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UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMDICAS



DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLGICAS CON ESPECIALIDAD
EN FISIOLOGA

PROPIEDADES MECNICAS Y MOLECULARES DE TEJ IDOS CARDIACOS EN
HIPERTROFIA FUNCIONAL DURANTE LA PREEZ.

TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLGICAS
CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGA


PRESENTA

M. EN C. ADOLFO VIRGEN ORTIZ



DIRECTOR DE TESIS

DR. J . J ESS MUIZ MURGUA




COLIMA, COL., MARZO DE 2006















DEDICATORIA

Este trabajo realizado lo dedico con mucho amor a mi esposa Liliana, por la
paciencia y el apoyo que me ha otorgado a lo largo de estos aos, en los cuales he
sacrificado muchas cosas para dedicarme a realizar experimentos en el laboratorio
que dieron como fruto la obtencin de esta tesis doctoral, gracias por permitirme dar
un paso ms en mi desarrollo profesional. Tambin, tengo una dedicatoria para mis
dos amados traviesos, mis hijos, Idarita y Haziel, que son una de las razones ms
fuertes en esta vida que me impulsan a seguir adelante. Finalmente, este trabajo lo
dedico con mucho cario a mis padres, Ma. del Carmen y Juan, que fueron los
iniciadores de este camino donde hoy me encuentro.












AGRADECIMIENTOS

A Dios, por permitirme ser lo que hoy soy en esta vida.

Al Dr. Jess Muiz, porque adems de ser mi asesor fue un amigo, que me otorg
toda su confianza y en los momentos difciles ah estuvo para motivarme y no
dejarme caer ante las dificultades que enfrentamos en esta vida llena de
enseanzas, en especial en el mundo de la investigacin.

A mis compaeros y amigos de laboratorio: Ana, Vctor, Mario y Santiago, con
quienes diariamente compart experiencias que nos llevaron a mejorar diariamente
en nuestro trabajo.

A los estudiantes: Norma, Enerith, Bertha, Arlet, Yara, Marcela y Uriel, todos ellos
alumnos de la Facultad de Ciencias Qumicas, por su valiosa colaboracin.

A la Dra, Elena Castro por su asesora y facilidades otorgadas para la realizacin de
experimentos de biologa molecular en su laboratorio.

A los Drs. Snchez Chapula y Ricardo Navarro, por ensearme la tcnica de
dispersin de miocitos cardiacos en rata.

Al Dr. Elizalde, por sus valiosos consejos en la realizacin de experimentos
mecnicos con tiras de msculo cardiaco aislado.

A MVZ. Jess Dueas, por su apoyo en la programacin de cruzas de ratas para
tener a tiempo ratas en estado de preez y en posparto.

A la Universidad de Colima, que me permiti estudiar el doctorado en Ciencias
Fisiolgicas que ofrece a travs de la Facultad de Medicina.













Este proyecto fue desarrollado gracias al financiamiento


CONACYT-MEXICO, 42065M.
FONDO RAMN LVAREZ BUYLA DE ALDANA, UNIVERSIDAD DE COLIMA.
CONVENIO UC-MEXUS, 2003.
BECA DE CONACYT PARA ESTUDIAR EL DOCTORADO


INDICE GENERAL

Pg.
Cuadros i
Figuras ii
Abstract vii
Resumen viii
I. Introduccin 01
II. Marco terico 04
La hipertrofia cardiaca 05
El corazn y la preez 07
La tensin pasiva y la titina cardiaca 09
Cambios de la titina cardiaca durante el desarrollo 14
Tensin pasiva en distintos modelos de disfuncin cardiaca 15
La histresis en tejidos cardiacos 18
III. Hiptesis 20
IV. Objetivos
General 22
Especficos 24
V. Materiales y Mtodos 26
Manejo de los animales y obtencin de muestras 27
Aislamiento de los miocitos cardiacos para determinar el rea de cada
clula.

27
Propiedades mecnicas pasivas 28
Anlisis de titina con tcnicas bioqumicas y de biologa molecular 31
Histologa 37

Anlisis estadstico 38
VI. Resultados 39
Peso de corazones 40
rea de miocitos cardiacos 42
Desarrollo de la tensin pasiva 45
Correlacin entre la longitud de los miocitos cardiacos y la tensin pasiva 54
Histresis 55
Mdulo de elasticidad 57
Electroforesis de titina cardiaca 59
Anlisis de Western-blot 60
Niveles de ARNm para titina cardiaca mediante RT-PCR semicuantitativo 63
Cortes histolgicos teidos con Tricromo de Masson 64
VII. Discusin 67
VIII. Conclusiones 75
IX. Perspectivas 78
X. Anexo 81
XI. Bibliografa 85


CUADROS


Cuadro Pg.

1 Cambios en el corazn observados durante el embarazo y
posparto de mujeres sanas.

7
2 Valores hemodinmicos en la preez de rata. 7
























FIGURAS

No. Fig. Pg.

1 Cortes histolgicos de paredes miocrdicas
hipertrofiadas por sobrecarga de presin.

6
2 Morfologa del corazn durante la preez y no preez de
ratn.

6
3 Curso temporal del perfil hormonal plasmtico durante la
preez de rata.

8
4 Esquema de la sarcmera.

10
5 Diferencias de tensin pasiva entre el msculo cardiaco y
esqueltico.

11
6 Isoformas de titina N2BA y N2B observadas en msculo
cardiaco.

12
7 Las isoformas de titina modulan la tensin pasiva en el
msculo cardiaco.

13
8 Tensin pasiva y expresin de isoformas de titina en
ventrculo izquierdo de corazn de cerdo.

14
9 Tensin pasiva y expresin de isoformas de titina en
corazn de humano con disfuncin en la arteria
coronaria.

15

10 Tensin pasiva en un modelo de cardiomiopata dilatada
en aves.

16
11 Expresin de isoformas de titina cardiaca asociada a la
tensin pasiva en cardiomiopata dilatada en humanos.

17
12 Fenmeno de histresis en miocitos cardiacos aislados.

18
13 Curso temporal de la recuperacin de la histresis en
miocitos cardiacos.

19
14 Sistema utilizado para registrar la tensin pasiva en
cortes de ventrculo cardiaco de rata.

28
15 Registro ilustrativo de tensin pasiva de la pared libre del
ventrculo derecho de rata a una deformacin del 10 % L

29
16 Montaje para realizar la electrotransferencia de protenas.

33
17 Esquema que ilustra los sitios de reconocimiento de los
anticuerpos anti-titina N2B y anti-titina N2BA.

34
18 Relacin peso del corazn vs. masa corporal en ratas.

40
19 Peso del corazn de ratas no preadas, preadas y en
posparto.

41
20 rea de miocitos cardiacos de la pared libre de ventrculo
derecho, endocardio y epicardio del ventrculo izquierdo
de rata.

42

21 rea de los miocitos cardiacos del ventrculo derecho y
ventrculo izquierdo de ratas no preadas, preadas y en
posparto.

43
22 Longitud de los miocitos cardiacos de ratas no preadas,
preadas y en posparto.

44
23 Tensin pasiva de la pared libre del ventrculo derecho
en cortes con orientaciones diferentes.

45
24 Tensin pasiva de la pared libre del ventrculo derecho
de ratas no preadas, preadas y en posparto.

47
25 Tensin pasiva en ventrculo izquierdo de ratas no
preadas, preadas y en posparto

49
26 Tensin pasiva de la pared libre del ventrculo derecho
durante la fase de regreso a su longitud inicial despus
de someterse a una deformacin.

51
27 Tensin pasiva del ventrculo izquierdo durante la fase de
regreso a su longitud inicial despus de someterse a una
deformacin.

53
28 Correlacin entre la longitud de los miocitos cardiacos y
la tensin pasiva mxima.

54
29 Fenmeno de histresis en la pared libre del ventrculo
derecho de ratas no preadas, preadas y en posparto.

55
30 Fenmeno de histresis en el ventrculo izquierdo de 56

ratas no preadas, preadas y en posparto.

31 Modulo de elasticidad o de Young de la pared libre del
ventrculo derecho.

57
32 Modulo de elasticidad o de Young del ventrculo
izquierdo.

58
33 Curva de calibracin con albmina de suero bovino.

59
34 Western-blot ilustrativo de membranas incubadas con
anticuerpos anti-N2B y anti- N2BA.

60
35 Expresin de isoformas de titina N2B y N2BA en corazn
de ratas no preadas, preadas y en posparto.

61
36 Cantidad total de titina respecto a miosina en tejidos
cardiacos de ratas no preadas, preadas y en posparto.

62
37 Niveles de expresin de ARNm de las dos isoformas de
titina N2B y N2BA en corazn de ratas no preadas,
preadas y en posparto.
63

38 Cortes histolgicos de tejidos cardiacos teidos con
tricromo de Masson.

64
39 Promedio de densidad de colgena ventricular de
corazn de ratas no preadas, preadas y en posparto.

65
40 Diferencias en la colgena del pericardio de corazones
de ratas no preadas, preadas y en posparto.
66


41 Perspectivas. Probables mecanismos moleculares que
pudieran estar involucrados en el desarrollo de hipertrofia
cardiaca durante la preez.

81






ABSTRACT

We evaluated changes in passive mechanical properties and titin isoforms expression
in cardiac tissues during rat pregnancy. Left and right ventricles free wall were
dissected from rats heart in non-pregnancy, pregnancy and postpartum. Mechanical
experiments in ventricular strips were done by stretch-release cycles using step
motor. N2B and N2BA titin isoforms expression were measured by western-blotting
(protein) and semiquantitative RT-PCR (mRNA). Besides, collagen was evaluated by
histology. The results show that during the pregnancy a cardiac hypertrophy was
present by increase of myocytes size; passive tension developed by myocardials
walls was decreased; elastic modulus, calculated with Magid and Law equation, and
hysteresis were decreased; and titin isoforms expression levels both, protein and
mRNA, were not altered. Moreover, collagen increased in the pregnancy. All changes
observed in rat pregnancy were reversed during postpartum. The reduction in elastic
modulus means less ventricular rigidity; which could contribute to facilitate the
ventricular filling in conditions of a greater circulating volume, a characteristic of the
pregnancy.










RESUMEN
Evaluamos cambios en las propiedades mecnicas pasivas y expresin de isoformas
de titina en tejidos cardiacos de ratas preadas. La pared libre de ventrculo derecho
e izquierdo fue disecada del corazn de ratas en preez, no preez y posparto. Se
realizaron experimentos mecnicos en tiras ventriculares mediante ciclos de
estiramiento-liberacin usando un motor de pasos. La expresin de titina N2B y
N2BA se midi con western-blot (protena) y RT-PCR semicuantitativo (ARNm).
Adems, la colgena fue evaluada por histologa. Los resultados muestran que
durante la preez hay hipertrofia cardiaca por incremento en tamao de los miocitos;
la tensin pasiva desarrollada por las paredes miocrdicas disminuy; el modulo
elstico y la histresis disminuyeron; y los niveles de expresin de las titinas, tanto en
protena como ARNm, no fueron alterados. Por otra parte, la colgena aument en la
preez. Todos los cambios observados en preez de rata se revirtieron en el
posparto. La reduccin en el mdulo elstico significa menos rigidez ventricular que
podra contribuir a facilitar el llenado ventricular en condiciones de mayor volumen
circulante caracterstico del embarazo.




1














INTRODUCCIN
















2
Durante la preez, el corazn sufre hipertrofia debido a cambios hemodinmicos
importantes como son el aumento del volumen circulante y la disminucin de la
resistencia vascular perifrica. Estos cambios se revierten en el posparto (Katz et al.,
1978; Slangen et al., 1997).

En la actualidad, la hipertrofia cardiaca ha sido ampliamente estudiada en modelos
patolgicos. Tambin, se han probado distintos frmacos, como los antihipertensivos
(Zakynthinos et al., 2004; Picca et al., 2004) y las estatinas, entre otros (Patel et al.,
2001; Liao, 2004), buscando revertir la hipertrofia; pero aunque hay muchas vas de
sealizacin estudiadas (Molkentin et al., 2001; Wilkins y Molkentin, 2002 y 2004) y
estudios teraputicos, todava no estn esclarecidos por completo los mecanismos
de sealizacin implicados en la hipertrofia. En este aspecto, la hipertrofia cardiaca
funcional que se desarrolla en la preez y se revierte despus del parto, parece ser
un modelo muy interesante de estudio en la bsqueda de mecanismos fisiolgicos
que reviertan la hipertrofia cardiaca.

El incremento en la tasa metablica de la hembra preada demanda un corazn ms
eficiente, con capacidad para expulsar un mayor volumen sistlico. El llenado
diastlico, durante la relajacin muscular, es un factor importante para asegurar el
aumento del gasto cardiaco. Las propiedades mecnicas pasivas, a pesar de su
posible papel en este proceso, han sido poco estudiadas. El estudio de la tensin
pasiva y la distensibilidad de los tejidos cardiacos son particularmente interesantes
en los corazones de hembras preadas, pues un corazn con menor resistencia a la
distensin favorecera el llenado ventricular y asegurara el aumento en el gasto
cardiaco.

Existen evidencias de que la responsable principal de generar tensin pasiva en
msculo cardiaco y esqueltico, es una protena sarcomrica gigante llamada titina
(Labeit et al., 1992; Squire, 1997; Trinick y Tskhovrebova, 1999; Cazorla et al., 2000;
Freiburg et al., 2000). La regin extensible de la titina que regula el desarrollo de
tensin esta formada por: 1) Dominios de Inmunoglobulinas, 2) un segmento PEVK
3
(denominado as, por ser rico en Prolina (P), Glutamato (E), Valina (V) y Lisina (L)) y,
3) una secuencia nica de aminocidos (N2B y/o N2A). En tejidos cardiacos se han
identificado dos isoformas distintas conocidas como N2B y N2BA.

La isoforma N2BA es ms larga y menos rgida que la N2B. Se ha propuesto que el
cociente de los niveles de expresin N2BA / N2B, determina las propiedades pasivas
de los tejidos cardiacos en las diferentes especies, y en las distintas regiones de un
mismo corazn (Cazorla et al., 2000; Trombitas et al., 2001; Granzier y Labeit, 2002).

La titina cardiaca en los ltimos aos despert gran inters por la contribucin que
puede tener en la distole, y en este punto, no hay datos de los niveles de expresin
de isoformas de titina en la preez y el posparto.

Dada la escasa informacin existente acerca de los eventos asociados a la
hipertrofia cardiaca funcional por preez, fue de particular inters para este estudio,
conocer los cambios en las propiedades mecnicas pasivas y moleculares de titina
(Niveles de expresin de isoformas de N2BA y N2B) de los tejidos ventriculares
izquierdo y derecho durante la preez y el posparto.
4














MARCO TERICO
















5

LA HIPERTROFIA CARDIACA

Las enfermedades cardiacas son de las principales causas de muerte en todo
el mundo. La hipertrofia cardiaca y la fibrosis intersticial son respuestas del corazn a
todas las formas de dao y son las principales determinantes de la morbilidad y
mortalidad por enfermedades cardiacas (Assayag et al., 1997; Haider et al., 1998).
La hipertrofia cardiaca, se define como el incremento en el tamao del corazn y/o
volumen miofibrilar sin un cambio en el nmero de miocitos. La hipertrofia le permite
al miocardio adaptarse ante alteraciones funcionales por sobrecarga asociada a un
desafo fisiolgico (por ejemplo, un incremento en la demanda de volumen sanguneo
como ocurre en el embarazo y en atletas de alto rendimiento) o un dao (Wilkins y
Molkentin, 2002). Est ampliamente validado que el entrenamiento fsico incrementa
la capacidad cardiovascular y la calidad de vida de los individuos y reduce la
mortalidad en pacientes con falla cardiaca (Belardinelli et al., 1999; Willenheimer et
al., 1998). Estos efectos pueden obtenerse sin un crecimiento importante en el
tamao del corazn como se ha demostrado en animales experimentales (Mokelke et
al., 1997; Moore et al., 1993). Tambin se sabe que la hipertrofia cardiaca observada
en los atletas profesionales es reversible (Shepard, 1996; Lonhurtst y Stebbins,
1997).

Se han caracterizado dos tipos de la hipertrofia cardiaca, una ocasionada por la
sobrecarga de presin, y otra por la sobrecarga de volumen. La hipertrofia por la
sobrecarga de presin es de forma concntrica, hay alargamiento del pex, y
engrosamiento de las paredes miocrdicas (Shimoyama et al., 1999; Van Eickels et
al., 2001). Este tipo de hipertrofia es muy comn en situaciones como la hipertensin
arterial (Fig. 1).

6

Fig. 1. Cortes histolgicos teidos con hematoxilina eosina donde se aprecia el
engrosamiento de las paredes miocrdicas durante la hipertrofia por sobrecarga de presin
(panel izquierda), y en el panel de la derecha se observa el alargamiento del pex.

En la hipertrofia por sobrecarga de volumen, como se puede apreciar en la figura 2,
el corazn tiene un crecimiento excntrico con un incremento en el dimetro
transverso y se observa un pex redondeado (Brower y Janicki, 2001; Eghbali et al.,
2005). Este tipo de hipertrofia esta presente en algunas alteraciones como en las
insuficiencias valvulares cardiacas, y en casos fisiolgicos adaptativos reversibles
como en el embarazo y en atletas de alto rendimiento.



Fig. 2. Morfologa del corazn durante la preez (P) y no
preez (NP) de ratn. Se aprecian las diferencias tanto en la
fotografa tomada como en los cortes histolgicos teidos con
hematoxilina-eosina.






7
EL CORAZN Y LA PREEZ

Tanto en humanos como en ratas, durante la preez se han observado los siguientes
cambios en el sistema cardiovascular (Cuadros 1 y 2): 1) Desarrollo de hipertrofia
cardiaca, 2) aumento entre el 30 y 40% en el gasto cardiaco, 3) disminucin de la
resistencia vascular perifrica, 4) incremento del volumen latido, 5) incremento de un
40% en el volumen sanguneo, 6) aumento de la frecuencia cardiaca, 7) disminucin
de la presin sangunea media en la segunda mitad de la gestacin, 8) disminucin
del tiempo de eyeccin del ventrculo izquierdo a lo largo de todo el periodo de
gestacin y tambin, 9) aumento en la actividad del sistema renina-angiotensina-
aldosterona, el flujo sanguneo renal y la tasa de filtracin glomerular (Katz et al.,
1978; Capeless y Clapp, 1989; Gilson et al., 1992; Mabie et al., 1994; Slangen et al.,
1997; Poppas et al., 1997; Chapman et al., 1997; Spaanderman et al., 2000).

Cuadro 1. Cambios en el corazn observados durante el embarazo y posparto de mujeres
sanas.
1er. trimestre 2do. trimestre 3er. Trimestre Posparto
Tiempo de eyeccin del LV (ms) 302 2.0 290 5.0 281 4.0 310 5.0
Dimensin de LA (mm) 35.4 0.8 38.3 0.9 40.3 0.9 36.1 0.8
Masa del LV (g) 167 8.2 150 8.5 162 8.3 142 6.2
LV = Ventrculo izquierdo, LA = Aurcula izquierda (Katz et al., 1978).

Cuadro 2.Valores hemodinmicos en la preez de rata
da 4 da 6 da 8 da 10 da 18
HR, latidos / min
P 373 21 375 9 377 10 374 16 408 24
NP 358 21 369 26 365 21 359 11 368 25
MAP, mmHg
P 125 12 112 8 107 9 110 7 101 10
NP 121 8 112 7 109 3 113 6 117 7
Frecuencia cardiaca (HR, pulsos / min) y presin arterial media (MAP, mmHg) en ratas no
preadas (NP) y preadas (P) a lo largo del periodo de preez (Slangen et al., 1997).

8

Se acepta que la hipertrofia cardiaca es iniciada por el estrs mecnico sobre las
paredes miocrdicas (Grossman et al., 1975; Nagatomo et al., 1999); en el caso de la
preez, la distensin durante el llenado ventricular es una de las seales que inicia la
hipertrofia. La hipertrofia por sobrecarga de volumen generalmente es menor que la
producida por sobrecarga de presin (Nagamoto et al., 1999; Spaanderman et al.,
2000). Otros factores, entre ellos las hormonas esteroideas, cuya tasa de secrecin
se incrementa notablemente en la preez (Fig. 3),

podran ser seales relevantes en
este proceso cardiaco, pero aun no han sido totalmente esclarecidas.

Fig. 3. Curso temporal del perfil hormonal plasmtico durante la preez de rata. Se midieron
los niveles de estradiol (E2), progesterona (P4) y testosterona (T) durante la preez y un da
despus del parto (LaPolt, Matt, Judd, y Lu, 1986).

En resumen, aun cuando la hipertrofia cardiaca durante la preez este bien
documentada, los mecanismos moleculares que la producen o que estn asociados
a ella se desconocen.


LA TENSIN PASIVA Y LA TITINA CARDIACA
9
Adems, de los cambios hemodinmicos y de la hipertrofia cardiaca, tambin se
esperaran cambios en la contractilidad del corazn que aumenten su eficiencia
durante la preez, sin embargo, hay pocos trabajos al respecto que documenten esta
posibilidad. Algunos de estos estudios en ratas han encontrado un aumento en la
velocidad de contraccin de fibras musculares cardiacas en la tercera semana de
preadas (Buttrick, Schaible, Malhotra, Mattioli y Scheuer, 1987), asimismo en
humanos durante el tercer trimestre (Katz et al., 1978); estos datos son muy
importantes, pero hace falta ms investigacin bsica aplicando tcnicas invasivas
en animales de experimentacin que aporten detalles sobre los eventos asociados a
la hipertrofia cardiaca que se desarrolla durante la preez.

Otro componente que no ha sido estudiado durante la preez y el posparto se
relaciona con las propiedades mecnicas pasivas de los tejidos cardiacos. Es
conocido que durante la distole el miocardio se estira y genera tensin pasiva. La
tensin pasiva se define como la tensin que genera un tejido cuando es estirado o
deformado. Desde los aos 70s se sugera que el origen de la tensin pasiva se
encontraba en el interior de las miofibrillas (Rapoport, 1972 y 1973). Trabajos ms
recientes confirman que el principal responsable de producir esta tensin en el
msculo esqueltico y cardiaco es una protena sarcomrica llamada titina (Labeit et
al., 1992; Squire, 1997; Trinick y Tskhovrebova, 1999; Cazorla et al., 2000; Freiburg
et al., 2000). LeWinter (2000), llamo a la titina como el eslabn perdido de la distole.
La titina (tambin llamada conectina), fue aislada por Wang, McClure y Tu (1979); y
fue caracterizada bioqumicamente por Maruyama, Kimura, Ohashi y Kuwano (1981),
mientras que Trinick, Knight y Whiting (1984) estudiaron sus propiedades elsticas.





La titina es la tercera protena ms abundante en la sarcmera del msculo cardiaco
pues representa el 10 % de la masa miofibrilar, se extiende desde la lnea M hasta el
10
disco Z en las sarcmeras (Fig. 4). Es la protena ms grande identificada hasta la
fecha en el reino animal, esta formada de alrededor de 2700 aminocidos con una
masa molecular promedio de 2.97-3.3 MDa (Trinick et al., 1984; Skeie, 2000;
Cazorla et al., 2000; Wu et al., 2002).



Fig. 4. Esquema de la sarcmera donde se ilustra la posicin de la Titina (Clark et al., 2002).

La titina es una protena codificada por un gen localizado en el brazo largo del
cromosoma 2 de humanos y roedores (Labeit et al., 1990; Rossi et al., 1994). La
regin que acta como un resorte est formada por dominios de Inmunoglobulinas
(Igs) y, un dominio PEVK denominado as por contener un alto porcentaje de
residuos de los aminocidos: Prolina (P), Glutamina (E), Valina (V) y Lisina (K).

La titina que se encuentra en el corazn se conoce como titina N2B y la de los
msculos esquelticos como N2A. La primera posee el elemento N2B formado por 3
monmeros de Ig y una secuencia nica (no repetida) de unos 572 aminocidos,
mientras que el elemento N2A est formado por 4 monmeros de Ig y una secuencia
nica de 106 residuos de aminocidos.

11
La titina cardiaca es ms corta que la esqueltica, haciendo que sea menos
distensible, por tanto, los tejidos cardiacos son ms rgidos en comparacin con el
msculo esqueltico (Fig. 5).

Fig. 5. Diferencias de tensin pasiva entre el msculo cardiaco y esqueltico. Registros
realizados en tiras musculares (Granzier e Irving, 1995).

En el msculo cardiaco, se ha encontrado una isoforma de titina, denominada N2BA
por contener secuencias de N2B y N2A. La titina N2BA tiene un segmento PEVK
ms largo y un dominio de Ig mayor que la titina N2B (ver Fig. 6). Tambin, se ha
encontrado que los niveles de expresin de ambas isoformas de titina varan en las
diferentes especies y en las distintas regiones del corazn.

La titina N2B predomina en el ventrculo izquierdo de los roedores (rata y ratn), con
niveles menores de N2BA; y en la aurcula izquierda de bovino domina la expresin
de titina N2BA; mientras que en otros mamferos ms grandes, como el humano,
coexpresan niveles similares de ambas isoformas de titina (Cazorla et al., 2000;
Trombitas et al., 2001).


12



Fig. 6. Isoformas de titina N2BA y N2B observadas en msculo cardiaco (Granzier y Labeit,
2002).

Se ha encontrado que los miocitos cardiacos que expresan principalmente titina N2B
tienen mayor rigidez que aquellos que expresan N2BA (Fig. 7), mientras que, los que
expresan ambas isoformas de titina desarrollan tensin pasiva a niveles intermedios
(Trombitas et al., 2001; Granzier y Labeit, 2002).


13


Fig. 7. El desarrollo de tensin pasiva de miocitos cardiacos es dependiente de la especie y
el tipo de isoforma de titina que expresen (Granzier y Labeit, 2002).




















14
CAMBIOS EN LA TITINA CARDIACA DURANTE EL DESARROLLO.


Durante el desarrollo general de un organismo ocurren cambios en la carga
hemodinmica para el corazn, y estos, inducen modificaciones en la contractilidad
debido a alteraciones en los patrones de expresin de protenas sarcomricas
(Siedner et al., 2003). Adems, se ha encontrado que los tejidos cardiacos de
mamferos neonatos desarrollan menor tensin pasiva, es decir, son ms
distensibles que en etapas posteriores. Recientemente, como se aprecia en la Fig. 8,
se ha reportado que este incremento en tensin pasiva observado durante el
desarrollo es debido a una alteracin en los patrones de expresin de isoformas de
titina cardiaca, disminuye el cociente de N2BA / N2B (Lahmers, Wu, Call, Labeit y
Granzier, 2004).





Fig. 8. Desarrollo de la tensin pasiva en ventrculo izquierdo de corazn de cerdo adulto (6
meses) comparado con cerdo neonato (1 da de nacido, d1) (Panel de la izquierda). Curso
temporal de los niveles de expresin de las isoformas de titina N2BA / N2B en ventrculo
izquierdo de cerdo (Panel de la derecha, Lahmers et al., 2004).





15
TENSIN PASIVA EN DISTINTOS MODELOS DE DISFUNCIN
CARDIACA.

Son muy pocos los estudios sobre los cambios en las propiedades mecnicas
pasivas presentes durante la sstole y la distole, los cuales regulan el desempeo
del corazn. Neagoe et al. (2002), realizaron un estudio en humanos con disfuncin
de arteria coronaria (CAD) y encontraron una disminucin del desarrollo de la tensin
pasiva el cual fue asociado a un incremento en los niveles de expresin de la
isoforma de titina N2BA y una disminucin en la isoforma de titina N2B (Fig. 9).

Fig. 9. Desarrollo de tensin pasiva (panel izquierda) y niveles de expresin de isoformas de
titina N2BA y N2A (Panel derecha), en corazones de humanos normales y con disfuncin en
la arteria coronaria (CAD).

En modelos animales existen controversias al compararlos con humanos; en un
modelo de falla cardiaca inducida por alteraciones en el ritmo cardiaco en perros, se
observ un incremento en el desarrollo de la tensin pasiva asociado a una
disminucin en el cociente de isoformas de titina N2BA / N2B (Wu et al., 2002).



16
Por otra parte, en ratas espontneamente hipertensas que sufren hipertrofia
cardiaca, se ha observado que hay una disminucin en los niveles de expresin de
isoformas de titina N2BA / N2B, sugiriendo que los niveles altos de la presin arterial
que cambian los niveles de expresin de isoformas de titina puede resultar en
alteraciones del desempeo cardiaco (Warren, Jordan, Roos, Krzesinski y Greaser,
2003).

Un estudio ms reciente, tambin apoya lo observado en animales, en un modelo de
cardiomiopata dilatada (DCM) en aves, encontraron que en los tejidos cardiacos
hipertrofiados aumenta el desarrollo de tensin pasiva (Fig. 10) y consecuentemente,
las paredes miocrdicas son ms rgidas, alterando la funcin diastlica del corazn
(Wu, Tobias, Bell, Barry, Helmes, Trombitas, Tucker, Campbell y Granzier, 2004).


Fig. 10. Tensin pasiva desarrollada por trabculas cardiacas de aves en un modelo
de cardiomiopata dilatada (DCM).





17
Estudios de DCM en humanos (Fig. 11), muestran que existe una disminucin en el
desarrollo de la tensin pasiva y la asocian a cambios moleculares de la titina,
observando un incremento en los niveles de expresin de la relacin de isoformas
N2BA / N2B (Nagueh et al., 2004). Adems, estudios previos sugeran una
disminucin en la cantidad de titina total en pacientes con DCM (Morano et al.,1994),
mientras que Nagueh et al. (2004) demostraron que la titina total no cambia,
apoyando otros trabajos realizados en animales (Cazorla, 2000). El grupo de Nagueh
et al. (2004), proponen que solo cambia la proporcin de isoformas de titina cardiaca.


Fig. 11. Niveles de expresin de isoformas de titina cardiaca asociadas al desarrollo de
tensin pasiva en cardiomiopata dilatada (DCM) en humanos.

En resumen, aun cuando se han realizado numerosos estudios de cambios en la
tensin pasiva asociados a alteraciones cardiacas, no hay ninguno que haya
estudiado los cambios de tensin pasiva y de isoformas de titina en un modelo de
hipertrofia cardiaca reversible, como lo es la preez, que adems podra ayudar a
explicar las adaptaciones en la distensibilidad ventricular que sufre el corazn para
favorecer un mayor llenado diastlico que demanda la preez.
18
LA HISTRESIS EN TEJIDOS CARDIACOS

Durante los latidos del corazn, los miocitos estn sujetos a ciclos repetidos de
estiramiento-relajacin. En cada ciclo, durante el estiramiento (distole) aumenta el
desarrollo de tensin pasiva debido a que los elementos elsticos de la sarcmera se
extienden; y durante la contraccin (sstole) el desarrollo de tensin pasiva
disminuye, por tanto, es de esperar que pueda influir sobre el llenado y vaciado
ventricular. Adems, durante los ciclos de deformacin de los miocitos se presenta el
fenmeno de histresis, es decir, la fuerza que se desarrolla durante el estiramiento
no es la misma que durante la relajacin a una misma longitud de la sarcmera (Fig.
12). Se ha propuesto que la histresis depende de la velocidad de desdoblamiento y
de la velocidad de redoblamiento de la molcula de titina (Li, et al., 2002).


Fig. 12. Fenmeno de histresis. Desarrollo de tensin pasiva a distintas deformaciones en
miocitos cardiacos. La velocidad de deformacin fue de 0.1 L/s y el reposo entre cada ciclo
de deformacin fue de 15 min (Helmes et al.,1999).


19
Se ha observado que cuando se aplican ciclos de deformacin repetidos con
intervalos de reposo, la histresis disminuye (ver Fig. 13), para lo cual se sugiere que
la titina pueda ajustar su longitud para evitar la perdida de energa en forma de calor
generada durante la histresis (Kellermayer, Smith, Granzier y Bustamante, 1997).



Fig. 13. Curso temporal de la recuperacin de la histresis. Los miocitos fueron estirados con
la misma deformacin y velocidad a distintos tiempos de reposo, 0 seg, 12 seg y 120 seg.

Por otro parte, durante la preez, hay un incremento en la frecuencia cardiaca, es
decir, los miocitos cardiacos son sometidos a mayor frecuencia de ciclos de
deformacin; por lo tanto, podramos esperar que durante la preez, disminuya la
histresis, actuando como un mecanismo de adaptacin ante el incremento de
latidos por minuto, as el mecanismo de deformacin relajacin de los miocitos sera
ms eficiente con menor perdida de energa en forma de calor; sin embargo, a la
fecha se desconoce, por lo que forma parte de este trabajo de investigacin conocer
el grado de histresis que presentan los tejidos cardiacos durante la preez usando
como modelo experimental la rata.



20












HIPTESIS














21











Durante la preez, los tejidos cardiacos hipertrofiados, desarrollan menor tensin
pasiva, debido a que aumenta el cociente de la expresin de titina N2BA/N2B, lo cual
provoca que las paredes miocrdicas tengan una mayor distensibilidad (menor
rigidez).












22











OBJETIVO GENERAL

















23













Estudiar las propiedades mecnicas pasivas y los niveles de expresin de la titina en
tejidos cardiacos que desarrollan hipertrofia funcional durante la preez.














24












OBJETIVOS ESPECFICOS
















25

1) Determinar la existencia de la hipertrofia cardiaca funcional en ratas preadas.
2) Caracterizar los cambios en el rea de los miocitos cardiacos de ventrculo
derecho e izquierdo obtenidos de dispersiones celulares de corazones de
ratas no preadas (NP), preadas (P18) y en posparto (PP).
3) Estudiar el desarrollo de la tensin pasiva del ventrculo derecho e izquierdo a
diferentes deformaciones en corazones de ratas NP, P18 y PP, y comparar
mediante curvas de esfuerzo-deformacin.
4) Determinar y comparar el mdulo de elasticidad del ventrculo derecho e
izquierdo en corazones de ratas no preadas, preadas y en posparto.
5) Valorar el fenmeno de histresis en ventrculo derecho e izquierdo en
corazones de ratas NP, P18 y PP.
6) Determinar la cantidad de expresin (a nivel de protena) de las isoformas de
titina N2B y N2BA en ventrculo derecho e izquierdo de corazones de ratas
NP, P18 y PP, usando western-blot.
7) Medir los niveles de expresin de ARNm de las isoformas de titina N2B y
N2BA de ventrculo derecho e izquierdo de corazones de ratas NP, P18 y PP,
mediante RT-PCR.
8) Estudiar cambios en la colgena mediante tcnica histolgica en tejidos
cardiacos de ratas NP, P18 y PP.

26









MATERIALES Y MTODOS












27

MANEJO DE LOS ANIMALES Y OBTENCIN DE MUESTRAS.
Ratas hembra de la cepa Sprague-Dawley de 200 - 250 g de peso corporal, no
preadas en diestro (grupo control, NP), preadas de 18 das (P18), y 7 das
posparto (PP) fueron sacrificadas con sobredosis de anestsico (Pentobarbital
Sdico). Los animales fueron manejados de acuerdo con la Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals (US Department of Health, NIH). El corazn fue extirpado
rpidamente por medio de una toracotoma medial y sumergido en solucin de
Tyrode normal (vase composicin en anexo) oxigenado con una mezcla de 95 % O
2
+ 5 % CO
2
a la temperatura ambiente (24 C). Despus de obtener el peso hmedo
en una balanza de pesada rpida (Sartorius Corporation, Edgewood, NY, USA), se
procedi a la diseccin de la pared libre del ventrculo derecho y ventrculo izquierdo
con el corazn sumergido en la solucin de Tyrode normal en una caja de Petri con
fondo cubierto con sylgard. Se obtuvieron tiras de aproximadamente 4 mm de
longitud, 2 mm de ancho y 0.5 mm de espesor cortadas desde la base (anillo fibroso)
hacia la regin del pex. De cada corazn, se obtuvieron preparaciones para
estudiar: 1) las propiedades mecnicas pasivas y, 2) la composicin molecular de
titina (a nivel de protena con electroforesis y western blot, y a nivel de ARNm con
RT-PCR semicuantitativo.

AISLAMIENTO DE LOS MIOCITOS CARDIACOS PARA DETERMINAR EL REA
DE CADA CLULA.
El corazn fue rpidamente extrado y montado en un sistema de perfusin de
Langendorff. Se perfundi con solucin de Tyrode normal por 5 min seguido de
Tyrode libre de Calcio por 5 min. Posteriormente, se perfundi por 15 min con una
mezcla de enzimas: 0.5 mg/ml de Colagenasa tipo I y 0.05 mg/ml de Proteasa XIV
(Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO, USA) diluidas en Tyrode libre de Calcio
(Snchez-Chapula, Salinas-Stefanon, Torres-Jcome, Benavides-Haro, Navarro-
Polanco, 2001). Finalmente, la enzima se lav por 10 min con medio KB (Kraftbihue,
ver composicin en anexo) (Isenberg y Klockner, 1982). Se obtuvieron cortes de la
28
pared libre del ventrculo derecho, y del epicardio y endocardio del ventrculo
izquierdo.
Las preparaciones fueron almacenadas a 4 C en medio KB durante 1 hora y
posteriormente los miocitos fueron observados con un microscopio Olympus
BX51WI, se adquirieron imgenes y fueron analizadas con el programa 1D Image
Analysis versin 3.0 (Kodak, Rochester, NY, USA) con el fin de determinar el rea y
la longitud y latitud de cada miocito cardiaco.

PROPIEDADES MECNICAS PASIVAS
Las preparaciones fueron incubadas en solucin cardiopljica oxigenada (ver
composicin en anexo) y la temperatura fue regulada a 37 C con un bao de
recirculacin (Techne, UK). Las preparaciones se ataron por sus extremos a dos
soportes de acero inoxidable en forma de L con hilo seda 8 ceros. Posteriormente, se
transfirieron a una cmara para rgano aislado horizontal de doble pared con
circulacin interna (Radnoti, WPI Inc, Florida, USA). Uno de los soportes se fij a un
transductor de tensin (Kent Sci Corporation, TRN011) y el otro, al actuador de un
motor (Ultramotion HT2340I4IK, Bimba, Illinois, USA) controlado por computadora
(Fig. 14).

Fig. 14. Sistema utilizado para registrar la tensin pasiva en cortes de ventrculo derecho e
izquierdo de ratas no preadas, preadas y en posparto. La cmara donde se coloc la
preparacin se mantuvo con temperatura constante de 37 C.
29
El protocolo de registro mecnico consisti en ajustar la tensin basal
progresivamente hasta 500 mg (tensin de reposo de tejidos cardiacos; Gando et al.,
1997; Hattori et al., 2000).
Las preparaciones permanecieron en estas condiciones una hora recambiando la
solucin del bao cada 15 minutos. Despus, mediante el motor comandado por
computadora se aplicaron ciclos de deformacin del 5, 10 y 20 % a una velocidad de
0.2 L/s (L es la longitud de la tira).
La tensin pasiva generada por estos ciclos de deformacin fue amplificada y
digitalizada para su posterior anlisis (ver registro ilustrativo en la Fig. 15).


Fig. 15. Tensin pasiva registrada a una deformacin del 10 % L. Este es un registro
ilustrativo de la pared libre del ventrculo derecho de rata no preada, donde se puede
apreciar el protocolo utilizado en los grupos experimentales.



2
0
0
0

N

/

m
2
O.05 L

30
Posteriormente, los registros de tensin fueron estudiados comparativamente
mediante curvas de esfuerzodeformacin (Muiz, Del Ro, Huerta y Marn, 2001).
Estas curvas se construyeron calculando el esfuerzo (o) con la siguiente ecuacin:
o = Fuerza / CSA
Donde, la Fuerza es la tensin registrada con el transductor y, CSA es el rea de
corte transversal de la preparacin calculada a partir de la siguiente ecuacin:
CSA = m / (L * ),
Donde, m es la masa del msculo (g); L, la longitud del msculo (cm) y, la densidad
muscular cardiaca (1.05 g / cm
3
) (Katz et al., 1988; Perhonen et al., 2001).
Por otro lado, la deformacin (o) fue calculada con la ecuacin:
Li
Li Lf
= o
Donde, Li y Lf corresponden a la longitud inicial y final respectivamente.
Finalmente, las curvas de esfuerzo-deformacin fueron ajustadas a la ecuacin de
Magid y Law (1985) con la finalidad de calcular el modulo de elasticidad del tejido
cardiaco en cada grupo experimental.

Ln (c) = o + Ln (E
0
/ )

Donde c, es el esfuerzo (Pascales = N / m
2
); o, es la deformacin; , corresponde a la
tasa de deformacin y es una medida de la velocidad de crecimiento de la curva y;
E
0
, es el Modulo de elasticidad o de Young el cual se calcul de la parte lineal de la
curva que corresponde entre el 50 y 95 % de la tensin mxima alcanzada (De Zee,
Bojsen-Mller, y Voigt, 2000).

Tambin, se midi la histresis entre la curva del desarrollo de tensin pasiva del
estiramiento y la relajacin a partir de la longitud inicial. Esta histresis fue medida
como el rea entre las dos curvas (Helmes et al., 1999; Minajeva, Kulke, Fernandez y
Linke, 2001), y se expres en Joules (J).

31
ANLISIS DE LA TITINA CARDIACA CON TCNICAS DE BIOQUMICA Y
BIOLOGA MOLECULAR

A) Estudios sobre las isoformas de la titina a nivel de protena
Preparacin de Muestras y Solubilizacin
Las preparaciones de ventrculos fueron pesadas y pulverizadas en nitrgeno lquido
usando un mortero con pistilo. Se adicion amortiguador de solubilizacin en una
dilucin 90:1 (50 mM Tris-Cl, 2 % dodecil sulfato de sodio (SDS), 80 mM de
ditiotreitol (DTT), 10 % de Glicerol) pH 6.8 a 0 C. Se agitaron los homogenados en
un Vortex (Thermolyne Iowa, USA) y se sometieron a centrifugacin a 2500 rpm por
2 minutos para favorecer la extraccin. Se guardaron duplicados de las muestras a -
70 C para su posterior anlisis (Granzier y Wang, 1993).

Determinacin de Protenas en los Homogenados
Para determinar la cantidad de protena que se cargara en los carriles de los geles
se realiz una curva estndar con Albmina de Suero Bovino (BSA, Sigma-Aldrich,
Missouri, USA). Se prepar una solucin madre de 10 mg/ml y se realizaron
diluciones en agua desionizada para alcanzar un rango de concentracin de 0.1 a 1
g/L. Se midi la absorbancia de las diluciones a 280 nm en un Biofotmetro
(Eppendor, Hamburg, Alemania) y se grafic la concentracin versus absorbancia
ajustando la curva a una recta (Ausubel et al., 2003).

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida
Los homogenados se diluyeron en amortiguador de carga (Tris 0.075 M, SDS 3 %,
DTT 0.12 M, Glicerol 15 %, Pyronin Y 55 mg/ml) e inhibidores de proteasas
(Leupeptina 0.04 mmol/L, y E64 0.01 mmol/L, pH 6.8). Las muestras se aplicaron
sobre geles de poliacrilamida con gradiente de concentracin del 3 % al 12 % (ver
composicin en anexo) y se utiliz como amortiguador para el corrimiento: Tris-
acetato 0.04 M, acetato de sodio 0.020 M, EDTA 0.002 M, SDS 0.1 %, pH 7.6 a
15C.
32

La electroforesis se corri a 120 V durante 3 horas en una cmara vertical con
sistema de enfriamiento (10 C). Las huellas fueron fijadas con una solucin de
isopropanol al 25 % y cido actico al 10 % durante 15 minutos.

Los geles se tieron con azul de Coomassie R al 0.5 % durante toda la noche,
posteriormente se decoloraron y finalmente los geles fueron escaneados a una
resolucin de 300 dpi (HP Scanjet 4070, Photosmart Scanner) y analizados por
densitometra con el programa 1D Image Analysis versin 3.0 (Kodak, Rochester,
NY, USA).

Cuantificacin de protenas por Western blot

Despus de la separacin electrofortica de las protenas, los geles teidos se
lavaron con agua desionizada durante 15 min y fueron decolorados con las
siguientes soluciones: solucin 25 mM Tris base / 192 mM glicina/1 % SDS durante
una hora en agitacin suave, seguida de 25 mM Tris base/192 mM glicina / 0.1 %
SDS por 30 min, y finalmente para incrementar la eficiencia de la transferencia en el
caso de protenas grandes como la titina ( 3 MDa), se coloc en una solucin de
urea 6 M durante 30 min (Perides, Plagens y Traub,1986; Dionisi, Checa y
Viale,1995).

Los geles decolorados, el papel trans-blot (Bio-Rad laboratorios CA, USA) y la
membrana de PVDF (Immobilon
TM
-P, Millipore Corporation, Bedford MA, USA),
previamente tratada con metanol durante un minuto, fueron sumergidos en
amortiguador de transferencia (ver composicin en anexo) por un tiempo de 30 min.
Posteriormente, se realiz un sndwich como se ilustra en la figura 16.




33
















El sndwich se coloc en una cmara de transferencia vertical (Trans-Blot Cell, Bio-
Rad, USA) y se llen con amortiguador de transferencia. La cmara fue montada
sobre un sistema con agitacin magntica, y los electrodos se conectaron a una
fuente de poder (Consort E865, Blgica) y la electrotransferencia se realiz a 100 V
durante una hora o a 14 V toda la noche en un cuarto fro. Terminada la transferencia
se lav la membrana varias veces con agua desionizada, y para determinar la
eficiencia de esta, se ti con solucin de Ponceau S durante 5 min a temperatura
ambiente, una vez visualizadas las bandas de las protenas en la membrana, se
decolor con agua desionizada por 15 min (Ausubel et al., 2003).

La membrana fue prehibridada con solucin de bloqueo (ver composicin en anexo)
durante una hora a temperatura ambiente en agitacin suave, en seguida se le
realizaron 3 lavados de 5 min con amortiguador PBS. Despus, se dej 15 min en
solucin de Avidina y 15 min en solucin de Biotina, lavando con PBS entre cada
solucin.
Fig. 16. Montaje para realizar la electrotransferencia de protenas
de un gel SDS-PAGE a membrana de PVDF.

34
Posteriormente, la membrana fue hibridada con anticuerpo primario especfico anti-
titina N2B (I16/I17, Fig. 17) y otras membranas con anti-titina N2A (I72/I73, Fig. 17)
donados amablemente por el Dr. Siegfried Labeit (European Molecular Biology
Laboratory, Heidelberg, Alemania), diluidos 1:1000 en solucin de bloqueo durante 2
horas a temperatura ambiente o toda la noche en un cuarto fro.

















Fig. 17. Esquema de la estructura de Titina conformada por dominios de Inmunoglobulina (I),
elementos N2B y N2A, y la regin del PEVK. En este esquema se muestran los sitios de
reconocimiento de los anticuerpos anti-titina N2B (I16/I17) y anti-titina N2BA (I72/73)
donados amablemente por el Dr. Labeit (Modificado de Granzier y Labeit, 2004).

Despus del tratamiento con anticuerpo primario, la membrana se lav con
amortiguador PBS y se marc con un anticuerpo secundario anti-conejo policlonal
biotinilado (Amersham Biosciences, UK) diluido 1:400 en solucin de bloqueo, se
dej durante 30 min a temperatura ambiente y se lav con PBS.


35
Para el revelado, la membrana fue tratada con el complejo ABC peroxidasa durante
30 min (kit de Vectastain, Vector Laboratorios Inc. Burlingame, CA, USA) y con el
substrato DAB (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) hasta la aparicin de
bandas, el DAB en presencia de peroxidasa form un precipitado caf fcil de
visualizar. Las bandas inmnoreactivas fueron analizadas por densitometra con el
programa 1D Image Analysis versin 3.0 (Kodak, Rochester, NY, USA). La cantidad
de la titina se determin como el rea integrada de la banda para cada grupo
experimental (n=8).

B) Estudio de las isoformas de la titina a nivel de ARNm
Extraccin de ARN total
Se sigui el protocolo basado en el Trizol (Isotiocianato de Guanidina y Fenol de
Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). El tejido se pulveriz en Nitrgeno
lquido y se agreg 1 ml de Trizol por cada 100 mg de tejido, se incub 5 min a
temperatura ambiente y despus se adicion 0.2 ml de Cloroformo por cada mililitro
de Trizol, se agit en el vortex y se incub a temperatura ambiente durante 3 min.
Posteriormente, fue centrifugado a 12, 000 rpm a 4 C durante 15 min. La fase
acuosa fue transferida a un tubo nuevo y se agreg 0.5 ml de isopropanol por cada
mililitro de Trizol, se dej en incubacin durante 10 min y despus, nuevamente fue
centrifugado a 12, 000 rpm a 4 C durante 10 min. El sobrenadante fue eliminado por
decantacin y se agreg 1 ml de Etanol al 75 % preparado en agua-DEP (agua libre
de ARNasas, ver preparacin en anexo). El etanol fue eliminado con un sistema de
vaco, se sec y el ARN fue resuspendido en 200 l de agua-DEP (Ausubel et al.,
2003).

RT-PCR (Retrotranscripcin seguida de una amplificacin de ADN por medio de la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa).
Se disearon primers u oligos en nuestro laboratorio y posteriormente fueron
construidos por GibcoBRL/Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Los primers
fueron gen-especficos para las isoformas de titina en estudio, N2BA y N2B; as
36
como de un gen control GAPDH (gen que codifica para la enzima Gliceraldehido 3-
Fosfato Deshidrogenasa).
Las secuencias fueron tomadas de Entrez Nucleotide del Nacional Center of
Biotechnology information. Las claves de acceso fueron: titina N2BA, AF525411;
titina N2B, AF525412; y la enzima GAPDH, X02231. Los primers diseados fueron:

N2BA
PRIMER F (Forward o sentido): 5-ATACAGAACATCGTGGTGAGC-3
8227-8247, Tm = 62 C
PRIMER R (Reverse o anti-sentido): 5-CTTCCGGGACTTTAGGTGGG-3
9327-9346, Tm = 64 C, Fragmento = 1119 pb.
N2B
PRIMER F: 5-TGAGCAGATCGGCCAGCAAAT-3 154174, Tm = 64 C
PRIMER R: 5-GGACATGATAACGGGTTGCAG-3 12041224, Tm = 64 C
Fragmento = 1070 pb
GAPDH
PRIMER F: 5-GCATCTTCTTGTGCAGTGCCA-3 32 52, Tm = 66 C
PRIMER R: 5-CCACCCTGTTGCTGTAGCC-3 1020 1038, Tm = 62 C
Fragmento = 1006 pb

Con los primers, se realiz la RT-PCR siguiendo las recomendaciones del kit
SuperScript One Step RT-PCR with Platinum Taq (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA). Para una reaccin de 50 l se agreg a un tubo eppendorf: 25
l de buffer Mix 2x (0.4 mM por cada dNTP, 2.4 mM MgSO
4
), 1 g de RNA, 1 l de
primer F, 1 l de primer R, 1 l de RT / Platinum Taq y se afor con agua esterilizada
hasta 50 l.

La reaccin de RT-PCR se llev a cabo en un termociclador (iCycler, Bio-Rad
laboratorios CA, USA) en tres etapas:

37


1) Sntesis de cDNA y pre-desnaturalizacin:
1 ciclo de: 50 C por 30 min y 94 C por 2 min.
2) Amplificacin de cDNA:
30 ciclos de: desnaturalizacin, 94 C por 15 segundos; Alineamiento, 62 C por 30
min; Extensin, 72 C por 1.06 min.
3) Extensin final:
1 ciclo de 72 C por 5 min.

Los cDNAs amplificados y un marcador de 100 pb (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA) se mezclaron con buffer de carga y se corrieron en geles de
agarosa al 1 % durante 2 horas a 110 V en una cmara horizontal. Como buffer de
corrimiento se utiliz TBE 1X (ver composicin en anexo). Posteriormente, los geles
fueron teidos con Bromuro de Etidio y se adquirieron imgenes en un
transiluminador U.V con el sistema gel doc (Bio-Rad, USA) y fueron analizados con
el programa Quantity One versin 9.2.1 (Bio-Rad, USA).

HISTOLOGA

Corazones de ratas NP, P18 y PP, fueron fijados en formol al 10% amortiguado a pH
de 7.0, posteriormente se embebieron en parafina y se realizaron cortes de 4 m de
espesor con un micrtomo (Leica). Los cortes se tieron con la tcnica tricrmica de
Masson la cual consisti en: hidratar los tejidos con agua destilada; colorear con
fucsina cida; lavar con agua destilada y colorear con cido fosfotngstico-
fosfomolbdico; contrastar con azul de anilina; lavar con agua destilada y diferenciar
con cido actico al 1%; deshidratar y aclarar con alcohol etlico al 95%, alcohol
absoluto y xileno; finalmente hacer el montaje en medio resinoso (Prophet el al.,
1992). Posteriormente, los cortes fueron examinados con microscopa ptica, las
imgenes fueron adquiridas con un microscopio Axioscop provisto de cmara digital
MR5 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany).
38
La densidad de colgena fue cuantificada como la cantidad de pxeles de color azul
(colgena) entre el total de pxeles por rea de tejido cardiaco (Hill et al., 2002),
utilizando el programa Image 1.6 del Nacional Institute of Health USA.

ANLISIS ESTADSTICO

Los datos fueron expresados como medias error estndar. Las medias fueron
comparadas con la prueba de Mann-Whitney, y la comparacin entre curvas se
realiz con un anlisis de varianza de un factor con una prueba post hoc de Tukey.
Para evaluar asociaciones se utiliz el coeficiente de correlacin de Pearson. Las
diferencias fueron consideradas significativas cuando se obtena una p < 0.05.
39












RESULTADOS
















40
Peso del Corazn
Se midi la relacin masa del corazn (mg) / peso corporal de la rata (g), y se
encontr que las ratas despus de 18 das de preez desarrollaron hipertrofia
cardiaca de manera significativa (p < 0.05) en comparacin con las ratas no
preadas. Adems, como se puede apreciar en la figura 18, 7 das despus del
parto, se observ reversin significativa (p < 0.05) de la hipertrofia cardiaca en ratas
que concluyeron la preez.


Fig. 18. Relacin peso del corazn vs. Masa corporal. Variacin del peso del corazn en
relacin al peso corporal de la rata en tres grupos experimentales: ratas no preadas (NP),
ratas de 18 das de preez (P18) y ratas 7 das despus del parto (PP). Esta relacin indica
que el corazn crece en un 16 % durante la preez. Los valores corresponden a medias
error estndar, n = 16 por grupo. * p < 0.05.



P
e
s
o

d
e
l

C
o
r
a
z

n

(
m
g
)

/

P
e
s
o

c
o
r
p
o
r
a
l

d
e

l
a

r
a
t
a

(
g
r
)
0
1
2
3
4
5
NP
P18
PP
Grupos Experimentales
*

41

La variacin promedio del peso de los corazones de ratas preadas es muy grande
como se aprecia en la Fig. 19.
Grupos Experimentales
P
e
s
o

d
e
l

C
o
r
a
z

n

(
m
g
)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
NP
P18
PP
*


Fig. 19. Peso del corazn de ratas en tres grupos experimentales: no preadas (NP), de 18
das de preez (P18) y, 7 das despus del parto (PP). El incremento relativo en las P18 es
de 28 % respecto al NP o PP. Los valores corresponden a medias error estndar, n = 16
por grupo. * p < 0.05.








42
rea de los Miocitos Cardiacos.
Para determinar si el incremento en masa cardiaca observado en las ratas preadas
se asocia a cambios en el tamao de los miocitos, se midi el rea de cada miocito
en una dispersin celular. Se evaluaron: la pared libre del ventrculo derecho, y el
endocardio y epicardio del ventrculo izquierdo. Para todas las regiones se encontr
que en la preez hay un incremento significativo (p< 0.05) en el rea de los miocitos
(Fig. 20). Tambin, se observ que 7 das despus del parto hay una disminucin del
rea de los miocitos respecto a la preez.

r
e
a

d
e

l
o
s

M
i
o
c
i
t
o
s

C
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r
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c
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s

(

m
2
)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
NP
P18
PP
PLVD ENDO EPI
*
*
*


Fig. 20. rea de los miocitos cardiacos de la pared libre de ventrculo derecho (PLVD),
endocardio (ENDO) y epicardio (EPI) del ventrculo izquierdo, de ratas no preadas (NP),
preadas de 18 das (P18) y en posparto (7 das despus del parto, PP). Los datos
corresponden a 200 clulas y una n = 4 animales por grupo y estn expresados en medias
error estndar. * p < 0.05.
43
Adems, los miocitos cardiacos fueron agrupados en dos regiones: ventrculo
derecho (los miocitos de la pared libre del ventrculo derecho) y ventrculo izquierdo
(miocitos del endocardio y epicardio del ventrculo izquierdo) y al graficar los
promedios, se puede apreciar como aumenta de forma significativa (p< 0.05) el rea
de los miocitos de ambos ventrculos durante la preez, mientras que en el posparto
tiende a revertirse este incremento (Fig. 21). Tambin se observ que el aumento en
el rea de los miocitos es mayor en el ventrculo derecho en comparacin con el
izquierdo, misma tendencia se aprecia en la reversibilidad, es decir, el rea de los
miocitos del ventrculo derecho se revierte ms que los del ventrculo izquierdo
durante el posparto.

r
e
a

d
e

l
o
s

M
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o
c
i
t
o
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C
a
r
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i
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c
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s

(

m
2
)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
NP
P18
PP
VD VI
*
*

Fig. 21. rea de los miocitos cardiacos del ventrculo derecho (VD) y ventrculo izquierdo
(VI), de ratas no preadas (NP), preadas de 18 das (P18) y en posparto (7 das despus
del parto, PP). Los datos corresponden a 200 clulas y una n = 4 animales por grupo y estn
expresados en medias error estndar. * p < 0.05.


44
Para conocer si el cambio en el rea de los miocitos cardiacos es resultado de un
cambio en su longitud, medimos el eje longitudinal y transversal, encontrando que
este ltimo no muestra cambios significativos entre los tres grupos, en cambio si
observamos cambios notables en el eje longitudinal, lo cual esta graficado en la Fig.
22. Estos resultados indican que el aumento en el tamao de los miocitos durante la
preez se debe a un aumento en la longitud.
L
o
n
g
i
t
u
d

d
e

l
o
s

M
i
o
c
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C
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a
c
o
s

(

m
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
NP
P18
PP
PLVD ENDO EPI
*
*
*

L
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g
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t
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c
o
s

(

m
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
NP
P18
PP
VD VI
*
*

Fig. 22. Longitud de los miocitos cardiacos. Panel de arriba, subdivididos en 3 regiones
PLVD, ENDO y EPI. Panel de abajo, divididos en ventrculo derecho (VD = PLVD) y
ventrculo izquierdo (VI = ENDO + EPI); en diferentes condiciones experimentales: ratas no
preadas (NP), preadas de 18 das (P18) y en posparto (7 das despus del parto, PP). Los
datos corresponden a 200 clulas y una n = 4 animales por grupo y estn expresados en
medias error estndar. * p < 0.05.
45
Desarrollo de la Tensin Pasiva
Uno de nuestros objetivos fue estudiar si la hipertrofia cardiaca observada en la
preez esta asociada a cambios en la tensin pasiva desarrollada por los tejidos
miocrdicos (pared libre del ventrculo derecho y ventrculo izquierdo), por lo que se
realizaron deformaciones del 5 %, 10 % y 20 % de la longitud de la tira muscular
cardiaca a una velocidad de 0.2 L / s.

Se realizaron registros de tiras musculares cardiacas obtenidas de cortes en tres
orientaciones: 1) corte vertical desde la base del anillo hasta el pex, 2) corte
diagonal desde la base del anillo hasta el pex, y 3) corte horizontal por la parte
ecuatorial de la pared ventricular. Los resultados encontrados (Fig. 23), muestran
diferencias en el desarrollo de la tensin pasiva con las distintas orientaciones
estudiadas.


Fig. 23. Tensin pasiva desarrollada por la pared libre del ventrculo derecho de una rata no
preada con una deformacin del 10 % L, en tres orientaciones: Vertical, Diagonal y
Horizontal.

o
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Vertical
Horizontal
Diagonal

46
Los resultados encontrados en la pared libre del ventrculo derecho, nos indican que
de forma significativa (p < 0.05), durante la fase de deformacin del 5 %, 10 % y 20
%, el desarrollo de tensin pasiva es menor en el grupo de las ratas preadas al
compararlo con las ratas no preadas, mientras que las ratas del grupo en posparto
desarrollan tensin pasiva cardiaca similar al grupo de no preadas (Fig. 24, panel A,
B y C). Tambin, se observ un incremento de la tensin pasiva en los tres grupos
estudiados conforme se incremento el porcentaje de deformacin.




Fig. 24 A
Deformacin (o)
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
NP
P18
PP

47

Fig. 24. Desarrollo de la tensin pasiva en la pared libre del ventrculo derecho de ratas no
preadas (NP), preadas de 18 das (P18) y en posparto (7 das despus del parto, PP), a
distintas deformaciones: Panel A, 5 %; Panel B, 10 %; y Panel C, 20 % de la longitud de la
tira muscular. Los datos corresponden a medias error estndar (n = 16).

Fig. 24 B
Deformacin (o)
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
NP
P18
PP

Fig. 24 C
Deformacin (o)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
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(
N

/

m
2
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NP
P18
PP

48
La tensin pasiva desarrollada por el ventrculo izquierdo durante la preez es
significativamente menor (p< 0.05) en comparacin con el ventrculo de ratas no
preadas. Adems, se encontr que los ventrculos de ratas en posparto desarrollan
tensin pasiva muy similar al grupo de las no preadas (Fig. 25, panel A, B y C). Con
el incremento de deformacin aument de forma muy significativa (p< 0.05), el
desarrollo de la tensin pasiva para los 3 grupos en estudio.








Fig. 25 A
Deformacin (o)
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
T
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n
s
i

n

p
a
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v
a

(
N

/

m
2
)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
NP
P18
PP

49


Fig. 25. Desarrollo de la tensin pasiva en el ventrculo izquierdo de ratas no preadas (NP),
preadas de 18 das (P18) y en posparto (7 das despus del parto, PP), a distintas
deformaciones: Panel A, 5 %; Panel B, 10 %; y Panel C, 20 % de la longitud de la tira
muscular. Los datos corresponden a medias error estndar (n = 16).

Fi g. 25 B
Deformacin (o)
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
T
e
n
s
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p
a
s
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(
N

/

m
2
)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
NP
P18
PP

Fig. 25 C
Deformacin (o)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NP
P18
PP

50
Por otra parte, result de inters estudiar el desarrollo de la tensin pasiva durante la
fase de regreso a su longitud inicial, despus de la fase de estiramiento. Los
resultados indican que de manera significativa (p< 0.05), la pared libre del ventrculo
derecho de ratas preadas desarrolla menor tensin pasiva que la pared del grupo
de ratas no preadas, mientras que no hay diferencias significativas en el desarrollo
de la tensin entre la pared del grupo de ratas en posparto y el de las no preadas
(Fig. 26, panel A, B y C).





Fig. 26 A
Esfuerzo (o)
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
NP
P18
PP
51



Fig. 26. Desarrollo de tensin pasiva durante la fase de regreso a su longitud inicial, en la
pared libre del ventrculo derecho de ratas no preadas (NP), preadas de 18 das (P18) y
en posparto (7 das despus del parto, PP), a distintas deformaciones: Panel A, 5 %; Panel
B, 10 %; y Panel C, 20 % de la longitud de la tira muscular. Los datos corresponden a
medias error estndar (n = 16).
Fig. 26 B
Esfuerzo (o)
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
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a

(
N
/
m
2
)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
NP
P18
PP

Fig. 26 C
Esfuerzo (o)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NP
P18
PP

52
Para el ventrculo izquierdo, el desarrollo de la tensin pasiva durante la fase de
regreso a la longitud inicial de la tira fue significativamente mucho menor en las ratas
preadas en comparacin con las no preadas (p< 0.05), mientras que entre el grupo
de ratas en posparto y el de no preadas el desarrollo de la tensin fue similar (Fig.
27, panel A, B y C). Estas observaciones fueron muy claras en las tres
deformaciones en estudio, 5 %, 10 % y 20 % de la longitud de la tira.







Fig. 27 A
Esfuerzo (o)
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
NP
P18
PP
53


Fig. 27. Desarrollo de la tensin pasiva durante la fase de regreso a su longitud inicial, en el
ventrculo izquierdo de ratas no preadas (NP), preadas de 18 das (P18) y en posparto (7
das despus del parto, PP), a distintas deformaciones: Panel A, 5 %; Panel B, 10 %; y Panel
C, 20 % de la longitud de la tira muscular. Los datos corresponden a medias error estndar
(n = 16).

Fig. 27 B
Esfuerzo (o)
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(

N

/

m
2
)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
NP
P18
PP

Fig. 27 C
Esfuerzo (o)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NP
P18
PP

54
Correlacin entre la Longitud de los Miocitos Cardiacos y la Tensin Pasiva

En el grupo P18 se observ una disminucin en el desarrollo de la tensin pasiva de
tejidos cardiacos y un aumento en el tamao de los miocitos cardiacos aislados. Para
determinar dicha asociacin de observaciones se determin el coeficiente de
correlacin de Pearson y los datos encontrados nos sugieren una fuerte correlacin
entre la longitud promedio de los miocitos cardiacos y el desarrollo de tensin pasiva
mxima que desarrollan como tejido, tanto en el ventrculo derecho como el izquierdo
(Ver Fig. 28).


Ventrculo Derecho
Longitud de los Miocitos Cardiacos (m)
105 110 115 120 125 130 135
T
e
n
s
i

n

P
a
s
i
v
a

M

x
i
m
a

(
K
P
a
)
4
6
8
10
12
Coeficiente de Correlacin de Pearson = 0.92
Ventrculo Izquierdo
Longitud de los Miocitos Cardiacos (m)
100 102 104 106 108 110 112 114 116
T
e
n
s
i

n

P
a
s
i
v
a

M

x
i
m
a

(
K
P
a
)
0
2
4
6
8
10
12
14
Coeficiente de Correlacin de Pearson = 0.87



Fig. 28. Correlacin entre la longitud promedio de los miocitos cardiacos aislados y la tensin
pasiva mxima desarrollada como tejido en ambos ventrculos cardiacos.







55
Histresis

Otro fenmeno interesante que se presenta en nuestros resultados es el fenmeno
de histresis. A deformacin del 5 %, no se observan diferencias entre los grupos de
ratas no preadas (36 9 J), preadas (23 6 J) y en posparto (43 6 J), pero a
deformaciones del 10 % hay una disminucin en el grupo de ratas preadas (NP, 154
22 J; P18, 79 21 J; PP, 172 25 J), y a 20 %, la disminucin en la histresis es
ms significativa (p< 0.05) durante la preez, en la pared libre del ventrculo derecho
(Fig. 29; NP, 788 100 J; P18, 496 80 J; PP, 791 106 J).
.

Fig. 29. Fenmeno de histresis en la pared libre del ventrculo derecho de ratas no
preadas (NP), preadas de 18 das (P18) y en posparto (7 das despus del parto, PP), a
una deformacin del 20 % de la longitud de la tira muscular. Los datos corresponden a
medias error estndar (n = 16).


Deformacin (o)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NP
P18
PP

56
En el ventrculo izquierdo, a deformaciones del 5 % no hay diferencias entre los
grupos en estudio (NP, 5 1 J; P18, 9 3 J; PP, 14 6 J). La histresis, con
deformacin del 10 % decay ligeramente durante la preez (NP, 98 7 J; P18, 88
3 J; PP, 103 5 J). Mientras que, a deformacin del 20 %, significativamente (p<
0.05), la histresis es mucho menor durante la preez (Fig. 30; NP, 663 10 J; P18,
420 19 J; PP, 643 40 J). Adems, estos resultados indican que no hay diferencias
entre el grupo posparto y el de no preadas.



Fig. 30. Fenmeno de histresis en el ventrculo izquierdo de ratas no preadas (NP),
preadas de 18 das (P18) y en posparto (7 das despus del parto, PP), a una deformacin
del 20 % de la longitud de la tira muscular. Los datos corresponden a medias error
estndar (n = 16).



Deformacin (o)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
T
e
n
s
i

n

p
a
s
i
v
a

(
N

/

m
2
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NP
P18
PP

57
Mdulo de Elasticidad

Las curvas de esfuerzo-deformacin fueron ajustadas a la ecuacin de Magid y Law
(1985) con la finalidad de calcular el mdulo de elasticidad o mdulo de Young (E
0
)
de los tejidos cardiacos en cada grupo experimental, el cual es una medida de la
rigidez que presentan los tejidos.

Como se aprecia en la Fig. 31, los resultados indican que, con una deformacin del
10 %, la pared libre del ventrculo derecho del grupo de preadas tiene un E
0

estadsticamente menor (p < 0.05) al del grupo de no preadas o en posparto.



Fig. 31. Mdulo de elasticidad o de Young de la pared libre del ventrculo derecho, calculado
a partir de la ecuacin de Magid y Law, ajuste realizado a las curvas de esfuerzo-
deformacin del 10 %, en los 3 grupos experimentales: ratas no preadas (NP), preadas de
18 das (P18) y en posparto (7 das despus del parto, PP). Los datos corresponden a
medias error estndar (n = 16). * p < 0.05.

Grupos experimentales
M
o
d
u
l
o

d
e

E
l
a
s
t
i
c
i
d
a
d

(
P
a
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
NP
P18
PP
*

58

Para el ventrculo izquierdo, tambin se aprecia de forma significativa (p < 0.05) un
E
0
mucho menor durante la preez de las ratas (Fig. 32).



Fig. 32. Mdulo de elasticidad o de Young del ventrculo izquierdo, calculado a partir de la
ecuacin de Magid y Law, ajuste realizado a las curvas de esfuerzo-deformacin del 10 %,
en los 3 grupos experimentales: ratas no preadas (NP), preadas de 18 das (P18) y en
posparto (7 das despus del parto, PP). Los datos corresponden a medias error estndar
(n = 16). * p < 0.05.

Si comparamos los ventrculos, es evidente que en ambos el E
0
disminuye durante la
preez, y adems, el E
0
del ventrculo izquierdo es menor que el de la pared libre del
ventrculo derecho.




Grupos experimentales
M
o
d
u
l
o

d
e

E
l
a
s
t
i
c
i
d
a
d

(
P
a
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
NP
P18
PP
*

59
Electroforesis de la Titina Cardiaca

Se realiz una curva de calibracin de protenas (Fig. 33), para asegurar que la carga
de protena fuera similar en los carriles.

Fig. 33. Curva de calibracin con albmina de suero bovino. Las mediciones fueron hechas
con mtodo espectrofotomtrico a 280 nm. Los datos fueron ajustados a una recta para
conocer las concentraciones de las muestras problemas (homogenado de protenas), con el
ajuste se obtuvo un coeficiente de correlacin aceptable de 0.998.

Al realizar el anlisis electrofortico de la pared libre del ventrculo derecho y
ventrculo izquierdo, se apreci la separacin de las distintas protenas musculares
(titina, nebulina, miosina); sin observar cambios en movilidad de las protenas al
comparar los grupos experimentales de no preez, preez y posparto.






Concentracin de protenas (g/l)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

60
Anlisis de la Titina por Western-Blot

Otro punto importante de nuestra investigacin, consisti en determinar, si haba
cambios en la cantidad de expresin de las isoformas de la titina N2B y N2BA, para
lo cual se utiliz la tcnica del western-blot con marcajes especficos. Los resultados
indican la presencia de ambas isoformas en los 3 grupos en estudio (ver Fig. 34 A y
B).


(A)

(B)


Fig. 34. Western-blot ilustrativo de membranas incubadas con anticuerpo anti-N2B (Panel A)
y anti- N2BA (Panel B) para los grupos en estudio: NP (No preadas), P18 (preadas) y PP
(posparto), en dos regiones del corazn, VD (ventrculo derecho) y VI (Ventrculo izquierdo).



N2B
VD VI
NP PP
P18 NP
P18
PP
N2B
VD VI
NP PP
P18 NP
P18
PP

NP P18 PP NP P18 PP
VD VI
NP P18 PP NP P18 PP
VD VI

61
Al cuantificar cada isoforma de la titina, es decir N2B y N2BA, no se observaron
diferencias significativas entre los grupos estudiados (NP, P18 y PP), en ambos
ventrculos, derecho e izquierdo. Los resultados sugieren, que para todos los casos
se expresan en cantidades aproximadamente iguales ambas isoformas de la titina
cardiaca (Fig. 35).
Expresin de Titina en Ventrculo Derecho
0%
20%
40%
60%
80%
100%
NP P18 PP
Grupos experimentales
C
o
m
p
o
s
i
c
i

n

d
e

T
i
t
i
n
a

(
%
)
N2BA
N2B
Expresin de Titina en Ventrculo Izquierdo
0%
20%
40%
60%
80%
100%
NP P18 PP
Grupos experimentales
C
o
m
p
o
s
i
c
i

n


d
e

T
i
t
i
n
a

(
%
)
N2BA
N2B

Fig. 35. Porcentaje de expresin de las isofornas de la titina N2B y N2BA en los grupos en
estudio: NP (No preadas), P18 (preadas) y PP (posparto), en ventrculo derecho (Panel de
arriba) y ventrculo izquierdo (Panel de abajo). Los datos fueron obtenidos del anlisis de
densitometra de los western-blot y corresponden a medias error estndar.

62
Tambin, se realiz la cuantificacin de la titina total (suma de ambas isoformas)
respecto a la cantidad de miosina cardiaca (M) y los resultados encontrados (Fig.
36), nos sugieren que durante la preez y el posparto de la rata no cambia de forma
significativa la cantidad total de la titina cardiaca en ninguno de los dos ventrculos,
derecho e izquierdo.
T
i
t
i
n
a

t
o
t
a
l

r
e
s
p
e
c
t
o

a

M
i
o
s
i
n
a

(
u
.
a
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
NP
P18
PP
VD VI


Fig. 36. Cantidad total de la Titina respecto a la Miosina en tejidos cardiacos (ventrculo
derecho, VD; e Izquierdo, VI) de ratas: NP (No preadas), P18 (preadas) y PP (posparto).
Los datos corresponden a medias error estndar.












63
Niveles de ARNm mediante RT-PCR semicuantitativo

En el ventrculo derecho, como se aprecia en la figura 37, se encontraron niveles
similares de ARNm para ambas isoformas de la titina, en las tres condiciones
estudiadas (no preez, preez y en posparto). Para el caso del ventrculo izquierdo
se encontraron los mismos resultados que el ventrculo derecho (~50 % de ARNm de
N2B y ~50 % de N2BA).





Fig. 37. Panel superior, niveles de ARNm de las dos isoformas de la titina N2B y N2BA
normalizados con respecto al gen constitutivo de GAPDH, en los grupos experimentales de
no preadas (NP), preadas (P18) y en posparto (PP). Panel inferior, bandas ilustrativas de
un gel de agarosa al 1%, donde se corrieron muestras de ADN del gen control GAPDH (1),
gen de la isoforma N2B (2) y gen de la isoforma N2BA (3) en los tres grupos experimentales.

N
i
v
e
l

d
e

A
R
N
m

d
e

t
i
t
i
n
a
/

A
R
N
m

d
e

G
A
P
D
H

(
%
)
0
10
20
30
40
50
60
NP P18 PP
Isoforma de titina N2B
Isoforma de titina N2BA


64
Cortes histolgicos teidos con Tricromo de Masson

Al no encontrar datos significativos en la expresin de la titina que explicaran los
cambios de tensin pasiva observados durante la preez, estudiamos la matriz
extracelular en busca de modificaciones en la densidad de colgena mediante la
tcnica histolgica descrita en mtodos. Observaciones al microscopio demuestran
que durante la preez hay un aumento en la cantidad de colgena (ver Fig. 38),
mientras que en el posparto se revierten dichos cambios.




Fig. 38. Cortes histolgicos de tejidos cardiacos teidos con tricromo de Masson, donde se
puede apreciar diferencias en la colgena (teida de azul) de los corazones de ratas no
preadas (Panel A), preadas (Panel B) y posparto (Panel C). Estas imgenes fueron
tomadas con el objetivo 20x.

Los datos obtenidos respecto a la densidad de colgena indican que en los cortes de
tejidos de corazones del grupo P18 hay 67% ms de colgena que en los animales
de los grupos NP y PP (Fig. 39).
A B C
65
Grupos experimentales
D
e
n
s
i
d
a
d

d
e

c
o
l

g
e
n
a

(
%
)
0
1
2
3
4
5
NP
P18
PP *


Fig. 39. Promedio de densidad de colgena de ambos ventrculos cardiacos durante la
preez de rata y el posparto en comparacin con ratas sin prear. Los datos corresponden a
medias error estndar. * p < 0.05.


Adems, tambin se puede apreciar que en la preez hay una mayor cantidad de
colgena en la regin del pericardio (ver Fig. 40).

66


Fig. 40. Cortes histolgicos de tejidos cardiacos teidos con tricromo de Masson, donde se
puede apreciar diferencias en la colgena (teida de azul) del pericardio de corazones de
ratas no preadas (NP), preadas (P18) y posparto (PP). Estas imgenes fueron tomadas
con el objetivo 100x.

NP
P18
PP
67


















DISCUSIN





















68
El objetivo principal de esta tesis fue, estudiar los cambios en las propiedades
mecnicas pasivas de los tejidos cardiacos que han sufrido hipertrofia funcional
durante la preez, y evaluar los cambios de isoformas de la titina (N2B y N2BA), a
nivel de ARNm y como protena expresada, en un modelo experimental de rata.

Hipertrofia Cardiaca.

Existen pocas investigaciones que estudien la hipertrofia cardiaca fisiolgica
relacionada con la preez; por lo tanto, los cambios fisiolgicos y los mecanismos
moleculares asociados a la hipertrofia son pobremente entendidos. Se ha establecido
que durante la preez el corazn desarrolla hipertrofia como un mecanismo de
adaptacin ante un incremento en la sobrecarga de volumen sanguneo.
Recientemente en la preez de ratn se encontr un incremento significativo en el
tamao del corazn, sin embargo, la relacin entre la masa del corazn y el peso
corporal no aumento significativamente (Eghbali et al., 2005). Nuestros resultados
muestran que para el caso de la rata, durante su preez, se observa un aumento
significativo en la relacin masa del corazn / peso corporal, coincidiendo con lo
reportado por otros autores, tanto en humanos como en animales (Katz et al., 1978;
Capeless y Clapp, 1989; Gilson et al., 1992; Mabie et al., 1994; Slangen et al., 1997;
Poppas et al., 1997; Spaanderman et al., 2000); Adems, en cuanto a la
reversibilidad de la hipertrofia cardiaca en ratas, se ha reportado que pocos das
despus del parto regresa a su tamao original (Buttrick et al., 1987); en nuestro
estudio, 7 das despus del parto, la hipertrofia se revirti por completo. Estos
hallazgos hacen sugerir que la hipertrofia cardiaca puede ser un mecanismo
compensatorio activado durante la preez para mejorar la capacidad de bombeo del
corazn y satisfacer la demanda hemodinmica.

Por otra parte, es aceptado que el crecimiento del corazn inducido por sobrecarga
de volumen est asociado a un incremento en el tamao de los miocitos cardiacos,
tal como ha sido demostrado en distintas condiciones experimentales como son: el
ejercicio, modelo de fstula arteriovenosa y la preez de ratn (Chen, Torry,
69
Baumbach, y Tomanek, 1994; Natali, Turner, Harrison y White, 2001; Wang, Ren,
Liu, Sentex, Tappia, y Dhalla, 2003; Eghbali et al., 2005); en este punto, nuestros
experimentos indican que la hipertrofia cardiaca desarrollada en la preez de la rata,
tambin esta asociada a un incremento en el rea de los miocitos cardiacos en las
distintas regiones de los ventrculos; adems, nuestros resultados indican que el
aumento en el rea de los miocitos es a expensas del aumento en su eje longitudinal,
lo cual explica la hipertrofia excntrica observada en la preez de la rata. Tambin,
en la investigacin realizada recientemente por Eghbali et al. (2005) encontraron que
el rea de la cavidad del ventrculo derecho aument ms que en el ventrculo
izquierdo durante la preez, esto podra ser explicado por nuestros resultados, que
muestran que la longitud de los miocitos aumenta ms en el ventrculo derecho en
comparacin con el ventrculo izquierdo.

Propiedades Mecnicas Pasivas.

La elasticidad es una propiedad inherente del msculo estriado, cuando un msculo
es estirado genera tensin pasiva. En el msculo cardiaco, las propiedades
mecnicas pasivas son de suma importancia ya que influyen en la velocidad de
acortamiento de las fibras (De Tombe y Ter Keurs, 1992; Sweitzer y Moss, 1993), y
es un factor que determina el lmite de volumen sanguneo que entra al corazn y por
lo tanto del volumen sistlico final (Brady, 1991).

En la preez, el corazn debe ser capaz de manejar un mayor volumen sanguneo,
es decir, las paredes miocrdicas deben ser ms distensibles, y esto lo pueden
lograr, disminuyendo la resistencia a la distensin, la cual es detectable a travs del
registro de la tensin pasiva. Los resultados de este trabajo apoyan esta idea, ya que
durante la preez, cuando las preparaciones musculares fueron estiradas al 5, 10 y
20 % de su longitud inicial, desarrollaron menor tensin pasiva en comparacin con
el grupo control (no preez). Adems, el desarrollo de tensin pasiva durante el
posparto fue similar al grupo control, lo cual hace sugerir que el corazn durante la
preez disminuye el desarrollo de tensin pasiva de sus paredes miocrdicas,
70
actuando como un mecanismo de adaptacin que mejora el desempeo cardiaco
para manejar el incremento de volumen sanguneo al cual esta expuesto.

Un parmetro importante que ayuda a determinar la rigidez o distensibilidad de un
tejido es el mdulo de Young (E
0
); a mayor mdulo de elasticidad, ms rgido es un
tejido. A menor mdulo implica que es ms distensible. Magid y Law (1985) proponen
que, si las curvas de esfuerzo-deformacin de un tejido muscular son ajustadas a la
ecuacin: Ln (c) = o + Ln (E
0
/ ), se puede obtener el mdulo de elasticidad inicial
que determina las propiedades mecnicas pasivas de estos tejidos. Haciendo el
ajuste con la ec. de Magid y Law, encontramos en nuestros resultados que el
ventrculo derecho tiene un mdulo de elasticidad mayor que el ventrculo izquierdo,
es decir, la pared libre del ventrculo derecho es menos elstica que la pared
miocrdica del ventrculo izquierdo; adems, durante la preez el mdulo de
elasticidad disminuye en ambos ventrculos. Estos resultados del mdulo de
elasticidad explicaran como el ventrculo izquierdo es ms distensible, lo cual podra
favorecer que la longitud sarcomrica de arranque para la contraccin permita un
mayor desarrollo de fuerza durante la sstole, expulsando un mayor volumen
sanguneo haca el sistema arterial que le permita satisfacer todas las necesidades
metablicas del organismo incluyendo los requerimientos fetales.

Estos cambios en las propiedades mecnicas del corazn durante la preez
sugieren el requerimiento de una fuente energtica ms eficiente. En los tejidos
cardiacos hipertrofiados por sobrecarga de volumen se han encontrado cambios en
la actividad mitocondrial aumentando la oxidacin de la glucosa (Huss y Nelly, 2004;
Ingwall y Weiss, 2004). En este sentido, hacen falta futuras investigaciones que
ayuden a esclarecer como se administran energticamente los tejidos cardiacos
durante la preez.




71
HISTERESIS.

Cuando un tejido es sometido a ciclos de deformacin, la tensin que se genera
durante el estiramiento es mayor que en la relajacin, observndose el fenmeno de
histresis (Helmes et al., 1999; Minajeva, Kulke, Fernndez y Linke, 2001), en donde
se puede evaluar la cantidad de calor que se pierde durante el proceso, es decir, el
rea entre las dos curvas (estiramiento y relajacin).

En nuestros experimentos observamos que el calor que se pierde durante la
histresis se incrementa con la amplitud de los ciclos de deformacin, resultados que
son consistentes con lo observado en estudios previos realizados en molculas
individuales de titina (Kellermayer et al., 1997) o en miocitos cardiacos donde
midieron la cantidad de calor que se disipa durante la histresis a distintas longitudes
sarcomricas (Helmes et al., 1999).

Se ha propuesto que durante la fase de estiramiento, hay un desdoblamiento de la
molcula de titina en el segmento PEVK y probablemente en algunos monmeros de
Ig; y en la fase de relajacin, la molcula de titina recuperan su plegamiento original.
La histresis puede ser explicada por diferencias entre las velocidades de
desdoblamiento y plegamiento (Minajeva et al., 2001). Se ha reportado que la
velocidad de plegamiento es menor que la de desdoblamiento (Li et al., 2002), sin
embargo, cuando ha terminado un ciclo estiramiento-relajacin, la molcula de titina
parece contener regiones en estado de predesdoblamiento, haciendo todo el proceso
de plegamiento ms lento; adems, si inmediatamente se inicia un nuevo ciclo de
deformacin, la molcula de titina al contener regiones en estado de
predesdoblamiento ocasiona que la tensin pasiva producida en este nuevo ciclo sea
menor que la anterior, de esta forma reducira la cantidad de energa que se pierde
en forma de calor durante la histresis de cada ciclo de deformacin-relajacin
(Kellermayer et al., 1997; Helmes et al., 1999; Trombitas, Freiburg, Centner, Labeit, y
Granzier, 1999). En nuestros experimentos encontramos que durante la preez la
72
cantidad de calor que se pierde durante la histresis es menor en comparacin con el
control (no preez).

Si consideramos que tanto en humanos como en animales, durante la preez
aumenta la frecuencia cardiaca (ciclos deformacin-relajacin) (Katz et al., 1978;
Gilson et al., 1992; Mabie et al., 1994; Slangen et al., 1997); entonces, esta
disminucin en la perdida de calor durante la histresis podra ser un mecanismo
protector que se presentara durante la preez con el fin de disminuir la energa que
se pierde durante cada latido, aunque faltan ms investigaciones que detallen los
cambios en estructura y conformacin que ocurren al interior de la titina y su
interaccin con otras protenas sarcomricas.

ISOFORMAS DE LA TITINA.

El principal responsable de la generacin de la tensin pasiva en el msculo estriado
es la titina, protena sarcomrica que va desde la banda Z hasta la lnea M (Granzier
y Labeit, 2004). La regin extensible de la molcula de titina est localizada en la
banda I (Granzier y Labeit, 2002). En tejidos cardiacos, se expresan dos isoformas
conocidas como la N2B y la N2BA que difieren en su composicin y peso molecular
(Freiburg et al., 2000; Granzier y Labeit, 2004). Adems, es conocido que los tejidos
que expresan la isoforma de titina N2B desarrollan ms tensin pasiva que los que
expresan la isoforma N2BA (Cazorla et al., 2000). Tambin, es importante mencionar
que recientes investigaciones sugieren que el desarrollo de tensin pasiva en los
tejidos cardiacos podra estar regulado por la relacin entre los niveles de expresin
de isoformas N2BA / N2B (Neagoe et al., 2002; Wu et al., 2002; Warren et al., 2003;
Lahmers et al., 2004; Wu et al., 2004; Nagueh et al., 2004).

En nuestros experimentos se observ disminucin significativa en el desarrollo de
tensin pasiva durante la preez, por lo que formulamos la hiptesis que podra ser
causada por un incremento en los niveles de expresin de la isoforma de titina N2BA
y/o disminucin de titina N2B, sin embargo, los resultados obtenidos en esta
73
investigacin no muestran diferencias significativas en los niveles de expresin de las
isoformas de titina N2B y N2BA; pero si consideramos que el gen de la titina tiene la
facilidad de producir splicing (Un mismo gen codifica para la formacin de protenas
distintas) y formar titinas de distintos tamaos moleculares (Granzier y Labeit, 2002 y
2004), entonces no podramos descartar la posibilidad de que la disminucin en la
tensin pasiva observada en la preez se debe a cambios en la longitud de titina sin
necesariamente modificar los niveles de expresin de las isoformas de titina N2B y
N2BA, dejando para futuras investigaciones la exploracin de esta hiptesis usando
tcnicas como la espectrometra de masas. Adems, en nuestros experimentos los
cambios en tensin pasiva no los podemos atribuir a una variacin en la titina total,
ya que tambin nuestros datos de titina total (~0.22) estn dentro del rango reportado
por otros autores (Cazorla et al., 2000; Nagueh et al., 2004). Con respecto al nivel de
expresin de los transcriptos para las dos isoformas de titina fueron muy similares
coincidiendo con la expresin de protenas. Estos datos de ARNm son consistentes
con lo obtenido por Opitz et al. (2004), mediante estudios de RT-PCR en tiempo real
mientras que nosotros usamos RT-PCR semicuantitativo.

Un mecanismo que sera interesante explorar a futuro y que podra contribuir a la
reduccin en la tensin pasiva de los tejidos cardiacos observada en la preez sera
un aumento en la actividad de la protena cinasa A (PKA) la cual se ha encontrado
que fosforila titina cardiaca y disminuye el desarrollo de tensin pasiva (Fukuda et al.,
2005) sin cambiar los niveles de expresin de las isoformas de la titina. Adems,
durante la preez hay un aumento en la duracin del potencial de accin cardiaco
(Eghbali et al., 2005), esto facilita la entrada de calcio al interior celular para
favorecer una mayor actividad contrctil que se demanda en esta condicin
fisiolgica; pero por otro lado, el aumento de calcio intracelular podra activar a la
Calpaina 3, una proteasa dependiente de calcio, la cual posee sitios de unin a titina
cardiaca (Granzier y Labeit, 2002; Ono et al., 2004) y podra tambin contribuir a la
reduccin de la tensin pasiva sin cambiar la expresin de las isoformas de titina.


74
COLAGENA

Otra protena involucrada en regular la tensin pasiva de las paredes ventriculares es
la colgena, principal protena de la matriz extracelular. En tejidos cardiacos
predominan los tipos I y III; el tipo I forma una estructura resistente a la extensin,
mientras que el tipo III forma una estructura muy flexible (Medugorac, 1982). En la
hipertrofia cardiaca de origen patolgico tambin se ha reportado que existe un
aumento en la rigidez ventricular asociado a un incremento en el contenido de la
colgena, en particular de la colgena tipo I (Marijianowski et al., 1995; Wu et al.,
2002; Wu et al., 2004), y como resultado afecta negativamente la funcin diastlica
del corazn. En nuestros experimentos, un modelo de hipertrofia cardiaca funcional
reversible, mostramos evidencia histolgica de un aumento en el contenido de
colgena cardiaca durante la preez, la cual se revierte en el posparto. Dichos
cambios pueden explicar los cambios en la rigidez ventricular observados en los
experimentos mecnicos. Este hallazgo de la colgena, nos abre una excelente
perspectiva de una futura investigacin a nivel molecular para probar si durante la
preez hay un aumento en la expresin de colgena tipo III lo cual dara como
resultado una menor rigidez ventricular durante la preez para facilitar el llenado
diastlico.


75


















CONCLUSIONES





















76

1) Durante la preez el corazn sufre hipertrofia funcional y 7 das despus del
parto se revierte; adems, la hipertrofia esta asociada a un incremento en el
rea y longitud de los miocitos cardiacos.

2) Los tejidos cardiacos durante la preez desarrollan menor tensin pasiva en
comparacin con los tejidos cardiacos de ratas no preadas o en fase de
posparto. Al comparar ambos ventrculos, la pared libre del izquierdo
desarrolla menor tensin pasiva que la pared libre del derecho.

3) Existe una correlacin negativa entre los cambios de longitud de los miocitos
cardiacos y los cambios de la tensin pasiva que ocurren como tejido cardiaco
durante la preez.

4) El mdulo de elasticidad durante la preez disminuye en ambos ventrculos
hacindolos ms distensibles. De ambos ventrculos, el izquierdo es ms
distensible que el derecho.

5) Las paredes miocrdicas del corazn de ratas no preadas y en posparto
presentan niveles similares de histresis, mientras que en la preez la
histresis es menor.

6) Los niveles de ARNm y la expresin de las isoformas de titina N2BA y N2B no
cambian durante la preez.

7) La cantidad de colgena en los tejidos cardiacos aumenta durante la preez y
se revierte en el posparto.



77
En general, durante la preez los miocitos cardiacos crecen longitudinalmente
conduciendo a la formacin de una hipertrofia cardiaca excntrica; las paredes
ventriculares desarrollan una menor tensin pasiva, son menos rgidas y
presentan una menor histresis, pero dichos cambios no estn asociados a una
alteracin en el patrn de expresin de isoformas de la titina. Finalmente, la
histologa revel un incremento en el contenido de colgena.

Por tanto, los resultados de este trabajo favorecen la nocin de una asociacin
dinmica con el citoesqueleto al presentarse cambios en el tamao de los
miocitos y de las paredes miocrdicas (tensin pasiva y mdulo elstico) durante
la preez. As, estos hallazgos toman importancia en el contexto de que a nivel
molecular estn participando elementos que regulan tanto el crecimiento como la
mecnica pasiva del corazn y que aun no se sabe como participan, por lo que el
presente trabajo sienta las bases para estudiar las complejas cascadas de
sealizacin que deben de estar regulando el desarrollo de la hipertrofia cardiaca
y los cambios en las propiedades mecnicas pasivas durante la preez.
78

















PERSPECTIVAS






















79
1) Caracterizar en la preez, el mecanismo molecular implicado en el desarrollo
de hipertrofia cardiaca. Uno de estos mecanismos, podra ser va activacin
hormonal mediante receptores a estradiol acoplados a protenas G los cuales
activaran la va Ras desencadenando cambios a nivel de factores de
transcripcin (Fig. 41).

















Fig. 41. Probables mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de hipertrofia
cardiaca durante la preez. Et (Receptores a Endotelina), AT1 (Receptores a Angiotensina),
AR (Receptores adrenrgicos), MusAcR (Receptores muscarnicos a acetilcolina), ER
(Receptor a estradiol), Goq, os, oi y | (Subunidades de protenas G), PLC (Fosfolipasa C),
IP3 (Inositol trifosfato), DAG (Diacilglicerol), PKC (Protena cinasa C), PKA (Protena cinasa
A), AC (Adenilato ciclasa), RGS (Regulador de la sealizacin de protenas G), cAMP
(Adenosina monofosfato cclico), MAPK (Protenas cinasas activadas por mitogenos), ARK
(Receptor cinasa beta adrenrgico), PI3K (Fosfatidil 3-Inositol cinasa), Akt (Protena cinasa
B), Ras (Superfamilia de GTPasas monomricas), Raf (Protena con actividad cinasa-cinasa-
cinasa activada por mitogenos), ERK (Cinasa reguladora de seales extracelulares), JNK
(Cinasa de c-Jun), NFAT (Factor nuclear activado por clulas T).
80
Otras vas de sealizacin muy interesantes que podran estar implicadas en el
desarrollo de la hipertrofia cardiaca son la Endotelina y la Angiotensina activando
cascadas de sealizacin mediadas por Calcineurina y Ras (Fig. 41).

2) Estudiar los cambios en las propiedades contrctiles y su relacin con la carga
energtica de las clulas cardiacas, en busca de entender los mecanismos que
regulan el incremento de la frecuencia cardiaca y el gasto cardiaco durante la preez.

3) Investigar si otras protenas del citoesqueleto y de la matriz extracelular participan
en los cambios de la tensin pasiva de las paredes miocrdicas durante la preez, en
particular las protenas: y tubulina, desmina, fibronectina, vimentina, las cuales
han sido asociadas a hipertrofia cardiaca.

4) Establecer si la fosforilacin de titina cardiaca va protena cinasa A (PKA) es
responsable de regular los cambios en las propiedades mecnicas pasivas que
ocurren durante la preez y el posparto.

5) Estudiar la participacin de la Calpana 3, la cual posee dominios de unin a titina
cardiaca, como un posible mecanismo regulador de las propiedades mecnicas
pasivas que ocurren durante la preez y el posparto.

6) Estudiar si el TGF| esta participando en el aumento de expresin de colgena, va
algunos factores de transcripcin como NFK|.
81









ANEXO










82
A) Soluciones de registro mecnico y dispersin celular de miocitos cardiacos

1. Solucin Tyrode Normal (mM): NaCl 125, KCl 5.4, MgCl
2
1.05,

NaHCO
3
24,
NaH
2
PO
4
0.42, CaCl
2
1.8 y Dextrosa 11. pH = 7.4 con NaOH.

2. Solucin Cardiopljica (mM): NaCl 121.9, KCl 8.5, MgCl
2
1.05,

NaHCO
3
24,
NaH
2
PO
4
0.42, CaCl
2
1.8 y Dextrosa 11. pH = 7.4 con NaOH.

3. Medio KB (mM): Glutamato de potasio 100, cido asprtico 10, KCl 25,
KH
2
PO4 10, MgSO
4
2, Taurina 20, Creatina base 5, EGTA 0.5, Hepes 5 y
Glucosa 20. pH 7.2 con KOH.

B) Geles de SDS-PAGE

Gel al 10%.

Sustancia
Volumen final del gel
5.5 ml
Glicerol (15%) 0.8250 ml
Amortiguador de corrimiento
STOCK (10X)
0.5500 ml
PAGE (20%) 2.7500 ml
Agua destilada (fra) 1.0340 ml
APS (0.06% de soln 1%) 0.3300 ml
TEMED 9.9000 L


Gel al 3%.

Sustancia
Volumen final del gel
4.8 ml
Glicerol (15%) 0.24 ml
Amortiguador de corrimiento
STOCK (10X)
0.45 ml
PAGE (20%) 0.72 ml
Agua destilada (fra) 2.6304 ml
APS (0.15% de soln 1%) 0.72 ml
TEMED 9.6 L

83


C) Western-blot.

- Amortiguador de transferencia (25 mM de Tris, 190 mM de glicina, 20% de
metanol, pH de 8.2-8.3).

- Ponceau S (se disuelve 0.5 g de Ponceau S en 1 ml de cido actico
glacial y se afora a 100 ml con agua desionizada).

- Solucin de bloqueo (5 % de Leche en polvo sin grasa, 0.02 % de azida de
sodio, 0.02 % de Tween-20).

- PBS 10X (240 g de NaCl, 6 g de KCl, 81.6 g de Na
2
HPO
4
-7H
2
0, 7.2 g de
KHPO
4
para 3 litros, pH de 7.4 con NaOH 10 N).

- TBS 10X (66.55 g de Tris, 45 g de NaCl para 500 ml, pH de 7.5 con HCl).

- TBST (5 ml de TBS 10X, 10 L de Tween 20, 45 ml de agua desionizada).

- Avidina (Diluir avidina 1:25 en TBST).

- Biotina (Diluir biotina 1:25 en TBST).

- Complejo Avidina-Biotina (100 L de solucin A, 100 L de solucin B, 9.8
ml de TBST).

- Reactivo DAB (4.5 ml de buffer peroxido y 5 ml de sustrato DAB)



84


D) Extraccin de RNA

Agua-DEP (Se agrega 1 l de Dietil Pirocarbonato por cada ml de agua
desionizada, se agita y se deja en reposo toda la noche. Finalmente, se esteriliza
en autoclave).

E) Electroforesis de DNA

TBE 10X (Tris base 500 mM, H
3
BO
3
500 mM, EDTA 25 mM, pH = 8.3).

Gel de agarosa al 1 % (La agarosa se disuelve en buffer TBE 1X calentando
hasta ebullicin en un horno de microondas).

Amortiguador de carga 5X (Ficoll 20 %, EDTA 500 mM pH de 8.0, Azul de
bromofenol 0.05 % y Azul de Xilencianol 0.1 %).

Solucin madre de Bromuro de Etidio (10 mg / ml, Mantener en refrigeracin y
oscuridad).

85









BIBLIOGRAFA











86
1. Assayag, P., Carre, F., Chevalier, B., Delcayre, C., Mansier, P., y
Swynghedauw, B. (1997). Compensated cardiac hypertrophy:
Arrhythmogenicity and the new myocardial phenotype. I. Fibrosis. Cardiovasc.
Res., 34 (3), 439-44.
2. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith,
J.A., y Struhl, K. (2003). Current protocols in molecular biology. Vol. 2 (Cap. 4,
10 y 14), New York, USA: John Wiley & Sons, In.
3. Belardinelli, R., Georgiou, D., Cianci, G., y Purcaro, A. (1999). Randomized,
controlled trial of long-term moderate exercise training in chronic heart failure:
Effects on functional capacity, quality of life, and clinical outcome. Circulation.,
99, 117382.
4. Brady, A.J. (1991). Mechanical properties of isolated cardiac myocytes.
Physiol. Rev., 71, 413-24.
5. Brower, G.L., y Janicki, J.S. (2001). Contribution of ventricular remodeling to
pathogenesis of heart failure in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol., 280 (2),
H674-83.
6. Buttrick, P.M., Schaible, T.F., Malhotra, A., Mattioli, S., y Scheuer, J. (1987).
Effects of pregnancy on cardiac function and myosin enzymology in the rat.
Am J Physiol., 252 (4 Pt 2), H846-50.
7. Capeless, E.L., y Clapp, J.F. (1989). Cardiovascular changes in early phase of
pregnancy. Am. J Obstet. Gynecol., 161, 144953.
8. Cazorla, O., Freiburg, A., Helmes, M., Centner, T., McNabb, M., Wu, Y.,
Trombitas, K., Labeit, S., y Granzier, H. (2000). Differential expression of
87
cardiac titin isoforms and modulation of cellular stiffness. Circ. Res., 86 (1), 59-
67.
9. Chapman, A.B., Zamudio, S., Woodmansee, W., Merouani, A., Osorio, F.,
Johnson, A., Moore, L.G., Dahms, T., Coffin. C., Abraham, W.T., y Schrier,
R.W. (1997). Systemic and renal hemodynamic changes in the luteal phase of
the menstrual cycle mimic early pregnancy. Am. J. Physiol. Renal Physiol.,
273, F777F782.
10. Chen, Y., Torry, R.J., Baumbach, G.L., y Tomanek, R.J. (1994). Proportional
arteriolar growth accompanies cardiac hypertrophy induced by volume
overload. Am J Physiol., 267 (6 Pt 2), H2132-7.
11. Clark, K.A., McElhinny, A.S., Beckerle, M.C. y Gregorio, C.C. (2002). Striated
muscle cytoarchitecture: an intricate web of form and function. Annu Rev Cell
Dev Biol. 18, 637-706.
12. De Tombe, P.P., y Ter Keurs, H.E. (1992). An internal viscous element limits
unloaded velocity of sarcomere shortening in rat myocardium. J Physiol., 454,
19-42.
13. De Zee, M., Bojsen-Moller, F., y Voigt, M. (2000). Dynamic viscoelastic
behavior of lower extremity tendons during simulated running. J Appl Physiol.,
89 (4), 1352-9.
14. Dionisi, H.M., Checa, S.K., y Viale, A.M. (1995). Protein immunoblotting of
stained gels. Biotechniques., 19 (3), 348-50.
15. Duvekot, J.J., Cheriex, E.C., Pieters, F.A.A., y Peeters, L.L.H. (1993). Early
pregnancy changes in hemodynamics and volume homeostasis are
88
consecutive adjustments triggered by a primary fall in systemic vascular tone.
Am. J. Obstet. Gynecol., 169, 138292.
16. Eghbali, M., Deva, R., Alioua, A., Minosyan, T.Y., Ruan, H., Wang, Y., Toro,
L., y Stefani, E. (2005). Molecular and Functional Signature of Heart
Hypertrophy during Pregnancy. Circ Res., 96:1208-16.

17. Freiburg, A., Trombitas, K., Hell, W., Cazorla, O., Fougerousse, F., Centner,
T., Kolmerer, B., Witt, C., Beckmann, J.S., Gregorio, C.C., Granzier, H., y
Labeit, S. (2000). Series of exon-skipping events in the elastic spring region of
titin as the structural basis for myofibrillar elastic diversity. Circ. Res., 86 (11),
1114-21.
18. Fukuda, N., Wu, Y., Nair P. Y Granzier, H.L. (2005). Phosphorilation of Titin
Modulates Passive Stiffness of Cardiac Muscle in a Titin Isoform-dependent
Manner. J. Gen. Physiol., 125, 257-71.
19. Gando, S., Hattori, Y., Akaishi, Y., Nishihira, J. y Kanno, M. (1997). Impaired
contractile response to beta adrenoceptor stimulation in diabetic rat hearts:
Alterations in beta adrenoceptors-G protein-adenylate cyclase system and
phospholamban phosphorylation. Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics., 282, 475-84.
20. Gilson, G.J., Mosher, M.D., y Conrad, K.P. (1992). Systemic hemodynamics
and oxygen transport during pregnancy in chronically instrumented, conscious
rats. Am. J. Physiol., 263 (6 Pt 2), H1911-8.
21. Granzier, HL., y Labeit, S. (2002). Cardiac titin: An adjustable multi-functional
spring. J. Physiol., 41 (Pt 2), 335-42.
89
22. Granzier, H.L., Labeit, S. (2004). The giant protein titin: a major player in
myocardial mechanics, signaling, and disease. Circ Res., 94 (3), 284-95.
23. Granzier, H.L., y Wang, K. (1993). Gel electrophoresis of giant proteins:
Solubilization and silver-staining of titin and nebulin from single muscle fiber
segments. Electrophoresis., 14, 56-64.
24. Granzier, H.L., e Irving, T.C. (1995). Passive tension in cardiac muscle:
Contribution of collagen, titin, microtubules, and intermediate filaments.
Biophys. J., 68, 1027-44.
25. Granzier, H., Helmes, M., y Trombitas, K. (1996). Nonuniform elasticity of titin
in cardiac myocytes: A study using immunoelectron microscopy and cellular
mechanics. Biophys J., 70 (1), 430-42.
26. Grossman, W., Jones, D., y McLaurin, L.P. (1975). Wall stress and patterns of
hypertrophy in the human left ventricle. J. Clin. Invest., 56, 5664.
27. Haider, A.W., Larson, M.G., Benjamin, E.J., y Levy, D. (1998). Increased left
ventricular mass and hypertrophy are associated with increased risk for
sudden death. J. Am. Coll. Cardiol., 32 (5), 1454-9.
28. Hattori, Y., Matsuda, N., Kimura, J., Ishitani, T., Tamada, A., Gando, S.,
Kemmotsu, O., y Kanno, M. (2000). Diminished function and expression of the
cardiac Na+-Ca2+ exchanger in diabetic rats: implication in Ca2+ overload. J
Physiol., 527 (Pt 1), 85-94.
29. Helmes, M., Trombitas, K., Centner, T., Kellermayer, M., Labeit, S., Linke,
W.A., y Granzier, H. (1999). Mechanically driven contour-length adjustment in
rat cardiac titin's unique N2B sequence: Titin is an adjustable spring. Circ Res.,
84 (11), 1339-52.
90
30. Hill, J.A., Rothermel, B., Yoo, K.D., Cabuay, B., Demetroulis, E., Weiss, R.M.,
Kutschke, W., Bassel-Duby, B., y Sanders, W. (2002). Targeted inhibition of
calcineurin in pressure-overload cardiac hypertrophy. J. Biol. Chem., 277 (12),
10251-5.
31. Huss, J.M., y Kelly, D.P. (2004). Nuclear receptor signaling and cardiac
energetics. Circ Res., 95(6), 568-78.
32. Isenberg, G., y Klockner, U. (1982). Calcium tolerant ventricular myocytes
prepared by pre-incubation in a KB-medium. Pfluegers Arch., 395, 618.
33. Ingwall, J.S., y Weiss, R.G. (2004). Is the failing heart energy starved? On
using chemical energy to support cardiac function. Circ Res., 95 (2), 135-45..
34. Katz, R., Karliner, J.S., y Resnik, R. (1978). Effects of a natural volume
overload state (pregnancy) on left ventricular performance in normal human
subjects. Circulation., 58 (3), 434-41.
35. Katz, J., Milliken, M.C., Stray-Gundersen, J., Buja, L.M., Parkey, R.W.,
Mitchell J.H., y Peshock, R.M. (1988). Estimation of human myocardial mass
with MR imaging. Radiology., 2, 495-8.
36. Kellermayer, M.S., Smith, S.B., Granzier, H.L., y Bustamante, C. (1997).
Folding-unfolding transitions in single titin molecules characterized with laser
tweezers. Science., 276 (5315), 1112-6.
37. Labeit, S., Barlow, D.P., Gautel, M., Gibson, T., Holt, J., Hsieh, C.L., Francke,
U., Leonard, K., Wardale, J., y Whiting, A. (1990). A regular pattern of two
types of 100-residue motif in the sequence of titin. Nature., 345 (6272), 273-6.
38. Labeit, S., Gautel, M., Lakey, A., y Trinick, J. (1992). Towards a molecular
understanding of titin. EMBO J., 11 (5), 1711-6.
91
39. Lahmers, S., Wu, Y., Call, D.R., Labeit, S., y Granzier, H. (2004).
Developmental control of titin isoform expression and passive stiffness in fetal
and neonatal myocardium. Circ Res., 94 (4), 505-13.
40. LaPolt, P.S., Matt, D.W., Judd, H.L., y Lu, J.K.H. (1986). The relation of
ovarian steroid levels in young female rats to subsequent estrous cyclicity and
reproductive function during aging. Biol. Reprod., 35, 113139.
41. LeWinter, M.M. (2000). Titin: The "missing link" of diastole. J Mol Cell Cardiol.,
32 (12), 2111-4.
42. Li, H., Linke, W.A., Oberhauser, A.F., Carrion-Vazquez, M., Kerkvliet, J.G., Lu,
H., Marszalek, P.E., y Fernandez, J.M. (2002). Reverse engineering of the
giant muscle protein titin. Nature., 418 (6901), 998-1002.
43. Liao, J.K. (2004). Statin therapy for cardiac hypertrophy and heart failure.
J Investig Med., 52 (4), 248-53.
44. Longhurst, J.C., y Stebbins, C.L. (1997). The power athlete. Cardiol. Clin., 15,
41329.
45. Mabie, W.C., DiSessa, T.G., Crocker, L.G., Sibai, B.M., y Arheart, K.L. (1994).
A longitudinal study of cardiac output in normal human pregnancy. Am. J.
Obstet. Gynecol., 170 (3), 849-56.
46. Magid, A., y Law, D.J. (1985). Myofibrils bear most of the resting tension in
frog skeletal muscle. Science., 230 (4731), 1280-2.
47. Marijianowski, M.M., Teeling, P., Mann, J., y Becker, A.E. (1995). Dilated
cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen
ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol., 25(6), 1263-72.
92
48. Maruyama, K., Kimura, S., Ohashi, K., y Kuwano, Y. (1981). Connectin, an
elastic protein of muscle. Identification of "titin" with connectin. J Biochem
(Tokyo)., 89 (3), 701-9.
49. Medugorac, I. (1982). Characterization of intramuscular collagen in
mammalian left ventricle. Basic Res Cardiol., 77(6), 589-98.
50. Minajeva, A., Kulke, M., Fernandez, J.M., y Linke, W.A. (2001). Unfolding of
titin domains explains the viscoelastic behavior of skeletal myofibrils. Biophys
J., 80 (3)., 1442-51.
51. Mokelke, E.A., Palmer, B.M., Cheung, J.Y., y Moore, R.L. (1997). Endurance
training does not affect intrinsic calcium current characteristics in rat
myocardium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 273, H1193H1197.
52. Molkentin, J.D., y Dorn, II. G.W. 2nd. (2001). Cytoplasmic signaling pathways
that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev Physiol., 63, 391-426.
53. Moore, R.L., Musch, T.I., Yelamarty, R.V., Scaduto-RC, J., Se-manchick,
A.M., Elensky, M., y Cheung, J.Y. (1993). Chronic exercise alters contractility
and morphology of isolated rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell. Physiol.,
264, C1180C1189.
54. Morano, I., Hadicke, K., Grom, S., Koch, A., Schwinger, R.H., Bohm, M.,
Bartel, S., Erdmann, E., y Krause, E.G. (1994). Titin, myosin light chains and
C-protein in the developing and failing human heart. J. Mol. Cell. Cardiol., 26
(3), 361-8.
55. Muiz, J., Del Rio, J., Huerta, M., y Marn, J.L. (2001). Effects of sprint and
endurance training on passive stress-strain relation of fast- and slow-twitch
skeletal muscle in Wistar rat. Acta Physiol. Scand., 173, 20712.
93
56. Nagatomo, Y., Carabello, B.A., Hamawaki, M., Nemoto, S., Matsuo, T., y
McDermott, P.J. (1999). Translational mechanisms accelerate the rate of
protein synthesis during canine pressure-overload hypertrophy. Am. J.
Physiol., 277, H2176H2184.
57. Nagueh, S.F., Shah, G., Wu, Y., Torre-Amione, G., King, N.M., Lahmers, S.,
Witt, C.C., Becker, K., Labeit, S., y Granzier, H.L. (2004). Altered titin
expression, myocardial stiffness, and left ventricular function in patients with
dilated cardiomyopathy. Circulation, 110 (2)., 155-62.
58. Natali, A., Turner, D., Harrison, S., y White, E. (2001). Regional effects of
voluntary exercise on cell size and contraction-frequency responses in rat
cardiac myocytes. Exp. Biol., 204 (6), 11919.
59. Neagoe, C., Kulke, M., del Monte, F., Gwathmey, J.K., de Tombe, P.P.,
Hajjar, R.J., y Linke, W.A. (2002). Titin isoform switch in ischemic human heart
disease. Circulation., 106 (11), 1333-41.
60. Ono, Y., Kakinuma, K., Torii, F., Irie, A., Nakagawa, K., Labeit, S., Abe, K.,
Suzuki, K., y Sorimachi, H. (2004). Possible regulation of the conventional
calpain system by skeletal muscle-specific calpain, p94/calpain 3. J Biol
Chem., 279:276171.
61. Opitz, C.A., Leake, M.C., Makarenko, I., Benes, V., y Linke, W.A. (2004).
Developmentally regulated switching of titin size alters myofibrillar stiffness in
the perinatal heart. Circ Res., 94 (7), 967-75.
62. Patel, R., Nagueh, S.F., Tsybouleva, N., Abdellatif, M., Lutucuta, S., Kopelen,
H.A., Quinones, M.A., Zoghbi, W.A., Entman, M.L., Roberts, R., y Marian, A.J.
(2001). Simvastatin induces regression of cardiac hypertrophy and fibrosis and
94
improves cardiac function in a transgenic rabbit model of human hypertrophic
cardiomyopathy. Circulation., 104 (3), 317-24.
63. Perhonen, M.A., Franco, F., Lane, L.D., Buckey, J.C., Blomqvist, C.G.,
Zerwekh, J.E., Peshock, R.M., Weatherall, P.T., y Levine, B.D. (2001). Cardiac
atrophy after bed rest and spaceflight. J Appl Physiol., 91 (2), 645-53.
64. Perides, G., Plagens, U., y Traub, P. (1986). Protein transfer from fixed,
stained, and dried polyacrylamide gels and immunoblot with protein A-gold.
Anal Biochem., 152 (1), 94-9.
65. Picca, M., Agozzino, F., y Pelosi, G. (2004). Effects of losartan and valsartan
on left ventricular hypertrophy and function in essential hypertension.
Adv Ther., 21 (2), 76-86.
66. Poppas, A., Shroff, S.G., Korcarz, C.E., Hibbard, J.U., Berger, D.S.,
Lindheimer, M.D., y Lang, R.M. (1997). Serial assessment of the
cardiovascular system in normal pregnancy. Role of arterial compliance and
pulsatile arterial load. Circulation., 95, 2407-15.
67. Prophet, E.B., Mills, B., Arrington J.B., y Sobin L.H. (1992). Laboratory
Methods in Histotechnology. American Registry of Pathology, Washington D.C.
68. Rapoport, S.I. (1972). Mechanical properties of the sarcolemma and
myoplasm in frog muscle as a function of sarcomere length. J Gen Physiol., 59
(5), 559-85.
69. Rapoport, S.I. (1973). The anisotropic elastic properties of the sarcolemma of
the frog semitendinosus muscle fiber. Biophys J., 13 (1), 14-36.
95
70. Rossi, E., Faiella, A., Zeviani, M., Labeit, S., Floridia, G., Brunelli, S.,
Cammarata, M., Boncinelli, E., y Zuffardi, O. (1994). Order of six loci at 2q24-
q31 and orientation of the HOXD locus. Genomics., 24 (1), 34-40.
71. Sanchez-Chapula, J.A., Salinas-Stefanon, E., Torres-Jacome, J., Benavides-
Haro, D.E., y Navarro-Polanco, R.A. (2001). Blockade of currents by the
antimalarial drug chloroquine in feline ventricular myocytes. J Pharmacol Exp
Ther., 297 (1), 437-45.
72. Shepard, R.J. (1996). The athlete's heart: is big beautiful? Br. J. Sports. Med.,
30, 510.
73. Shimoyama, M., Hayashi, D., Takimoto, E., Zou, Y., Oka, T., Uozumi, H.,
Kudoh, S., Shibasaki, F., Yazaki, Y., Nagai, R., y Komuro, I. (1999).
Calcineurin plays a critical role in pressure overload-induced cardiac
hypertrophy. Circulation., 100 (24), 2449-54.
74. Siedner, S., Kruger, M., Schroeter, M., Metzler, D., Roell, W., Fleischmann,
B.K., Hescheler, J., Pfitzer, G., y Stehle, R. (2003). Developmental changes in
contractility and sarcomeric proteins from the early embryonic to the adult
stage in the mouse heart. J Physiol., 548 (Pt 2), 493-505.
75. Skeie, G.O. (2000). Skeletal muscle titin: physiology and pathophysiology.
Cell. Mol. Life Sci., 57 (11), 1570-6.
76. Slangen, B.F., Out, I.C., Janssen, B.J., y Peeters, L.L. (1997). Blood pressure
and heart rate variability in early pregnancy in rats. Am. J. Physiol., 273 (4 Pt
2), H1794-9.
77. Spaanderman, M.E., Meertens, M., van Bussel, M., Ekhart, T.H., y Peeters,
L.L. (2000). Cardiac output increases independently of basal metabolic rate in
96
early human pregnancy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 278, H1585
H1588.
78. Squire, J.M. (1997). Architecture and function in the muscle sarcomere. Curr.
Opin. Struct. Biol., 7 (2), 247-57.
79. Sweitzer, N.K., y Moss, R.L (1993). Determinants of loaded shortening
velocity in single cardiac myocytes permeabilized with alpha-hemolysin. Circ
Res., 73(6), 1150-62.
80. Trinick, J., y Tskhovrebova, L. (1999). Titin: a molecular control freak. Trends
Cell. Biol., 9 (10), 377-80.
81. Trinick, J., Knight, P., y Whiting, A. (1984). Purification and properties of
native titin. J. Mol. Biol., 180 (2), 331-56.
82. Trombitas, K., Freiburg, A., Centner, T., Labeit, S., y Granzier, H. (1999).
Molecular dissection of N2B cardiac titin's extensibility. Biophys J., 77 (6),
3189-96.
83. Trombitas, K., Wu, Y., Labeit, D., Labeit, S., y Granzier, H. (2001). Cardiac
titin isoforms are coexpressed in the half-sarcomere and extend independently.
Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 281 (4), H1793-9.
84. Van Eickels, M., Grohe, C., Cleutjens, J.P., Janssen, B.J., Wellens, H.J., y
Doevendans, P.A. (2001). 17beta-estradiol attenuates the development of
pressure-overload hypertrophy. Circulation, 104 (12), 1419-23.
85. Wang, K., McClure, J., y Tu, A. (1979). Titin: major myofibrillar components of
striated muscle. Proc Natl Acad Sci., 76 (8), 3698-702.
97
86. Wang X., Ren B., Liu S., Sentex E., Tappia P.S., y Dhalla NS. (2003).
Characterization of cardiac hypertrophy and heart failure due to volume
overload in the rat. J Appl Physiol., 94 (2), 752-63.
87. Warren, C.M., Jordan, M.C., Roos, K.P., Krzesinski, P.R., y Greaser, M.L.
(2003). Titin isoform expression in normal and hypertensive myocardium.
Cardiovasc Res., 59 (1), 86-94.
88. Wilkins, B.J., y Molkentin, J.D. (2002). Calcineurin and cardiac hypertrophy:
Where have we been? Where are we going? J. Physiol., 15, 541 (Pt 1), 1-8.
89. Wilkins, B.J., y Molkentin, J.D. (2004). Calcium-calcineurin signaling in the
regulation of cardiac hypertrophy. Biochem Biophys Res Commun., 322
(4),1178-91.
90. Willenheimer, R., Erhardt, L., Cline, C., Rydberg, E., y Is-raelsson, B. (1998).
Exercise training in heart failure improves quality of life and exercise capacity.
Eur. Heart J., 19, 77481.
91. Wu, Y., Bell, S.P., Trombitas, K., Witt, C.C., Labeit, S., LeWinter, M.M., y
Granzier, H. (2002). Changes in titin isoform expression in pacing-induced
cardiac failure give rise to increased passive muscle stiffness. Circulation., 106
(11), 1384-9.
92. Wu, Y., Tobias, A.H., Bell, K., Barry, W., Helmes, M., Trombitas, K., Tucker,
R., Campbell, K.B., y Granzier, H.L. (2004). Cellular and molecular
mechanisms of systolic and diastolic dysfunction in an avian model of dilated
cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol., 37 (1), 111-9.
93. Zakynthinos, E., Pierutsakos, C.H., Konstantinidis, K., Zakynthinos, S., y
Papadogiannis, D. (2004). Losartan reduces left ventricular hypertrophy
98
proportionally to blood pressure reduction in hypertensives, but does not affect
diastolic cardiac function. Angiology., 55 (6), 669-78.