida) + diferencia de log = 3 + 0,19 = 3,2 (aprox.) De aqu, log de la dilucin final del 50% = -3,2 = 10-3,2
MPR - CNSP - 010
45
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Setiembre 2002 Tiraje: 3,000 ejemplares
MPR - CNSP - 010
46

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO DE LA RABIA

Serie de Normas Tcnicas N 31 Lima - 2002

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO DE LA RABIA

Serie de Normas Tcnicas N 31 Lima - 2002

Portada: Frontis del local central del Instituto Nacional de Salud.

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Manual de procedimientos para el diagnstico de la rabia

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO DE LA RABIA

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Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

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GENERALIDADES Objetivo Campo de aplicacin Responsabilidades Documentos de referencia Definiciones y abreviaturas

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Disposiciones Principales medidas de bioseguridad

CONSERVACIN, EMBALAJE Y TRANSPORTE DE MUESTRAS Conservacin de la muestra Embalaje Transporte

MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA Fundamento Objetivo Materiales Procedimientos de uso Procedimientos de mantenimiento

SECCIN 7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6

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DISPOSITIVO DE SUJECIN PARA CABEZAS DE LOS ANIMALES PARA LA TOMA DE MUESTRAS

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ANEXO B ANEXO C ANEXO D ANEXO E ANEXO F ANEXO G ANEXO H

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1.4.2 1.5 1.5.1 1.5.2

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1.5.4 1.5.5 1.5.6 1.5.7 1.5.8 1.5.9 1.5.10 1.5.11

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2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.9

2.2.10 2.2.11 2.2.12

2.2.13 2.2.14 2.2.15

2.2.16 2.2.17 2.2.18 2.2.19

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3.2.3.3 3.2.3.4 3.2.3.5