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Revises em Processos e Tcnicas

Avanadas de Isolamento e
Determinao Estrutural
de Ativos de Plantas Medicinais
Gustavo Henrique Bianco de Souza
Joo Carlos Palazzo de Mello
Norberto Peporine Lopes
ORGANIZADORES
REVISES EM PROCESSOS E TCNICAS
AVANADAS DE ISOLAMENTO E DETERMINAO
ESTRUTURAL DE ATIVOS DE PLANTAS MEDICINAIS
Gustavo Henrique Bianco de Souza
Joo Carlos Palazzo de Mello
Norberto Peporine Lopes
ORGANIZADORES
REVISES EM PROCESSOS E TCNICAS
AVANADAS DE ISOLAMENTO E DETERMINAO
ESTRUTURAL DE ATIVOS DE PLANTAS MEDICINAIS
2012
Reitor | Joo Luiz Martins
Vice-Reitor | Antenor Rodrigues Barbosa Junior
Diretor-Presidente | Gustavo Henrique Bianco de Souza
Assessor Especial | Alvimar Ambrsio
CONSELHO EDITORIAL
Adalgimar Gomes Gonalves
Andr Barros Cota
Elza Conceio de Oliveira Sebastio
Fbio Faversani
Gilbert Cardoso Bouyer
Gilson Ianinni
Gustavo Henrique Bianco de Souza
Carla Mercs da Rocha Jatob Ferreira
Hildeberto Caldas de Sousa
Leonardo Barbosa Godefroid
Rinaldo Cardoso dos Santos
APOIO
.
Dedicatria
A todos os
(co)autores que contribuiram
para a efetivao dessa publicao.
Ao INCT_if/CNPq,
Institutos Nacionais de Cincia e Tecnologia,
pelo estmulo e financiamento.
EDUFOP,
Editora da Universidade
Federal de Ouro Preto.
c EDUFOP
Coordenao Editorial
Gustavo Henrique Bianco de Souza
Projeto Grfico / Capa
Alvimar Ambrsio
Reviso Tcnica
Organizadores e Maria de Ftima Lisboa
Editorao Eletrnica
Autores
Fotografia / Capa
De Laia / UFOP
FICHA CATALOGRFICA
R454 Revises em Processos e Tcnicas Avanadas de Isolamento e Determina-
o Estrutural de Ativos de Plantas Medicinais / Gustavo Henrique
Bianco de Souza ... [et al.] - Ouro Preto : UFOP, 2012.
312p.: il. color.; grafs.; tabs.
Autores: Gustavo Henrique Bianco de Souza, Joo Carlos Palazzo de
Mello e Norberto Peporine Lopes.
1. Farmacognosia. 2. Plantas medicinais. 3. Princpios ativos. 4. Fito-
qumica. I. Souza, Gustavo Henrique Bianco. II. Mello, Joo Carlos Palazzo
de. III. Lopes, Norberto Peporine. IV. Ttulo.
ISBN 978-85-288-0285-6 CDU: 615.32:633.88
Catalogao: sisbin@sisbin.ufop.br
Reproduo proibida Art. 184 do Cdigo Penal e Lei 9.610 de fevereiro de 1998.
Todos os direitos reservados
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Agradecimentos
A todos os
(co)autores que contribuiram para a
efetivao dessa publicao.
Sumrio
SUBSTNCIAS VOLTEIS:
TCNICAS DE EXTRAES DAS
CLSSICAS S AVANADAS
Daniel Petinatti Pavarini
Denise Brentan da Silva
Joo Luis Callegari Lopes
Norberto Peporine Lopes
PROCESSOS DE
OBTENO DE EXTRATOS E
SUBSTNCIAS BIOATIVAS
Camila Gambini Pereira
MTODOS IN SILICO PARA ELUCIDAO
ESTRUTURAL DE SUBSTNCIAS: FUNDAMENTOS,
METODOLOGIAS E APLICAES EM PRODUTOS
NATURAIS E METABOLMICA
Fernando Batista da Costa
Marcus Tullius Scotti
ANLISES DE PRODUTOS DE ORIGEM NATURAL
POR CLAE-RMN
Carlos Alexandre Carollo
Daniel Pecoraro Demarque
APLICAO DA CROMATOGRAFIA LQUIDA
ACOPLADA A TCNICAS ESPECTROMTRICAS NA
ANLISE DE PRODUTOS NATURAIS
Eduardo de Jesus Oliveira
Jos Maria Barbosa Filho
Luiz Eldio Gregrio
15
FRAGMENTAO DE ALCALOIDES
ISOQUINOLNICOS
POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS VIA
IONIZAO POR ELECTROSPRAY
Adrian Martin Pohlit
Carolina Maria Xaubet Olivera
Joo Luis Callegari Lopes
Mrcio Adriano Andreo
Michael Niehues
Norberto Peporine Lopes
APLICAO DA ELETROFORESE
CAPILAR NA ANLISE DE
PRODUTOS NATURAIS
Joo Carlos Palazzo de Mello
Lia Akina Ito
APLICAO DE TCNICAS BIDIMENSIONAIS
DE RMN NA INVESTIGAO DE PRODUTOS NATURAIS
Andersson Barison
Maique Weber Biavatti
CROMATOGRAFIA EM CONTRACORRENTE
Marcelo Aparecido da Silva
Wagner Vilegas
PESQUISADORES
18
SUBSTNCIAS VOLTEIS: TCNICAS DE
EXTRAES DAS CLSSICAS S AVANADAS
Daniel Petinatti Pavarini
Denise Brentan da Silva
Joo Luis Callegari Lopes
Norberto Peporine Lopes
INTRODUO
Os leos essenciais, tambm conhecidos
como leos etreos (em latim, aetheroleum) ou leos
volteis, representam uma pequena frao lipoflica
da composio qumica das plantas. Essa frao,
geralmente, confere os aromas singulares s mais
diversas espcies de plantas, notadamente as
denominadas aromticas. Esses leos so
empregados, rotineiramente, em indstrias
farmacutica, alimentcia e cosmtica, bem como na
aromaterapia. Alm disso, apresentam uma
constituio qumica que pode ser categorizada em
dois tipos:
20
Presena de uma substncia voltil majoritria de teor elevado como, por exemplo, a presena do
1,8-cineol (80%) no leo essencial de eucalipto (Eucalyptus globulus Labill., Eucalyptus fruticetorum F. Muell.
ex Miq. e Eucalyptus smithii F. Muell. ex R.T. Baker segundo a Farmacopeia Europeia) e o anetol (90%) no leo
dos frutos de erva-doce (Pimpinella anisum L.) (SIMES & SPITZER, 2007). As outras substncias que constituem
esses leos podem ser encontradas em quantidades muito baixas (traos).
Misturas complexas de substncias volteis, que podem ser compostas desde poucas at centenas
de substncias contendo diversas funes orgnicas como lcoois, aldedos, cetonas, fenis, xidos, perxidos,
furanos, lactonas, acetais, teres, steres e at mesmo substncias contendo nitrognio e enxofre.
Os principais esqueletos carbnicos que sustentam essa diversidade de funes so, geralmente,
pertencentes a dois grupos:
(a) os terpenoides, que so substncias formadas por unidades isoprnicas (5 carbonos) e classificados
a partir do nmero dessas unidades que os constituem. Os terpenoides, uma das maiores classes de metablitos
em produtos naturais, possuem cerca de 30.000 estruturas descritas (BREITMAIER, 2006) e podem ser do tipo
hemiterpeno, monoterpeno, sesquiterpeno, diterpeno, sesterpeno, triterpeno e tetraterpeno, os quais
possuem 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 40 carbonos (CROTEAU et al., 2000), respectivamente. Porm, nos leos
essenciais esto presentes substncias mais volteis como os monoterpenos e sesquiterpenos.
(b) os derivados aromticos, que so, principalmente, representados pelos derivados fenilpropanoides.
Esses ltimos so esqueletos aromticos biossintetizados a partir da via do cido chiqumico e possuem uma
cadeia alqulica lateral (C
6
-C
3
) como, por exemplo, o isoeugenol, anetol e estragol (Figura 1).
HO
O

Isoeugenol
O

Anetol
O

Estragol
FIGURA 1 | Estruturas qumicas de alguns derivados fenilpropanoides
A produo e liberao de substncias volteis pelas plantas tm relao com as interaes dessas
com outros organismos vivos, como tambm devido influncia de fatores biticos e abiticos (SCHULTZ,
2002; DUDAREVA et al., 2004). Neste contexto, podemos citar algumas funes ecolgicas atribudas a essas
substncias volteis tais como: a inibio de germinao (efeito aleloptico) assim como ocorre no chaparral
californiano entre Salvia leucophylla Greene e Artemisia californica Less.

(HARBORNE, 1993a), atrao de
polinizadores e proteo. Este ltimo evidenciado, por exemplo, pelo efeito deterrente do epxido de
cariofileno em formigas (HARBORNE, 1993b).
O estabelecimento do perfil das substncias volteis, de forma geral, envolve duas etapas fundamentais;
a extrao e a anlise. A extrao pode ser realizada por diversas tcnicas como a hidrodestlilao, prensagem,
21
enfleurage, extrao com solventes e por fluido super crtico (SIMES & SPITZER, 2007). Alm dessas tcnicas
de extraes convencionais, tambm h outras tcnicas mais recentes, designadas de no convencionais e
que possuem alta capacidade de concentrao, como a microextrao em fase slida (SPME, Solid Phase
Microextraction), SBSE (Stir Bar Sorptive Extraction), STE (Sorptive Tape Extraction), SPDE (Solid Phase Dynamic
Extraction) entre outras (BICCHI et al., 2008).
A composio da frao voltil pode ser diferente dependendo do mtodo de extrao selecionado,
sendo que atualmente h uma tendncia na miniaturizao das tcnicas de preparo da amostra e tambm a
utilizao de tcnicas que extraiam as substncias o mais prximo do real perfil qumico encontrado no
vegetal para, por exemplo, estudos de ecologia qumica (STASHENKO et al., 2004). Convm ressaltar que
neste contexto mundial de crise ambiental e modelo econmico que prima pela constante diminuio de
custos e tempo no processo produtivo, ainda tem conduzido s pesquisas de mtodos de extrao mais
eficientes que utilizem pouco ou nenhum solvente orgnico e pouco tempo para a extrao (SAHRAOUI et al.,
2008).
A anlise (segunda etapa) das substncias volteis tem sido realizada, principalmente, por meio da
tcnica de cromatografia gasosa (GC, Gas Chromatography) acoplada a detectores como FID (Flame Ionization
Detector), MS (Mass Spectrometry), IR (Infrared Spectroscopy) entre outros (BONATO, 2006). Convm destacar
tambm os avanos nessa etapa de anlise, pois essas permitem anlises cada vez mais rpidas e com alta
resoluo cromatogrfica, o que resulta em alta produtividade e reduo dos custos por anlise. Como
exemplo, tem-se o Fast-GC, Ultra Fast-GC (BICCHI et al., 2004a) e GC bidimensional (GCxGC) (PEDROSO et al.,
2009), nesse ltimo pode ser utilizado uma coluna cromatogrfica, em uma das dimenses, para a separao
de enatimeros, o que permite analisar a composio enantiomrica de cada pico cromatogrfico (CORDERO
et al., 2006; PEDROSO et al., 2009).
PROCEDIMENTOS DE EXTRAO
O procedimento de extrao determinante na composio qumica do leo, o que tambm reflete
em suas caractersticas odorferas. Diante disto, a indstria utiliza esse critrio para otimizao do processo de
extrao, como tambm a obteno do maior rendimento possvel. Por outro lado, houve um grande avano
nas tcnicas realizadas em microescalas com alta capacidade de concentrao, o que , demasiadamente,
importante para o estabelecimento do perfil qumico dos volteis o mais prximo do emitido pelas espcies
vegetais, j que esse se faz necessrio para o estudo das relaes qumico-ecolgicas, pois essa frao voltil
emitida considerada um importante biosensor (DUDAREVA et al., 2004).
PROCESSOS CONVENCIONAIS
Os processos de extrao de leos que envolvem a hidrodestilao, enfleurage, prensagem e extrao
com solventes so considerados mtodos clssicos, porm, atualmente, foram desenvolvidas algumas
modificaes nessas metodologias com o intuito de se obter produtos finais com maiores rendimentos e
qualidade.
22
A enfleurage ou enflorao um processo milenar de extrao em fase slida utilizando gordura
animal ou vegetal. Em geral, ela empregada na extrao de volteis de flores que so termicamente
instveis e altamente volteis. Essa tcnica apresenta um baixo rendimento, porm resulta em um produto
final de alta qualidade e de aroma peculiar, o que reflete em produtos de alto valor comercial. Por esta razo,
ainda utilizada na extrao dos leos volteis para a produo de perfumes como, por exemplo, a partir das
flores de jasmim (Jasminum officinale L. e Jasminum sambac Soland. ex Ait.) na Frana e Itlia (HOLMES,
1998), como tambm de flores de lrio no Brasil.
A extrao por presso (prensagem) ainda bastante utilizada em indstrias devido ao seu alto
rendimento. Entretanto, esta tcnica de extrao pouco seletiva e em muitos casos podem produzir leos
com altos teores de substncias no volteis, impurezas e lipdios. Essa metodologia de extrao
rotineiramente empregada na obteno de leos de frutas ctricas (BAKKALI et al., 2008), sendo importante
destacar que o Brasil o maior exportador do leo de laranja (Citrus sinensis (L.) Osbeck), o qual obtido por
essa tcnica (BIZZO et al., 2009).
A extrao com solventes orgnicos realizada com solventes de baixa polaridade. Assim, os produtos
obtidos possuem desde substncias volteis e no volteis at substncias lipdicas em sua composio,
sendo denominadas de leos fixos ou concretos. Apesar desse tipo de extrao ter alto rendimento, no a
metodologia mais utilizada em escala industrial, pois geram produtos com muitas impurezas e resduos de
solventes, o que expresso em seus baixos valores comerciais (FERHAT et al., 2007; BIZZO et al., 2009).
J a extrao por arraste a vapor, como a hidrodestilao, a principal metodologia empregada na
obteno de leos essenciais, porm ocorre a trivial formao de artefatos, j que essa realizada em meio
aquoso e com elevadas temperaturas, o que pode promover reaes de hidrlise, rearranjos, isomerizaes
e oxidaes. Alm dessa desvantagem, podem ocorrer perdas de substncias altamente volteis, de baixo
peso molecular ou daqueles que esto em pequenas quantidades nas matrizes vegetais, como tambm essa
metodologia requer um longo tempo para a extrao, o que reflete na produtividade. Consequentemente,
esse tempo excessivo conduz em elevados custos para a realizao desse tipo de extrao em escala industrial,
devido ao grande consumo energtico. A grande parte desse consumo baseada em uma matria-prima no
renovvel e o desenvolvimento de tcnicas mais rpidas e eficientes de extrao contribuir na sustentabilidade
ambiental, o que resulta em estmulos para a realizao de pesquisas nesta rea visando busca de tcnicas
com menor consumo de solvente, tempo e energia.
O aparelho de Clevenger utilizado no processo de obteno de leos por hidrodestilao, mas
tambm j foram propostas algumas modificaes nesse tipo especial de vidraria (AKISUE, 1986). Quando
comparamos as Farmacopeias Europeia, Britnica e a dos Estados Unidos, possvel verificar que esse modelo
frequentemente modificado, visando melhores condies operacionais. Ressalta-se que estas diferenas
so, em sua maioria, devido s caractersticas que cada material pode apresentar como, densidade, volatilidade,
viscosidade e carter qumico.
Os produtos obtidos a partir da hidrodestilao possuem em suas composies altos teores de
monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanoides, os quais so os principais responsveis pelas caractersticas
odorferas dos leos essenciais. Alm do mais, esses leos podem ser analisados por injeo direta no
cromatgrafo a gs, ou seja, no requerem uma etapa prvia de purificao (clean-up) (SANTOS et al., 2001;
23
KHAJEH et al., 2004; BIZZO et al., 2009). Porm, convm destacar que o leo essencial obtido por esta
metodologia discrepante do real perfil qumico encontrado nas espcies vegetais e do emitido por elas.
Essa constatao confirmada na comparao entre os cromatogramas das anlises por GC-MS dos leos
essenciais de Bidens sulphurea (Cav.) Sch. Bip. obtidos por hidrodestilao e por SPME (Figuras 5 e 7).
Em virtude do grande tempo necessrio para extrao do leo essencial por hidrodestilao, podem
ser realizadas hidrodestilaes com o auxlio de micro-ondas, sendo denominado de MAHD (Microwave-
Assisted Hydrodistillation) (STASHENKO et al., 2004; PRESTI et al., 2005; WANG et al., 2006). Entretanto,
mais recentemente a extrao por auxlio de micro-ondas vem sendo realizada somente com o material
fresco (sem adio de gua) com a denominao de MSD (Microwave Steam Distillation) para a obteno
da frao voltil (LUCCHESI et al., 2004; FERHAT et al., 2006; SAHRAOUI et al., 2008; ). Nos estudos dos
volteis das flores de lavanda (Lavandula angustifolia Mill.), foi possvel verificar o mesmo rendimento e
perfil qumico

quando se comparou o leo obtido por arraste a vapor e MSD (SAHRAOUI et al., 2008; FARHAT
et al., 2009). Alm disso, os custos e o impacto ambiental foram, consideravelmente, reduzidos quando se
utilizou a MSD j que o tempo requerido para a extrao foi menor. Ainda, segundo neste estudo, tendo
como fonte de energia o carvo mineral ou ainda os combustveis fsseis, de forma geral, a emisso de CO
2
na atmosfera seria 80% menor, enquanto o rejeito de gua seria ainda 85% menor quando se utiliza a MSD.
Essa maior eficincia no processo de extrao atribuda ao coeficiente de transferncia de massa, pois
esse , aproximadamente, seis vezes maior na MSD (FARHAT et al., 2009).
Dentre as principais vantagens da extrao por MSD, pode-se ressaltar a significativa reduo do
tempo de extrao e a ausncia de solventes, inclusive gua, o que pode refletir na reduo da formao
de artefatos (LUCCHESI et al., 2004; FERHAT et al., 2006; DENG et al., 2006). As anlises qumicas dos leos
essenciais extrados por hidrodestilao e MSD das cascas da laranja revelaram apenas pequenas alteraes
nas composies qumicas desses leos, mas no foram observadas diferenas em suas constantes fsicas.
Entretanto, a anlise das cascas, aps os processos de extrao por de microscopia eletrnica de varredura,
revelaram significativas diferenas. Esses resultados demonstraram que ocorre a ruptura de clulas e glndulas
do material vegetal mais rapidamente quando utilizado o micro-ondas (FERHAT et al., 2006).
Alm das tcnicas descritas, tambm h a extrao e destilao simultneas (SDE, Simultaneous
Distillation-Extraction) que foi introduzida por Likens e Nickerson em 1964 e combina destilao a vapor e
extrao com um ou mais solventes. Esse tipo de extrao possui alta eficincia e reprodutibilidade, a qual
realizada em uma nica etapa para a extrao da frao voltil, sendo amplamente empregada apesar de
ainda haver a possibilidade de formao de produtos de degradao (CHAINTREAU, 2001).
As principais vantagens da SDE consistem na reduo do tempo de extrao e na utilizao de
volume reduzido de solventes orgnicos, como tambm permite a obteno de um produto final livre de
materiais no volteis (cidos graxos, clorofila e outros) podendo ser analisado atravs de injeo direta no
cromatgrafo gasoso

(JAYATILAKA et al., 1995; CHAINTREAU, 2001; DIAZ-MAROTO et al., 2005; TEIXEIRA
et al., 2007). Esse prottipo tem sido modificado atravs do tempo visando diversificar as aplicaes, as
quais chegaram, por exemplo, a serem usadas na indstria de aromas na forma proposta por Godefroot e
colaboradores (1981).
24
Extrao por fluido supercrtico
A extrao por fluido supercrtico (SFE, Supercritical Fluid Extraction) uma tcnica bastante antiga,
apesar de ainda ser considerada recente no Brasil devido a sua lenta difuso no pas. Essa extrao emprega
um gs como solvente, porm esse mantido acima de sua temperatura e presso crticas, tornando-se um
fluido supercrtico que exibe caractersticas peculiares, como baixa viscosidade, alta densidade e difuso
intermediria entre gases e lquidos que variam com a densidade (MAUL, 1999; MAUL et al., 1996). Logo, os
fluidos supercrticos exibem maiores taxas de transferncia de massa para a extrao a partir de uma matriz,
quando comparados com as extraes que empregam solventes orgnicos, consequentemente resultam em
maiores rendimentos (HERRERO et al., 2010).
Atualmente, a utilizao da SFE em escala industrial extensamente aplicada e teve incio na dcada
de 1970, na Alemanha, para a remoo da cafena do caf (ANKLAM & MLLER, 1995). Alm dessa aplicao
comercial, tambm incluem a remoo da nicotina do tabaco (Nicotiana tabacum L.) na produo de cigarros
light (KERROLA, 1995), obteno de carotenos da cenoura (VEJA et al., 1996), leos essenciais (REVERCHON,
1997), extraes de plantas para a utilizao em indstrias farmacuticas (KERROLA, 1995) e muitas outras
(HERRERO et al., 2010).
As indstrias farmacuticas, alm do emprego da SFE para obteno de extratos, tambm utilizam
esta tcnica em diversos procedimentos, como na purificao de excipientes (ASHRAF-KHORASSANI et al.,
2005), produo de lipossomas (MEURE et al., 2008), separaes enantiosseletivas (KESZEI et al., 1999; IZAKE,
2007), purificao de substncias a partir do meio reacional e muitas outras (HERRERO et al., 2010).
A presena de substncias termolbeis nos leos essenciais chama a ateno para o uso de tcnicas
que trabalhem a baixas temperaturas, como a SFE, para se evitar a possibilidade de reaes que comprometam
a integridade qumica das substncias como oxidaes, hidrlises e esterificaes (PEREIRA & MEIRELES,
2007). Neste ponto, convm destacar que no cenrio atual de crescente desenvolvimento industrial e
econmico, tambm h a exigncia da utilizao de processos que minimizem os danos ambientais, o que
ressalta a SFE j que essa tcnica utiliza gases como solventes e so designados de processos tecnolgicos
limpos (HUIE, 2002). Porm, um grande problema dessa tcnica a viabilidade econmica, pois os
equipamentos ainda possuem altos custos.
Alm das baixas temperaturas utilizadas na SFE para extrao, tambm se podem ressaltar muitas
outras vantagens dessa tcnica, como a reutilizao dos solventes j que os fluidos supercrticos voltam ao
estado gasoso em condies de presso normal e temperatura ambiente, o que tambm resulta na obteno
de produtos de alto valor agregado, pois esses so livres de resduos txicos de solventes orgnicos.
A maioria dos gases utilizados na SFE so inertes e seguros, como o CO
2
, um dos gases mais,
amplamente, difundidos em SFE, pois esse exibe uma srie de caractersticas interessantes. Dentre essas est
a sua baixa temperatura crtica, grande versatilidade, baixo custo, no inflamvel e possui presso crtica
baixa, o que facilita sua utilizao em escala industrial (LANAS, 2002).
Alm do CO
2
, muitos outros gases podem ser utilizados em SFE, como nitrognio (N
2
), metano (CH
4
),
etano (C
2
H
6
), xido nitroso (N
2
O), hexafluoreto de enxofre (SF
6
) dentre outros. Entretanto, mais de 90% dos
procedimentos utilizam o CO
2
, devido a suas vantagens analticas j enumeradas, anteriormente, e por ser
altamente seguro, pois no inflamvel (POURMORTAZAVI & HAJIMIRSADEGHI, 2007). O CO
2
possui carter
lipoflico e por esta razo os extratos produzidos a partir desse gs so ricos em substncias apolares e
25
apresentam composies qumicas similares aos dos leos essenciais, porm de maior qualidade e com
menor quantidade de produtos de degradao (HAN et al., 2009).
Em contrapartida, pode-se facilmente alterar a seletividade dos fluidos supercrticos para se obter
produtos enriquecidos com as substncias de interesse e/ou alterar a polaridade do solvente extrator (fluido
supercrtico) para a obteno de substncias de mdia at alta polaridade. Essa seletividade pode ser facilmente
modificada pela alterao da temperatura e presso, assim como sua polaridade que pode ser alterada pela
adio de cossolventes como, por exemplo, metanol, etanol e gua (ZANCAN et al., 2002; HERRERO et al.,
2010).
A prtica de adio de modificadores, denominados de cossolventes, amplamente disseminada
para a adequao da polaridade dos solventes extratores frente s substncias de interesse. Dessa maneira,
possvel a extrao de alcaloides (LING et al., 2007), metais (KERSCH et al., 2000; POURMORTAZAVI et al.,
2004), flavonoides no glicosilados (LIN et al.; 1999; PENG et al., 2006) e at mesmo de substncias glicosiladas
(MORAES et al., 1997; SCALIA et al., 1999).
PROCEDIMENTOS PARA MICROEXTRAES (TCNICAS COM ALTA
CAPACIDADE DE CONCENTRAO)
As tcnicas mais recentes, que sero descritas neste texto, consistem daquelas com alta capacidade
de concentrao dos analitos extrados a partir de uma matriz. Essas tcnicas, em sua grande maioria, podem
ser utilizadas nas extraes das substncias de duas maneiras: do headspace ou de forma direta. Essa ltima
envolve o contato direto do componente extrator com a matriz que contm os analitos a serem extrados. J
na extrao dos analitos a partir do headspace, esses devem ser, necessariamente, substncias de mdia a alta
volatilidade, pois a tcnica de extrao vai capturar essas substncias quando as mesmas estiverem volatilizadas.
Todos os recentes avanos, nessas tcnicas de alta capacidade de concentrao, a partir do headspace,
so de extrema relevncia nos estudos das substncias volteis produzidas pelas plantas. Alm dessas no
utilizarem solventes, tambm so capazes de extrair as substncias, at mesmo as altamente volteis, utilizando
apenas uma pequena quantidade de amostra vegetal e de maneira cada vez mais eficiente e rpida. Portanto,
essas caractersticas permitem que essas tcnicas sejam empregadas na anlise da frao voltil emitida pela
planta, j que modificaes nesses constituintes so importantes no diagnstico de alteraes no metabolismo
e ajudam a esclarecer questes relacionadas com a biossntese e ecologia (THOLL et al., 2006; DUDAREVA et
al., 2006).
Essas tcnicas de extrao, a partir do headspace, ainda podem ser divididas em duas categorias:
esttica e dinmica. Muitas dessas tcnicas j podem ser realizadas de forma simples e automatizadas, o que
facilita o emprego delas como tcnicas rotineiras para anlises de fraes volteis nos laboratrios (VITENBERG,
2003). Os avanos das tcnicas dinmicas foram de suma importncia, pois elas podem aumentar a velocidade
das extraes, alm de serem capazes de extrair as substncias de forma mais eficiente, principalmente em
termos quantitativos, o que pode permite em muitos casos o uso ainda de menores quantidades de amostras
vegetais (BICCHI et al., 2008).
26
Diante do exposto, apenas ser descrita uma reviso de tcnicas mais utilizadas na condio de
extrao das substncias a partir do headspace, pois neste captulo so abordadas questes apenas relacionadas
s substncias volteis.
Microextrao em fase slida (SPME)
A microextrao em fase slida (SPME, SPME, Solid Phase Micro-Extraction) uma tcnica que utiliza
uma fase extratora slida (polmero ou slido adsorvente) e permite a realizao de extraes em microescala
de maneira muito eficiente. Logo, essas extraes em microescala apresentam grandes vantagens, como a
no utilizao de solventes orgnicos e a rpida velocidade de extrao, o que viabilizaria a realizao de
repetidos experimentos e assim facilita os estudos quantitativos.
Dessa maneira, a SPME uma tcnica baseada na absoro ou adsoro de analitos em uma fibra de
slica fundida revestida por um polmero, a qual existe disponvel comercialmente com variados polmeros de
diferentes afinidades (VALENTE & AUGUSTO, 2000) (Figura 2). Aps a extrao dos analitos, a fibra mantida
exposta na cmara de injeo do cromatgrafo gasoso para que ocorra a dessoro trmica dos analitos e
carreao desses para a coluna cromatogrfica para a devida separao e deteco (Figura 3).
A tcnica SPME foi desenvolvida por Pawliszyn e colaboradores (1990) e desde ento a sua utilizao
vem crescendo cada vez mais. Alguns artigos de reviso sobre essa tcnica abordam as teorias, fundamentos
e aplicaes da SPME, sendo esses excelentes fontes para o estudo sobre esta tcnica de extrao (LOUGH et
al., 1992; VALENTE & AUGUSTO, 2000; VAS & VKEY, 2004; HAKKARAINEN, 2007).
O processo da SPME combina o isolamento dos analitos a partir de uma matriz, concentrao e
introduo dos analitos no cromatgrafo gasoso (ZHANG & PAWLISZYN, 1993). Essa tcnica vem sendo
amplamente empregada em anlises do meio ambiente (48%), alimentos e botnica (33%) e nas reas clnica
e forense (19%) (STASHENKO & MARTNEZ, 2007).

FIGURA 2 | Extrao por SPME a partir do headspace e detalhe da fibra
27

FIGURA 3 | Dessoro trmica da fibra de SPME no cromatgrafo gasoso. A:
insero do amostrador de SPME no injetor aquecido, B: exposio
da fibra de SPME para a dessoro das substncias extradas, C:
remoo do amostrador do injetor.
A SPME , extensivamente, aplicada no estudo de aromas, ou seja, das substncias volteis, j que
essa metodologia simples, rpida, no necessita de solventes, requer apenas uma pequena quantidade de
material vegetal, alm de minimizar a perda de substncias altamente volteis (VAS & VKEY, 2004; STASHENKO
& MARTNEZ, 2007; BICCHI et al., 2008). Como exemplos dessas aplicaes, podem-se enumerar as anlises
dos volteis de oito espcies vegetais brasileiras por Sartoratto e Augusto (2003) e o estudo dos aspectos
cinticos e termodinmicos da produo das substncias volteis de Capsicum annuum L. durante o
aquecimento (CREMER & EICHNER, 2000).
Em relao a muitos dos procedimentos convencionais de extrao, a SPME revela muitas vantagens
como a ausncia de solventes orgnicos, a necessidade de apenas uma pequena quantidade de material
vegetal, a extrao de substncias minoritrias e de alta volatilidade, alm do tempo de anlise ser menor,
mantendo e/ou melhorando a sensibilidade e reprodutibilidade. A SPME tambm evita a modificao qumica
e produo de artefatos, como tambm a perda de substncias altamente volteis que podem ocorrer nos
mtodos convencionais de extrao dos leos essenciais (STASHENKO & MARTNEZ, 2007).
28
A fim de exemplificar essas diferenas nos perfis qumicos dos volteis extrados por uma tcnica
convencional e a SPME, foram realizadas anlises dos volteis oriundos das partes areas e flores de
Bidens sulphurea (Cav.) Sch. Bip. obtidos por hidrodestilao e SPME (a partir do headspace). Esses
componentes volteis foram analisados por GC-MS e identificados atravs da comparao de seus
espectros de massas com os espectros do banco de dados do aparelho cromatogrfico e dos ndices de
reteno calculados a partir da srie homloga de hidrocarbonetos n-alcanos (ADAMS, 1995).
Aps essas anlises, foi possvel observar distintas variaes nos perfis qumicos dos volteis obtidos
pelas duas tcnicas, como pode ser verificado nas comparaes entre os cromatogramas (Figuras 5 e 7). Uma
diferena significativa nessas anlises a presena dos monoterpenos (substncias relativas aos picos
cromatogrficos 1 a 5 da Figura 5 e dos picos 2 a 4 e 6 da Figura 7), os quais estavam presentes somente na
extrao realizada por SPME. Isso se deve ao fato dessas substncias serem altamente volteis, alm de serem
componentes minoritrios da frao voltil, o que contribui para a perda dessas substncias durante o processo
de extrao do leo essencial por hidrodestilao.
As substncias 1 a 5 das anlises dos constituintes volteis das partes areas de B. sulphurea
correspondem aos monoterpenos sabineno, -pineno, -mirceno, pseudolimoneno e -felandreno,
respectivamente. J as substncias 2-4 e 6 oriundas das anlises das flores de B. sulphurea correspondem aos
monoterpenos (Z)-ocimeno, (E)-ocimeno, -linalol e allo-ocimeno (Figura 4).




Sabineno -Pineno -Mirceno Pseudolimoneno


OH


-Felandreno (Z)--Ocimeno -Linalol Allo-ocimeno

FIGURA 4 | Estruturas dos monoterpenos identificados a partir das partes
areas e flores de Bidens sulphurea por SPME/GC-MS.
29
FIGURA 5 | Cromatogramas obtidos nas anlises por GC-MS dos
componentes volteis das partes areas de Bidens sulphurea
obtidos por hidrodestilao e SPME (fibra de PDMS 100 )
(Condies cromatogrficas: split 1/20 (250 C), DB-5MS (30 m x
0,25 mm x 0,25 m, fluxo 1,41 mL/min, presso 87,1 kPa, 60-240
o
C a 3
o
C/min)
O bicicloelemeno (pico 9 da Figura 5 e pico 11 da Figura 7) foi detectado apenas na extrao por
SPME (Figura 6). Esse sesquiterpeno estava presente em quantidades significativas e no foi detectado se
quer na quantidade de trao nos leos essenciais obtidos por hidrodestilao. Isso indica uma possvel
degradao dessa substncia, juntamente com a perda de parte dessa por volatilizao, j que a tcnica de
hidrodestilao demasiadamente agressiva e utiliza altas temperaturas para a realizao da extrao.
Entretanto, as substncias majoritrias se mantiveram as mesmas em ambos os processos de extrao.
Nas partes areas (Figura 5) so os sesquiterpenos: -elemeno (pico 16), -cariofileno (pico 18), germacreno
D (pico 27) e biciclogermacreno (pico 29). J nas flores (Figura 7) so os sesquiterpenos: -cariofileno (pico
20), germacreno D (pico 28), biciclogermacreno (pico 30) e (E,E)--farneseno (pico 32).
Convm ressaltar que algumas substncias oriundas das partes areas e flores de B. sulphurea,
principalmente aquelas que se encontram em propores significativas, foram observadas somente quando
realizadas as extraes por SPME. Algumas dessas substncias, oriundas das partes areas, so: bicicloelemeno
(pico 9), -gurjuneno (pico 20), allo-arodendreno (pico 23) e valenceno (pico 30). A partir das flores so os
seguintes constituintes: bicicloelemeno (pico 11), allo-arodendreno (pico 24) e valenceno (pico 31).
30

H
H

H
H


Germacreno D -Cariofileno Biciclogermacreno Valenceno

H

H
H

H

(E,E)--Farneseno -Elemeno -Cadineno Bicicloelemeno

FIGURA 6 | Estruturas de alguns dos sesquiterpenos identificados a partir das
partes areas e flores de Bidens sulphurea por GC-MS.
FIGURA 7 | Cromatogramas obtidos nas anlises por GC-MS dos
componentes volteis das flores de Bidens sulphurea obtidos por
hidrodestilao e SPME (fibra de PDMS 100 ) (Condies
cromatogrficas: split 1/20 (250 C), DB-5MS (30 m x 0,25 mm x
0,25 m, fluxo 1,41 mL/min, presso 87,1 kPa, 60-240
o
C a 3
o
C/
min)
31
Alm do descrito at agora, tambm foi possvel observar uma maior incidncia de sesquiterpenos
oxigenados no leo obtido por hidrodestilao das partes areas (substncias correspondentes aos picos 37
a 52), podendo essas substncias serem produtos de degradao gerados durante o processo de extrao.
Essa extrao tambm foi realizada com uma fibra mais polar (Carbowax/Divinilbenzeno, CW/DVB) e com
temperaturas mais altas para verificar a extrao desses constituintes oxigenados. Porm, essas mesmas
substncias no foram visualizadas, o que um indcio de que muitos dos sesquiterpenos oxigenados
identificados no leo essencial de B. sulphurea podem ser artefatos.
O mecanismo de extrao da SPME baseado no fenmeno de absoro ou adsoro dependendo
do tipo de material da fibra, sendo esse ltimo, por exemplo, um fenmeno que ocorre em fibras de carboxen
(slido poroso de carvo ativo microparticulado) e o primeiro em fibras de PDMS (polidimetilsiloxano) e PA
(poliacrilato). Esse filme (polmero ou slidos porosos dispersos em matrizes polimricas), que recobre um
basto de slica fundida, pode ter diferentes espessuras (7 m a 100 m) (VALENTE & AUGUSTO, 2000) (Figura
2), afinidades qumicas e polaridades. As fibras disponveis comercialmente, as quais se encontram sumarizadas
na Tabela 1, podem ser utilizadas com amostradores (holder) manuais para a realizao das extraes ou para
sistemas totalmente automatizados com interfaces para o cromatgrafo gasoso ou no caso de substncias
polares acoplados para o cromatgrafo lquido de alta eficincia. Porm, neste captulo apenas sero abordadas
as fibras utilizadas para anlises de volteis em cromatgrafo gasoso.
A otimizao dos parmetros que influenciam nas extraes com a SPME so fundamentais para a
anlise dos volteis, pois desta forma possvel realizar anlises com superiores reprodutibilidade e
sensibilidade, alm de um menor tempo de extrao. Assim, de grande relevncia a seleo do tipo de
recobrimento da fibra, os estudos de cintica para se atingir o equilbrio, bem como a otimizao da dessoro
dessas substncias na cmara de injeo do cromatgrafo.
Os fundamentos que esta tcnica se baseia so os princpios de cintica de transferncia de massa
entre fases e de termodinmica (descrio do equilbrio de partio). Portanto, a resistncia a transferncias
de massas devem ser vencidas at que o ponto de equilbrio seja atingido. Logo, em um sistema trifsico,
conforme ilustrado na figura 2, as transferncias de massas vo depender do equilbrio entre as trs fases
(matriz-headpace e headspace-fibra), como tambm do coeficiente de difuso dos analitos a serem extrados
e as dimenses das fases utilizadas (VALENTE & AUGUSTO, 2000; VAS & VKEY, 2004).
Portanto, o ideal selecionar o tipo de recobrimento (afinidade), a espessura do filme para os analitos
a serem extrados, como tambm a temperatura e o tempo de extrao, agitao do sistema, pH da amostra,
fora inica e o tipo de frasco utilizado, j que todos esses aspectos influenciam a eficincia da extrao
(VALENTE & AUGUSTO, 2000; VAS & VKEY, 2004).
32
Tabela 1. Tipos de fibras de SPME disponveis comercialmente para GC
L
f
: espessura do recobrimento; T: temperatura mxi ma recomendada para dessoro trmica; PDMS:
polidimetilsiloxano; PA: poliacrilato; CAR: Carboxen; CW: Carbowax; PEG: polietilenoglicol
O tipo de recobrimento da fibra pode alterar de maneira significante o perfil das substncias extradas,
j que a constante de distribuio do analito na fibra um fator importante na transferncia de massas entre
esses sistemas, o que afeta diretamente a sensibilidade. Assim, substncias volteis mais polares so melhores
extradas quando se utilizam fibras mais polares (GRECKI et al., 1999, WARDENCKI et al., 2004, 2007) como,
por exemplo, foi observado nas anlises dos volteis do caf (ROBERTS et al., 2000).
As fibras com recobrimentos de menores espessuras so recomendadas para as anlises rpidas e na
extrao de substncias que possuem pontos de ebulies altos, pois dessa maneira a extrao e dessoro
so mais rpidas. Entretanto, convm ressaltar que apesar da reduo dos tempos das extraes, a quantidade
de material extrado menor devido a esse menor volume de recobrimento e isso pode acarretar problemas
de sensibilidade do mtodo (GRECKI et al., 1999; WARDENCKI et al., 2007).
O tipo de frasco (vial) utilizado tambm reflete na eficincia da extrao, pois o estabelecimento do
equilbrio atingido mais rapidamente em frascos com reduzidos volumes de headspace. Geralmente,
utilizam-se frascos vedados e com amostra at a metade de sua capacidade. Esta relao entre a reduo do
headspace e a eficincia na extrao foi verificada, por exemplo, no estudo realizado por Yang e Peppard
(1994).
Alm dos parmetros j descritos, o aumento da fora inica e do pH da amostra tambm influenciam
a eficincia da extrao. No primeiro caso, a adio de sais causa uma reduo da solubilidade das substncias
apolares facilitando a passagem dessas para a fase de vapor, assim o tempo de equilbrio pode ser minimizado
Composio qumica Tipo L
f
( m) T (C) Aplicaes
PDMS Apolar 7, 30, 100 280 Volteis e apolares
PA Polar 85 320
Semivolteis e polares
(mdia a alta)
PDMS/DVB Bipolar 60, 65 270
Volteis e no volteis
de baixa a alta
polaridade
CAR/PDMS Bipolar 75, 85 320 Volteis e gases
CW/DVB Polar 65, 70 265
Volteis de mdia a
alta polaridade
CW/PEG Polar 60 330
Volteis e polares
(mdia a alta)
DVB/PDMS/CAR Bipolar 50/30 270
Volteis e substncias
de peso molecular
entre 40 e 275
Carbopack-Z Polar 15 340
Volteis, gases e
substncias leves
33
(YANG & PEPPARD, 1994). Esse recurso muito utilizado nas determinaes de resduos de pesticidas (BOY-
BOLAND & PAWLISZYN, 1995; HWANG & LEE, 2000), de componentes de aromas (MESTRES et al., 2000;
FITZGERALD et al., 2000) e de resduos de solventes em produtos farmacuticos (LEGRAND et al., 2003). J no
segundo caso, a alterao do pH pode ser utilizada em casos de misturas contendo substncias de carter
cido e bsico, pois essas substncias, dependendo do pH, podem estar na forma inica e favorecer a
volatilizao das substncias no inicas (BUCHHOLZ & PAWLISZYN, 1994).
Com relao agitao da amostra, esta uma prtica tambm muito comum devido a sua simplicidade,
principalmente a agitao magntica. Essa prtica reduz, consideravelmente, os tempos de extrao, pois
facilita a difuso dos analitos. Entretanto, importante ressaltar que a capacidade de extrao da fibra no
alterada (VALENTE & AUGUSTO, 2000; WARDENCKI et al., 2007).
Outro fator que influencia, consideravelmente, a eficincia da pr-concentrao dos analitos a
temperatura de extrao. O aumento da temperatura facilita a difuso dos analitos e sua volatilizao o que
reflete na minimizao do tempo das extraes, mas uma elevao excessiva da temperatura pode conduzir
a dessoro precoce dos analitos da fibra. Portanto, a temperatura adequada para a extrao depender da
composio da matriz, do tipo de seus constituintes e do tipo de fase extratora da fibra (ZHANG & PAWLISZYN,
1993; VALENTE & AUGUSTO, 2000; WARDENCKI et al., 2004, 2007).
Outras tcnicas para microextraes
Extrao sortiva em tubo
Com o intuito de reduzir alguns problemas da SPME, principalmente aqueles relacionados com a
sensibilidade, fragilidade e falta de flexibilidade da fibra, foi desenvolvida uma tcnica denominada de INCAT
(Inside Needle Capillary Adsorption Trap) por McComb e colaboradores (1997). Essa tcnica consiste de uma
agulha capilar revestida internamente por um polmero (fase extratora) e acoplada a uma seringa, a qual foi
utilizada na anlise de misturas complexas de substncias oriundas de produtos de derivados de petrleo
(SHOJANIA et al., 1999).
Posteriormente, um dispositivo muito semelhante ao descrito acima foi disponibilizado
comercialmente pela Chromtech em 2000 (MUSSHOFF et al., 2002) sob a denominao de SPDE (Solid-Phase
Dynamic Extraction). Esse ltimo consiste em uma agulha de ao-inox (5,5 ou 7,5 cm) com um revestimento
interno de fase extratora (filme de 50 m e volume de 4,5 L) acoplada com uma seringa (2,5 mL), (Figura 8).
Durante o processo de extrao, os analitos so retidos no polmero que reveste a parede interna
dessa agulha e o ar (headspace) passado por essa agulha atravs do movimento do mbolo (RIDGWAY et al.,
2006). Aps essa extrao, as substncias so termicamente dessorvidas e conduzidas para o interior do
cromatgrafo gasoso por um gs carreador para poderem ser separadas e detectadas (Figura 9). Convm
destacar, que j h comercialmente disponveis interfaces entre SPDE e o cromatgrafo gasoso ou o lquido
de alta eficincia. Portanto, essas extraes e anlises podem ser realizadas de maneira automatizada, o que
facilita a sua realizao nos laboratrios como uma tcnica de rotina, alm de sua maior preciso.
Alguns parmetros devem ser otimizados como a temperatura de extrao, o volume aspirado, o
nmero e a velocidade das aspiraes, o tipo de fase extratora (revestimento interno da agulha), volume e
34
a velocidade do gs empregado na dessoro, pois todos esses parmetros citados influenciam a eficincia
das extraes por SPDE (Mccomb et al., 1997; TAN et al., 1999; RIDGWAY et al., 2006; JOCHMANN et al.,
2007).

FIGURA 8 | Comparao entre SPME e SPDE

FIGURA 9 | Extrao por SPDE (A) e dessoro trmica no injetor do
cromatgrafo gasoso (B)
35
O volume da fase extratora na SPDE aproximadamente de 4,5 L, o que 10 vezes maior quando
comparamos com o volume dessa fase comumente utilizada na SPME (0,4 a 0,6 L). Portanto, uma das
principais vantagens da SPDE sua maior capacidade na concentrao dos analitos, o que a torna uma tcnica
muito eficiente na extrao de substncias que se encontram em pequenas quantidades nas matrizes
(RIDGWAY et al., 2006). Alm disso, podem-se utilizar quantidades ainda menores de matrizes (amostras
vegetais), como tambm as extraes podem ser realizadas em menos tempo j que a extrao dinmica.
Assim, o ar (headspace) que entra em contato com a fase extratora , continuamente, renovado, o que
acelera a extrao (SAITO & JINNO, 2003).
A fase extratora (revestimento) pode ter diferentes seletividades dependendo do tipo de material
selecionado. Os polmeros disponveis comercialmente so o PDMS, PDMS/carvo ativado, PDMS/OV 225,
PDMS/fenil-metilpolisiloxano, polietilenoglicol (PEG) e DB 1701 (polidimetilsiloxano, 7% de fenil e 7% de
cianopropil).
A SPDE vem sendo aplicada em anlises nas reas ambiental, alimentcia e forense. Como exemplos
dessas aplicaes, se podem enumerar as anlises de pesticidas em gua (LIPINSKI, 2001), canabinoides e
anfetamina em cabelo humano (MUSSHOFF et al., 2002, 2003), plantas, banana, caf (verde e torrado) e
vinhos (BICCHI et al., 2004b).
Outra tcnica mais recente a ITEX (In-Tube Extraction), na qual entre a agulha (sem revestimento) e
a seringa h uma coluna empacotada com material responsvel pela soro dos analitos como, por exemplo,
Tenax. Esse procedimento de extrao dinmica tambm permite a realizao de anlises rpidas a partir do
headspace, alm de ser uma tcnica com alta sensibilidade (JOCHMANN et al., 2008).
Extrao sortiva em barra de agitao
A SBSE (Stir Bar Sorptive Extraction) foi desenvolvida por Baltussen e colaboradores (1999), sendo que
essa tcnica foi inicialmente utilizada para a extrao de substncias de baixa polaridade a partir de solues
aquosas. O dispositivo utilizado para a extrao possui trs partes; uma parte mais interna que constituda
por uma barra de ao-inox (haste) revestida por uma capa de vidro e na parte mais externa h uma camada de
revestimento constituda de um material responsvel pela soro dos analitos (Figura 10). Os dispositivos de
SBSE so confeccionados com PDMS (fase extratora), devido suas propriedades adequadas de difuso e
estabilidade trmica. A capa de vidro importante nesse dispositivo j que evita a degradao do PDMS por
contato deste com a haste metlica e, atualmente, esses so comercializados pela Gerstel sob a denominao
de Twister.
Em 2000, essa extrao por soro em barra de agitao magntica foi utilizada por dois grupos de
pesquisadores para a extrao das substncias a partir do headspace e ento a tcnica foi denominada de
HSSE (Headspace Sorptive Extraction). Assim, a barra de extrao foi mantida suspensa na fase vapor do frasco
contento a amostra a ser extrada (BICCHI et al., 2000; TIENPONT et al., 2000), (Figura 10).
As extraes por SPME e HSSE so muito similares, porm a HSSE possui uma maior capacidade de
concentrao dos analitos quando comparado com a SPME e, portanto, se destaca por sua alta sensibilidade.
Isso est relacionado com o maior volume de fase extratora na HSSE, a qual varia de 25 a 250 L dependendo
do tamanho da barra (1 a 4 cm). Alm disso, importante destacar as altas taxas de recuperao dessa tcnica,
mas essa dependente do volume e da rea superficial da fase extratora selecionada, quando comparada
com a SPME (BICCHI et al., 2002, 2008).
36
Assim como nas tcnicas j descritas anteriormente, na HSSE tambm h muitas varireis que
necessitam ser otimizadas e padronizadas para se obter extraes mais eficientes e menores tempos de
anlise nos estudos que sero conduzidos. Entre essas variveis, destacam-se os seguintes parmetros: volume
da amostra, tipo de revestimento, dimenses da barra de agitao, tempo de exposio, velocidade de
agitao e temperatura de extrao (BICCHI et al., 2003, 2005a; OCHIAIA et al., 2003; CHAVES & QUEIROZ,
2008).
Aps a extrao, os analitos devem ser dessorvidos para poderem ser analisados por GC. Assim, a barra
acondicionada em um tubo de vidro e transferida para um sistema de dessoro trmica, o qual acoplado
ao cromatgrafo. Entretanto, para a realizao da dessoro trmica necessrio esse sistema de dessoro,
o qual h disponvel comercialmente dois tipos de sistemas e podem ser totalmente automatizados
(KAWAGUCHI et al., 2004). Porm, esses sistemas requerem cromatgrafos a gs equipados com injetores de
temperatura programada que possuem o criotrap, para a concentrao criognica dos analitos j que o
processo de dessoro dos analitos muito lento quando comparado com o da SPME. Dessa maneira, essa
etapa de concentrao dos analitos antes de serem transferidos para a coluna cromatogrfica de extrema
relevncia para uma boa resoluo na separao das substncias (BICCHI et al., 2003; CHAVES & QUEIROZ,
2008).
Como os Twisters disponveis comercialmente possuem a camada externa de PDMS e por essa razo
h limitaes na extrao de substncias mais polares, muitos pesquisadores desenvolveram outras fases
extratoras, principalmente por processos de sol-gel, para tentar contornar este problema na extrao com
barras de agitao produzidas com PDMS. Nesse sentido, foram confeccionadas e testadas barras de agitao
com diferentes seletividades produzidas com, por exemplo, PDMS/PMHS (polimetil-hidrossiloxano) (LIU et
al., 2004a), alquil-diol-slica (LAMBERT et al., 2005), fases molecularmente impressas com polmeros (ZHU et
al., 2006), PDMS/poli(pirrol) (MELO et al., 2009) dentre outras.
FIGURA 10 | Dispositivos utilizados em extrao sortiva em barra de agitao
e detalhe da extrao a partir do headspace

37
Alm dessas variaes nas barras de extrao, Bicchi e colaboradores (2005b) desenvolveram uma
segunda gerao do Twister, o qual comercializado pela Gerstel sob a denominao de Dual-phase Twister.
Portanto, essas barras de extrao de segunda gerao foram desenvolvidas devido falta de capacidade do
polmero PDMS (apolar) em extrair substncias de mdia a alta polaridade e de alta volatilidade. Desse modo,
essas barras mantm a alta capacidade de concentrao de analitos a partir de uma matriz, mas ao invs de
um material extrator essas barras utilizam dois ou mais materiais para esse fim e assim promovem a extrao
por combinao de diferentes modos como a adsoro e soro. Porm, essa tcnica ainda precisa ser
modificada para a extrao de substncias altamente polares (BICCHI et al., 2005b).
As barras de extrao de segunda gerao (Dual-phase Twister) so constitudas por um tubo de PDMS
empacotado com material adsorvente (carbono ativado) e nas extremidades esse tubo mantido fechado
por um material magntico (Figura 10), pois assim esse pode ser magneticamente agitado. Assim, os analitos,
primeiramente, so absorvidos na camada de PDMS, em seguida sofrem difuso em direo ao interior do
dispositivo de extrao e por fim so adsorvidos no material constituinte da camada interior (BICCHI et al.,
2005b).
Portanto, as extraes de analitos a partir de uma matriz pelas barras de segunda gerao dependem
da afinidade desses pelo PDMS, sua capacidade de difuso e afinidade pelo material adsorvente. Dessa
maneira, com a modificao dos Twisters convencionais foi possvel aumentar a capacidade de extrao, ou
seja, a quantidade de analitos extrados, como tambm aumentar, dependendo do material utilizado na fase
interior, a extrao de substncias mais polares (BICCHI et al., 2005b).
Um exemplo dessas variaes nas extraes com a modificao do material da camada interna foi
observado no estudo dos volteis do caf e das folhas de slvia (Salvia lavandulifolia Vahl), no qual foram
avaliados tubos de PDMS empacotados com Tenax, bisfenol/copolmero de PDMS (25:75), Carbopack com 5%
de Carbowax e -ciclodextrina (BICCHI et al., 2007a). Alm disso, neste estudo tambm foi avaliado a substituio
dos materiais baseados em carbono (camada interna), pois esses apresentam problemas como a produo de
artefatos, reatividade, adsoro irreversvel e tambm pode haver a dessoro irregular das substncias, ou
seja, a descriminao das substncias durante a liberao dessas do dispositivo de extrao (ZABARAS &
WILLIE, 2002).
A SBSE apresenta diversas vantagens como, por exemplo, a ausncia de solventes orgnicos para a
extrao, alta sensibilidade e sua maior aplicabilidade em anlises quantitativas. Dessa maneira, essa tcnica
amplamente empregada em anlises de frmacos em fluidos biolgicos, principalmente atravs da extrao
por imerso direta (CHAVES & QUEIROZ, 2008), como tambm utilizada nas anlises dos componentes
volteis do headspace a partir de amostras de espcies vegetais (BICCHI et al., 2000; KRECK et al., 2002),
fungos (DEMYTTENAERE et al., 2003, 2004; WIHLBORG et al., 2008) e alimentos (CAVALLI et al., 2003; BICCHI
et al., 2005b; SALVADEO et al., 2007).
Tcnicas de extrao em grande rea superficial de fase extratora
A superfcie de fase extratora um dos parmetros que influenciam de maneira muito significativa
na extrao das substncias. Dessa maneira, foram desenvolvidas tcnicas com maior rea superficial de fase
38
extratora na tentativa de se desenvolver tcnicas mais sensveis e capazes de extrair substncias que estejam
em nveis de traos nas matrizes.
Neste contexto, Yang e colaboradores (1994) desenvolveram uma tcnica denominada de MESI
(Membrane Extraction Sorbent Interface) e que, posteriormente, foi utilizada para a extrao de substncias
volteis a partir do headspace (SEGALA et al., 2000). Essa tcnica simples, no requer a utilizao de
solventes, bem como tem sensibilidade destacvel e tambm um processo ininterrupto, pois est diretamente
acoplada ao cromatgrafo a gs e evita a perda de analitos.
A MESI realizada em duas etapas simultneas que envolvem a extrao e concentrao das
substncias. Inicialmente, a extrao das substncias volteis realizada em uma membrana de PDMS e logo
em seguida as substncias extradas so arrastadas para o outro lado da membrana por um gs e conduzidos
at um trap para serem concentradas (YANG et al., 1994). Geralmente, esses sistemas de trap so constitudos
por Tenax, PDMS, Carboxen ou outros (WANG et al., 2002; LIU & PAWLISZYN, 2005). Aps a extrao e
concentrao das substncias, elas so conduzidas at o cromatgrafo para serem devidamente separadas.
Os analitos na MESI devem ser transportados pela membrana no porosa de PDMS atravs do
mecanismo de difuso/soluo. Portanto, os constituintes a serem extrados devem possuir grandes
coeficientes de partio (membrana de PDMS/amostra) e difuso. Essa membrana de PDMS tambm evita
que vapores de gua sejam introduzidos no cromatgrafo, porm esta membrana atua como um filtro seletivo
(LUO et al., 1997). Apesar dessa desvantagem, Bruheim e colaboradores (2003) observaram extraes mais
eficientes e com maiores sensibilidades quando utilizaram membranas de PDMS do que em extraes realizadas
por SPME. Por essa razo, alguns pesquisadores utilizaram essa tcnica em estudos que visavam monitorar a
emisso de volteis como a partir das folhas de Eucalyptus dunnii Maiden (WANG et al., 2002; LIU et al.,
2004b), bem como determinar as substncias orgnicas volteis presentes no ar (LIU & PAWLISZYN, 2005).
Todavia, essa tcnica possui diversos parmetros que necessitam ser otimizados, como as temperaturas do
trap e do mdulo que contm a membrana, fluxo do gs, tempo de extrao dentre outros (LIU et al., 2004b).
Outra tcnica com maior rea superficial para a extrao a STE (Sorptive Tape Extraction), a qual foi
desenvolvida por Sandra e colaboradores em 2006 e fundamenta-se na extrao de substncias apolares em
uma fita flexvel de PDMS. Inicialmente, a STE foi empregada para a anlise da composio do sebo da pele
humana antes e aps o tratamento com um cosmtico. Para tal estudo, foram fixadas fitas de PDMS sobre a
pele e aps a extrao as substncias foram submetidas dessoro trmica on-line com o cromatgrafo a gs
e a dessoro com solvente.
Em seguida, Bicchi e colaboradores (2007b) utilizaram a STE para a extrao de substncias volteis de
matrizes vegetais como Mentha spicata L., Rosmarinus officinalis L. e ma (Malus Mill.), tanto a partir do
headspace quanto do contato direto com tais matrizes. Alm disso, nesse estudo tambm foram realizadas as
mesmas extraes a partir do headspace com HSSE (recobrimento de 20 L de PDMS) e SPME (fibra com
recobrimento de 100 m de PDMS). Esses dados evidenciam as vantagens da STE como, por exemplo, a
rpida velocidade das extraes, maior sensibilidade e reprodutibilidade. Convm destacar que essa tcnica
tambm pode ser de grande valia nos estudos da emisso dos volteis para o estabelecimento dos fatores
que possam alterar o perfil qumico dos volteis das plantas.
39
Microextrao em fase lquida (LPME)
Se uma gotcula de solvente extrator fosse (Figura 11) encarregada de extrair, atravs da afinidade
qumica e do coeficiente de partio, uma pequena quantidade de analitos presentes em uma amostra,
teramos um processo dificultado por questes tcnicas como, por exemplo, a recuperao de pequenos
volumes. Entretanto essa abordagem, denominada de LPME (Liquid Phase Micro-extraction), foi inicialmente
empregada por Jeannot e colaboradores (1996). Esses pesquisadores realizaram a extrao da 4-metil-
acetofenona, em amostras de gua, atravs de uma gota de n-octano (8 L) suspensa na ponta de um basto
de teflon, sendo inicialmente denominada por esses autores de SDME (Single Drop Microextraction). Aps
isso, o volume da gota de solvente orgnico (fase extratora) foi reduzido para 1 L e este foi mantido suspenso
na agulha de uma microsseringa (JEANNOT & CANTWELL, 1997).
FIGURA 11 | Esquema demonstrando a hiptese de microextrao em fase
lquida.
Outras tcnicas de microextrao envolvendo os conceitos da extrao da LPME foram desenvolvidas,
entretanto foram utilizadas membranas porosas para a imobilizao da fase orgnica. Dentre essas tcnicas,
pode-se citar a SLM (Supported Liquid Membrane), MMLLE (Microporous Membrane Liquid-Liquid Extraction)
(PEDERSEN-BJERGAARD & RASMUSSEN, 1999; SHEN et al., 1998; SANDAHL et al., 2000) ou a extrao em
fibras ocas revestidas com membranas denominadas de HFLPME (Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction)
ou simplesmente LPME (SHEN & LEE, 2002).
A LPME uma tcnica simples, de baixo custo e grande versatilidade, j que o tipo de solvente
extrator pode ser ajustado de acordo com os analitos que se deseja extrair como, por exemplo, a extrao de
substncias que possuem maior polaridade (OLIVEIRA et al., 2008). Entretanto, o solvente extrator selecionado
deve possuir presso de vapor baixa o suficiente para evitar sua evaporao durante o processo de extrao,
como tambm ele deve ser compatvel para a injeo no cromatgrafo a gs (XU et al., 2007).
Em 2001, a LPME comeou a ser utilizada na extrao de substncias a partir do headspace, sendo que
nesta primeira abordagem foi realizada a extrao do benzeno, tolueno, etilbenzeno e o-xileno presentes em
uma matriz aquosa (THEIS et al., 2001). Alm da extrao das substncias do headspace de modo esttico,
tambm possvel a extrao dinmica das substncias utilizando a LPME podendo, nesse caso, at mesmo
40
serem utilizados solventes que possuam presses de vapores mais elevadas, j que este tipo de extrao
muito rpida, alm de haver uma reduzida rea dentro da microsseringa (SHEN & LEE, 2003; HE & LEE, 1997).
Assim como nas tcnicas anteriores descritas, na LPME tambm existem diversos parmetros que
influenciam, consideravelmente, a eficincia da extrao e, portanto, requerem a otimizao. Dentre esses
parmetros, pode-se enumerar a temperatura e tempo de extrao, pH (amostra), quantidade de amostra,
tipo e volume de solvente extrator, agitao e fluxo da movimentao (extraes por modo dinmico) (OLIVEIRA
et al., 2008).
A LPME, assim como as demais tcnicas de microextrao abordadas aqui nesse captulo, tambm
necessita de uma pequena quantidade de amostra para a extrao e utiliza um pequeno volume de solvente
orgnico, acarretando menores danos ambientais. Alm do mais, a LPME pode ser aplicada em estudos
quantitativos, bem como a realizao de derivatizao das substncias extradas no prprio solvente extrator
(DENG et al., 2005a; LI et al., 2005), a possvel combinao com outras tcnicas (DENG et al., 2005b; DENG et
al., 2006) e automatizao (XU et al., 2007).
Essa tcnica amplamente utilizada em anlises de volteis de plantas (BICCHI et al., 2008), como
tambm de alguns alimentos (ZHU et al., 2002; KAYKHAII & RAHMANI, 2007) e bebidas (XIAO et al., 2006).
Existem diversos exemplos de estudos dos volteis de plantas (headspace) por LPME na literatura, como
aqueles conduzidos com as espcies Pimpinella anisum L. (anis ou erva-doce) (BESHARATI-SEIDANI et al.,
2005), Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk. (DENG et al., 2005b), Curcuma wenyujin Y.H. Chen & C. Ling
(CAO et al., 2006), Rosmarinus officinalis L. (SALEHI et al., 2007), Lavandula angustifolia Mill. (FAKHARI et al.,
2005) e outros.
ANLISES DAS SUBSTNCIAS VOLTEIS
Algumas das tcnicas convencionais abordadas aqui neste captulo continuam sendo empregadas
em escala industrial para a extrao de leos essenciais. Apesar de ter ocorrido modificaes nos procedimentos
extrativos nesse tipo de abordagem, no houve o desenvolvimento de novas metodologias. O que torna esse
campo atrativo para as pesquisas, j que, atualmente, se buscam procedimentos com altos rendimentos, bem
como a gerao de produtos de alta qualidade para aumentar o valor agregado de tais produtos. Alm disso,
tambm se almejam metodologias com reduzidos gastos energticos e de solventes orgnicos.
Entretanto, os avanos nas tcnicas de microextrao sem dvida so notveis e representam um
marcante crescimento no estabelecimento dos perfis qumicos das substncias volteis mais prximos dos
reais emitidos e produzidos pelas espcies vegetais. Em adio a isso, tambm convm destacar a importncia
dessas tcnicas para alguns esclarecimentos proporcionados no campo da ecologia qumica, como tambm
so tcnicas que utilizam mnimos volumes de solventes orgnicos ou nem mesmo os utilizam, requerem
pequenas quantidades de amostras vegetais e menores tempos para as extraes. Um exemplo dessas
constataes a possibilidade da anlise das substncias volteis emitidas in vivo das flores de Petunia
hybrida Vilm. durante seu ciclo para desabrochar (VERDONK et al., 2003). Neste trabalho foram utilizadas
41
extraes por SPME a partir do headspace para traar as variaes na emisso de benzenoides, aldedos
alifticos, sesquiterpenos e alguns derivados de cidos graxos (Figura 12).
O
H

Benzaldedo
H
H

Cadina-3,9-dieno
O
H

2-Hexanal
O
H

Decanal
FIGURA 12 | Substncias volteis das flores de Petunia hybrida detectadas in
vivo atravs de SPME.
Os avanos no foram somente nas tcnicas de microextrao, mas tambm nas anlises por
cromatografia gasosa dos componentes extrados, sendo que esses ltimos foram tanto na deteco quanto
na separao das substncias. Entretanto, importante ressaltar que para uma caracterizao autntica das
substncias presentes no headspace ou no leo essencial, tais substncias devem ser termicamente estveis
nas condies de aquecimento estabelecidas no mtodo cromatogrfico selecionado, caso contrrio sero
detectados e identificados artefatos.
O acoplamento do espectrmetro de massas ao cromatgrafo a gs ocorreu nos anos 50 e foi sem
dvida fundamental para a caracterizao das substncias presentes nas misturas complexas dos leos
essenciais, pois a partir disso podem ser obtidas informaes sobre as estruturas qumicas podendo ser
empregado em estudos quantitativos e qualitativos de substncias volteis e semivolteis (SNEDDON et al.,
2007). Os espectrmetros de massas com fonte de ionizao por eltrons (EI, Electron Ionization) foram os
primeiros a serem acoplados ao cromatgrafo a gs e continuam sendo um dos mais utilizados na caracterizao
de componentes volteis, porm j existem outros tipos de fontes de ionizao passveis de acoplamento
com o GC (HIRAOKA, 2005).
Uma das principais vantagens da utilizao desses aparelhos de GC-MS com fonte de ionizao do tipo
EI a disponibilidade comercial de bibliotecas com um grande nmero de espectros de massas de substncias,
o que facilita na identificao das substncias por meio da comparao entre os perfis de fragmentao
(RAGUNATHAN et al., 1999). Alm disso, tambm podem ser realizados os clculos dos ndices de reteno
relativos a cada substncia do cromatograma e a comparao com os ndices descritos na literatura (ADAMS,
1995). Assim, com os dados de espectrometria de massas aliados aos ndices de reteno pode-se propor a
caracterizao das substncias de maneira mais segura.
O ndice de reteno calculado a partir de dados dos tempos de reteno de um determinado
composto e dos observados para os n-alcanos de uma srie homloga. O ndice de reteno o mais
difundido e utilizado, porm existem muitas outras sries alternativas para a realizao da identificao de
substncias (CASTELLO, 1999), sendo que estas so menos utilizadas e cada uma delas recebe uma
42
denominao particular como, por exemplo, nmero de carbono que calculado a partir de steres metlicos
de cidos graxos saturados (WOODFORD & VAN GENT, 1960).
O acoplamento do GC com a tcnica de Espectroscopia de Infravermelho (IR, Infrared Spectroscopy)
surgiu nos anos 60 e prximo a esse desenvolvimento tambm houve a combinao desse com a MS (LOW &
FREEMAN, 1967, 1968). O IR uma tcnica analtica universal, verstil e que pode ser utilizada tanto em
estudos qualitativos quanto quantitativos, sendo que com o desenvolvimento da tcnica com a transformada
de Fourier essa se tornou mais sensvel, reprodutvel e rpida. A grande relevncia da utilizao do GC-IR na
diferenciao de ismeros, os quais no podem ser diferenciados por GC-MS (SASAKI & WILKINS, 1999). A
tcnica IR baseia-se nas vibraes moleculares, logo essa depender dos comprimentos das ligaes das
substncias analisadas, massas atmicas dos tomos presentes e das interaes inter e intramoleculares.
Uma das desvantagens da IR a sensibilidade, pois apresentam limites de deteco altos quando
comparados aos observados com a MS. Porm, tambm houve certa evoluo nos tipos de interface para o IR,
no qual foi possvel, em alguns casos, obter deteces mais rpidas e com alta sensibilidade (GALLIGNANI &
BRUNETTO, 2004). Atualmente, h disponveis trs tipos de interface que so: light pipe (LP), matrix isolation
(MI) e direct deposition (DD) (SASAKI & WILKINS, 1999).
A LP, primeiro tipo de interface utilizada, a mais simples das interfaces e apresenta baixa sensibilidade,
o que acarreta problemas com relao aos limites de deteco (aproximadamente de 10 ng). Na LP os
espectros de IR so obtidos em fase gasosa em um capilar de vidro de borossilicato com revestimento de ouro
nas paredes (AZARRAGA, 1980), sendo que esta cela de deteco tem volume de 100-150 L, o que limita a
resoluo cromatogrfica (GISS & WILKINS, 1984).
Na tentativa de sanar o problema da sensibilidade da LP foram desenvolvidos outros dois tipos de
interface; a MI e DD (NORTON & GRIFFITHS, 1995). Nessas duas interfaces a obteno do espectro de IR das
substncias realizada em fase slida, sendo que a diferena entre elas a forma final obtida do slido. Na MI,
a substncia em fase gasosa (efluente da coluna cromatogrfica) congelada em uma matriz gasosa,
geralmente contendo 2-5% de argnio, com isso h uma reduo das interaes intermoleculares, o que
reflete na obteno de espectros com bandas mais finas. J na DD, as substncias em fase gasosa so
congeladas em uma janela transparente de seleneto de zinco (ZnSe) (SASAKI & WILKINS, 1999), a qual foi,
posteriormente, recoberta por ouro ou prata para reduzir ainda mais o limite de deteco da DD, sendo que
esta recebeu a denominao de DD-SEIRA (Direct Deposition- Surface Enhanced Infrared Absorption) (Heaps
& Griffiths, 2005). Nas interfaces do tipo MI e DD, os limites de deteco so menores do que na LP, mas a
utilizao da DD sem dvida mais vantajosa, pois os espectros obtidos nessa interface so muito similares
com os espectros obtidos em KBr e dessa maneira h grandes bibliotecas de espectros de substncias para a
busca de similaridade e auxlio na identificao dos ismeros (NORTON et al., 1996).
Portanto, em alguns casos para a identificao inequvoca das substncias necessria a utilizao de
mais de uma tcnica de deteco, bem como a comparao dos ndices de reteno. Um exemplo disso pode
ser observado na anlise dos constituintes do leo essencial de Salvia sclarea L. por GC-MS e GC-IR. Em um dos
picos o MS identificou a substncia como sendo o monoterpeno nerol (96% de similaridade) ou o acetato de
geranila (91% de similaridade) em segunda opo, porm o espectro de IR confirmou que este pico acetato
de geranila (98% de similaridade) (Figura 13). Nesse mesmo estudo, tambm foi possvel verificar que com
a tcnica de subtrao de espectros de IR possvel a identificao inequvoca das substncias sem a completa
separao das substncias, no qual o MS identificou o pico apenas como -terpineol, mas com o IR foi possvel
43
confirmar que os picos, os quais no estavam totalmente separados, correspondiam s substncias -terpineol
e formiato de geranila (CAI et al., 2006).
OH

Nerol
OH

-Terpineol
O
O

Acetato de geranila
O H
O

Formiato de geranila
FIGURA 13 | Alguns dos constituintes do leo essencial de Salvia sclarea
identificados por GC-MS e GC-IR.
Alm dos detectores para GC j citados tambm existem os seguintes: ionizao em chama (FID,
Flame Ionization Detector), captura de electron (ECD, Electron Capture Detector), ionizao terminico (TID,
Thermionic Ionization Detector), fotoionizao (PID, Photoionization Detector), olfatomtrico (O, Olfatometry)
e outros. Esse ltimo de grande importncia na indstria de aromas para utilizao em diversos campos
como alimentos, cosmtica e farmacutica, pois atravs desse pode-se avaliar a contribuio individual de
cada substncia no aroma final do leo essencial e assim desenvolver novas substncias odorferas. Em geral,
essa tcnica utilizada em paralelo com outra para a identificao e quantificao das substncias como, por
exemplo, o GC-MS (PLUTOWSKA & WARDENCKI, 2008; CURIONIA & BOSSET, 2002).
Alm dos avanos na rea da deteco, os melhoramentos na rea da separao das substncias
volteis por GC tambm foram de grande relevncia nas caracterizaes qumicas dos leos essenciais, pois
refletiram, consideravelmente, nos tempos necessrios para as anlises e nas resolues das separaes
cromatogrficas. Inicialmente, as colunas utilizadas na GC eram colunas do tipo empacotadas, porm em
1957, com o desenvolvimento de colunas do tipo capilares, houve um aumento significativo na eficincia das
separaes cromatogrficas e redues nos tempos das anlises. Essas colunas capilares possuem um dimetro
interno de 250 a 320 m (convencional) e revestindo a parede interna do capilar est a fase estacionria que
pode ou no estar quimicamente ligada (PEREIRA & NETO, 2000; SEQUINEL et al., 2010).
A partir disso, foram desenvolvidas colunas com fases estacionrias mais seletivas e resistentes
termicamente, o que permitiu o desenvolvimento de colunas com dimetro interno e comprimentos cada
vez menores, como as colunas narrow bore para cromatografia gasosa ultrarrpida (Ultra Fast-GC). Dessa
maneira, foi possvel aumentar, consideravelmente, as velocidades das anlises podendo ser realizadas
separaes de misturas complexas em menos de 1 minuto (PEREIRA & NETO, 2000; SEQUINEL et al., 2010).
H diversas definies para classificar os tipos de GC (convencional at ultrarrpida), porm ser
abordada apenas a classificao elaborada por Magni e colaboradores (2002), pois uma das que consideram
44
um maior nmero de parmetros para a classificao. Nessa classificao a Ultra Fast-GC definida segundo
os parmetros sumariados na Tabela 2, no qual as velocidades de aquecimento so superiores que 1 C/s e as
colunas possuem apenas de 2 a 10 m de comprimento com dimetro interno de 0,05 a 0,1 mm. Com isso
possvel realizar a separao dos constituintes de uma mistura complexa em menos de 1 min, podendo ser
reduzido o tempo de anlise cromatogrfica em at 40 vezes quando comparado com a cromatografia
gasosa convencional (GC) que utiliza colunas de at 30 m de comprimento.
A utilizao da Ultra Fast-GC como tcnica de rotina acarreta em um significativo aumento da
produtividade, sendo que essa pode ser empregada tanto em estudos qualitativos quanto quantitativos.
Convm destacar que os fornos convencionais de GC no podem ser utilizados na Ultra Fast-GC, pois a taxa de
aquecimento excessiva dessa modalidade incompatvel com tais fornos e por isso essas colunas so aquecidas
por resistncia diretamente conectadas as colunas.
Apesar do significativo aumento da produtividade com a Ultra Fast-GC, h algumas perdas em
termos de resoluo cromatogrfica nessa modalidade, devido drstica reduo do comprimento e dimetro
interno das colunas, aumento excessivo da taxa de aquecimento e das presses, logo misturas com alto grau
de complexidade podem no ser totalmente resolvidas com a Ultra Fast-GC. Entretanto, h diversos exemplos
na literatura da utilizao da Ultra Fast-GC na anlise de leos essenciais obtidos a partir da camomila, hortel,
alecrim e slvia (BICCHI et al., 2004a).
Tabela 2. Alguns parmetros que so utilizados para classificar a modalidade de CG segundo Magni e
colaboradores (2002)
1
: Convencional; comp.: comprimento; d.i.: dimetro interno; TA: tempo de anlise; TxA: taxa de
aquecimento; LP: largura do pico.
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Coluna cromatogrfica
TA
(min)
TxA
(C/min)
LP
(s)
comp. (m) d.i. (mm)
GC
1
25-30 0,25-0,32 10-60 1-10 1-10
Fast-GC 5-15 0,10-0,25 < 10 15-60 0,5-2,0
Ultra Fast-GC 2-10 0,05-0,10 > 1 > 60 0,05-0,2
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PROCESSOS DE OBTENO DE EXTRATOS
E SUBSTNCIAS BIOATIVAS
Camila Gambini Pereira
INTRODUO
O interesse dos consumidores por uma vida
saudvel por meio do uso de alimentos enriquecidos
e produtos naturais tem crescido mundialmente.
Muito tem se falado a respeito dos alimentos
funcionais e nutracuticos. Seja para reduzir o risco
a doenas, seja para prevenir a ideia em se consumir
esses produtos que est vinculada ao consumo de
substncias benficas a sade. Hoje j se sabe que
uma alimentao saudvel, rica em alimentos
funcionais e nutracuticos, possui um papel
fundamental no fortalecimento do sistema
imunolgico, na promoo da sade e na preveno
de doenas. De fato, existe uma srie de termos
utilizados para alimentos e produtos naturais com
ao benfica sobre o organismo. Kwak & Jukes
56
(2001) fazem uma extensa discusso sobre os diversos termos hoje utilizados e como eles se relacionam. A
Figura 1 apresenta a interseco entre alguns desses termos. Embora no tenham includo nessa representao,
os autores explicam que os nutracuticos englobariam alimentos ou partes de alimentos que so consumidos
para fins especficos e atuam na preveno do tratamento de doenas. Independente da terminologia utilizada,
no que diz respeito atividade, a ao que um alimento funcional ou nutracutico exerce sobre o organismo
resultado da existncia de uma determinada substncia ou grupo de substncias bioativas presentes nesses
produtos. O consumo de frutas/verduras e peixes, aconselhado por muitos nutricionistas, baseado no fato
desses alimentos serem ricos em substncias funcionais, como vitaminas e cidos graxos, respectivamente.
FIGURA 1 | Classificao de alimentos ou suplementos com funo bioativa
(adaptado de KWAK & JUKES, 2001, com permisso).
Substncias bioativas so encontradas em diversas matrizes vegetais como razes, sementes, folhas,
caule, flores, frutos. A importncia desses produtos est no somente no uso in natura, mas tambm na sua
aplicao como base para a formulao de novos produtos alimentcios, cosmticos ou medicinais. O gengibre,
por exemplo, pode ser consumido in natura, utilizado como ch, ou ainda, devido a sua ao bactericida, atuar
como insumo para fabricao de produtos farmacuticos ou cosmticos. A indstria vem investindo muito
nesse setor. Diferentes produtos tm sido criados e apoiados pelo aumento da procura por alimentos saudveis
por parte da populao. Suplementos alimentares, alimentos fortificados ou enriquecidos so utilizados para
complementar a dieta com a finalidade de se ampliar o consumo de uma determinada substncia ativa no
organismo.
O que se sabe que as atividades funcionais encontradas nos produtos naturais advm das diversas
classes de substncias como leos essenciais, flavonoides, carotenoides, alcaloides, dentre outros. Em se
tratando de alimentos funcionais, especial ateno tem sido dada queles constitudos por componentes
57
antioxidantes, pois atuam na manuteno e preveno de um organismo saudvel. Estudos tm demonstrado
que essa ao decorrente a presena de substncias fenlicas, consideradas um dos principais grupos
antioxidantes naturais. Por outro lado, das diversas classes de substncias, os alcaloides e os terpenos se
destacam por serem as classes qumicas com maiores potencialidades de fornecer substncias com atividade
farmacolgica. Depois desses, seguem as lignanas, flavonoides, cumarinas, esteroides, dentre outros (DI
STASI, 1996).
Devido ao elevado valor que essas substncias possuem, no somente pela ao, mas por serem piv
de muitas indstrias do setor, investimentos tm sido feito para se adquirir essas substncias de forma mais
criteriosa e produtiva possvel. A extrao dessas substncias pode ser realizada por diversos processos de
separao. A escolha correta o ponto de partida para o sucesso na obteno do produto desejado. Dependendo
da substncia ou classe de substncias, matria-prima utilizada e aplicao final, a escolha do processo pode
no ser uma tarefa fcil. Quando se trata de extrao, a etapa de fracionamento ou purificao deve ser
considerada. Essas etapas adicionais muitas vezes so demoradas e dispendiosas, no entanto tudo vai depender
do extrato original obtido e do extrato final ou substncia a ser almejada. O Captulo 17 deste livro, por
exemplo, tratar somente sobre os procedimentos de obteno, anlise e aplicao de substncias volteis,
j o Captulo 19 versar sobre o emprego de ESI (Eletron Spray Ionisation- Ionizao por Eletrospray) na anlise
de alcaloides. No entanto, embora haja uma especificidade no que diz respeito ao objeto a ser obtido,
detalhes entre os diferentes processos de extrao de substncias a partir de matrizes vegetais podem ser
definidos.
O intuito desse captulo abordar as diferentes tcnicas para a obteno de extratos e substncias
bioativas em termos de aspectos fundamentais, metodologia operacional, especificidades e principais
aplicaes. Neste captulo, focaremos nos processos de extrao slido-lquido, como destilao por arraste
a vapor, extrao com solvente a baixa presso, extrao com fluidos supercrticos, extrao por micro-ondas
e extrao por ultrassom.
CONSIDERAES GERAIS DE PROCESSO
O princpio base do processo de extrao slido-lquido a dissoluo preferencial de uma ou mais
substncias de uma matriz slida (produto natural) em um solvente lquido. A escolha do solvente baseada
nos fatores inerentes ao processo como solubilidade do constituinte no solvente, estabilidade, toxicidade,
disponibilidade, viscosidade, reatividade, tenso superficial e custo do solvente. Muitas substncias bioativas
extradas de produtos naturais so utilizadas como insumo para produo de alimentos. Nesse sentido, cuidados
maiores devem ser tomados na escolha do solvente. Para obteno de substncias bioativas a FDA (Food and
Drug Administration
1
) faz recomendaes com relao aos diversos solventes aplicados na indstria de
alimentos. Para tal, a fundao classifica os diversos solventes em 3 classes: Classe 1: solventes extremamente
txicos, no aceito no processo; como benzeno, tetracloreto de carbono, 1,2-dicloroetano, 1,1-dicloroetano,
1,1,1-tricloroetano; Classe 2: solventes de considervel toxicidade, seu uso permitido em casos e condies
especficas (limite de concentrao variando de 50 a 3880 ppm, dependendo do solvente utilizado), como
acetonitrila, clorofrmio, hexano, metanol, tolueno, etilmetilcetona, diclorometano; Classe 3: solventes aceitos,
permitindo-se uma pequena porcentagem residual do solvente no produto final, como acetona, etanol,
acetato de etila, 1-propanol, 2-propanol, acetato proplico.
58
Alm da escolha do solvente, outros fatores devem ser considerados, como tamanho da partcula,
teor de umidade, temperatura empregada no processo, natureza da matria-prima (localizao da coleta,
idade e parte da planta utilizada), porosidade do leito e localizao do constituinte bioativo na matriz
(intracelular, extracelular, compartimentos celulares especficos, entre outros). Esses fatores interferem
diretamente no perfil do extrato obtido e rendimento do processo.
PROCESSOS DE EXTRAO
DESTILAO POR ARRASTE A VAPOR
Destilao uma operao unitria utilizada para separar os componentes de uma mistura de lquidos,
ou ainda, separar lquidos de slidos. O processo pode se apresentar em diversas conformaes e tipos, sendo
os mais comuns: destilao simples, destilao fracionada, destilao extrativa, destilao a vcuo e destilao
por arraste a vapor, sendo esse ltimo o mais empregado para obter leos volteis.
Destilao por arraste a vapor e hidrodestilao so mtodos de extrao baseados no poder de
volatilizao dos constituintes, por esse motivo so aplicados para extrao de substncias volteis. A diferena
bsica entre esses dois processos que na destilao por arraste a vapor, o vapor passa atravs da matriz e as
substncias volteis se difundem atravs da corrente de vapor. J na hidrodestilao a matria-prima imersa
na gua que evapora juntamente com as substncias volteis. No entanto, o contato direto da gua quente
com a planta por longo perodo de tempo pode degradar substncias termossensveis e ainda promover a
hidrlise parcial de algumas substncias (MATEUS et al., 2006; CERPA et al., 2010).
A destilao por arraste a vapor permite destilar substncias termicamente sensveis, imiscveis com
a gua, a temperaturas reduzidas. Misturas imiscveis no se comportam como solues, e a destilao dessas
misturas feita de forma diferenciada. O princpio da destilao por arraste a vapor baseia-se no fato de que
a presso total de vapor de uma mistura de lquidos imiscveis igual soma da presso de vapor dos
componentes puros individuais (Lei de Dalton). Para dois lquidos imiscveis A e B:
vap
B
vap
A
P P P
onde
vap
A
P
e
vap
B
P
so as presses de vapor dos componentes A e B puros, respectivamente.
Vale ressaltar que, para mistura de substncias miscveis, esse comportamento diferente, pois a
presso total de vapor a soma das presses parciais dos componentes, ou seja, para uma mistura ideal, que
segue a Lei de Raoult:
vap
B B
vap
A A
P x P x P
59
onde
vap
A A
P x
e
vap
B B
P x
so as presses parciais dos componentes A e B, respectivamente
na mistura.
Na destilao por arraste a vapor, se a gua e a fase orgnica so consideradas imiscveis, pela Lei de
Dalton, tem-se que, a constituio de uma fase contendo gua lquida, separada da fase orgnica, reduz o
ponto de ebulio da mistura, isto , a mistura apresentar um ponto de bolha em uma temperatura menor
do que os pontos de ebulio dos componentes puros individuais. Normalmente, na destilao por arraste
a vapor, o processo ocorre presso atmosfrica. Assim, a separao do componente de ponto de ebulio
mais alto ocorrer a uma temperatura inferior a temperatura de bolha da gua (100 C).
Industrialmente, a destilao por arraste a vapor mais empregada devido maior economia e
simplicidade, pois possvel trabalhar com grande quantidade de material de uma nica batelada. O vapor,
gerado por uma caldeira, permeia a matriz vegetal presente no extrator e o material obtido (vapor + substncias
volteis) se condensa no condensador e, por fim, ocorre a separao em um decantador. O vapor pode ainda
ser superaquecido a presses moderadas. Quando se trata de leos volteis, em especial, o vaso decantador
denominado Florentino, a representao do processo dada pela Figura 2. Em escala laboratorial, a
hidrodestilao o mtodo mais empregado para obteno de leos volteis, apresentando um papel
importante como pr-avaliao do processo industrial (GUENTER, 1948, STEFFENS, 2010).
Devido simplicidade de operao e baixo custo, essas tcnicas so muito utilizadas para obteno
de substncias bioativas volteis.
FIGURA 2 | Representao de um destilador por arraste a vapor aplicado a
destilao de leos volteis (STEFFENS, 2010).
60
EXTRAO COM SOLVENTE A BAIXA PRESSO
A extrao com solvente a baixa presso a tcnica mais empregada para obteno de substncias
bioativas de baixa volatilidade de matrizes naturais. Ela se baseia no princpio de solubilizao de substncias
pela passagem do solvente lquido pela matriz. Esse processo pode ser realizado a baixas ou elevadas
temperaturas.
Normalmente, solventes orgnicos como hexano e etanol so mais utilizados. A gua tambm
empregada em alguns casos, como na extrao da cafena de caf e chs. No entanto, a gua possui baixa
seletividade, ou seja, dissolve muitas outras substncias alm do soluto desejado, tornando muitas vezes
necessrio realizar etapas posteriores para separao dessas substncias indesejveis.
Na indstria, diversos equipamentos com conformaes diferentes (horizontais e verticais) so
encontrados para a extrao com solventes a baixa presso. O princpio da extrao o mesmo. O solvente
flui atravs da matriz (co-corrente, contracorrente ou corrente-cruzada, conforme Figura 3), solubiliza as
substncias extraveis, obtendo-se ento um extrato rico em substncias solveis. O processo pode ser realizado
ainda em batelada, ou seja, mantido em contado com o solvente ao longo de certo tempo pr-determinado.
Nesse formato, o tempo de extrao um fator decisivo quando para a escolha do processo a ser empregado
em uma escala industrial. Em alguns casos, o equipamento comporta agitadores, que promovem a
movimentao do fluido e da matriz, permitindo maior contato e maior taxa de transferncia de constituintes
da matriz vegetal para o solvente.
FIGURA 3 | Desenho esquemtico dos tipos de passagem de solvente em
um processo de extrao a baixas presses.
61
A aplicao de temperaturas mais elevadas nos processos de extrao com solvente orgnico
comum, uma vez que, geralmente, o aumento da temperatura proporciona uma elevao na taxa de extrao
devido ao aumento da solubilidade do soluto no solvente. No entanto, o uso de temperatura elevada no
recomendvel para extrair substncias termossensveis, como o caso dos carotenoides.
Nos processos de extrao com solvente a baixa presso, a escolha do solvente o ponto principal
que define a eficincia do processo. Como citado anteriormente, a seleo deve levar em conta a sua
estabilidade, toxicidade, disponibilidade, viscosidade, dentre outros pontos. Assim, a escolha certa do solvente
ir determinar a qualidade do extrato obtido. Dependendo da substncia desejvel, muitas vezes se faz
necessrio o uso de uma bateria de solventes. Na extrao de flavonoides, por exemplo, geralmente utilizam-
se solventes com polaridade crescente, partindo do solvente menos polar para o de maior polaridade. Solventes
apolares so utilizados, inicialmente, por removerem os leos, gorduras, esteris e pigmentos, facilitando a
extrao dos flavonoides. Em seguida, empregam-se solventes de polaridade intermediria (clorofrmio,
diclorometano, acetato de etila ou ter etlico) para extrair agliconas livres pouco polares, como flavonas,
flavonis flavononas, isoflavonas e outras agliconas com alto grau de metilao. Aumentando-se ainda mais
a polaridade (metanol, acetona e gua) possvel obter as agliconas poli-hidroxiladas, auronas e chalconas.
Por ltimo, utiliza-se gua quente para retirar os heterosdeos mais polares, tais como flavonodiis, catequinas,
poliglicosdeos e os acares (SIMES et al., 2006). Assim, dependendo da substncia, a escolha do ou dos
solventes vai requerer maior ateno. A Tabela 1 apresenta as propriedades fsicas dos solventes orgnicos
mais utilizados na extrao de substncias bioativas, com exemplos de aplicao.
EXTRAO COM FLUIDOS SUPERCRTICOS
O princpio de extrao com fluido supercrtico (SFE- Supercritical Fluid Extraction) similar ao da
extrao com solvente a baixa presso. A diferena est no uso de um solvente que se encontra no seu estado
supercrtico. O ponto crtico, representado na Figura 4 pelas condies crticas P
c
, T
c
, a condio mxima na
qual se consegue realizar a mudana de fase lquido-vapor de um determinado componente. Acima desse
ponto, ou seja, em condies de temperatura e presso acima do ponto crtico, o fluido encontra-se no estado
supercrtico. A passagem para o estado supercrtico pode ser visualizada quando, ao se aumentar a presso e
temperatura do sistema, a interface que separa as fases desaparece (Figura 5).
O fluido nessas condies apresenta propriedades que so similares de gases (como difusividade) e
similares a de lquidos (como densidade), veja Tabela 2. Essa caracterstica faz com que o fluido tenha um
comportamento desejvel para extrao, isto , altos valores de densidade do fluido supercrtico atribuem ao
solvente um elevado poder de solubilizao, enquanto baixos valores de viscosidade combinados com altos
valores de difusividade promovem um elevado poder de penetrao, o que gera altas taxas de transferncia
de massa.
O uso da tecnologia em processos de extrao teve grande repercusso nos anos 80. Desde
ento, muitos estudos tem sido realizados a fim de mostrar a aplicabilidade dessa tecnologia para obteno
de substncias bioativas. A indstria tem utilizado essa tecnologia para obter substncias com alto valor
agregado como cafena, lpulo, aromas e corantes, cidos graxos, dentre outras substncias bioativas
(TAYLOR, 1996).
62
TABELA 1 - Principais caractersticas de solventes orgnicos e aquosos utilizados na extrao de substncias
bioativas (adaptado de SIMES et al., 2003).
TABELA 2 - Propriedades fsicas associadas a diferentes estados fsicos (RIZVI et al., 1986).
Solvente
Massa
Molecular
Ponto de
Ebulio (C)
Exemplo de Aplicao
n-Hexano 86,17 68,7
Lipdios, ceras, pigmentos
furanocumarinas
Tolueno 92,14 110,6
Bases livres de alcaloides, antraquinonas
livres, leos volteis, glicosdeos
cardiotnicos
Diclorometano 84,94 39,9
Clorofrmio 119,38 61,2
Acetato de etila 88,11 77,1
Flavonoides, cumarinas
n-Butanol 74,12 117,7
Etanol 46,09 78,3
Heterosdeos em geral
Metanol 32,04 64,5
Acetato de etila 72,12 34,5
Agliconas, ceras, sapogeninas, iridoides e
sesquiterpenos
Misturas
hidroalcolicas
- -
Saponinas
Taninos
gua 18,01 100
gua acidificada - - Alcaloides
gua alcalinizada - - Saponinas
Estado
Densidade
10
3
(kg/m
3
)
Difusividade
10
4
(m
2
/s)
Viscosidade
(kg/m,s)
Gs
P= 1 bar, T= 15-30 C (0,6-0,2) 10
-3
0,1-0,4 (1-3) 10
-5
Supercrtico
Pc, Tc 0,2-0,5 0,7 10
-3
(1-3) 10
-5
4Pc, Tc 0,4-0,9 0,2 10
-3
(3-9) 10
-5
Lquido
P= 1 bar, T= 15-30 C 0,6-1,6 (0,2-2) 10
-5
(0,2-3) 10
-3
63
FIGURA 4 | Diagrama de fases presso versus temperatura de uma
substncia pura.
FIGURA 5 | Desaparecimento da Interface das fases gs-lquido para o
sistema oleato de metila- CO
2
(FANG et al., 2004, com permisso).
64
A grande vantagem dessa tecnologia advm da facilidade em se alterar o poder de solvatao do
solvente por mudanas nas condies operacionais, como temperatura e presso. Assim, a solubilidade de
um componente pode ser melhorada por meio do ajuste das condies operacionais. A Figura 6 apresenta
uma representao da solubilidade de um soluto em solvente supercrtico em funo da variao da
temperatura e presso. Essa particularidade do solvente no estado supercrtico propicia uma maior seletividade
do solvente, alm de facilitar a sua retirada do produto ao final do processo.
FIGURA 6 | Comportamento da solubilidade de um soluto em funo da
temperatura e presso (adaptado de BRUNNER, 2005, com
permisso).
O processo consiste na passagem do solvente supercrtico por uma coluna contendo o material
vegetal nas condies de temperatura e presso pr-estabelecidas. O extrato ao sair da coluna de extrao
passa por um processo de expanso que pode ser realizado em um ou mais separadores (para processos de
fracionamento) ou diretamente em condies ambientes. Ao final do processo, o extrato recuperado a
baixas presses e, nestas condies, o solvente se separa facilmente do extrato, podendo ainda ser reutilizado
no processo. Esse procedimento de extrao apresentado na Figura 7.
65
FIGURA 7 | Fluxograma do processo de extrao com Fluido Supercrtico
(adaptado de PEREIRA & MEIRELES, 2009, com permisso).
Diversos solventes podem ser utilizados como fluido supercrtico. A Tabela 3 apresenta as propriedades
crticas de alguns solventes. Dentre esses diversos solventes, o mais empregado o dixido de carbono (CO
2
)
devido a sua atoxicidade, inodoro, no inflamvel, alta volatilidade, alta difusividade, baixa viscosidade,
apolaridade e custo relativamente baixo.
TABELA 3 - Propriedades crticas de substncias puras.
Solvente
Temperatura
crtica (K)
Presso crtica
(bar)
Volume crtico
(cm/mol)
CO2 304,1 73,7 94,1
Etileno 282,3 50,4 131,0
Xenon 290,1 58,0 118,0
Eter Dimetlico 400,1 52,7 171,0
Etano 305,3 48,7 145,5
Propano 369,8 42,5 200,0
Amnia 405,4 113,5 72,5
n-Hexano 507,5 30,2 368,0
Metanol 512,6 80,9 118,0
gua 647,1 220,6 55,9
66
O CO
2
supercrtico um timo solvente para extrair substncias apolares e de baixa polaridade, no
entanto, quando se trata de extrair substncias mais polares, como flavonoides, seu poder de extrao
reduzido. Para contornar esse fato, normalmente faz-se o uso de um cossolvente, ou modificador, que altera
a polaridade do solvente supercrtico. Dessa forma, o uso de cossolvente amplia a faixa de aplicao de fluidos
supercrticos por permitir o aumento no espectro de substncias extradas. Pelo menos 17 cossolventes tm
sido utilizados em estudos com fluido supercrtico para obteno de substncias a partir de produtos naturais.
De todos esses modificadores, o metanol o solvente polar mais utilizado. Acredita-se que elevada
porcentagem de metanol (MeOH) pode romper o vnculo soluto-matriz slida obteno de substncias
bioativas. No entanto, quando se trata de obteno de produtos para fins alimentcios, devido a sua elevada
toxicidade, o metanol tem sido descartado. Etanol (EtOH) outra boa escolha por possuir baixa toxicidade. De
um modo geral, em produtos naturais, os solventes mais utilizados como modificadores so: etanol, isopropanol,
metanol, gua e mistura dessas substncias (LANG & WAI, 2001).
Sabemos que os produtos naturais so fonte de substncias bioativas das mais diferentes classes:
substncias volteis, carotenoides, flavonoides, alcaloides, esteroides, entre outros. A extrao das diferentes
classes por SFE possvel graas flexibilidade operacional desse processo. Isso porque mudanas na
temperatura e presso provocam mudanas na densidade do solvente supercrtico, e essa mudana altera
seu poder de solvatao, ou seja, possvel extrair substncias mais leves ou mais pesadas, dependendo da
densidade do solvente supercrtico conseguida naquela dada temperatura e presso. Nesse sentido, possvel
extrair substncias de interesse de diferentes classes, desde substncias volteis at lipoflicas, desde que se
ajustem as condies ideais de temperatura e presso no processo de SFE. Substncias mais volteis, por
exemplo, so extradas em condies mais amenas, com temperatura variando entre 30 e 50 C e presses
que variam de 80 a 250 bar (SIMNDI et al., 1998; FRANCISCO et al., 2001; RODRIGUES et al., 2003; BRAGA et
al., 2005; KOTNIK et al., 2007).
Os carotenoides so outra classe de substncias de grande importncia por sua aplicao em termos
de pigmentao (amarelo a vermelho prpura) e bioatividade (precursor da vitamina A, ao antioxidante,
ao sobre o sistema cardiovascular). Normalmente, essas substncias so extradas com solvente orgnico.
No entanto, devido a sensibilidade luz e calor e instabilidade, podem facilmente sofrer oxidao ou
isomerizao. A extrao com fluidos supercrticos normalmente realizada em condies intermedirias,
com temperaturas at 40 C 50 C, e presso at 500 bar.
Substncias fenlicas, por sua vez, possuem estruturas que podem ser simples ou bem complexas, o
que pode facilitar ou no a sua solubilidade no solvente empregado. Nesses casos, comum o emprego de
cossolvente. Substncias fenlicas tm sido extradas em condies intermedirias, com presso entre 200 e
400 bar, e temperaturas que variam de 35 a 60 C, com uso de etanol como cossolvente (0-25%) (CHIU et al.,
2002; GOLI et al., 2005; PEREIRA et al., 2008a; PIANTINO et al., 2008).
Substncias mais lipoflicas tambm podem ser extradas com CO
2
supercrtico, como vitaminas,
tocoferis e tocotrienis (DE LUCAS et al., 2002; MENDES et al., 2002; GULU-USTUNDAG & TEMELLI, 2004).
De um modo geral, observa-se que a solubilidade de uma determinada substncia em um fluido supercrtico
diminui com o aumento da massa molecular do soluto. Por exemplo, a solubilidade do cido mirstico
67
(MM=228,38 g/gmol) em CO
2
supercrtico maior que as solubilidades dos cidos palmtico (MM=256,43 g/
gmol) e oleico (MM=282,47g/gmol) (GULU-USTUNDAG & TEMELLI, 2000).
Muitas vezes em uma mesma matriz vegetal existe mais de uma substncia/classe de substncias de
interesse. Devido facilidade em se alterar as condies operacionais, possvel ainda obter separadamente
as diversas classes de substncias em um mesmo processo com fluidos supercrticos. Essa peculiaridade
possvel ser realizada em um mesmo equipamento, com alterao das condies operacionais ao longo do
processo, ou com uso de mais de uma coluna operando em condies distintas. Esse tipo de processo
denominado extrao fracionada. A mudana nas condies de temperatura e presso altera a densidade do
solvente supercrtico e assim seu poder de solvatao. Por exemplo, Braga (2005) extraiu leos volteis e
curcuminoides de Curcuma longa L. realizando o processo de extrao em duas etapas. Na primeira etapa, o
processo ocorreu a 35 C e 225 bar sem uso de cossolvente, em um segundo momento, utilizou-se uma
mistura de etanol+isopropanol (1:1; volume:volume) como cossolventes (50%) a 30 C, 300 bar. Desde que
as substncias de interesse sejam os curcuminoides, na primeira etapa do processo ocorreu a remoo das
substncias volteis, permitindo assim que os curcuminoides pudessem ser recuperados com elevada pureza
no segundo estgio.
Comparativamente, estudos tm mostrado que a extrao com fluidos supercrticos uma excelente
alternativa aos mtodos convencionais. Alm de ser considerado uma tecnologia limpa, pelo fato de no se
verificar resduo de solvente no extrato final quando se aplica CO
2
supercrtico, o processo de extrao com
fluidos supercrticos apresenta menor gasto energtico quando comparado aos processos convencionais.
Alm disso, por empregar temperaturas mais amenas, esse processo indicado para extrair substncias
termolbeis. No entanto, o custo fixo inicial do equipamento mais elevado, o que inibe a aplicao do
processo em empresas de menor porte. Essa tecnologia recomendada para obteno de substncias com
elevado valor agregado, indicado para indstrias que processam produtos naturais para obteno de substncias
bioativas com alto grau de pureza.
Diante disso, pesquisas com uso da tecnologia supercrtica crescem a cada ano e tem reforado e
demonstrado a viabilidade tcnica na obteno dessas substncias. Martinez (2008), recentemente, discutiu
informaes importantes sobre a aplicao dessa tecnologia na obteno de substncias bioativas e
nutracuticos em seu livro Supercritical Fluid Extraction of Nutraceuticals and Bioactive Compounds. Pereira
& Meireles (2009) apresentaram uma extensa reviso da literatura, apresentando dados especficos na extrao
de cada grupo de substncias (leos essenciais, substncias fenlicas, carotenoides, tocoferis e tocotrienis),
elucidando tambm aspectos importantes do processo como solubilidade, extrao/fracionamento e anlise
de custo do processo.
Neste cenrio, observa-se que essa tecnologia, embora, aparentemente, considerada de elevado
custo, por causa do custo do equipamento e no por causa do processo em si, apresenta reais condies de
ser empregada para a obteno de substncias sensveis com bioatividade e de alto valor agregado. O que de
fato tem sido comprovado pelo aumento de unidades industriais que fazem uso dessa tecnologia como base
do processo: nos ltimos 20 anos cerca de 100 colunas de extrao de 100 L foram instaladas na Europa, EUA,
Japo e pases do Sudeste Asitico (BRUNNER, 2005).
68
EXTRAO POR MICRO-ONDAS
Um mtodo novo empregado para obteno de substncias bioativas a extrao por micro-ondas.
Diferente dos processos de extrao slido-lquido (seja a baixa ou a alta presso), a extrao por micro-
ondas ocorre devido s modificaes nas estruturas celulares induzidas pelo efeito das ondas
eletromagnticas.
As micro-ondas so ondas eletromagnticas de energia no ionizada com freqncia de 0,3 a 300
GHz. O princpio do processo de extrao diferente dos mtodos anteriormente citados. Neste, a energia
das micro-ondas que incide sobre o material slido penetra nesse e interage com molculas polares, gerando
calor. O aquecimento interno do material provoca a ruptura da estrutura celular, permitindo a exposio dos
constituintes ao solvente. O resultado o contato maior do solvente com os slidos e a maior taxa de
transferncia de massa do material para o solvente.
Neste processo no indicado utilizar o material totalmente seco. Na verdade, a presena de gua no
material slido essencial para acontecer a extrao, pois a absoro da energia feita, principalmente, pela
gua que est presente no material slido.
O uso dessa tecnologia ainda muito recente, no entanto importantes resultados tm sido
demonstrados. A Tabela 4 apresenta alguns casos de aplicao dessa tecnologia para obteno de substncias
bioativas.
EXTRAO POR ULTRASSOM
Assim como na extrao por micro-ondas, a extrao por ultrassom ocorre devido a modificaes
nas estruturas celulares, no entanto, nesse caso ao invs de ondas eletromagnticas, aqui se aplica o
ultrassom.
As ondas de ultrassom so vibraes mecnicas com frequncias maiores de 20 kHz. A diferena
entre ultrassom e ondas eletromagnticas, alm da faixa de frequncia aplicada, que a transferncia de
energia pelas ondas de ultrassom s possvel se houver material para essa se propagar, no entanto, para
as ondas eletromagnticas, a transferncia de energia pode ser feita tambm no vcuo.
O princpio de extrao baseado nos ciclos de compresso e expanso que o material sofre pelo
efeito do ultrassom. Os ciclos promovem a formao de bolhas de lquido que, devido ao seu crescimento ao
longo dos ciclos, entram em colapso provocando a quebra da parede celular. Como resultado, o solvente
permeia mais facilmente no sistema aumentando a taxa de transferncia de massa entre o material slido e
o solvente.
Assim como a tecnologia de extrao com micro-ondas, esse mtodo ainda muito recente, no
entanto tm-se verificado importantes avanos na obteno de substncias com atividades funcionais, como
pode ser observado na Tabela 4.
Diante do exposto, temos uma variedade de processos de extrao que podem ser utilizados para a
obteno de substncias bioativas. A escolha do processo vai depender das condies da indstria e/ou do
produto final desejado.
69
TABELA 4 - Exemplos de aplicao de extrao por micro-ondas e ultrassom na obteno de substncias
bioativas.
1- Deng et al. (2006), 2- Alfaro et al. (2003), 3- Pan et al. (2003), 4- Hao et al. (2002), 5- Liazid et al. (2007), 6-
Gutierrez et al. (2008), 7- Ma et al. (2008), 8- Paniwnyk et al. (2001), 9- Fulzele et al. (2005), 10- Hromadkova
et al. (1999).
70
AGRADECIMENTO
A autora agradece o apoio do INCT_if e do CNPq para o desenvolvimento desse trabalho.
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1
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MTODOS IN SILICO PARA ELUCIDAO ESTRUTURAL DE
SUBSTNCIAS: FUNDAMENTOS, METODOLOGIAS E APLICAES
EM PRODUTOS NATURAIS E METABOLMICA
Fernando Batista da Costa
Marcus Tullius Scotti
INTRODUO
A elucidao estrutural de substncias uma
atividade muito antiga e tem sua origem registrada
no sculo XVIII, poca em que o homem ainda nem
possua o devido conhecimento terico sobre
estrutura molecular. Desde ento, as estratgias
empregadas por um especialista para elucidar a
estrutura de uma substncia desconhecida pouco
mudaram, pois elas envolvem fundamentos bsicos
em que so geradas e testadas hipteses com o intuito
de se chegar soluo de um problema. Entretanto,
de l para c houve um enorme avano nas etapas
aquisio, processamento e manipulao de dados
espectrais, incluindo o desenvol vimento de
espectrmetros e softwares. Recentemente, com a
74
enorme quantidade de dados gerados, continuamente, que necessitam ser processados aliado necessidade
de otimizar tempo, os computadores se tornaram indispensveis para auxiliar o homem nas diferentes etapas
desse processo. Do simples desenho de uma estrutura qumica at a sua elucidao estrutural automatizada,
passando-se pelo seu armazenamento e busca em bancos de dados, gerao de propriedades estruturais,
alm da visualizao e manipulao de espectros, os programas de computador hoje so vitais, seja para a
academia ou para as empresas.
No mbito da elucidao estrutural de substncias orgnicas, a qumica de produtos naturais , sem
dvida, a rea da Cincia que mais contribui para grandes avanos. Sua contribuio enorme, chegando
a causar impacto at na quantidade e qualidade dos dados espectrais de ressonncia magntica nuclear
(RMN) que so publicados em peridicos especializados, por exemplo, quando estes so comparados
queles oriundos de outras reas, tais como a sntese orgnica ou a qumica de compostos heteroccliclos
(ROBIEN, 2009). A principal explicao que pode ser dada para todo esse avano a elevada diversidade e
complexidade estrutural das substncias isoladas de matrizes biolgicas como plantas, microrganismos e
organismos marinhos. O processo de desreplicao de tais matrizes e a consequente determinao estrutural
das substncias presentes em misturas tm se tornado ainda mais urgentes com o advento dos estudos de
metaboloma. Tal fato pode ser justificado pelo prprio objetivo da metabolmica, que no apenas realizar
uma acurada deteco de estruturas qumicas em vrias matrizes biolgicas. Na verdade, o que se almeja
analisar os dados obtidos por meio dos mtodos analticos com intuito de extrair a informao neles
contida para, finalmente, se poder efetuar a determinao estrutural e estudar sua variao em sistemas
biolgicos (DUNN et al., 2005; van der KOOY et al., 2009).
Nesse contexto que a aplicao de mtodos in silico para elucidao de substncias passa a
ser importante e ganha enorme espao, pois pode auxiliar em cada uma das diferentes etapas de todo
o processo. Esses mtodos envolvem o uso de algoritmos, mtodos estatsticos e de Inteligncia
Artificial (IA) que so desenvolvidos e incorporados em sistemas, aplicativos e programas de computador
que auxiliam o usurio a elucidar estruturas qumicas (STEFANI et al., 2007). Como consequncia, o
estudo e a aplicao de mtodos estatsticos, quimiomtricos e de quimioinformtica para essa
finalidade esto em ascenso. Cabe ressaltar a evoluo da elucidao estrutural de substncias auxiliada
por computador propriamente dita, traduo do termo em ingls Computer-Aided Structure Elucidation
(CASE), que trata do processo de determinao da estrutura qumica de uma substncia desconhecida
com base em seus dados espectroscpicos experimentais e no conhecimento prvio de suas
propriedades, empregando-se, exclusivamente, programas de computador (STEINBECK, 2004;
ELYASHBERG et al., 2010).
O objetivo deste captulo , portanto, por meio de exemplos e com uma linguagem acessvel, mostrar
ao leitor interessado na rea de Qumica de Produtos Naturais e de outras correlatas, tais como da Ecologia
Qumica, Sntese Orgnica e Cincias Farmacuticas, como as diferentes ferramentas in silico podem
efetivamente auxiliar na elucidao de substncias de origem natural. Alguns conceitos, fundamentos bsicos
e modalidades de elucidao estrutural automatizada sero discutidos, incluindo-se a descrio sobre o
funcionamento dos algoritmos mais comuns e a capacidade de alguns programas de computador auxiliarem
na elucidao de estruturas de substncias naturais e em estudos de metaboloma. Na opinio dos autores,
esse texto , portanto, uma das raras contribuies na lngua portuguesa para esse setor importante da
informao qumica aplicada a produtos naturais e reas correlatas.
75
HISTRICO
O primeiro projeto de elucidao estrutural automatizada foi o DENDRAL, baseado no nome DENDRitc
ALgorithm (LINDSAY et al., 1980). Esse projeto, iniciado a partir de 1965 na Universidade de Standford, EUA,
partiu do desenvolvimento de algoritmos para tratamento de dados de espectrmetros de massas. O programa
funcionava com a estratgia clssica denominada planejar-montar-testar e, durante o projeto, foram sendo
adicionados diversos algoritmos e outros dados espectroscpicos, como RMN-
13
C, com o objetivo de aumentar
a capacidade de elucidao. Em todos os casos o sistema confrontava os dados do espectro-problema com o
banco de dados que contm uma significativa lista de fragmentos compatveis com o espectro e a frmula
molecular obtidos da espectrometria de massas. A partir dessa etapa, era necessria a interveno do usurio
que deveria informar quais grupos funcionais e/ou subestruturas estavam presentes ou ausentes.
A partir dessa experincia, foram gerados outros sistemas como o CONGEN (CONectivity GENerator)
e o GENOA (GENeration with Overlapping Atoms) (MASINTER et al., 1974; CARHART et al., 1981). Outro
software, mais recente e avanado que o DENDRAL, mas ainda pioneiro, o DARC/EPIOS (Direct Acess Radar
Channel/Elucidation by Progressive Intersection of Ordered Substructures) (DUBOIS & SOBEL, 1985). Como
era um sistema especialista clssico de determinao estrutural, assim como o DENDRAL, tambm possua
um banco de dados de fragmentos estruturais. Porm, esses fragmentos eram baseados em um tomo de
carbono central ligado aos seus respectivos vizinhos contendo a descrio de deslocamentos qumicos,
sendo que estas subestruturas, conhecidas como ELCOs (Environment Limited and Concentric Ordered)
(DUBOIS et al., 1984), eram capazes de descrever diversos ambientes qumicos. O DARC/EPIOS necessitava
de uma menor interveno do usurio para a determinao da estrutura-problema por possuir um algoritmo
mais eficiente que o do DENDRAL.
O sistema especialista PAIRS (Program for the Analysis of IR Spectra), desenvolvido por Woodruff &
Smith (1980), era capaz de analisar espectros no infravermelho (IV) de modo semelhante a um espectroscopista.
Em 1994, Chalmers e colaboradores usaram uma abordagem automatizada de interpretao da transformada
de Fourier para espectros de Raman de polmeros complexos (CLAYBOURHN et al., 1994). O sistema EXPIRS
outro sistema desenvolvido para anlise de espectros no IV (ANDREEV et al., 1993), que organiza,
hierarquicamente, grupos caractersticos que so reconhecidos pelos picos detectados. Plamen et al. (2000)
desenvolveram um sistema computacional que realiza buscas em bancos de dados espectrais, classificando
espectros no IV com a ajuda de anlise linear discriminante, redes neurais artificiais e o mtodo dos k-vizinhos
mais prximos (k-Nearest Neighbors kNN).
Um programa que era baseado em um banco de dados de RMN-
13
C de estruturas completas foi
desenvolvido por Munk et al. (1996). Nesse programa, o usurio informa os dados experimentais de RMN-
13
C
e o nmero mnimo de sinais e de solues que devem apresentar. Com as informaes fornecidas pelo
usurio, o sistema especialista faz uma busca dos dados no banco, filtrando aqueles compatveis, os quais,
com o nmero mnimo de sinais requeridos, so novamente filtrados, excluindo as estruturas duplicadas.
Outros programas foram desenvolvidos, tais como o ASSEMBLE, SESAMI e HOUDINI (SHELLEY & MUNK,
1982; MADISON et al., 1998; KORYTKO et al., 2003). O ASSEMBLE se diferenciou dos demais por no possuir
um banco de dados e por no trabalhar com dados espectromtricos, sendo ento pouco til, pois, inicialmente,
apenas gerava todos os ismeros possveis a partir da frmula molecular, tendo um aumento exponencial de
estruturas possveis e alto custo computacional com o aumento do nmero de tomos. Portanto, a ele foram
adicionadas opes de fragmentos que o usurio indicava como sendo possveis de haver na estrutura ou que
deveriam estar ausentes (SHELLEY & MUNK, 1982). O SESAMI, (Systematic Elucidation of Structure Applying
76
Machine Intelligence) (Madison et al., 1998; Korytko et al., 2003), tambm do mesmo grupo de pesquisa,
possui um gerador que trabalha primeiro procurando todos os centros quirais possveis na molcula, em
conjunto com as restries impostas pelo usurio. Seu algoritmo baseado em tabelas que correlacionam
estruturas com caractersticas de um espectro. Atualmente, esse sistema denominado de HOUDINI, o qual
tambm utiliza dados de RMN bidimensionais (2D) (KORYTKO et al., 2003).
Todos os programas CASE descritos at aqui so capazes de gerar estruturas qumicas atravs da
montagem de tomos e/ou fragmentos de molculas. Porm, outra estratgia baseada na gerao de
estruturas atravs da remoo de ligaes de uma hiperestrutura que, inicialmente, contm todas as possveis
ligaes entre todos os tomos e fragmentos moleculares necessrios. Softwares baseados nesse conceito
so o COCOA (Constrained COmbination of ACFs, onde ACFs so Atom-Centered Fragments) (BANGOV,
1990) e o GEN (BOHANEC & ZUPAN, 1991).
Como foi descrito anteriormente, mais recentemente foi desenvolvido o sistema HOUDINI a
partir do SESAMI, os quais utilizam dados de RMN mono e bidimensionais juntamente com a frmula
molecular da estrutura desconhecida (MADISON & MUNK, 2003). Assim como o COCOA e o GEN, o
HOUDINI envolve primeiro a criao de uma hiperestrutura com todas as ligaes possveis entre seus
tomos e, a partir deste ponto, as ligaes excedentes so removidas de acordo com as valncias
atmicas e correlaes bidimensionais, restando poucas estruturas compatveis com os dados
experimentais.
O sistema CSEARCH (Carbon NMR, Spectral Database, Environment, Sophisticated Algorithms,
Reliable Results, Clever Implementation, Highly Interactive), desenvolvido por Kalchhauser & Robien
(1985), baseado no sistema de procura desenvolvido pelo grupo de Munk (SHELLEY & MUNK, 1982),
porm com a adio de algumas melhorias, como por exemplo o cdigo HOSE (Hierarchical Ordered
Spherical Description of Environment, BREMSER, 1978), o qual ser descrito com maiores detalhes na
seo Metodologias, Tcnicas Computacionais e Algoritmos. O programa realiza a predio de
deslocamentos qumicos de RMN-
13
C e buscas por grupos funcionais e similaridade de espectros, sendo
tambm capaz de quebrar as estruturas encontradas em fragmentos de at trs tomos, combinando-os
depois a outras estruturas. O CSEARCH ser abordado em detalhes na seo denominada Banco de
Dados.
O sistema CHEMICS (Combined Handling of Elucidation Methods for Interpretable Chemical Structures)
(KUDO & SASAKI, 1976; SASAKI & KUDO, 1985), desenvolvido por um grupo de pesquisadores japoneses,
tambm utiliza algoritmos semelhantes aos usados pelo DENDRAL e DARC/EPIOS e capaz de tratar dados
de RMN bidimensionais para descartar fragmentos invlidos durante a gerao estrutural. O ACCESS outro
sistema desenvolvido que combina um gerador estrutural com a busca de biblioteca de espectros (BREMSER
& FACHINGER, 1985).
possvel observar com esses exemplos que o desenvolvimento de programas para auxlio na
elucidao estrutural de substncias no uma atividade recente e atualmente existem vrias modalidades,
desde os simples simuladores aos sistemas CASE completos envolvendo geradores estruturais, o que ser
abordado nas sees seguintes.
77
FUNDAMENTOS BSICOS E ESTRATGIAS DA ELUCIDAO
ESTRUTURAL DE SUBSTNCIAS EMPREGANDO MTODOS IN SILICO
FUNDAMENTOS BSICOS DA REPRESENTAO DE ESTRUTURAS QUMICAS
NO COMPUTADOR
Antes de discutir sobre as estratgias e modalidades de elucidao estrutural de substncias orgnicas
atravs de mtodos in silico e os programas disponveis, importante considerar a representao de estruturas
qumicas no computador. Tomando-se como exemplo a predio de propriedades moleculares atravs de
algoritmos de aprendizado, pode-se afirmar que uma boa predio comea com a boa qualidade da estrutura
qumica que apresentada a um dado programa. Surge ento uma pergunta bsica: como apresentar uma
estrutura qumica a um computador de modo que ele consiga interpret-la? Em outras palavras, como o
computador consegue enxergar, por exemplo, a efedrina, substncia natural isolada de espcies vegetais do
gnero Ephedra L.? Embora a estrutura qumica seja a linguagem natural dos qumicos, o mesmo no se aplica
aos computadores, os quais trabalham com uma outra linguagem, a dos bits e bytes (Figura 1). Portanto, foi
necessrio o homem desenvolver modelos para que as estruturas qumicas pudessem ser representadas e
entendidas pelos programas de computador.
FIGURA 1 | Computadores no conseguem imaginar como a molcula da
efedrina sem que ela lhes seja devidamente representada.
No passado, foram iniciados os primeiros estudos para representar a informao qumica, inicialmente
em textos de livros e mais tarde em peridicos. Em outras palavras, atravs dos tempos foi necessrio
78
desenvolver mtodos adequados para que uma dada substncia qumica fosse, adequadamente, representada
e entendida, primeiro no papel e depois na forma eletrnica. No caso das substncias orgnicas, inicialmente
elas receberam nomes para caracteriz-las. Em seguida, foram atribudas frmulas e nomes sistemticos,
chegando-se ento s representaes mais complexas envolvendo tomos, ligaes qumicas, geometria e
estereoqumica (ENGEL, 2003). Com o aumento vertiginoso da quantidade de dados disponveis em qumica
e a massificao do uso de computadores, em especial nas ltimas duas dcadas, surgiram vrios programas
para desenhar, editar, visualizar e compartilhar estruturas qumicas em duas ou trs dimenses (2D e 3D),
bem como possibilitar seu armazenamento e consulta em bancos de dados. Porm, como essa informao
processada? Qual sua influncia na qualidade da predio de propriedades, por exemplo, os deslocamentos
qumicos de RMN?
Hoje em dia, bastante comum desenhar e armazenar estruturas de substncias orgnicas em
programas de computador, os chamados editores de molculas, sejam eles proprietrios, gratuitos (freeware),
de cdigo aberto (open source) e de acesso livre ou pblico (open access), estejam eles instalados em um
nico computador (standalone), disponveis em rede, online em pginas da internet ou como applets. O
modo grfico disposio do usurio (interface grfica do usurio Graphical User Interface ou GUI) para
desenhar estruturas, com poucas excees, basicamente o mesmo na maioria dos programas. Entretanto,
para armazen-las, os proprietrios possuem os seus prprios formatos: por exemplo, o ChemDraw da empresa
CambridgeSoft possui o formato .cdx, o ChemSketch da ACD/Labs possui o formato ISIS sketch Extension .sk2
e o sucessor do ISIS/Draw, o Symyx Draw da Accelrys/Symyx, possui o formato .skc, todos eles capazes de
armazenar estruturas 2D. No caso de estruturas 3D, o HyperChem da Hyperclube Inc. opera com o formato
.hin e o Spartan da Wavefunction, Inc. com o .spartan, porm as estruturas 3D tambm podem ser armazenadas
em formato .pdb (Protein Data Bank), o qual pode ser lido por quase todos os programas adequados a essa
finalidade.
No sero discutidos aqui os detalhes sobre os diferentes formatos de cada programa, com exceo
de dois deles, que j no so mais proprietrios: o formato .mol da MDL e o .smi (SMILES) da Daylight. Esses
formatos so muito importantes, porque podem ser lidos e compartilhados pela grande maioria dos editores
de estruturas e tambm pelos programas mais avanados de informao qumica. Funcionam como uma
espcie de moeda de troca para informao de estruturas qumicas e so o formato de escolha dos programas
open access e freeware, englobando os de edio de espectros e de elucidao estrutural. Alm disso,
utilizando-se programas especficos, a partir desses formatos podem ser obtidas coordenadas em 3D e
realizadas rotinas de modelagem com as estruturas.
O formato Mol da MDL, ou arquivo Mol (Molfile), um dos poucos que amplamente aceito pela
comunidade mundial para o armazenamento e troca de informaes de estruturas qumicas e reaes. Foi
descrito nos anos 1980 por Dalby e colaboradores que trabalhavam na empresa Molecular Design Limited
(MDL), tendo sido inicialmente criado para os prprios programas desenvolvidos pela MDL (DALBY et al.,
1992). Entretanto, tornou-se o padro de vrias outras empresas, inclusive para o armazenamento e troca de
propriedades moleculares. Um arquivo Mol descreve uma nica estrutura molecular e composto por
fragmentos ou blocos. Outro formato bastante similar, denominado arquivo SD (SDfile), pode descrever vrias
estruturas em um nico arquivo, sendo o mais conveniente para manipular um conjunto delas, especialmente
para a transferncia de informao entre bancos de dados ou desses para ferramentas de anlise de dados.
Um arquivo Mol tem como origem uma tabela de conexo, que por sua vez origina-se da teoria dos grafos e
matrizes, que so notaes matemticas muito estudadas para a representao de estruturas qumicas (ENGEL,
2003). A tabela de conexo tem sido a principal forma de representar estruturas qumicas desde os anos
79
1980. Basicamente, envolve uma lista (ou bloco) de tomos e outra contendo suas ligaes qumicas. Essas
listas ou blocos esto, adequadamente, dispostos em um arquivo que os converte em uma estrutura
qumica na GUI dos editores moleculares. Ao se abrir um arquivo Mol em um editor de textos comum,
podem ser visualizados valores numricos e smbolos atmicos em uma arquitetura subdividida em quatro
blocos. Os dois maiores o bloco de tomos, na parte superior, e o de ligaes, na parte inferior compem
a base de uma tabela de conexo, como mostrado na figura 2, referente ao arquivo Mol da estrutura 2D
da efedrina.
FIGURA 2 | Arquivo Mol da estrutura 2D da efedrina aberto com um editor de
textos.
O SMILES da Daylight foi criado por David Weininger em 1986, para o processamento de dados
qumicos (ENGEL, 2003). Na verdade, o SMILES uma notao qumica em linha usada para representar
estruturas e reaes e que gera arquivos em formato .smiles ou .smi. Seu nome vem de Simplified Molecular
Input Line Entry Specification, o que revela sua principal caracterstica, ou seja, uma representao molecular
simplificada e compacta, alm de ser flexvel, fcil de compreender e de carter universal, independente do
software e da arquitetura de hardware utilizados. A representao estrutural no SMILES dada por um
conjunto de regras que renem uma combinao de smbolos atmicos e sinais que indicam valncias,
ramificaes, anis, aromaticidade, geometria molecular e at estereoqumica. Esse arquivo tambm pode
ser aberto com um editor de textos comum. A estrutura da efedrina representada por meio da seguinte
notao SMILES:
80
CN[C@@H](C)[C@H](O)C1=CC=CC=C1
Portanto, para a representao de estruturas pode-se utilizar os formatos Mol e SMILES. Eles esto
disseminados tanto na comunidade acadmica como nas empresas que trabalham com informao
qumica e obviamente nos programas destinados a auxiliar na elucidao estrutural. Pode-se resumir a
representao estrutural em computador tomando-se como exemplo a substncia efedrina. Ela pode ser
representada por uma estrutura desenhada em um editor que a armazena em um arquivo 2D, o qual
contm informaes sobre sua constituio que podem estar embutidas tanto no formato .mol como
.smiles. Essa estrutura 2D pode ser convertida para uma 3D e sua nova representao ir conter
informaes sobre sua topologia e geometria, sendo ento possvel visualiz-la, por exemplo, em formato
.pdb, em um outro programa apropriado. A visualizao de estruturas em 3D importante, porque por
meio dela possvel analisar em detalhes a disposio espacial de seus tomos e sua estereoqumica. O
modelo de representao e visualizao da efedrina discutido mostrado na figura 3, onde est
esquematizada a forma universal de entrada/sada de informao qumica em um computador. A estrutura
2D desenhada em um editor grfico de molculas e, automaticamente, convertida em uma das possveis
representaes estruturais (ou formato compreendido apenas pelo programa utilizado), podendo ser
armazenada, por exemplo, em formato .mol ou .smi. Por fim, as coordenadas 3D dessa estrutura podem
ser obtidas por meio de um programa apropriado e armazenadas em um formato especfico, como por
exemplo, o .pdb, e ento ela pode ser visualizada em um outro programa adequado para essa finalidade.
Esse processo todo de entrada/sada totalmente reversvel. Logo, a visualizao de uma estrutura em
um programa nada mais do que a converso das notaes em figuras atravs de uma GUI e estrutura
interna apropriada.
FIGURA 3 | Representaes e visualizao da estrutura da efedrina em 2D e
3D.
81
DESENHANDO CORRETAMENTE ESTRUTURAS QUMICAS
Deve ficar claro que no basta apenas entender sobre os programas, formatos de arquivos e
representao qumica de estruturas se elas no forem desenhadas corretamente. sabido que a qualidade
das informaes qumicas influenciada pelo modo como as estruturas so desenhadas nos editores
moleculares. Por exemplo, deve-se tomar bastante cuidado com a correta representao de ligaes duplas
em ismeros Z e E, orientao espacial de tomos na fuso de anis em policiclos, a orientao espacial dos
substituintes de um dado tomo de carbono sp
3
, entre outros. A qualidade das informaes qumicas como
consequncia da forma de desenhar torna-se ainda mais drstica quando uma dada estrutura possui um ou
mais centros quirais e sua estereoqumica relativa necessita ser representada para se realizar, por exemplo,
predies de deslocamentos qumicos de RMN, uma das modalidades mais empregadas na atualidade. Nesses
casos, a atribuio da correta estereoqumica relativa passa a ser obrigatria. Estruturas sem nenhuma atribuio
de estereoqumica ou geometria tambm correm o risco de terem as predies de seus deslocamentos
qumicos prejudicadas, podendo levar a srios erros de interpretao de espectros.
A explicao para todos esses cuidados que a grande maioria dos algoritmos presentes nos softwares
para predio de deslocamentos qumicos de RMN e simulao de espectros possui uma arquitetura tal que
leva em considerao informaes sobre a geometria molecular e a estereoqumica, o que ser abordado nas
sees seguintes. Conclui-se ento que um bom programa desenvolvido, para realizar predies de
deslocamentos qumicos de RMN de forma acurada, deve possuir um algoritmo que seja capaz de utilizar tais
informaes. Porm, ao final, entrar com os dados corretos cabe apenas ao usurio, que alm de dominar um
determinado programa de computador, dever obrigatoriamente ter conhecimento das regras bsicas de
representao estrutural, o que por sua vez resultado de seus conhecimentos de Qumica Orgnica.
ESTRATGIAS PARA ELUCIDAO ESTRUTURAL DE SUBSTNCIAS: O HOMEM
E A MQUINA
Como foi mencionado na introduo, h muito tempo o homem adquiriu experincia em elucidao
estrutural e o modus operandi seguido por ele no evoluiu muito desde ento, ao contrrio das tcnicas
espectroscpicas e equipamentos utilizados no processo.
Aps o isolamento e a purificao de uma substncia desconhecida, ou aps a sua sntese, a prxima
etapa a determinao ou elucidao de sua estrutura qumica, a qual realizada seguindo-se basicamente
trs passos. Inicialmente, obtido um conjunto de espectros e, a partir de seus respectivos dados, os quais so
analisados por um especialista, ou seja, um ser humano, so propostos fragmentos compatveis. Em seguida,
os fragmentos propostos so analisados, alguns so descartados e outros combinados, e ento estruturas
hipotticas so geradas. Por fim, as estruturas geradas so testadas (validadas) com intuito de se chegar a uma
nica que seja compatvel com os dados espectrais (ELYASHBERG et al., 2008).
A estratgia descrita no pargrafo anterior realizada pela maioria dos especialistas em elucidao
estrutural a partir dos dados espectrais. Os dados analisados so oriundos de um conjunto inicial de espectros,
como infravermelho (IV), ultravioleta (UV), RMN e espectrometria de massas (EM). Em relao RMN, dados
de RMN-
1
H, RMN-
13
C e DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) geralmente so utilizados
no incio do processo de elucidao. Assim, propostas envolvendo grupos funcionais, fragmentos estruturais,
conectividade entre tomos, isomeria e estereoqumica relativa so obtidas e, exaustivamente, analisadas,
82
sempre com auxlio de informaes da literatura. Quando se chega a uma proposta final e constatado que
a estrutura proposta j conhecida, sua validao feita atravs dos dados da literatura. Entretanto, quando
o grau de complexidade da estrutura a ser elucidada muito elevado, ou a mesma ainda no foi descrita na
literatura, necessria a obteno de espectros bidimensionais e a realizao de tcnicas especiais (ELYASHBERG
et al., 2008). Como exemplos, podem ser citados o NOE (Nuclear Overhauser Effect), espectroscopia
bidimensional homo e heteronuclear tais como
1
H-
1
H COSY (COrrelated SpectroscopY), HMQC (Heteronuclear
Multiple Quantum Coherence), HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) e HMBC (Heteronuclear
Multiple Bond Correlation), alm de NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY), TOCSY (TOtal
Correlation SpectroscopY), J-RES (J-REsolved Spectroscopy), dentre outros. Em alguns casos, o raio-X da
substncia tambm passa a ser importante (STEFANI & DA COSTA, 2007).
Embora parea simples, essa estratgia composta de vrias etapas que tornam todo o processo
moroso e complexo, demandando muito esforo e necessitando da ajuda de um ou mais especialistas,
havendo ainda outras limitaes. Essa estratgia realizada pelo humano tecnicamente chamada de heurstica,
termo que implica a capacidade de solucionar um problema com base em regras empricas estabelecidas
pela experincia prpria. No caso da elucidao estrutural de produtos naturais, o mtodo heurstico ainda
pode envolver outras etapas, como por exemplo, anlise quimiotaxonmica, avaliao da origem biossinttica
de molculas, uso de bibliotecas de substncias e de bancos de dados espectrais. Pode-se concluir que o
sucesso da elucidao estrutural de um produto natural complexo muitas vezes depende quase,
exclusivamente, da experincia da pessoa envolvida. Entretanto, sabido que muitas vezes o ser humano
pode se cansar, errar e ser tendencioso. Da a importncia de se empregar mtodos in silico, sendo que em
muitos deles as estratgias empregadas so basicamente as mesmas do especialista, porm demandando
muito menos tempo e realizando anlises exaustivas e bem mais complexas, tudo isto sem incorporar alguns
vcios do ser humano (STEFANI & DA COSTA, 2007).
Com relao elucidao estrutural auxiliada por computador, o programa ideal seria aquele que, a
partir dos dados experimentais, fosse capaz de fornecer em poucos segundos a estrutura qumica da substncia
em questo sem nenhuma ou com a mnima interferncia do especialista. Entretanto, ainda est longe de
haver programas com esta capacidade, embora quase todos eles se baseiem no mesmo modo de pensar do
especialista.
Na verdade, no mbito da elucidao estrutural automatizada existem diferentes categorias de
programas que se baseiam na estratgia clssica denominada por alguns autores de planejar-gerar-testar
(ou planejar-montar-testar, como mencionado no incio da seo denominada Histrico), exemplo dos trs
passos utilizados pelo humano que foram mencionados no incio desta seo (ELYASHBERG et al., 2008). Na
etapa de planejamento, os dados experimentais da substncia-problema so confrontados com dados de
uma biblioteca ou de um banco de dados que possuem inmeras estruturas, subestruturas e fragmentos
estruturais aliados aos seus respectivos dados espectrais, sendo geradas novas subestruturas e fragmentos,
compreendendo, portanto, um processo similar busca na literatura pelo humano. Na gerao (ou montagem)
de estruturas, estruturas qumicas hipotticas so geradas com base na frmula molecular e nas subestruturas
e fragmentos obtidos na etapa anterior, com o objetivo de se chegar a uma estrutura condizente com os
dados experimentais e, portanto, trata-se da etapa limitante do processo e que envolve os mtodos
computacionais mais difceis de serem desenvolvidos. Na terceira e ltima etapa, a de teste ou validao, as
estruturas geradas na etapa anterior so verificadas para se avaliar se so compatveis ou no com os dados
experimentais da substncia-problema e se elas so vlidas; aqui, so utilizadas diversas metodologias para
83
predio de dados e simuladores de espectros (STEFANI et al., 2007; STEFANI & DA COSTA, 2007; ELYASHBERG
et al., 2008).
Apenas os sistemas completos de elucidao estrutural automatizada, denominados programas CASE
ou sistemas especialistas, executam as trs etapas descritas no pargrafo anterior, sendo capazes de analisar
dados de IV, EM e RMN mono e bidimensional (ELYASHBERG et al., 2010). Entretanto, existem poucos sistemas
especialistas disponveis. A grande maioria dos programas desenvolvida, especificamente, para executar
cada uma das trs etapas, em especial para a de validao, momento em que j existem propostas concretas
para a estrutura a ser elucidada. Assim, cabe ao usurio complementar toda a anlise e ainda usar sua sagacidade
para chegar soluo final.
Conforme discutido nos pargrafos anteriores, as diferentes categorias de programas disponveis,
atualmente, executam as diferentes etapas da elucidao estrutural com base na estratgia planejar-gerar-
testar, a exemplo do que empregado pelo humano para solucionar os problemas da vida real, denominado
heurstica. Alm disso, deve ser lembrado que mesmo com suas limitaes os programas no so tendenciosos
e no possuem idias preconcebidas acerca da elucidao de estruturas qumicas, uma vez que a eles foram
incorporadas tcnicas e metodologias computacionais, de IA ou ferramentas de aprendizado de mquina
(machine learning tools), alm de algoritmos altamente eficazes para realizar diferentes tarefas e trabalhar
com informaes qumicas, o que ser abordado nas sees a seguir.
SISTEMAS ESPECIALISTAS
Um sistema especialista uma forma de sistema baseado no conhecimento, sendo especialmente
projetado para emular a especializao humana em algum domnio especfico. Esses sistemas so programas
computacionais derivados da pesquisa envolvendo IA. O objetivo da IA entender a inteligncia construindo
programas com comportamento inteligente, estando preocupada com os conceitos e mtodos de inferncia
simblica ou raciocnio por um computador e como o conhecimento usado para fazer dedues que so
representadas no interior da mquina (JACKSON, 1999).
Os sistemas especialistas operam com regras que so avaliadas para se predizer um resultado para
uma determinada entrada. Para gerar essas regras, necessrio um conhecimento a priori sobre a correlao
entre os dados de sada e a consulta. Essa correlao pode ser obtida a partir de mtodos indutivos de
aprendizado analisando-se os dados experimentais. O termo sistema especialista geralmente reservado
para programas que se baseiam no conhecimento usado por especialistas humanos em contraste ao
conhecimento obtido por intermdio de livros didticos ou no especialistas.
Sistemas baseados em conhecimento so definidos como um sistema computacional que tem o
conhecimento no domnio da soluo do problema. Os sistemas especialistas se baseiam tanto na
experincia como no conhecimento. Essa a razo por que a soluo de problemas no pode ser obtida
a partir de simples algoritmos. A experincia relacionada a um tipo especfico de conhecimento criada
a partir de uma complexa interao de regras e decises. Muito frequentemente os termos sistema
especialista (Expert System - ES) e sistemas baseados em conhecimento (Knowledge-Based Systems -
KBS) so utilizados como sinnimos e representam uma vasta rea de aplicao de IA (LUGER &
STUBBLEFIELD, 1989).
84
No mbito da elucidao estrutural, apesar de haver diversas possibilidades, emprego de diferentes
algoritmos, ferramentas e aplicaes orientadas a espectros de vrios tipos, o que h de comum nessas
aplicaes que elas simulam o raciocnio, ou seja, de que modo um espectroscopista realiza a identificao
de uma estrutura a partir da informao espectral. Esse processo inclui detectar os fragmentos estruturais de
compostos desconhecidos compilando uma frmula estrutural a partir desses, em seguida realizar a verificao
determinando a correlao entre esses fragmentos e os dados experimentais do espectro, tendo ainda como
suporte informaes adicionais de natureza qumica, fsico-qumica e espectral. Os sistemas especialistas
possuem componentes que executam essas tarefas baseando-se em diferentes mtodos matemticos. A
base da elucidao estrutural, utilizando os sistemas especialistas, , contudo, presumir quais estruturas ou
fragmentos similares correspondem a espectros ou subespectros similares. Tal abordagem fortemente
afetada pela qualidade do banco de dados disponvel, os quais so sua base (JACKSON, 1999).
Muitos sistemas especialistas so baseados na abordagem de frequncias caractersticas. Gribov &
Orville-Thomas (1988) fizeram diversas consideraes sobre as bandas caractersticas em um espectro no IV.
Gribov & Elyashberg (1979) sugeriram diferentes tcnicas matemticas nas quais regras e decises so
expressas de forma explcita. Elyashberg et al. (1998) salientaram que a modelagem discreta de sistemas
lgicos de estrutura/espectro uma ferramenta valiosa no estudo de complicados objetos de natureza
discreta. Zupan (1989) demonstrou que a relao entre a estrutura molecular e o correspondente espectro no
IV poderia ser representada condicionalmente por um modelo discreto finito. Essas relaes podem ser
formuladas como regras condicionais na base de conhecimento de sistemas especialistas. Sistemas baseados
nessa lgica podem ser encontrados em vrias publicaes (FUNATSU et al., 1989; LUINGE, 1990; WYTHOFF et
al., 1991; WARR, 1993).
Os sistemas especialistas so designados para ajudar um especialista em sua anlise e no para
substitu-lo. Os problemas sofisticados raramente podem ser resolvidos sem a experincia de um especialista
humano e muito dessa experincia no pode ser substituda por um sistema de regras lgicas. Um sistema
especialista serve como um amplificador poderoso de intelecto humano. Os sistemas existentes mostram
que so relativamente efetivos neste aspecto. Por exemplo, as abordagens que utilizam redes neurais artificiais
autoassociativas so suplementos extremamente teis para os sistemas especialistas. A combinao de regras
com redes neurais pode ser uma etapa mais similar aos mtodos de deciso humana simulada pelos sistemas
especialistas, o que ser discutido na prxima seo.
METODOLOGIAS, TCNICAS COMPUTACIONAIS E ALGORITMOS
Nesta seo sero abordados alguns aspectos sobre a arquitetura interna e o funcionamento das
ferramentas empregadas na elucidao estrutural automatizada. Um dos principais estmulos para o usurio
conhecer como um determinado programa funciona ele poder saber de antemo se tal programa ser ou
no adequado aos seus propsitos, ou melhor, se o programa ser ou no capaz de resolver seu problema
adequadamente.
As metodologias, tcnicas computacionais e algoritmos mais comuns so baseados em mecnica
quntica, regras de incremento ou de aditividade, mtodos baseados em fragmentos, cdigo HOSE, IA e
tcnicas de aprendizado de mquina. Esses esto presentes nas ferramentas para elucidao estrutural
automatizada disponveis atualmente, as quais, em sua grande maioria, foram desenvolvidas com base na
85
estratgia planejar-gerar-testar discutida nas sees anteriores. Na etapa de planejamento esto inclusos os
bancos de dados, na etapa de gerao esto os geradores de estruturas, e na etapa de teste ou validao est
a maioria dos programas disponveis na atualidade, que so aqueles capazes de realizar predies de
propriedades espectroscpicas e, a partir delas, as simulaes de espectros, o que ser detalhado nos prximos
pargrafos. J os programas CASE e os sistemas especialistas podem incluir todas essas etapas.
Nos bancos de dados esto inseridas as principais ferramentas de busca por estruturas, subestruturas
ou fragmentos estruturais com seus respectivos dados espectrais (UV, IV e RMN), ou ainda ferramentas de
busca por espectros e subespectros. Muito esforo tem sido despedido no sentido de desenvolver mtodos
de busca cada vez mais eficazes, envolvendo tcnicas de quimioinformtica (KOCHEV et al., 2003). Com o uso
dessas tcnicas, as informaes estruturais (ou espectrais) podem ser armazenadas em bancos de dados e,
posteriormente, procuradas e acessadas de modo apropriado. Por exemplo, a busca por similaridade se
revelou como uma tcnica extremamente til para casos de programas CASE e sistemas especialistas, uma
vez que molculas similares possuem propriedades fsico-qumicas similares. Entretanto, outros aspectos
devem ser observados no desenvolvimento dessas ferramentas, tais como rapidez, capacidade de buscas
completas e sem redundncia, sejam por frmula ou peso molecular, por nomes, dentre outros. Um dos
maiores bancos de dados espectroscpicos disponveis atualmente o SpecInfo, que possui dados de RMN,
IV e EM, alm de vrias informaes complementares; j o CSEARCH e o NMRShiftDB possuem apenas dados
de RMN, o que ser discutido na seo intitulada Bancos de Dados. Muitos bancos de dados so utilizados no
apenas para armazenar espectros ou subestruturas, mas tambm para realizar predies.
A gerao de estruturas realizada por geradores de estruturas que operam atravs de dois mtodos:
determinstico ou estocstico. Nesses mtodos, normalmente, os tomos e as ligaes qumicas das estruturas
so tratadas matematicamente como um conjunto de vrtices e arestas, tendo como base a teoria dos grafos
(ENGEL, 2003). No mtodo determinstico, um algoritmo matemtico especial gera e testa todas as combinaes
possveis de estruturas a partir de um dado conjunto de fragmentos e de dados espectrais, juntamente com
restries impostas. Nesse mtodo, h tambm a etapa de montagem e de reduo de estruturas atravs de
metodologias exaustivas (STEINBECK, 2004). No mtodo estocstico, so geradas estruturas aleatoriamente
de acordo com um determinado conjunto de dados espectrais e combinaes possveis. Todas as estruturas
geradas so quimicamente corretas e compatveis com os dados fornecidos, porm nem todas as estruturas
possveis so geradas (STEFANI et al., 2007).
Como mencionado no incio desta seo, na etapa de teste ou validao que encontrada a grande
maioria dos programas disponveis na atualidade, ou seja, aqueles que realizam predies de propriedades.
Para realizar essas predies, os mtodos ab initio, semiempricos e de IA so os mais comuns.
As metodologias baseadas em mtodos ab initio, fundamentados na mecnica quntica, tem se
restringido a RMN ou IV (tambm so utilizadas em RAMAN e tcnicas espectroscpicas de fotoionizao) e
os programas que as contm so capazes de realizar predies de frequncias vibracionais, deslocamentos
qumicos e assim simular espectros. Porm, ao contrrio das demais metodologias, antes da predio a
estrutura em questo deve ter sua geometria otimizada, empregando-se algoritmos apropriados, para que se
obtenha um ponto de mnimo na superfcie de energia potencial. Os mtodos mais utilizados para tal tem
como base a teoria do funcional de densidade (Density Functional Theory DFT) e aqueles associados a
equaes de Hartree-Fock-Roothaan (STEINBECK, 2003). Aps a otimizao de geometria so realizados os
clculos de predies para a grandeza de interesse. Apesar de ser uma ferramenta poderosa, devido a
algumas limitaes, tais como a necessidade de um maior tempo de computao, disponibilidade de
computadores mais potentes, clculos realizados no vcuo (embora, exista a oportunidade de se empregar
86
modelos para a solvatao e fenmenos correlacionados), essas metodologias ainda esto disponveis em
poucos programas. Porm, hoje em dia, alguns desses clculos podem se realizados em poucas horas em PCs
comuns, o que ser discutido na seo Mtodos in Silico para Elucidao Estrutural de Substncias: Aplicaes
em Produtos Naturais e Metabolmica.
Na atualidade a predio de propriedades e as simulaes de espectros envolvendo IA e tcnicas de
aprendizado de mquina tm recebido mais ateno pela comunidade de produtos naturais (DA COSTA et al.,
2004) e este tema ser abordado de maneira mais detalhada no decorrer deste captulo. No contexto da
elucidao estrutural, a predio de propriedades envolve, por exemplo, estimar deslocamentos qumicos de
RMN ou nmero de ondas do IV, ou ainda simular espectros com base nas propriedades calculadas, tendo
como base a correlao entre estrutura qumica e propriedade espectroscpica. No caso de RMN-
1
H, tambm
possvel realizar a predio de constantes de acoplamento. Logo, importante saber como as predies so
realizadas.
Nas predies, geralmente, o problema em questo baseia-se em modelagem e envolve investigar a
relao entre uma dada estrutura qumica (objeto) e uma propriedade, envolvendo um sistema de pares
entrada/sada. Como o computador no consegue realizar essa tarefa de modo direto, pode-se utilizar como
artifcio ferramentas de estatstica e aprendizagem por mquina (GASTEIGER, 2006; KUHN et al., 2008), como
mostra a figura 4. Esta situao exatamente a mesma dos estudos sobre QSAR (Quantitative Structure-
Activity Relationship), com nica diferena de que em elucidao a propriedade estrutural em questo uma
dada propriedade espectral e no biolgica.
FIGURA 4 | Representao esquemtica de um caso tpico de modelo
computacional para predio de uma propriedade
espectromtrica, utilizando tcnicas de aprendizado de mquina
(adaptado de GASTEIGER, 2006).
Como tcnicas de aprendizado de mquina podem ser usadas redes neurais artificiais, algoritmos
genticos, regresso por mquina de vetores de suporte (Support Vector Machines SVM regression), rvores
de deciso (decision trees), floresta randmica (random forest) e kNN, dentre outras (Figura 4). Essas tcnicas
87
compreendem um ramo da IA (ver seo Sistemas Especialistas) e envolvem o uso de algoritmos poderosos
que so capazes de aprender algoritmos de aprendizagem a partir de exemplos (dados de treino) para
depois tomarem decises inteligentes (resposta). Atualmente uma vasta quantidade de material publicado a
respeito de cada uma dessas tcnicas est disponvel (ZUPAN & GASTEIGER, 1999; KUHN et al., 2008). Entretanto,
alm de selecionar uma boa tcnica de aprendizado para desenvolver uma boa ferramenta que realize
predies, os descritores para as estruturas qumicas devem ser cuidadosamente selecionados, o que ser
descrito brevemente a seguir.
Em um caso tpico de predio que explora a relao entre estrutura qumica e propriedades (Figura
4) so utilizadas variveis apropriadas, denominadas descritores. Logo, inicialmente a estrutura representada
(ou codificada) atravs de um conjunto de descritores estruturais, ou seja, representaes numricas que
descrevem suas propriedades (STEINBECK, 2003). A partir de estruturas qumicas 2D e utilizando-se por
exemplo arquivos Mol, SD ou SMILES (ver seo Fundamentos Bsicos da Representao de Estruturas Qumicas
no Computador), os descritores so calculados e incorporados a esses arquivos empregando-se um software
apropriado. Os descritores tambm podem ser incorporados a estruturas 3D.
Em RMN, por exemplo, os descritores mais utilizados so derivados de propriedades atmicas, de
ligaes ou de propriedades moleculares, sendo tambm includos os que descrevem topologia e geometria
moleculares (STEINBECK, 2003; BINEV & AIRES-DE-SOUSA, 2004). Os descritores estruturais so calculados por
intermdio de programas apropriados e depois submetidos aos algoritmos de aprendizagem, como as redes
neurais artificiais, compondo, portanto, a etapa de entrada de dados (Figura 4). Como mencionado
anteriormente, os algoritmos de aprendizagem so capazes de aprender com o exemplo fornecido e
realizar predies, retornando ento os dados de sada, ou seja, o resultado de cada predio, como o
deslocamento qumico de um dado tomo (Figura 4). No desenvolvimento de um modelo, a qualidade de
cada predio para cada objeto (estrutura) avaliada por mtodos estatsticos e comparao com os dados
experimentais (erro mdio, validao cruzada, coeficiente de regresso, dentre outros), compondo a etapa
de treino do problema da predio. Ao final, existe a etapa de teste ou validao do modelo, momento em
que sua qualidade verificada (KUHN et al., 2008).
Na etapa de validao do modelo, objetos externos, ou seja, aqueles que no participaram da etapa
de treino, so apresentados ao modelo e os resultados das predies so analisados estatisticamente mais
uma vez. Um modelo bem treinado aquele capaz de apresentar bons resultados ao realizar novas predies,
ou seja, ele mostra que aprendeu a partir de exemplos. justamente neste tipo de situao que esto
includos os programas de computador desenvolvidos para a predio de deslocamentos qumicos que tm
embutidos em sua estrutura algoritmos capazes de utilizar informaes da geometria e estereoqumica das
estruturas, como foi comentado no final da seo Fundamentos Bsicos da Representao de Estruturas
Qumicas no Computador. Estes programas possuem, portanto, descritores estruturais que envolvem
informaes 3D e estereoqumica. Aps aprender como funcionam os algoritmos de aprendizagem e como
so realizadas as predies, interessante ter conhecimento de como alguns deles so empregados em
elucidao estrutural.
Um importante ramo da IA a heurstica, uma das primeiras tcnicas desenvolvidas para predio
que consiste em um conjunto de regras de tomada de deciso. Algumas regras so inseridas pelo especialista
durante o projeto do sistema, enquanto outras so inferidas pelo sistema medida que novos casos so
apresentados. Todas as regras so sistematicamente armazenadas em um banco de dados. Assim, quando
aparece um problema semelhante, o sistema capaz de julgar qual o melhor caminho para sua soluo
(STEFANI et al., 2007). O ser humano tambm capaz de realizar heurstica na elucidao estrutural, conforme
88
foi mencionado na seo denominada Estratgias para Elucidao Estrutural de Substncias: o Homem e a
Mquina, bem como vrios softwares antivrus existentes que detectam cdigos suspeitos.
Outra tcnica de predio bastante comum em IA so as redes neurais artificiais, que compreendem
tcnicas computacionais inspiradas em neurnios biolgicos animais. As redes neurais possuem algoritmos
com a capacidade de simular o funcionamento do crebro humano atravs do aprendizado por exemplos,
ou seja, adquirem conhecimento pela experincia. So modelos treinveis com a capacidade de armazenar
e processar informaes. O tipo mais comum de redes neurais encontradas em programas para predio
de propriedades, como deslocamentos qumicos de RMN, a que possui o algoritmo de retropropagao
dos sinais de erros (back propagation of errors), um mtodo de aprendizado supervisionado (ZUPAN &
GASTEIGER, 1999). Sua arquitetura inclui vrios neurnios dispostos em camadas: uma camada de entrada
(input), onde os dados (por exemplo, os descritores estruturais) so inseridos, as camadas intermedirias
onde realizado o processamento, e a camada de sada (output), por meio da qual retornado o valor da
predio de uma dada propriedade (Figura 5). O funcionamento de uma rede neural se resume aos estmulos
que so dados aos neurnios de entrada, os quais se propagam para os intermedirios at se obter uma
resposta na camada de sada, de forma anloga aos neurnios biolgicos. As redes neurais tm sido bastante
empregadas em diferentes reas da qumica (ZUPAN & GASTEIGER, 1999), pois por meio delas possvel
trabalhar com relaes complexas e no lineares entre estruturas qumicas e suas propriedades, como no
caso da RMN.
FIGURA 5 | Arquitetura de uma rede neural artificial com algoritmo de
retropropagao para a predio de propriedades.
89
A predio de propriedades espectrais ainda envolve outros mtodos, como o cdigo HOSE, as regras
de incremento (ou regras de aditividade) e os mtodos baseados em fragmentos. O cdigo HOSE um
mtodo bem estabelecido que foi descrito por Bremser em 1978 e muito utilizado em programas para
predio de deslocamentos qumicos de RMN-
13
C. Como no inclui nenhuma informao em 3D, ele no
recomendado para predies de RMN-
1
H. A anlise pelo cdigo HOSE inicia-se no tomo cujo deslocamento
deve ser calculado, o chamado tomo central, e avana uma ligao (ou uma esfera) adiante para localizar, em
um banco de dados, o ambiente esfrico desse tomo a uma ligao. Se esse ambiente encontrado, o
cdigo avana mais uma esfera e repete o processo e assim sucessivamente, como ilustrado para a estrutura
na figura 6. Ao final, com base nos ambientes encontrados nas n esferas equivalentes a n ligaes, a predio
do tomo central realizada. Para realizar predies confiveis, um programa deve possuir um cdigo HOSE
para descrever as vizinhanas de pelo menos trs esferas de um dado tomo central e, portanto, seu banco de
dados deve possuir vrias classes de estruturas qumicas armazenadas (Steinbeck, 2003).
FIGURA 6 | Exemplo do funcionamento de um cdigo HOSE de trs esferas
em uma estrutura qumica. O tomo central est envolto por um
quadrado (STEFANI & DA COSTA, 2006).
As regras de incremento, tambm chamadas de regras de aditividade (additivity rules), foram criadas
para serem embutidas manualmente e compreendem uma das mais antigas metodologias aplicadas na
predio de deslocamentos qumicos de RMN. Atualmente, os incrementos so baseados em equaes
matemticas expressas em algoritmos que descrevem as contribuies de grupos substituintes em cada
tomo de um dado esqueleto, como por exemplo, o que encontrado nas tabelas clssicas de RMN-
13
C que
90
mostram os efeitos de substituintes em uma molcula de benzeno. Ao longo dos anos, essas regras foram
sofrendo alteraes e hoje possuem elevado nvel de sofisticao, sendo possvel realizar predies de
deslocamentos qumicos com alto grau de preciso, em especial para RMN-
13
C, quando contribuies de
efeitos podem ser calculadas para substituintes distantes at quatro ligaes. Em algumas implementaes
mais modernas, uma estrutura decomposta em vrios subesqueletos e cada um deles se torna a base de
predies baseadas em incremento. Atualmente, j existem mais de 4.000 parmetros para RMN (STEINBECK,
2003).
Os mtodos baseados em fragmentos compreendem algoritmos especiais de predio derivados de
bancos de dados contendo estruturas qumicas associadas aos seus deslocamentos qumicos de RMN-
13
C.
Para cada tomo de carbono de cada estrutura do banco de dados so gerados fragmentos centrados em
tomos com um nmero determinado de camadas concntricas de um cdigo HOSE. Esses fragmentos e seus
deslocamentos qumicos correspondentes so armazenados em uma lista especial para os algoritmos de
predio. Para realizar a predio dos deslocamentos qumicos de
13
C de uma dada estrutura, inicialmente o
programa seleciona todos os seus possveis fragmentos, realiza uma busca por fragmentos anlogos no banco
de dados e depois atribui aos tomos de carbono a serem estimados os deslocamentos retirados dos fragmentos
de referncia. Caso um fragmento no seja encontrado no banco de dados, o programa faz uma interpolao
utilizando o fragmento estrutural mais similar disponvel. Os resultados desse procedimento so muito bons,
desde que o banco de dados seja grande e diverso o suficiente. Apesar do alto nvel de acuidade nas predies,
esse mtodo tem uma desvantagem quando os fragmentos no possuem informaes sobre a estereoqumica
(ELYASHBERG et al., 2008).
Sumarizando o que foi discutido nesta seo, os programas para predio de deslocamentos qumicos
de RMN podem possuir algoritmos baseados em IA (heurstica, redes neurais), cdigo HOSE, regras de
incremento e mtodos baseados em fragmentos, em particular aqueles que trabalham com RMN-
13
C. Os
programas que trabalham com RMN-
1
H devem possuir algoritmos mais elaborados pelo fato de haver efeitos
espaciais que influenciam o deslocamento qumico dos tomos de hidrognio. Portanto, o desenvolvimento
de programas para predio de deslocamentos qumicos de
1
H mais difcil (AIRES-DE-SOUSA et al., 2002;
BINEV & AIRES-DE-SOUSA, 2004).
MTODOS ESPECTROSCPICOS E MTODOS IN SILICO PARA
ELUCIDAO ESTRUTURAL
As principais tcnicas espectroscpicas utilizadas no laboratrio para a elucidao estrutural de
substncias naturais so UV, IV, EM e RMN, e, geralmente, os dados espectrais obtidos so analisados em
conjunto. No mbito da elucidao estrutural automatizada essas tcnicas tambm so importantes e, com
base nelas, vrios programas foram desenvolvidos. Tais programas, desenvolvidos para todas as etapas de
elucidao estrutural automatizada, possuem em sua estrutura interna as metodologias e algoritmos descritos
na seo anterior, ou mesmo combinaes desses, originando ferramentas poderosas que propiciam auxlio
inestimvel aos seus usurios. Nesta seo sero discutidas as tcnicas de IV, EM e RMN no contexto da
elucidao estrutural automatizada, revelando-se as principais potencialidades de cada uma.
Nesse contexto, importante ter em mente que os bancos de dados so capazes de armazenar
quaisquer tipos de dados espectrais, espectros ou subespectros, podendo ser facilmente acessados por meio
91
de ferramentas de busca adequadas. Os geradores de estruturas operam com dados fornecidos pelo usurio,
como por exemplo a frmula ou massa molecular, ou ainda dados de IV e deslocamentos qumicos de RMN,
alm de DEPT e dados de espectros bidimensionais. Entretanto, atualmente a grande maioria das ferramentas
disponveis opera com predio de propriedades e simulao de espectros, sendo mais difundidas para
aplicaes em produtos naturais e metabolmica, o que tambm ser discutido a seguir.
INFRAVERMELHO
A espectroscopia no IV uma tcnica analtica muito poderosa largamente usada e com uma vasta
aplicabilidade, tendo maior papel na identificao e elucidao estrutural de substncias orgnicas, bem
como em anlises quantitativas. Os espectros no IV contm informaes que refletem propriedades de toda
a molcula, descrevendo quais os fragmentos que a constituem e como esses esto arranjados.
A predio e interpretao direta de espectros no IV com mtodos ab initio de qumica quntica
consomem relativamente muito tempo e, portanto, esto limitadas a molculas relativamente pequenas.
Mtodos semiempricos so mais rpidos, porm necessitam de escalonamento dos resultados para obter
correspondncia satisfatria com os dados experimentais. Alternativas como os sistemas que modelam a
correlao entre as estruturas e os dados de espectroscopia no IV, baseados no conhecimento derivado de
dados experimentais so, portanto, necessrios para transpor essas dificuldades.
Como explicado anteriormente, uma substncia identificada pela comparao de seu espectro com
um espectro de um banco de dados. Quando a identificao no concluda, devido constituio da
estrutura da substncia ainda no ser conhecida e nenhum espectro de referncia estar disponvel, um
especialista tem que extrair caractersticas estruturais dessa substncia a partir de seu espectro. Essa informao
combinada com aquelas obtidas de outros mtodos espectroscpicos para permitir a elucidao da amostra.
Esse processo tem uma grande desvantagem, pois consome muito tempo e consequentemente
custoso, no apenas pelo prprio trabalho de elucidao, mas, principalmente, pela larga quantidade de
experincia que o especialista tem que acumular para se tornar apto a codificar as caractersticas estruturais
do espectro. A automao desse trabalho para aplicaes rotineiras , portanto, de grande importncia.
O padro caracterstico de um espectro IV, particularmente na regio entre 1.500 e 1.000 cm
-1
, pode
ser usado para a identificao confivel de uma estrutura. Portanto, fcil a automao da interpretao no IV
e, para tal, existem diversas tcnicas que podem ser utilizadas.
As correlaes entre estruturas e espectros podem ser descritas por regras. Essas regras so derivadas
pela investigao cuidadosa de padres espectrais e caractersticas estruturais que os geram. Vrios esforos
foram realizados para desenvolver sistemas de regras para interpretar automaticamente dados
espectroscpicos (RICARD et al., 1993). Essas podem ser inclusivas ou exclusivas, ou seja, a presena de um
pico indica a existncia de um determinado fragmento e a ausncia do pico, consequentemente, indica a
ausncia do fragmento. Esse mtodo trabalha com os picos, portanto altamente dependente do algoritmo
de seleo de picos aplicado ao espectro. Entretanto, a predio automtica de caractersticas estruturais
baseada apenas nas posies dos picos no muito confivel.
Outra forma de relacionar estruturas qumicas a espectros utilizando redes neurais artificiais (ZUPAN
& GASTEIGER, 1991, 1999), nas quais as conexes dos neurnios so determinadas pelos pesos. Durante o
treinamento a rede neural aprende indutivamente sobre a correlao entre a estrutura molecular e os dados
92
de sada (espectro no IV). Essa relao no expressa por uma equao, mas pelos valores dos pesos e a
respectiva arquitetura da rede neural.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
A espectrometria de massas (EM) uma tcnica analtica para a investigao de uma dada molcula
ou misturas complexas e que tem se desenvolvido de maneira bastante dinmica nos ltimos anos. Na rea
de produtos naturais ela bastante empregada, pois de primordial importncia obter a massa molecular de
uma substncia para confirmar sua estrutura em combinao com dados provenientes de outras tcnicas
espectroscpicas. No mbito da metabolmica de plantas, o emprego de EM acoplada a tcnicas de separao,
tais como cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) ou cromatografia gasosa (CG), que originou as
tcnicas acopladas (ou hifenadas) CLAE-EM e CG-EM, tem sido bastante explorado para auxiliar no processo
de desreplicao de matrizes biolgicas, tais como plantas, microrganismos e organismos marinhos. Por meio
dessa abordagem, as substncias de uma mistura so tentativamente identificadas com base na busca em
bibliotecas ou na interpretao de fragmentaes conhecidas.
No mbito dos mtodos in silico de elucidao estrutural envolvendo EM deve ser destacado o
pioneirismo do DENDRAL (ver seo Histrico), uma das primeiras tentativas de se criar um programa para
elucidao estrutural baseado em IA. Neste programa, o uso da EM era feito com base em padres de
fragmentao para se tentar deduzir estruturas qumicas ou com base na predio de fragmentos estruturais
de ismeros. At hoje os sistemas de elucidao estrutural automatizada que possuem mdulos de EM so
baseados na metodologia usada no DENDRAL. Alm disso, a grande maioria das regras de interpretao de
fragmentaes presentes nos sistemas atuais foi desenvolvida para dados gerados por ionizao atravs de
ionizao por eltrons, quase todas elas desenvolvida nas dcadas de 1970 e 1980, incluindo o uso de
bibliotecas com dados de fragmentao. Portanto, necessita-se desenvolver novos algoritmos, pois atualmente
o fator limitante a enorme diversidade molecular e de fragmentos gerados para substncias com estruturas
similares (KIND & FIEHN, 2010).
Uma grande vantagem de se utilizar dados de EM em programas de elucidao estrutural de produtos
naturais o fato dos aparelhos de alta resoluo fornecerem uma acurada relao massa carga (m/z) de uma
dada substncia desconhecida para que, a partir dessa, os programas possam gerar suas possveis frmulas
moleculares e, consequentemente, propor subestruturas (ELYASHBERG et al., 2010). Existem tambm programas
capazes de auxiliar a determinao da frmula molecular ou composio elementar, incluindo a deteco de
adutos formados com hidrognio ou lcalis em tcnicas de ionizao, tais como ionizao qumica, por
electrospray, desoro por laser, assistida por matriz, e ionizao qumica a presso atmosfrica, alm da
determinao de estados de carga e padro isotpico em electrospray. Para o clculo de composio elementar,
existem programas que operam com regras de heurstica, muitos deles desenvolvidos pelas empresas que
fabricam seus prprios equipamentos. Apesar dos enormes avanos das tcnicas e equipamentos para EM,
bem como o desenvolvimento de novos programas e aplicativos, ainda no existe nenhuma ferramenta
capaz de predizer a probabilidade de formao de um determinado aduto com base na estrutura qumica de
uma dada substncia (KIND & FIEHN, 2010).
Atualmente muito esforo tem sido despendido em estudos de bibliotecas de dados e vrios algoritmos
de busca tm sido desenvolvidos. O objetivo da busca nessas bibliotecas encontrar a estrutura correta da
substncia desejada ou obter informaes parciais a partir de substncias similares. Geralmente realizada
93
uma busca por espectros armazenados na biblioteca com base em um dado de um espectro obtido
experimentalmente. Entretanto, deve ser enfatizado que existe o problema da dependncia do tipo de
tcnica e dos espectrmetros utilizados, da o surgimento de vrias bibliotecas comerciais desenvolvidas para
determinados instrumentos e condies experimentais (KIND & FIEHN, 2010). por esse motivo que muitos
usurios elaboraram suas prprias bibliotecas ou se baseiam em padres de fragmentao de uma srie de
substncias anlogas, publicados na literatura. Outro problema de determinadas tcnicas de EM, quando
comparada a outras tcnicas espectroscpicas, tais como IV ou RMN, est relacionado baixa reprodutibilidade
de seus dados espectrais quando obtidos em diferentes instrumentos em dadas condies de anlise
(VERPOORTE et al., 2005), o que reflete na qualidade das ferramentas in silico derivadas desses instrumentos.
Em suma, o desenvolvimento de mtodos in silico para elucidao estrutural de produtos naturais
baseada em EM ainda limitado e atualmente existem poucos programas que realmente oferecem solues
confiveis. Alm das bibliotecas de dados espectrais, o que se encontra so apenas alguns programas de
computador que podem ser utilizados sozinhos ou associados a sistemas de elucidao estrutural automatizada,
os quais so capazes de interpretar fragmentaes pr-estabelecidas. Ainda no existem algoritmos
desenvolvidos o suficiente para predizer fragmentos e abundncias a partir de uma estrutura a ser fragmentada
atravs de diferentes modos de ionizao. Logo, o desenvolvimento de mtodos in silico para elucidao
estrutural de substncias baseado em EM ainda um campo totalmente aberto para pesquisas, cujo estudo
deve ser estimulado.
RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR
A RMN a tcnica espectroscpica mais poderosa para determinao e elucidao estrutural. Seus
vrios mtodos disponveis oferecem diferentes informaes sobre a estrutura molecular. Por exemplo,
fornece o estado de hibridizao de ncleos, o nmero e a natureza de seus vizinhos, as informaes sobre
acoplamento entre ncleos vicinais, a quantas ligaes, um dado par de ncleos est acoplado e at como
pares de ncleos interagem no espao.
Em comparao com as duas tcnicas abordadas anteriormente, a RMN aquela para qual o maior
nmero e diversidade de softwares, sistemas e ferramentas foram desenvolvidos desde os primeiros estudos
sobre elucidao estrutural automatizada. Uma vantagem inestimvel da RMN frente s demais tcnicas
espectromtricas, em especial a EM, que o deslocamento qumico de um tomo independe do tipo de
equipamento e da potncia do campo utilizados. Como consequncia, essa propriedade pode ser modelada
e regras e algoritmos de predio podem ser desenvolvidos, em especial para RMN-
13
C, em que no
envolvida a multiplicidade de sinais, como no caso da RMN-
1
H, a qual ainda inclui as constantes de acoplamento.
Assim, um conjunto de deslocamentos qumicos pode ser estimado a partir de uma dada estrutura qumica.
Em outra abordagem, como nos programas CASE e sistemas especialistas, apenas a anlise dos dados
experimentais de RMN de uma dada substncia pode fornecer sua estrutura. Logo, a RMN uma tcnica
poderosa na elucidao estrutural automatizada.
Atualmente, existem ferramentas in silico para elucidao estrutural baseadas em RMN que empregam
principalmente dados de espectros unidimensionais, porm o uso de dados bidimensionais tem crescido
bastante. Dentre essas ferramentas, existem aquelas que podem ser utilizadas sozinhas ou as que esto
presentes em sistemas CASE e sistemas especialistas. Dentre as que podem ser operadas sozinhas, h os
94
editores de espectros e as enormes bibliotecas de dados espectrais com poderosas ferramentas de busca. Tais
bibliotecas, ou bancos de dados, por si s poderiam ser capazes de realizar rotinas de elucidao estrutural,
uma vez que so capazes de fornecer dados de estruturas, subestruturas, espectros e subespectros. Mas h
casos onde a capacidade de fornecer dados estruturais pode no resolver o problema de elucidao de uma
dada estrutura e, portanto, outras ferramentas devem estar disponveis, como aquelas capazes de realizar
predies de deslocamentos qumicos (STEINBECK, 2003, 2004; ELYASHBERG, 2010).
As ferramentas que so capazes de realizar predies de deslocamentos qumicos e a simulao de
espectros de RMN so muito importantes no processo de elucidao estrutural. Estes so capazes de gerar
predies em um tempo bastante reduzido, na ordem de segundos, inclusive para conjuntos de vrias
estruturas armazenadas em arquivos SD. Uma ferramenta confivel extremamente importante na etapa de
validao estrutural, quando j existem propostas para a estrutura de uma dada substncia (DA COSTA et al.,
2004). Alm disso, essa ferramenta passa a ser til para se obter dados para substncias que ainda no foram
descritas na literatura ou para aquelas cujos dados experimentais de RMN ainda no foram obtidos. Essa
possibilidade tambm pode propiciar o surgimento de novas ferramentas para auxiliar no processo de
desreplicao de matrizes biolgicas, como no mbito da metabolmica, por exemplo, para a subtrao de
espectros de RMN. Nesse processo, inicialmente, os sinais de espectros de misturas de substncias obtidos
experimentalmente so comparados a sinais de espectros simulados de vrias substncias; em seguida, os
sinais dos espectros simulados so subtrados daqueles da mistura. No caso de coincidncia entre o conjunto
de sinais dos espectros simulados com os experimentais, pode-se chegar determinao estrutural de
substncias presentes em misturas complexas sem que estas sejam isoladas, num caso tpico de desreplicao
via RMN. Na predio de deslocamentos qumicos de RMN utilizada atualmente uma enorme diversidade
de algoritmos, desde os heursticos queles que so baseados em IA, como as redes neurais artificiais, alm
de outros especiais como as regras de incremento, mtodos baseados em fragmentos e cdigo HOSE.
Entretanto, deve ser lembrado que esses algoritmos dependem da qualidade dos dados experimentais para
derivarem suas predies.
Como consequncia desta enorme importncia da RMN na elucidao estrutural de substncias,
atualmente uma enorme gama de ferramentas, sistemas e programas esto disponveis aos usurios para
auxiliar na elucidao estrutural de produtos naturais.
FERRAMENTAS, SISTEMAS E PROGRAMAS PARA ELUCIDAO
ESTRUTURAL IN SILICO
Nesta seo so descritas vrias ferramentas empregadas na elucidao estrutural de substncias por
meio de mtodos in silico que, atualmente, esto disponveis aos usurios. Foram selecionadas ferramentas
com diferentes funes, tais como bancos de dados, programas para predio de propriedades, simulao,
processamento e visualizao de espectros. So discutidos e avaliados apenas os programas acessveis aos
usurios para realizar rotinas de elucidao estrutural, excluindo-se aqueles de cunho meramente acadmico
ou restritos a um pequeno grupo de pesquisadores.
Uma observao importante a se fazer que quase todas as ferramentas descritas nesta seo so
freeware, open source ou esto disponveis on-line na internet. Os programas proprietrios aqui descritos, no
momento da redao do texto possuam licena vlida ou estavam no perodo de avaliao gratuita. Os
95
autores no estimulam o uso de quaisquer software sem a sua devida licena, pois alm de ser crime e lesar
financeira e intelectualmente seus desenvolvedores e distribuidores, trata-se de uma atitude bastante antitica.
Antes de empregar mtodos in silico para elucidao estrutural, sempre importante saber de
antemo sobre algumas funcionalidades e caractersticas importantes dos programas. Por exemplo, no caso
de predies de RMN-
1
H, uma das recomendaes principais avaliar se um dado programa capaz de
distinguir tomos de hidrognio de grupos metileno (CH
2
) de sistemas rgidos ou tomos diasterotpicos.
Tambm interessante saber se eles so capazes de realizar predies de constantes de acoplamento. No
caso de predies de RMN-
13
C, recomenda-se verificar se o programa considera estereoqumica e geometria
molecular, parmetros dependentes de conformao e de configurao, se diferencia grupamentos metila
em posio cis e trans, presena de substituintes nas posies axial e equatorial de ciclo-hexanos, ou se
considera de forma diferenciada duas metilas ligadas a um tomo de carbono de sistema rgido. Outro
aspecto muito importante verificar quais solventes deuterados esto disponveis para predies de RMN,
por exemplo, deuteroclorofrmio (CDCl
3
) ou outros como deuterometanol ou dimetilsulfxido deuterado.
Salienta-se que a grande maioria dos programas foi desenvolvida para realizar predies, considerando as
substncias solubilizadas em CDCl
3
e que so raros os que tratam do deslocamento gerado por solventes
polares nos sinais de determinados ncleos. No caso de EM, deve-se pesquisar se o programa realiza predies
para uma determinada tcnica especfica ou generalista.
Resumindo, para saber se um dado programa ser adequado s necessidades, a regra bsica e mais
sensata antes de utiliz-lo investigar e conhecer melhor sobre sua estrutura interna, como por exemplo, seu
banco de dados e os algoritmos implementados. Uma vez selecionado o programa, recomenda-se ler
atentamente as informaes contidas em seu manual e realizar diversos testes empregando substncias
conhecidas. Se o programa muito caro, antes de efetuar sua compra recomenda-se solicitar um perodo de
avaliao.
Para se comparar e consequentemente avaliar a qualidade das predies so utilizados mtodos
estatsticos, seja no caso de predies para diferentes estruturas qumicas realizadas com um nico programa
ou predies para uma mesma estrutura realizadas com diferentes programas. No caso de RMN, os mtodos
estatsticos mais comuns so o erro mdio absoluto (EMA) e o erro padro (EP), conforme as seguintes
equaes:
EMA

exp

pred

n
e
EP
(
exp

pred
)
2

n
,
onde d
exp
o deslocamento qumico obtido experimentalmente para um dado ncleo e d
pred
o deslocamento
qumico obtido por predio para o mesmo ncleo (KUHN et al., 2008).
Ao utilizar mtodos estatsticos como o EMA ou EP, pode-se facilmente avaliar os pontos mais fortes e
mais fracos de um dado programa, como por exemplo a sua capacidade em predizer deslocamentos qumicos
para tomos do tipo sp
3
, sp
2
de ligaes duplas, sp
2
de anis aromticos, carbonos quirais, constantes de
acoplamento e assim por diante.
96
BANCOS DE DADOS
Nesta seo sero apresentados bancos de dados desenvolvidos genuinamente para armazenar
espectros e demais informaes associadas. No sero discutidos os grandes bancos de dados de estruturas
que associam estruturas qumicas a propriedades moleculares, atividades biolgicas e informao qumica,
tais como o NCI/CADD (http://cactus.nci.nih.gov), o ChemSpider (http://www.chemspider.com), o PubChem
(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) e outros similares, os quais so mais apropriados para estudos das reas
de qumica medicinal e quimioinformtica do que elucidao estrutural.
SpecInfo
Desenvolvido pela BASF e adquirido pela empresa alem Chemical Concepts GmbH, o SpecInfo um
dos maiores bancos de dados espectroscpicos existentes, com cerca de 740.000 espectros digitais de mais
de 200.000 estruturas associadas. Esse banco possui dados de RMN, IV e EM dentre outras informaes
complementares, tais como condies experimentais, constantes de acoplamento e informaes bibliogrficas.
Tambm possui um editor de estruturas, realiza busca de espectros e de subestruturas por similaridade e
tambm realiza predies de RMN, dentre vrias outras funcionalidades. As predies de RMN-
13
C so por
cdigo HOSE e mtodos baseados em fragmentos. Atualmente a verso online do SpecInfo pela internet j
est na verso 4.0 (http://specinfo.wiley.com/specsurf/welcome.html) e acessada pelo SpecSurf (applet
Java) de dentro de um navegador e em qualquer sistema operacional. O SpecInfo tambm acessado atravs
da pgina da internet da editora Wiley-VCH (http://www.wiley-vch.de), que quem o comercializa, e est
associado aos dados do CAS (Chemical Abstract Service).
NMRShiftDB
Trata-se de um banco de dados de acesso livre (open access) e de cdigo aberto (open source)
disponvel na internet (http://www.nmrshiftdb.org) que armazena dados de RMN. Foi desenvolvido por um
grupo de pesquisadores de institutos e universidades alemes, liderados por Christoph Steinbeck. Os usurios
tambm podem contribuir, enviando deslocamentos qumicos de RMN de molculas pequenas e as atribuies
submetidas so constantemente verificadas por curadores, ou seja, especialistas que realizam o processo de
checagem. Por meio de seus algoritmos especiais, o banco permite que o usurio faa buscas por espectros
ou deslocamentos qumicos, ou obtenha predies de espectros (
1
H e
13
C). Os dados so retornados em
porcentagem de similaridade. Ao todo existem 38.746 estruturas e 43.905 espectros (dados de novembro de
2010). Para realizar buscas, cabe ao usurio acessar o site, selecionar o boto search e, nos campos apropriados,
entrar com os dados de uma dada substncia. possvel entrar com vrios tipos de dados, tais como
deslocamentos qumicos ou espectros de RMN (formato JCAMP), estrutura qumica (vrios formatos de
arquivo), nome qumico ou peso molecular. Tambm possvel desenhar a estrutura utilizando o editor
JChemPaint, um applet integrado pgina. Em seguida, o usurio pode selecionar as modalidades de busca,
como por espectros ou subespectros. Caso o banco j possua os dados da substncia em questo, esses so
97
automaticamente retornados, juntamente, com sua estrutura qumica, espectro e deslocamentos qumicos.
Do contrrio, realizada uma busca e as estruturas associadas aos espectros so retornadas juntamente com
a porcentagem de similaridade (Figura 7). Existe ainda a opo de realizar predies de espectros, o que ser
abordado adiante na seo intitulada Programas, Geradores e Sistemas Especialistas.
FIGURA 7 | Tela do resultado de busca de espectros de RMN-
13
C do
NMRShiftDB a partir de uma estrutura qumica.
CSEARCH
O CSEARCH um banco de dados com deslocamentos qumicos de RMN-
13
C que surgiu como um
projeto acadmico do pesquisador Wolfgang Robien, da Universidade de Viena (http://homepage.univie.ac.at/
wolfgang.robien/csearch_main.html). Recentemente o CSEARCH passou a ser comercializado no pacote
Know-It-All da empresa Bio-Rad e tambm pode ser encontrado no mdulo NMR Predict Desktop da empresa
Mnova, os quais sero discutidos a seguir. Os algoritmos envolvidos nas predies envolvem uma associao
entre um banco de dados, cdigo HOSE, redes neurais e outros modelos computacionais. Caso o usurio
98
deseje realizar predies gratuitas, basta ler as condies, contatar o pesquisador por e-mail e submeter as
estruturas em formato Mol.
KnowItAll
Trata-se de um banco de dados espectrais proprietrio da empresa estadunidense Bio-Rad Laboratories
(http://www.knowitall.com), a qual possui representao no Brasil (www.bio-rad.com) e convnio com algumas
universidades para seu uso gratuito. Possui cerca de 1,3 milhes de estruturas e espectros no IV e de RMN.
Atualmente, tambm podem ser acessados online atravs do navegador KnowItAll AnyWare. As buscas
podem ser feitas por espectro (formato JCAMP), por estrutura (arquivos Mol, SMILES, entre outros), nome
CAS, frmula molecular, propriedade qumica, dentre outros (Figura 8). Aps a busca ser realizada, uma srie
de estruturas retornada juntamente com diversas informaes, incluindo referncias bibliogrficas. possvel
visualizar o espectro simulado e seus deslocamentos qumicos em uma tabela.
FIGURA 8 | Tela do resultado de busca de espectros do KnowItAll AnyWare a
partir de uma estrutura qumica.
NIST
O NIST (http://www.sisweb.com/software/ms/nist.htm) uma enorme biblioteca comercial de dados
de EM, em especial por ionizao eletrnica, incluindo tambm dados de CG e massa/massa (EM/EM). A
verso de 2008, denominada de NIST 08, fruto de cerca de duas dcadas de trabalho. Possui softwares para
99
busca de dados de EM que so capazes de realizar vrios tipos de tarefas, tais como visualizao, anlise e
comparao de espectros, bem como integrao com vrios formatos proprietrios de diferentes empresas.
O usurio tambm pode interpretar espectros e construir sua prpria biblioteca de dados de EM. Em sua
pgina da internet, alm de haver vrias informaes detalhadas sobre como operar as diferentes ferramentas,
o usurio ainda pode pesquisar se os dados espectrais de determinada substncia esto presentes na biblioteca,
sendo que as buscas podem ser realizadas por meio do nome, nmero CAS ou frmula da substncia de
interesse. Atualmente, existe o NIST MS, uma verso gratuita do NIST 08 que capaz de gerar informaes de
subestruturas atravs de um algoritmo de k-NN que procura por espectros de massas em um enorme banco
de dados.
PROCESSAMENTO E ANLISE DE ESPECTROS
H alguns anos as empresas que desenvolviam espectrmetros disponibilizavam suas prprias
ferramentas para acessar, visualizar e processar espectros, como EM, IV e RMN. Como, geralmente, as licenas
desses programas eram muito caras, o usurio ficava limitado ao uso do computador instalado aos
equipamentos. Essa situao comeou a mudar quando surgiram os primeiros editores de espectros gratuitos,
alguns dos quais posteriormente passaram a ser comercializados, porm com os preos de suas licenas bem
mais acessveis em comparao com aqueles anteriores. Essas ferramentas foram desenvolvidas basicamente
para o sistema operacional Windows da Microsoft, havendo uma menor quantidade de material disponvel
para os sistemas Linux e Mac OS X da Apple.
A grande maioria, seno todos os programas, alm daqueles para visualizao de espectros na internet
(applets), trabalham com arquivos em formato JCAMP-DX. O formato JCAMP (Joint Committee on Atomic
and Molecular Physical Data), que armazena arquivos com a extenso .dx, aberto e padro internacional. Foi
inicialmente desenvolvido por pesquisadores da Universidade das ndias Ocidentais da Jamaica para a troca
de arquivos de espectros no IV de diferentes equipamentos. Atualmente, seu desenvolvimento e suporte
esto sob os cuidados de um comit especial da IUPAC (http://www.jcamp-dx.org). O JCAMP est sendo
utilizado at para a troca de arquivos de dados cromatogrficos e de EM em tcnicas hifenadas. Suporta
arquivos de EM, IV e RMN.
Para visualizar e editar espectros no IV existem algumas ferramentas disponveis, gratuitas ou comerciais,
como o aplicativo online JSpecView (http://jspecview.sourceforge.net) e o mdulo do Essential FTIR (http://
www.essentialftir.com), porm elas no sero discutidas aqui.
Os programas mais populares atualmente para visualizar, processar e analisar espectros de RMN so o
SpinWorks e o ACD/NMR Processor, ambos gratuitos, alm do Mnova NMR, comercial. Esses programas
oferecem a possibilidade de abrir arquivos fidmono e bidimensionais obtidos por espectrmetros de diversos
fabricantes de equipamentos, realizar transformada de Fourier, visualizar espectros, calibrar espectros com
sinais de solventes deuterados, corrigir a fase e a linha de base, realizar expanses, integrar sinais e medir
constantes de acoplamento de RMN-
1
H, dentre vrias outras funes. Alm disso, os espectros editados
podem ser armazenados em formato JCAMP-DX e exportados como figura para editores de textos,
apresentadores e outros programas, inclusive para applets da internet.
100
ACD/NMR Processor
At meados de 2010 a licena deste programa proprietrio da empresa canadense ACD/Labs (http:/
/www.acdlabs.com) era paga, sendo que passou a ser oferecido gratuitamente a acadmicos, bastando baixar
o arquivo de sua pgina da internet. O programa possui todas as funcionalidades comuns para esse tipo de
editor que foram descritas no pargrafo anterior. Oferece ainda a possibilidade de associar uma estrutura
qumica ao espectro para realizar a atribuio de sinais de seus tomos e tambm gerar relatrios que podem
ser armazenados, dentre outras funes. A interface bem moderna e os menus so intuitivos, o que facilita
o usurio abrir e editar rapidamente um espectro (Figura 9).
FIGURA 9 | ACD/NMR Processor operando com um espectro de RMN-
1
H de
uma substncia.
Mnova NMR
Desenvolvido pela empresa espanhola MestreLab Research (http://mestrelab.com), esta ferramenta
multiplataforma evoluiu a partir do MestReC, anteriormente distribudo de forma gratuita pela Universidade
de Santiago de Compostela. Hoje comercializado como Mnova NMR e sua verso Standard/Lite est disponvel
no ChemDraw Ultra 12.0 Suite da empresa CambridgeSoft. Possui vrias sutes e plugins que podem ser
instalados a um preo adicional, como o mdulo para realizar predies de RMN (NMRPredict Desktop). A
empresa criou diferentes verses para serem instaladas nos sistemas operacionais Windows, Linux e Mac OS
X. Tambm possui as mesmas funcionalidades comuns para esse tipo de editor as quais foram,descritas
anteriormente nesta seo, alm da possibilidade de associar uma estrutura qumica ao espectro para realizar
a atribuio de sinais de seus tomos, comparar diferentes espectros superpostos em srie, remover sinais de
artefatos, de impurezas e de solventes, bem como realizar a desconvoluo e resoluo de multipletos
sobrepostos.
101
PROGRAMAS, GERADORES E SISTEMAS ESPECIALISTAS
Nesta seo so discutidas algumas das ferramentas mais populares que esto disponveis ao usurio,
em especial aquelas para trabalhar com dados de RMN.
ACD/Predictor, -/Elucidator,- /MS Fragmenter, -/MS Processor e -/MS Manager
Estes programas proprietrios so comercializados pela empresa ACD/Labs. O ACD/Predictor realiza
predies de deslocamentos qumicos e simula espectros de RMN com diferentes ncleos (
1
H,
13
C,
15
N,
19
F e
31
P). As estruturas podem ser desenhadas com o editor gratuito ACD/ChemSketch ou importadas por meio de
uma enorme variedade de formatos. Possui um banco de dados com mais de 420.000 estruturas, cerca de 1,7
milhes de fragmentos e subespectros, e mais de 4,3 milhes de deslocamentos qumicos, constituindo um
dos maiores bancos de dados comercialmente disponveis. O software possui uma tabela de fragmentos
estruturais associados a seus respectivos deslocamentos qumicos, o que o torna bastante eficaz. As predies
so baseadas em redes neurais, cdigo HOSE, regras de incremento e mtodos baseados em fragmentos,
levando em considerao a estereoqumica, hidrognios diasterotpicos e at tautmeros. Oferece uma
variedade de opes de solventes deuterados para realizar predies de RMN-
1
H e
13
C. um dos poucos
softwares capazes de realizar predies de espectros 2D (
1
H-
13
C e
1
H-
15
N em COSY, HSQC, HSQC-DEPT, HMQC,
HMBC, entre outros) e com a possibilidade do usurio treinar predies com seu prprio conjunto de dados
experimentais. Realiza predies de constantes de acoplamento de RMN-
1
H e, em uma mesma tela, compara
os espectros, experimental e simulado, de uma dada estrutura, uma vez que o programa tambm capaz de
processar espectros de RMN.
O ACD/Elucidator um dos mais completos pacotes na atualidade para realizar rotinas completas de
elucidao estrutural de substncias desconhecidas a partir de seus dados espectrais, sendo um genuno
sistema especialista. Possui em sua interface o mesmo banco de dados do ACD/Predictor. Processa os mais
variados tipos de arquivos de espectros no UV, IV, RMN e EM, incluindo os bidimensionais. Realiza todas as
etapas de elucidao estrutural descritas na seo Metodologias, Tcnicas Computacionais e Algoritmos,
como a busca por estruturas e fragmentos em bancos de dados, gerao de estruturas com base em dados
espectrais (IV, RMN) e predies de deslocamentos qumicos de RMN. Recentemente, os pesquisadores
envolvidos no projeto de desenvolvimento desse sistema realizaram grandes melhoras no produto e inmeros
detalhes experimentais foram descritos e comentados (ELYASHBERG et al., 2010).
Alm desses programas e de outros relacionados a RMN, a empresa tambm comercializa trs
aplicativos que operam com espectros de massas: o MS Fragmenter, o MS Processor e o MS Manager. O
primeiro realiza predies de fragmentos de massa a partir de uma dada estrutura qumica e da tcnica de
ionizao selecionada. Seu algoritmo baseado em regras clssicas de fragmentao, como em reaes
qumicas, e que so consideradas clssicas conforme discutido na seo Espectrometria de Massas. O segundo
programa, alm de processar espectros de vrios fabricantes de espectrmetros, tambm atribui fragmentos
estruturais a picos, relaciona fragmentos estruturais a espectros e possui um algoritmo denominado CODA
(COmponent Detection Algorithm) para atenuar o rudo de espectros. J o terceiro serve para processar,
interpretar e armazenar espectros de quaisquer espectrmetros, alm de possibilitar a elaborao de bancos
de dados para consultas posteriores.
102
NMRPredict Desktop e MNova MS
O mdulo de predio destes programas so plugins que podem ser adquiridos a um preo adicional
e incorporados ao processador MNova NMR discutido anteriormente. Na realidade o mdulo NMRPredict
Desktop um programa desenvolvido e tambm comercializado pela empresa britnica ModGraph Consultants
Ltd. (http://www.modgraph.co.uk) que comercializa o ModGraph. O algoritmo de predio de RMN
13
C do
NMR Predict Desktop e tambm do ModGraph o mesmo do CSEARCH, que em sua estrutura utiliza uma
associao entre cdigo HOSE e redes neurais, conforme discutido nas sees Metodologias, Tcnicas
Computacionais e Algoritmos e Bancos de Dados. J o algoritmo para predies de RMN-
1
H incorpora os
esforos de outros pesquisadores que desenvolveram metodologias diferentes, tais como a parametrizao
de grupos funcionais e clculos de campos de fora.
O NMRPredict Desktop possui uma GUI moderna e intuitiva. Atravs dele possvel importar
estruturas no formato Mol, realizar predies de deslocamentos qumicos e simular espectros de RMN
com diferentes ncleos (
1
H,
13
C,
15
N,
19
F,
31
P,
17
O e
29
Si), levando em conta a estereoqumica e hidrognios
diasterotpicos. Tambm realiza predies de constantes de acoplamento de RMN-
1
H e, em uma
mesma tela, compara espectros experimentais com os simulados de uma dada estrutura qumica
(Figura 10). Oferece uma variedade de opes de solventes deuterados para realizar predies de
RMN-
1
H. Tambm possvel visualizar e exportar para editores de texto uma tabela com os dados das
predies efetuadas.
FIGURA 10 | A simulao do espectro de uma estrutura qumica (espectro
superior) e a comparao com seu espectro experimental
(espectro inferior) realizadas pelo NMRPredict Desktop da Mnova.
103
A empresa tambm comercializa o Mnova MS para visualizao, processamento e anlise de espectros
de massas e dados de CG- e CLAE-MS obtidos em equipamentos de vrias empresas. As principais
funcionalidades do Mnova MS so as mesmas dos programas da ACD/LAbs, porm no h a possibilidade de
realizar predies ou busca em bancos de dados.
ChemNMR
O ChemNMR, desenvolvido pela empresa sua Upstream Solutions (http://www.upstream.ch), um
mdulo presente em diferentes verses do programa ChemDraw, uma poderosa ferramenta para desenho e
edio de estruturas qumicas que foi desenvolvida e comercializada pela empresa norte-americana
CambridgeSoft (http://www.cambridgesoft.com).
Baseado em regras de aditividade, procedimentos de heurstica e pacotes de mecnica molecular,
realiza predies de deslocamentos qumicos e simulao de espectros de RMN, alm de predio de
constantes de acoplamento de RMN-
1
H. Opera com estereoqumica, geometria molecular e hidrognios
diasterotpicos.
A predio de deslocamentos de RMN extremamente simples, bastando selecionar na tela a estrutura
qumica desejada e acionar o comando necessrio. Os deslocamentos qumicos so vizualizados diretamente
na estrutura qumica (Figura 11).
FIGURA 11 | ChemNMR da CambridgeSoft e suas predies de
deslocamentos qumicos de RMN a partir de uma estrutura
qumica.
104
HyperChem Professional 8.0
Este programa, desenvolvido pela empresa estadunidense Hyperclube, Inc. (http://www.hyper.com),
possui diferentes verses e bastante diferente dos editores de estruturas comuns que foram discutidos
anteriormente. Ele oferece uma gama imensa de possibilidades para realizar trabalhos mais elaborados com
as estruturas qumicas. Dentre elas, pode-se citar os estudos de qumica quntica e de mecnica molecular,
tais como a otimizao de estruturas, anlise de dinmica molecular, modelagem molecular em geral e
demais funcionalidades como alguns clculos de parmetros fsico-qumicos, por exemplo energia de HOMO
(Highest Occupied Molecular Orbital) e LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital). Uma das possibilidades
a de se realizar predies de deslocamentos qumicos de RMN (Figura 12).
Para o clculo, utiliza-se o mdulo Invoke NMR em Compute. Esse mdulo tambm pode ser
obtido separadamente pela pgina http://www.hallogram.com/science/hypernmr/index.html. Nesse, os
espectros de NMR podem ser obtidos em duas etapas sequenciais. Inicialmente, so calculados o campo
magntico e as constantes de acoplamento dos spins entre os ncleos para qualquer ncleo selecionado do
sistema molecular, usando uma descrio de mecnica quntica da estrutura eletrnica. Na segunda etapa,
calcula-se as frequncias e as intensidades do espectro de RMN entre os resultados da etapa anterior. Alm
disso, o mdulo permite uma variedade de opes para visualizar os resultados de cada uma das duas etapas.
O programa realiza a minimizao de energia para otimizar a geometria em 3D da estrutura para posteriormente
se obter os valores de RMN. Dependendo do tamanho e da complexidade da estrutura, esse processo pode
ser extremamente custoso se for levado em considerao o tempo gasto com o computador, o que pode vir
a ser uma desvantagem. Este software, assim como os demais, abre os arquivos codificados das estruturas em
vrios formatos: .hin do prprio software, .skc do Symyx Draw, .mol da MDL, .mol2 da Tripos e .pdb, dentre
outros.
FIGURA 12 | HyperChem Professional 8.0 e o mdulo Invoke NMR que calcula
as predies de deslocamentos qumicos de RMN de uma
estrutura qumica.
105
Spartan 08
Desenvolvido pela empresa estadunidense Wavefunction, Inc. (http://www.wavefun.com), sua
estrutura e funes so bastante similares s do HyperChem Professional, descrito anteriormente.
Essa verso calcula os deslocamentos qumicos de carbono e de prton a partir de modelos Hartree-
Fock e DFT. Assim como HyperChem, o tempo computacional do Spartan 08 tambm pode ser alto
dependendo do tamanho e complexidade da estrutura. Entretanto, realiza estudos minuciosos com as
estruturas qumicas em 3D. Como exemplos, podem-se citar clculos de energia, equilbrio de
geometria, geometria do estado de transio, anlise conformacional, espectros no IV e de UV-visvel,
dentre outros. Esse programa tambm reconhece diversos formatos de arquivos como o .spartan,
.mol, .pdb e .mol2.
Alm do espectro obtido graficamente (Figura 13), pode-se obter os valores de deslocamentos
qumicos, tabelados dentro do arquivo da molcula no formato .spartan, os quais podem ser copiados e
transferidos para uma tabela.
FIGURA 13 | Tela do Spartan 08 e predies de deslocamentos qumicos de
RMN obtidas por clculos ab initio a partir de uma estrutura
qumica.
106
SPINUS-WEB
Esta ferramenta proprietria online e de acesso livre na internet (http://www.dq.fct.unl.pt/spinus)
realiza predies de deslocamentos qumicos, simula espectros de RMN-
1
H e estima constantes de acoplamento.
Foi desenvolvida sob a liderana do pesquisador portugus Joo Aires de Sousa, da Universidade Nova de
Lisboa, e implementada em linguagem Java, sendo verstil, fcil de operar e bastante confivel (BINEV &
AIRES-DE-SOUSA, 2004).
O usurio pode desenhar a estrutura no editor Marvin Applet (Figura 14) ou import-la em vrios
formatos. Em seguida, basta pressionar o boto Predict full proton NMR spectra para obter os resultados
(Figura 15). Os clculos das predies so baseados em redes neurais e realizados com as estruturas 3D cujas
coordenadas so previamente geradas no servidor por intermdio de um programa especfico, o CORINA, da
empresa alem Molecular-Networks (http://www.molecular-networks.com). Apesar do algoritmo ser
relativamente simples e do programa ser de acesso livre, o SPINUS-WEB uma poderosa ferramenta para
realizar predies que considera a estereoqumica, prtons CH
2
diasterotpicos e rgidos de anis. As
instrues para utilizar essa ferramenta bem como dados adicionais esto disponveis em sua prpria pgina
da internet.
Como resultados, alm das predies, o usurio tambm obtm as estruturas em 2D e 3D, que so
visualizadas e editadas com o plug-in MDL Chime (hoje da Accelrys-Symyx), o qual deve estar previamente
instalado no navegador. So obtidas tambm duas tabelas, uma com os deslocamentos qumicos e outra com
as constantes de acoplamento em Hz, alm do espectro simulado (Figura 15). Tanto as tabelas como o
espectro podem ser importados e armazenados como arquivos de texto (.txt) e JCAMP-DX (.dx),
respectivamente.
FIGURA 14 | Tela inicial do SPINUS-WEB com o Marvin applet para desenhar ou
importar, em diferentes formatos, a estrutura qumica cujas
predies sero realizadas.
107
FIGURA 15 | Resultado das predies realizadas com o SPINUS-WEB,
mostrando uma lista com os deslocamentos qumicos (parte
superior direita), as estruturas 2D e 3D (no topo, ao centro e
esquerda) e o espectro de RMN-
1
H simulado (parte inferior).
NMRShiftDB
O mdulo de predio do banco de dados NMRShiftDB baseado em cdigo HOSE para estimar
deslocamentos qumicos de RMN-
13
C, embora tambm possa estimar deslocamentos de outros ncleos,
incluindo prtons em CDCl
3
, porm utilizando um outro algoritmo (STEINBECK et al., 2003).
Estando na pgina da internet da ferramenta, basta o usurio selecionar o boto Predict, carregar a
estrutura no formato apropriado ou desenh-la em um applet. Tambm possvel selecionar quantas esferas
do cdigo HOSE devero ser utilizadas na predio. Aps os clculos, alm da estrutura utilizada para as
predies e seu respectivo espectro simulado, os deslocamentos qumicos calculados e alguns dados estatsticos
so fornecidos em uma tabela (Figura 16). possvel saber, por exemplo, quantas esferas do cdigo HOSE
foram utilizadas nas predies.
108
FIGURA 16 | Resultado da predio de deslocamentos qumicos de RMN-
13
C
de uma estrutura qumica realizada com o NMRShiftDB,
apresentando a estrutura ( esquerda, ao topo), o espectro
simulado ( esquerda, embaixo) e a tabela com os deslocamentos
( direita).
SISTEMAT
O sistema especialista SISTEMAT foi desenvolvido por um grupo de pesquisadores brasileiros para a
elucidao estrutural de produtos naturais e utiliza, especialmente, dados de RMN
13
C. Entre os resultados
fornecidos pelo sistema, os fragmentos estruturais e o provvel esqueleto da estrutura so frequentemente
apresentados com elevados ndices de acerto. O sistema executado em plataforma Windows ou DOS,
ambos da Microsoft. Foi concebido originalmente em linguagem FORTRAN e a seguir em PASCAL para
melhorar a interface com o usurio.
109
O banco de dados do SISTEMAT extremamente compacto, onde 3.000 estruturas qumicas ocupam
um espao menor de 1,0 MB. O sistema formado por diversos mdulos, dentre eles o DATASIS, que executa
a insero de dados no banco; SISBOTA e SISTAX, que realizam a anlise e extrao de dados botnicos;
REGRAS e SISCONST, que so responsveis pela busca de dados espectromtricos (GASTMANS et al., 1990). O
SISCONST trabalha com dados de RMN
13
C e utiliza-os para procurar por subestruturas compatveis com o
espectro problema.
MTODOS IN SILICO PARA ELUCIDAO ESTRUTURAL DE
SUBSTNCIAS: APLICAES EM PRODUTOS NATURAIS E METABOLMICA
Nesta seo sero descritas aplicaes de mtodos in silico para elucidao estrutural de substncias
na rea de produtos naturais e metabolmica envolvendo estudos de caso.
Na rea de produtos naturais, a aplicao de mtodos in silico como ferramenta para a elucidao
estrutural de substncias tem crescido bastante e os mtodos empregados tem evoludo. H alguns anos,
passou a ser comum realizar modelagem molecular por meio do clculo de campos de fora e estudos
conformacionais com algumas estruturas. Os resultados desses estudos de dinmica e mecnica molecular
eram aliados a dados experimentais de RMN, como por exemplo NOE e constantes de acoplamento, no
sentido de auxiliar na determinao da estereoqumica relativa e estabelecer a conformao de algumas
estruturas (SPRING et al., 2001). Relativamente simples, essa prtica tem sido realizada at os dias de hoje e
trazido bons resultados, sendo que para tal existem vrios programas e pacotes disponveis, como o prprio
Hyperchem (seo Programas, Geradores e Sistemas Especialistas). Existem, atualmente, trabalhos similares
de mecnica quntica envolvendo clculos tericos de deslocamentos qumicos e constantes de acoplamento
(CONTRERAS et al., 2009), enquanto que na EM ela tem auxiliado no estudo dos processos qumicos envolvidos
em fragmentaes (VESSECCHI et al., 2008).
Recentemente, o interesse dos qumicos de produtos naturais por bancos de dados espectrais e
programas para realizar predies e simulaes de espectros tem aumentado, estimulando a academia e as
companhias do setor a suprirem tais necessidades. Atualmente, a oferta de ferramentas para auxlio elucidao
estrutural por meio de mtodos in silico tem sido considervel e tanto a comunidade cientfica como o setor
empresarial que realizam rotinas de elucidao de estruturas passaram a aceit-las com mais naturalidade. O
grande gargalo ainda continua sendo a carncia de bons geradores de estruturas, os quais, a partir de dados
espectrais, fornecem propostas convincentes de estruturas ou subestruturas, ou mesmo sistemas CASE
generalistas, funcionais e totalmente automticos. Embora vrias publicaes acadmicas a respeito deste
tema tenham surgido, os produtos ainda no podem ser publicamente testados e tampouco comercializados
(STEINBECK, 2004; ELYASHBERG et al., 2010). Deve ser lembrado que um qumico de produtos naturais no
est encarregado de desenvolver algoritmos ou aplicativos para elucidao estrutural, mas sim gerar e fornecer
dados e suporte para que essas ferramentas possam ser cada vez mais aprimoradas.
Na rea de metabolmica de plantas a situao diferente, pois as ferramentas realmente necessrias
so as mais difceis de serem desenvolvidas, havendo muito poucas disponveis. O grande desafio nos estudos
de metabolmica trabalhar com matrizes biolgicas contendo misturas complexas de metablitos. Logo, as
ferramentas in silico para auxlio desreplicao e elucidao estrutural nestes estudos devem considerar
esse fato.
110
A anlise metabolmica propriamente dita ainda invivel, pois seu objetivo detectar e quantificar
todos os metablitos em um organismo. Segundo alguns autores (VERPOORTE et al., 2005), os estudos de
metabolmica podem ser classificados basicamente em trs grupos: aqueles que utilizam mtodos
cromatogrficos (CLAE e CG), os que so baseados em peso molecular (EM) e os que se valem de caractersticas
fsicas (RMN), cada qual com suas vantagens e limitaes. Os objetivos desses estudos podem ser variados,
por exemplo com foco na identificao de uma determinada classe de substncias em um organismo
(metabolic profilig), ou anlise da impresso digital de metablitos em um organismo sem se preocupar com
sua identificao (metabolic fingerprinting). A combinao de diferentes mtodos, como as tcnicas hifenadas
CLAE-EM e CG-EM, tambm bastante empregada, ao passo que a CLAE-RMN ainda pouco usada
(VERPOORTE et al., 2005; VAN DER KOOY, 2009). Tais caractersticas dos estudos de metaboloma fazem com
que o desenvolvimento de mtodos in silico para elucidao estrutural seja realmente um grande desafio.
Nesse contexto, com relao a EM, atualmente tem-se tentado associar ferramentas de predio de
fragmentaes de estruturas a bancos de dados, mas como foi descrito na seo denominada Espectrometria
de Massas, ainda h pouco material confivel disponvel, sendo que ao usurio restam praticamente os
bancos de dados, os quais so bastante utilizados em metabolmica.
No caso de RMN, conforme discutido na seo Ressonncia Magntica Nuclear, tem havido interesse
em desenvolver ferramentas capazes de realizar a subtrao de espectros simulados daqueles obtidos
experimentalmente de misturas, o que muito importante em estudos de metaboloma. Por exemplo,
substncias comuns como cidos orgnicos do ciclo de Krebs, aminocidos e carboidratos j so facilmente
identificados em matrizes biolgicas com base em seus deslocamentos qumicos. Uma outra abordagem
interessante seria, a partir dos sinais de RMN de uma mistura, gerar estruturas compatveis e obter seus
respectivos espectros simulados para em seguida subtra-los sucessivamente do espectro da mistura. Entretanto,
ferramentas com essa finalidade ainda no esto disponveis. Os maiores problemas quando se utiliza RMN-
1
H para a identificao de substncias so a sobreposio de sinais e os seus multipletos, o que congestiona
demais os espectros. Nesses casos, inicialmente os dados espectrais so extrados e analisados por mtodos
quimiomtricos ou de estatstica multivariada, tais como Anlise dos Componentes Principais (PCA) ou regresso
por Mnimos Quadrados Parciais (PLS), com intuito de reconhecer padres e encontrar sinais discriminantes
para alguns marcadores e, portanto, poder comparar grupos de amostras com base em seus constituintes.
Embora os sinais de RMN-
13
C sejam cruciais para a determinao estrutural, fornecendo o esqueleto bsico
das estruturas, o problema passa a ser baixa sensibilidade e os longos tempos de relaxao. Assim, no caso de
RMN em metabolmica, o uso de experimentos bidimensionais como COSY, TOCSY, J-RES, HSQC e HMBC so
bastante importantes (VAN DER KOOY, 2009). Entretanto, mesmo com todo esse aparato, ainda h limitaes.
Em suma, atualmente o que mais h em oferta para estudos de metaboloma so as ferramentas in
silico que do suporte desreplicao e anlise de dados, tais como bancos de dados e softwares para
manipular dados, realizar o processo de desconvoluo e anlises estatsticas, quimiomtricas ou outras
tcnicas de modelagem. Uma rea que necessita evoluir mais e que pode ser uma grande aliada dos mtodos
de desreplicao a predio de tempos de reteno cromatogrficos para CLAE e CG, realizada por meio de
estudos de QSRR (Quantitative Structure-Retention Relationship). Utilizando descritores estruturais
diversificados e mtodos de predio com base em IA (ver item intitulado Metodologias, Tcnicas
Computacionais e Algoritmos e Figura 4), a QSRR tem funcionado bem para a gerao de modelos de
predio de tempos de reteno de estruturas anlogas e congenricas, porm ainda tem deixado a desejar
no caso de predio para estruturas diversas. Modelos de QSRR so importantes e podem auxiliar na
desreplicao, por exemplo, ao gerar tempos de reteno de estruturas oriundas de bancos de dados virtuais
ou das que so propostas a partir de dados experimentais de EM ou RMN. Assim, os tempos de reteno
experimentais provenientes de CLAE-EM e os calculados por QSRR podem ser comparados e as estruturas
cujos tempos estiverem muito fora de uma janela preestabelecida podem ser descartadas. Um outro aspecto
111
que deixa a desejar na rea de QSRR que a maioria dos trabalhos so acadmicos e os dados no so
disponibilizados para validao em sistemas de acesso livre ou comerciais (KIND & FIEHN, 2010).
Como o emprego de ferramentas in silico para elucidao estrutural de substncias em estudos de
metabolmica ainda carece de evoluo, nesta seo optou-se por demonstrar, por intermdio de estudos de
caso, uma das etapas da elucidao estrutural que atualmente tem sido mais difundida na comunidade de
produtos naturais: a predio de dados espectrais.
Foram selecionadas duas estruturas para revelar o potencial de predio de alguns programas comentados
anteriormente (seo Programas, Geradores e Sistemas Especialistas) e os resultados obtidos so apresentados
a seguir. Nesse estudo de caso, a inteno revelar ao leitor a capacidade de cada programa em executar as
predies, bem como demonstrar como pode ser realizada uma avaliao de resultados. De forma alguma os
autores esto preocupados em apontar qual o melhor ou pior programa pois, para tal, outros tipos de anlises
deveriam ser realizadas e uma gama enorme de deslocamentos qumicos deveria ser estimado.
Para realizar as predies, foi selecionada a estrutura de uma lactona sesquiterpnica do tipo
guaianolido e a de um diterpeno do tipo pimarano, as quais possuem elevado grau de complexidade
estrutural, contendo centros quirais, hidrognios diasterotpicos CH
2
, fuso de anis e ncleos com
diferentes graus de hibridizao (Figura 17), alm de terem seus dados de RMN publicados na literatura.
Estas duas estruturas pertencem a classes de metablitos secundrios que so encontradas em plantas
medicinais e que possuem importantes atividades farmacolgicas, sendo o guaianolido um anti-
infl amatrio (SCHORR et al. , 2002) e o pimarano antiespasmdico (AMBRSIO et al. , 2005),
antimicrobiano (PORTO et al. , 2009) e tripanocida (AMBRSIO et al. , 2008). Para a lactona
sesquiterpnica foram avaliados os resultados da predio de deslocamentos qumicos de RMN-
1
H
(SCHORR et al., 2002) e para o cido ent-pimaradienico foram avaliados os resultados da predio de
deslocamentos qumicos de RMN-
13
C (MATSUO et al., 1976). A seleo das predies de RMN-
1
H e
13
C
para essas duas estruturas foi feita com finalidade didtica pois, neste estudo de caso, cada uma das
duas modalidades de RMN mais adequada e, portanto, mais informativa, para cada uma das estruturas
em questo.
FIGURA 17 | Estruturas qumicas da lactona sesquiterpnica do tipo
guaianolido ( esquerda) e do diterpeno cido ent-
pimaradienico ( direita).
112
Os resultados das predies de RMN para ambas as estruturas, utilizando programas de computador,
foram comparados aos respectivos deslocamentos qumicos experimentais atravs do erro mdio absoluto
(EMA) descrito anteriormente (seo Ferramentas, Sistemas e Programas para Elucidao Estrutural in
Silico). Como ferramentas para as predies de RMN-
1
H foram utilizados o SPINUS-WEB e os mdulos de
predio do ChemDraw, MNova, HyperChem Professional 8.0 e Spartan 08. Para as predies de RMN-
13
C
foram utilizados os mdulos de predio do NMRShiftDB, ChemDraw, MNova, HyperChem Professional 8.0
e Spartan 08.
Os deslocamentos qumicos experimentais, publicados na literatura e aqueles obtidos nas predies
de RMN-
1
H, esto inseridos na Tabela 1, enquanto que os de RMN-
13
C encontram-se na Tabela 2. Na ltima
linha de cada tabela esto os respectivos EMA calculados.
Com base nas anlises realizadas neste estudo de caso, o programa SPINUS-WEB foi o que obteve
melhor desempenho para predies de RMN-
1
H (Tabela 1), enquanto o NMRPredict Desktop da MNova foi
o melhor para predies de RMN-
13
C (Tabela 2). Nas duas tabelas pode-se observar ainda, para qual, tipo de
ncleo de cada estrutura foram obtidas as melhores predies realizadas por cada ferramenta. O que pode
ser analisado a partir dos resultados que, em geral, os mtodos, utilizando clculos qunticos, obtiveram
erros maiores do que os outros mtodos, principalmente nos dados de RMN-
13
C para os ncleos com
hibridizao sp
2
.
Os mtodos qunticos levam em conta a rotao e a vibrao das molculas que so calculados a
partir da geometria e tm influncia direta nos dados de RMN, como tambm as foras intermoleculares e
o efeito do solvente. Todos esses fatores devem ser considerados alm do mtodo ab initio escolhido,
sendo ainda fatores limitantes a memria da mquina e o tempo computacional. Nesse estudo, o mtodo
ab initio empregado foi o Hartree-Fock com a base 6-31G* para o HyperChem e o Spartan, utilizando-se um
microcomputador com processador Intel Core 2 Duo com 1,86 GHz e 2,0 GB de memria RAM. Foram
gastas, aproximadamente, cinco horas para realizar o clculo de cada estrutura. No programa HyperNMR foi
utilizado o mtodo semiemprico TNDO/2 (Typed Neglect of Differential Overlap) para os clculos das
propriedades eletrnicas. Esses mtodos esto sendo constantemente pesquisados e modificados para
melhor predizerem propriedades moleculares, incluindo os valores de RMN, utilizando um menor custo
computacional.
Um ponto importante a ser destacado nas predies de deslocamentos qumicos de RMN-
1
H do
guaianolido (Tabela 1) que em todas elas os dois pares de hidrognio metilnicos geminais H13a/H13b
e H3a/H3b foram diferenciados, assim como hidrognios diasterotpicos H9a/H9b. Nesses trs pares de
hidrognios, o destaque que seus valores experimentais em alto e baixo campos tiveram seus valores
correspondentes preditos na mesma ordem. Os hidrognios das duas metilas allicas H14 e H15, com
deslocamentos qumicos experimentais idnticos, tiveram predies bastante razoveis. A atribuio do
H8 sempre problemtica em lactonas sesquiterpnicas e, nesse estudo de caso, apenas o SPINUS-WEB
teve um bom desempenho. O par H5/H7 nesse tipo de guaianolido possui deslocamentos qumicos bem
prximos e os resultados foram melhores para o SPINUS-WEB e o ChemDraw. Chama ateno o fato de que,
embora a maioria das predies tenham sido satisfatrias, o erro mdio absoluto calculado para o SPINUS-
WEB ( = 0,14 ppm) foi cerca de duas a trs vezes menor do que os erros do ChemDraw ( = 0,36 ppm),
MNova ( = 0,43 ppm) e Spartan ( = 0,48 ppm), e mais de cinco vezes menor que o do HyperChem ( =
0,77 ppm).
113
TABELA 1 - Deslocamentos qumicos de RMN-
1
H experimentais
a
e calculados para o guaianolido e as
diferenas () entre os dados experimentais e os calculados (valores em ppm).
a
dados experimentais = Exp (SCHORR et al., 2002); Mno = NMR Predict Desktop da Mnova; Cdr = ChemNMR
do ChemDraw; Spi = SPINUS-WEB; Spa = Spartan 08; Hyp = HyperChem Professional 8.0;
b
EMA = erro mdio
absoluto em ppm.
As predies para deslocamentos qumicos de RMN-
13
C, de modo geral, tambm foram boas,
destacando-se o MNova e o NMRShiftDB com os menores valores para o EMA, seguido de perto pelo
ChemDraw. Cada um desses trs programas apresentou pelo menos um valor de erro elevado para um
ncleo: o MNova para o C5 ( = 5,0 ppm), o NMRShiftDB para o C7 ( = 8,6 ppm) e o ChemDraw para as
metilas C18 e C20 ( = 8,4 e 7,2 ppm, respectivamente). Os valores de erro prximos a 10,0 ppm so
considerados elevados para predies de RMN-
13
C e aqueles prximos a 1,0 ppm so considerados excelentes.
Segundo esse critrio, 60% dos deslocamentos preditos pelo MNova e NMRShiftDB ficaram entre 1,0 ppm,
enquanto que o ChemDraw ficou com 45%. Conforme mencionado anteriormente, a causa dos valores de
erros mais elevados do Spartan e do HyperChem foi devido s predies pouco satisfatrias para os ncleos
com hibridizao sp
2
.
114
TABELA 2 - Deslocamentos qumicos de RMN-
13
C experimentais
a
e calculados para o diterpeno e as diferenas
() entre os dados experimentais e os calculados (valores em ppm).
a
dados experimentais = Exp (MATSUO et al., 1976); Mno = NMR Predict Desktop da Mnova; Cdr = ChemNMR
do ChemDraw; Nmr = NMRShiftDB; Spa = Spartan 08; Hyp = HyperChem Professional 8.0;
b
EMA = erro mdio
absoluto em ppm.
CONSIDERAES FINAIS
Os recentes avanos tecnolgicos da rea de informtica possibilitaram o desenvolvimento de
computadores mais potentes que processam experimentos mais rapidamente, alm de bancos de dados
espectrais cada vez maiores, o desenvolvimento de algoritmos mais poderosos e uma maior acuidade nos
resultados. Essa combinao de fatores tem possibilitado que a rea da elucidao estrutural, auxiliada por
computador, se desenvolva consideravelmente tanto na academia como nas empresas e que novas ferramentas
estejam constantemente disponveis aos usurios.
Atualmente, bastante fcil o acesso a algum programa computacional ou aplicativo que possa
auxiliar o usurio no processo de elucidao estrutural, seja ele de cdigo aberto ou proprietrio, alguns
muitas vezes disponveis on line na internet. Destaca-se alta velocidade de obteno de resultados e ao
aumento de sua acuidade. Entretanto, ainda no existe um programa que possa ser empregado com sucesso
em todos os casos, pois cada um deles possui suas vantagens e desvantagens, havendo sempre a necessidade
da interferncia do usurio, que deve estar apto a identificar qual deles mais apropriado para resolver seu
problema.
O resultado dessa situao que a rea de produtos naturais tem sido altamente beneficiada, em
especial no que concerne a edio de espectros, qualidade de bancos de dados, predio de propriedades e
115
simulao de espectros. J a pesquisa em metabolmica ainda enfrenta alguns desafios, em especial com
relao anlise e integrao de dados. Em ambos os setores os gargalos so a carncia de bons geradores
estruturais e a necessidade do desenvolvimento de novas ferramentas para realizar predies para EM.
Um grande desafio para os prximos anos uma maior interao entre o profissional da rea de
produtos naturais e os desenvolvedores de softwares para que, a partir do conhecimento atual e do estado da
arte em suas respectivas reas, se propicie o desenvolvimento de sistemas cada vez mais rpidos e eficientes
e de preferncia com pouca interferncia do usurio para a elucidao estrutural de substncias de
origem natural cada vez mais complexas, alm de encarar-se de vez as misturas presentes em matrizes
biolgicas.
8 AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a CAPES, CNPq e INCT_if. F.B. Costa agradece a FAPESP e a Fundao Alexander
Von Humboldt (Alemanha).
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ANLISES DE PRODUTOS DE ORIGEM
NATURAL POR CLAE-RMN
Carlos Alexandre Carollo
Daniel Pecoraro Demarque
INTRODUO
Ao se trabalhar com extratos vegetais, uma
fonte promissora de novas molculas bioativas, o
grande objetivo a separao e identificao de seus
constituintes (WOLFENDER et al., 1997). O interesse
nestes extratos se baseia na diversidade e
variabilidade estrutural de seus componentes,
contudo estas caractersticas tornam as amostras
complexas e de difcil elucidao (EXARCHOU et al.,
2005). Visando diminuir essas limitaes, o avano
da pesquisa na rea de produtos naturais est
intimamente ligado com o desenvolvimento de
tcnicas aprimoradas de separao, anlise e
identificao destas molculas (PHILLIPSON, 2003).
120
Diversas tcnicas j esto consolidadas e so amplamente utilizadas no processo de caracterizao de
extratos vegetais (CROTTI et al., 2008). Inmeras publicaes podem ser encontradas na literatura a respeito
das tcnicas tradicionais de fracionamento dos extratos, em que os constituintes so separados e isolados e,
posteriormente, caracterizados por tcnicas espectroscpicas e espectromtricas (EXARCHOU et al., 2003).
Dentro desse cenrio, a utilizao de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) ganha cada vez
mais espao e aplicao, visto que garante a separao eficiente dos componentes do extrato e possibilita sua
determinao quantitativa. Deve-se levar em considerao, no entanto, que o monitoramento da separao
pelos mtodos usuais como ultravioleta, fluorescncia e espectrometria de massas no dispe informaes
suficientes a respeito da estrutura qumica dos componentes da mistura (WOLFENDER et al., 1997; WOLFENDER
et al., 2001).
Dentre as tcnicas espectroscpicas que possibilitam a elucidao estrutural completa de molculas,
a ressonncia magntica nuclear (RMN) a mais importante, principalmente para identificao de substncias
desconhecidas (HOLZGRABE et al., 1998; HICKS, 2001; HARVEY, 2007), por fornecer um grande nmero de
informaes estruturais, tais como diferenas entre substncias com mesma massa ou frmula molecular,
deslocamentos qumicos caractersticos, multiplicidade (a interao entre os ncleos vizinhos) e integrais,
alm de ser uma tcnica no destrutiva (CORCORAN et al., 2003). A anlise clssica por RMN exige prvia
separao de seus componentes, normalmente realizada pela demorada e nem sempre efetiva tcnica de
coluna cromatogrfica clssica (CCC) (LAMBERT et al., 2005), sendo as fraes puras, posteriormente secas,
solubilizadas em solvente deuterado, para assim serem submetidas anlise (ALBERT, 2002; STAERK et al.,
2009).
Uma sada interessante para esse problema a utilizao de tcnicas hifenizadas, isto , a
combinao de tcnicas de anlise, que podem ser a perfeita associao no estudo de misturas complexas
provenientes de produtos naturais ( WILSON et al., 2003). A cromatografia lquida, acoplada com
ressonncia magntica nuclear, vem ganhado destaque, principalmente a partir das ltimas duas dcadas
(EXARCHOU et al., 2005). As primeiras tentativas foram realizadas na dcada de 1970, as quais contriburam
muito para o desenvolvimento da tcnica (KEIFER, 2003), uma vez que a baixa sensibilidade e altos
custos desses experimentos iniciais despertaram para a necessidade de melhorias na construo dos
campos magnticos, sondas e na interface de solventes entre CLAE e RMN. Com os recentes avanos, a
tcnica j vem sendo utilizada como uma importante ferramenta na pesquisa de produtos naturais
(BOBZIN et al., 2000; WOLFENDER et al., 2000; DALLUGE et al., 2001; QUEIROZ et al., 2002; CORCORAN
et al., 2003; MILIAUSKAS et al., 2005; SANDVOSS et al., 2005; SCHNEIDER et al., 2005; GAO et al., 2010),
produtos farmacuticos em geral (PENG et al., 1999; MUTLIB et al., 2000; FENG et al., 2001; BORLAK et
al., 2003; GODEJOHANN et al., 2004; PAULI et al., 2005; PAN et al., 2006; WU et al., 2007; KESTING et al.,
2010; PROVERA et al., 2010), alimentos (CHRISTOPHORIDOU et al., 2005; SUGIMOTO et al., 2006) e em
diversas outras reas de pesquisa (PUSECKER et al., 1999; DUARTE et al., 2005; HILLER et al., 2005; WEBB,
2005; BLECHTA et al., 2006; SILVA et al., 2006; BLECHTA et al., 2007; PREISS et al., 2007; SKOGERSON et
al., 2009).
A combinao de CLAE-RMN representa uma importante economia de tempo na anlise de extratos
brutos (IWASA et al., 2008), descoberta de novas substncias (SANDVOSS et al., 2001; HARVEY, 2007; DAI et
121
al., 2009) e no processo de desreplicao (ALALI et al., 2008), em que substncias indesejveis ou sem
interesse podem ser identificadas rapidamente, no perdendo, assim, esforos inteis com seu isolamento
(BRINGMANN et al., 1999; BOBZIN et al., 2000).
As diversas inovaes que tentam consolidar as duas tcnicas esto principalmente ligadas resoluo
de problemas de acoplamento, dadas as particularidades e incompatibilidades que as tcnicas de CLAE e
RMN apresentam. Inicialmente, discute-se a respeito das dificuldades de acoplamento e as sadas que foram
encontradas para o sucesso da tcnica de CLAE-RMN e, posteriormente, sua aplicabilidade em produtos
naturais.
INTERFACE ENTRE CLAE-RMN: O SOLVENTE
Um dos maiores problemas no acoplamento das tcnicas de CLAE e RMN consiste nas diferenas com
relao ao solvente que as duas tcnicas demandam. Para uma separao eficiente dos picos e obteno de
quantidades significativas de substncias, a CLAE precisa de quantidades considerveis de solvente, o que
dificulta a anlise por RMN, dada a baixa sensibilidade da tcnica. Para RMN h a necessidade de utilizao de
solventes deuterados, inviabilizando sua utilizao durante toda a anlise em CLAE-RMN pelo alto custo.
Ainda assim, o desenvolvimento de colunas de fase reversa para uma melhor separao em CLAE demanda,
normalmente, uma grande quantidade de gua, a qual aparecer no espectro de RMN como uma banda larga,
encobrindo outros sinais. Outro fator que esse sinal estar, consequentemente, em proporo muito maior
que a amostra (ELIPE, 2003b).
Deve-se considerar ainda que, a maioria das anlises cromatogrficas realizadas para separao de
substncias em CLAE utilizam gradientes de solventes, o que outro fator limitante para a otimizao do
campo magntico em RMN (ELIPE, 2007).
Para tentar contornar todos esses problemas, foram desenvolvidas diversas tcnicas de supresso de
sinal de solvente na tentativa de aprimorar a compatibilidade entre CLAE-RMN, dentre elas: pr-saturao,
irradiao mltipla com pulsos suaves e WET pr-saturao (WET, do ingls, water suppression enhanced
through T effects) (ALBERT, 2002). Na pr-saturao, ou NOESY pr-saturao (Nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy), o equipamento calibrado para no operar na frequncia do sinal do solvente. Na irradiao
mltipla com pulsos suaves, o princpio o mesmo da NOESY pr-saturao, porm visa suprimir sinais
mltiplos do solvente (multipletos, por exemplo). A WET pr-saturao usa quatro pulsos seletivos de
comprimentos variveis. A cada pulso h uma defasagem no gradiente de campo, variando a ponta do ngulo
do pulso, otimizando a tcnica (ALBERT, 1997; 2002).
Dentre estas tcnicas, a mais usada em CLAE-RMN a WET pr-saturao, pois capaz de suprimir
todos os sinais do solvente com o mnimo de distoro na linha de base. A pr-saturao NOESY reduz o sinal
do solvente com efetividade, porm, como utilizada constantemente mais de um solvente, essa tcnica
invivel dentro da rea de produtos naturais. A pr-saturao WET, apesar de eficaz, inviabiliza, assim como as
outras duas tcnicas, a utilizao de gradientes de solventes, pois a mudana da constante dieltrica, provocada
pela mudana de proporo de solventes, causa alteraes no campo magntico (ALBERT, 2002; WILSON et
al., 2003; ELIPE, 2007).
122
A opo por trabalhar com mtodos de supresso de sinal do solvente depende de caractersticas do
extrato e de que maneira proceder com o solvente para uma separao efetiva dos picos. Deve-se considerar,
ainda, que mesmo suprimindo o sinal do solvente eficientemente, existe ainda a possibilidade do sinal da
amostra cair justamente no ponto onde o sinal foi suprimido, havendo uma perda de informaes (ALBERT,
2002; ELIPE, 2007).
SENSIBILIDADE DA TCNICA DE CLAE-RMN
A baixa sensibilidade da tcnica de RMN, na ordem de microgramas, associada necessidade de
quantidade de solvente relativamente grande, criam outra barreira no sucesso do acoplamento de CLAE-
RMN. Reduzir o fluxo do CLAE abaixo de 1 mL/min pode comprometer a efetividade da separao entre os
picos (WILSON et al., 2003; ELIPE, 2007). Torna-se evidente, portanto, a necessidade de utilizao de campos
magnticos de alta magnitude (500 Hz ou mais). Diversos pesquisadores otimizaram suas anlises na tentativa
de aumentar a sensibilidade da tcnica (WOLFENDER et al., 2001).
EXTRAO EM FASE-SLIDA PARA ANLISE EM RMN
Como abordado anteriormente, um dos problemas mais limitantes no desenvolvimento da tcnica
CLAE-RMN a necessidade de maior quantidade de solvente para a eficiente separao dos picos e a
utilizao de mais de um solvente durante a anlise. Para tentar contorn-los, houve o desenvolvimento de
tcnicas aplicadas na interface entre CLAE e RMN com um princpio de operao relativamente simples:
concentrao da amostra. Baseado nisso, a extrao em fase slida (SPE, do ingls - Solid Phase Extraction)
em combinao ou no com sondas criognicas em RMN ou separao por capilaridade em CLAE, pode ser
uma alternativa universal e rpida para solucionar esse problema. O processo , basicamente, conectar
uma passagem do fluxo advindo de CLAE em cartuchos descartveis de SPE, os quais concentram a amostra
e, consequentemente, aumentam a sensibilidade da RMN (MILIAUSKAS et al., 2005; MILIAUSKAS et al.,
2006; ELIPE, 2007).
O sistema operacional de CLAE-SPE-RMN alm de ser muito mais sensvel que o convencional,
rpido, reprodutvel, seletivo para as amostras de interesse e elimina a necessidade de utilizao de solventes
deuterados em CLAE (ALEXANDER et al., 2006). O sistema elimina ainda, os efeitos de perturbao do campo
magntico provocados pelo emprego de gradientes de solventes. Os picos que so separados pelo sistema
de CLAE so interceptados ao entrar na deteco de UV, onde, por meio de um brao robtico, so diludos
em uma ps-coluna com gua, a qual conectada diretamente com cartuchos de SPE. Nos cartuchos, existe
uma fase slida formada geralmente de slica de fase reversa, em que a substncia de interesse ter maior
afinidade do que pela gua. A partir da, seco com nitrognio, solubilizado com solvente deuterado e
transferido para a sonda de RMN (WILSON et al., 2006). A reutilizao do mesmo cartucho de SPE, durante
mltiplas injees da mesma amostra, possibilita obter uma quantidade maior das fraes e a aquisio de
123
espectro de carbono 13 (
13
C), dada a menor sensibilidade na sua deteco por sua baixa concentrao natural
na natureza, em torno de 1,1% (EXARCHOU et al., 2003; SIMPSON et al., 2004; EXARCHOU et al., 2005).
As inmeras possibilidades de aplicaes que o desenvolvimento da CLAE-SPE-RMN implicam, podem
ser ilustradas por diversos trabalhos publicados no meio cientfico, comprovando a eficincia da tcnica
(CLARKSON et al., 2005; LAMBERT et al., 2005; SEGER et al., 2005; WILSON et al., 2006; WILSON et al., 2007;
KOSKELA et al., 2009; MOTTI et al., 2009; YANG et al., 2009; CASTRO et al., 2010; GAO et al., 2010; MAZUMDER
et al., 2010). Godejohann et al. (2004), ao comparar a eficcia das tcnicas de CLAE-RMN e CLAE-SPE-RMN ao
estudar metablitos do paracetamol, encontraram uma sensibilidade dessa ltima, pelo menos duas vezes
maior, em relao tcnica clssica. Pukalskas et al. (2005) ao analisar extratos complexos de plantas, relatam
a possibilidade de diferenciao de substncias intimamente parecidos (mesma massa molecular) pela tcnica
de CLAE-SPE-RMN.
OUTROS AVANOS NO AUMENTO DA SENSIBILIDADE DA TCNICA
A utilizao de sonda criognica (termo vindo do ingls cryo-probe) foi utilizada pela primeira vez
por Spraul et al. (2003) para a determinao de metablitos de acetaminofeno em urina. Esta metodologia
visa a diminuio da temperatura das bobinas e pr-amplificadores eletrnicos temperaturas criognicas,
isto , temperaturas muito abaixo de 0C, mantendo a amostra em temperatura ambiente. Dessa forma,
elimina o rudo trmico associado aos estgios iniciais de deteco, o que aumenta a sensibilidade e o limite
de deteco em quatro vezes reduzindo o tempo de experimento em dezesseis vezes (FLYNN et al., 2000;
ELIPE, 2003a; SPRAUL et al., 2003; EXARCHOU et al., 2005; CLOAREC et al., 2007; ELIPE, 2007).
Outra maneira de contornar o problema da baixa sensibilidade o desenvolvimento de uma tcnica
que consiga tornar equivalente a quantidade de solvente utilizada para separao em CLAE dentro do limite
utilizado pelo RMN. Esse objetivo pode ter xito por meio da miniaturizao das bobinas de radiofrequncia
(RF), utilizando-se microbobinas, e pela separao em CLAE em colunas capilares. As microbobinas conseguem
promover uma deteco que corresponde ao pico de eluio do CLAE em colunas capilares (em torno de 1,5
L). Assim, reduzindo o limite de deteco, torna-se possvel a anlise de substncias de alto peso molecular
e substncias minoritrias em extratos vegetais (KRUCKER et al., 2004; EXARCHOU et al., 2005). A miniaturizao
em conjunto do sistema de CLAE, torna a tcnica ainda mais robusta, viabilizando a utilizao de solvente
deuterado durante toda anlise. Tcnicas que utilizam capilares so teis especialmente em casos em que a
amostra necessita de um limite de deteco na ordem de nanogramas. Deve ser, no entanto, solvel em um
volume de aproximadamente 5 L do solvente deuterado ou menos, o que nem sempre possvel (HENTSCHEL
et al., 2005; LEWIS et al., 2005; WEBB, 2005).
Mais recentemente, o desenvolvimento de vrias bobinas ligadas em paralelo pode ser aplicvel para
a aquisio de dados de RMN de vrias amostras ao mesmo tempo (MACNAMARA et al., 1999). CLAE-RMN
capilar tambm pode ser usada com outras tcnicas capilares, como eletroforese capilar e outros (GRIFFITHS
et al., 1998; OLSON et al., 1998; PUSECKER et al., 1999; SCHEWITZ et al., 1999; RUSSELL et al., 2000; LACEY et
al., 2001; JAYAWICKRAMA et al., 2003; RAPP et al., 2003; JAYAWICKRAMA et al., 2004; KRUCKER et al., 2004;
OLSON et al., 2004; LIN et al., 2008; KOSKELA et al., 2009; MOLINSKI, 2010; TANG et al., 2010; YAMAUCHI et al.,
2010).
124
SISTEMAS OPERACIONAIS DE CLAE-RMN
O tipo de sistema operacional utilizado para uma anlise em CLAE-RMN depende muito da amostra
que se est trabalhando e quais dados so necessrios para sua completa elucidao estrutural.
Os tipos de operao so classificados de acordo com o status da amostra durante a anlise (BRAUMANN
et al., 2002). So, basicamente, quatro sistemas em que CLAE-RMN operam: fluxo contnuo, fluxo interrompido,
time-slice e recolhimento de loop (ELIPE, 2003a). Essas condies em que a amostra analisada (em fluxo/
esttica) esto intimamente relacionadas com a forma que a amostra conduzida RMN, o que necessita
tambm, de sistemas de deteco de RMN diferenciados. Esses sistemas funcionam normalmente
automatizados e com controle computadorizado (on-line) (ELIPE, 2003a; 2007).
FLUXO CONTNUO
Nesse tipo de anlise, a deteco das fraes que esto sendo separadas ocorre no RMN concomitante
com a separao de outras fraes em CLAE. Ou seja, o sistema de deteco funciona continuamente com
separao de fraes da amostra e anlise por RMN, assim como em CLAE-DAD, no necessitando, portanto,
de sistema adicional de monitoramento em CLAE (UV ou DAD) (BRAUMANN et al., 2002; EXARCHOU et al.,
2005; ELIPE, 2007).
Esse sistema operacional possui a desvantagem da uma necessidade maior de amostra (WASIM et
al., 2005b). Assim, por exemplo, em um fluxo de 1 mL/min, o pico demora 3,6 segundos para passar pelo
RMN, o que reduz a estabilidade da bobina de deteco, limitando a aquisio de espectros 1D apenas
(ELIPE, 2007). Uma maneira de tentar contornar o problema reduzir extremamente o fluxo abaixo de
0,1 mL/min, em que um nmero maior de substncias podem ser separadas e detectadas e h melhoria na
relao sinal/rudo. Porm a anlise pode levar at 24 h ou mais para ser realizada (GRIFFITHS, 1997;
WILSON, 2000; QUEIROZ et al., 2002; ELIPE, 2003a; EXARCHOU et al., 2003; ELIPE, 2007).
O modo de fluxo contnuo permite uma triagem com
1
H, limitado aos sinais das substncias
majoritrias. Assim, esse modo pode servir para uma anlise inicial dos constituintes majoritrios de uma
mistura complexa. A aquisio de
13
C fica tambm impossibilitada pela proporo sinal-rudo aumentada
(EXARCHOU et al., 2005; WASIM et al., 2005a; KOSKELA et al., 2009).
Deve-se levar em considerao, ainda, a proporo de solventes utilizados para a separao em
CLAE (SPRAUL, 2008). Uma mistura, por exemplo, de acetonitrila (50%) e D
2
O (50%) tem um campo
qumico de 1150 Hz, alterando para 1300 Hz se a proporo de acetonitrila mudar para 60% (BRAUMANN
et al., 2002).
FLUXO INTERROMPIDO
Nesse sistema, a frao (ou pico) analisada sob condies estticas, isto , aps a frao ser detectada
em CLAE, interrompe-se a anlise e encaminha-se a frao para RMN. Aps essas serem realizadas, o fluxo em
CLAE retomado e o processo repete-se sucessivas vezes (Figura 1). As principais vantagens desse sistema
so a sensibilidade aumentada, no necessitando de uma quantidade maior de amostra como em fluxo
contnuo, e a possibilidade de obteno de espectros 1D e 2D dentre outros experimentos de RMN, uma vez
que a corrida da amostra est interrompida na CLAE. Possibilita, ainda, a supresso precisa do sinal do solvente
125
e eliminao das interferncias que o fluxo com gradientes de solvente causam no campo magntico
(BRAUMANN et al., 2002; ELIPE, 2007).
Wolfender et al. (WOLFENDER et al., 1997; WOLFENDER et al., 2001), ao compararem os mtodos
de fluxo contnuo e fluxo interrompido, encontram uma relao sinal-rudo em torno de cinco vezes menor
para essa ltima tcnica. Elipe et al. (ELIPE, 2003a) utilizaram a tcnica para a identificao de metablitos
obtidos da urina ou bile de ces, demonstrando a aplicabilidade mesmo quando se trabalha com metablitos
instveis.
Inmeros tipos de amostras e anlises podem ser realizadas com esse tipo de sistema (PETRITIS et al.,
2002; NOVAK et al., 2004; WU et al., 2007; PROVERA et al., 2010). Porm, a principal desvantagem consiste na
possibilidade de diminuio da resoluo, uma vez que a amostra fica parada na coluna enquanto est sendo
feita a anlise por RMN. O pico com uma frao em alta concentrao, precedido de pico com baixa
concentrao, pode sofrer efeitos residuais, interferindo na anlise (memory effects). H tambm a necessidade
de um detector parte entre CLAE e RMN (Spraul, 2008). Deve-se lembrar, ainda, que o tempo de sada da
frao do CLAE at a chegada na RMN deve ser calibrado (WILSON et al., 2003).
FIGURA 01 | Sistema CLAE-RMN operando em Fluxo Interrompido
126
TIME-SLICE
Esse mtodo principalmente utilizado quando no h uma separao efetiva dos picos. baseado
em uma srie de interrupes durante a sada de um pico de interesse, funcionando semelhante ao modo de
fluxo interrompido, porm a inteno principal desse modo de operao desreplicar todo o extrato e
identificar todos os constituintes, at mesmo os que, devido semelhanas estruturais, no se separaram
satisfatoriamente (WOLFENDER et al., 2001).
ARMAZENAMENTO EM LOOP
Esse modo de operao um intermedirio entre o os modos de fluxo contnuo e o de fluxo
interrompido, uma vez que opera em fluxo contnuo em CLAE durante toda a corrida. As fraes so separadas
e armazenadas em Loops para uma posterior anlise em RMN. Esse sistema controlado por software,
exigindo um detector parte ao RMN (normalmente UV/DAD). Aps o trmino da corrida, as fraes
armazenadas podem ser conduzidas na ordem que se desejar ao RMN, o que possibilita as vantagens de
anlise do sistema de fluxo interrompido: experimentos de 1D e 2D. Para efetiva operao desse sistema, o
analito deve ser estvel durante o tempo de espera para anlise por RMN (BRAUMANN et al., 2002;
JAYAWICKRAMA et al., 2003; EXARCHOU et al., 2005; ELIPE, 2007).
Por no haver a necessidade de sucessivas interrupes durante a anlise, esse sistema no sofre com
problemas na resoluo da separao em CLAE. Devido, ainda, a independncia da anlise de CLAE e RMN, h
a possibilidade de preparao da amostra enquanto o RMN pode ser utilizado para outros fins. H a possibilidade,
inclusive de se manter os aparelhos em salas ou laboratrios diferentes (BRAUMANN et al., 2002).
HIFENIZAO MLTIPLA: ACOPLAMENTO DE ESPECTRMETRO DE
MASSAS E RMN
A hifenizao mltipla, hypernation, do ingls, unio das palavras hyper com hyphenation, o
acoplamento de mltiplas tcnicas para elucidao estrutural de substncias (WILSON et al., 2003). Para
CLAE-RMN, a unio mais comum com espectrmetro de massas (EM): CLAE-EM/RMN ou CLAE-EM/EM/RMN.
Nesse sistema, a amostra separada pelo cromatgrafo e posteriormente conduzida a um spliter, que divide
as fraes entre o EM e a RMN (a barra entre EM e RMN indica um fluxo paralelo) (WILSON et al., 2003; ELIPE,
2007).
O modo mais comum de utilizar a hifenizao mltipla o modo em paralelo, que possibilita obter
informaes de EM e RMN a respeito do pico de interesse. O acoplamento de CLAE-EM est bastante
desenvolvido, porm apresenta limitaes quanto s informaes que podem fornecer a respeito de uma
amostra de origem natural. Peso molecular, fragmentao e frmulas moleculares so dados que o EM pode
fornecer, porm so insuficientes para elucidao de estruturas desconhecidas. Molculas de mesmo peso
molecular (isbaras) e estereoismeros no podem ser diferenciadas, o que limita anlises de extratos vegetais
(CORCORAN et al., 2003). O RMN, mesmo quando no acoplado com EM, pode resolver esses problemas, no
fornecendo, no entanto, informaes respeito do peso molecular. Deve-se considerar, ainda, que grupos
como hidroxilas e aminas normalmente no so observados pela tcnica de RMN, pois o deutrio desloca o
hidrognio desses grupos, deixando-os invisveis ao aparelho. Grupos nitrados e conjugados de sulfato no
127
contm hidrognios, porm podem ser facilmente detectados por EM (WILSON, 2000; CORCORAN et al.,
2003). As anlises feitas pelas tcnicas, separadamente, nem sempre garantem de qual pico a substncia se
refere, causando ambiguidade e dificultando a elucidao estrutural. A utilizao de um sistema on-line pode
garantir que as anlises que esto sendo feitas por EM e RMN se tratam da mesma molcula, alm de evitar a
degradao que certas molculas sofrem quando separadas do extrato (ELIPE, 2007).
A utilizao de solventes deuterados durante toda a anlise de CLAE-EM/RMN pode resultar em
diferenas no peso molecular dos fragmentos obtidos pelo EM, uma vez que o deutrio pesa o dobro do
hidrognio. Isto pode deixar dvidas ao se proceder a elucidao estrutural de uma molcula. As tcnicas de
supresso do sinal do solvente ou SPE so preferidas para esse tipo de hifenizao (Figura 2) (ELIPE, 2007).
FIGURA 2 | Esquema de um sistema de cromatografia lquida acoplado a um
espectrmetro de massas e ressonncia magntica nuclear,
utilizando um sistema de SPE.
O sistema de operao CLAE-EM/RMN necessita de um spliter para dividir o fluxo de amostra do CLAE
para os sistemas de EM e RMN. Essa diviso no afeta, porm, a sensibilidade da tcnica de RMN, uma vez que
esta no igualitria. Isso porque a tcnica de EM muito mais sensvel que a RMN, sendo desviado, geralmente,
em torno de 5% do fluxo para EM e 95% para RMN (ELIPE, 2007).
128
O sistema CLAE-EM/RMN pode ser montado com os sistemas anteriormente citados (ELIPE, 2007).
No modo de fluxo contnuo, o spliter divide o fluxo para EM e RMN (5:95), e as anlises so obtidas em
ambos os equipamentos para um mesmo pico. Caso a anlise por RMN necessite de maiores informaes
a respeito do pico de interesse, o modo de fluxo interrompido pode ser til, possibilitando anlises
complementares que demandam um maior tempo, como COSY, NOESY, HSQC e HMBC. Nesse caso,
necessrio quantidade de amostra maior que 100 g, o que pode ser obtido com a utilizao de cartuchos
de SPE com mltiplas injees. O modo time-slice til em casos que os picos esto sobrepostos e se
deseja obter o perfil metablico completo de um determinado extrato ( WOLFENDER et al., 2001; ELIPE,
2007).
O modo de operao de armazenamento em loop tambm interessante, pois experimentos de
EM podem ser obtidos com o contedo do loop, enquanto RMN adquire outros dados. Dessa forma, os
sistemas operam separadamente com o contedo do mesmo loop, cada um no seu tempo de anlise.
Todas essas operaes podem ser manuais, semiautomticas ou totalmente automatizadas (CORCORAN et
al., 2003).
APLICAO DE CLAE-RMN EM ANLISES DE PRODUTOS NATURAIS
Os produtos de origem natural possuem como caracterstica marcante sua complexidade estrutural e
elevado nmero de metablitos, o que os torna um foco de interesse na busca de novos prottipos e, ao
mesmo tempo, fora o incremento das tcnicas analticas j existentes. Entre as ferramentas, atualmente
disponveis, a utilizao de CLAE-RMN possui o maior campo para desenvolvimento, visto a potencialidade
demonstrada pelas tcnicas individualmente, podendo se tornar, em um futuro breve, a ferramenta de
escolha na identificao de novas substncias de origem natural. A seguir sero apresentados alguns casos
interessantes da utilizao de tcnicas hifenadas de CLAE-RMN, em conjunto com tcnicas mais consolidadas
encontradas na literatura, que permitiro demonstrar a aplicao de alguns dos conceitos apresentados
anteriormente.
Dentre as possibilidades de explorao da tcnica na anlise de novos extratos, a utilizao da
desreplicao permite um direcionamento e otimizao na identificao de novas substncias, evitando o
tedioso trabalho de isolamento e purificao de substncias conhecidas (HOSTETTMANN et al., 2001). Este
novo campo de anlises vem sendo mais intensamente explorado no campo acadmico com destaque para
o grupo de pesquisa liderado por Hostettmann e Wolfender que publicaram diversas revises sobre a aplicao
de CLAE-RMN em anlises fitoqumicas (WOLFENDER et al., 2005; 2006; LAMBERT et al., 2007; QUEIROZ et al.,
2009).
Um exemplo do uso de CLAE-RMN na anlise de produtos naturais a identificao dos principais
alcaloides de Erythroxylum vacciniifolium Mart.. Neste trabalho, alm da utilizao dessa tcnica, os autores
utilizam outros procedimentos, contribuindo para uma caracterizao mais segura dos metablitos. Uma
anlise preliminar dos extratos, combinando CLAE-UV-DAD e CLAE-EM, foi realizada e pode-se observar uma
srie de substncias com espectros de UV semelhantes e que apresentavam fragmentos de baixo peso
molecular caractersticos, sugerindo um esqueleto comum entre as substncias. Em seguida, foram feitas
129
anlises em fluxo contnuo e interrompido em CLAE-RMN, o que permitiu a identificao de 24 alcaloides
tropnicos, exemplificados pela catuabina D (Figura 3) (ZANOLARI et al., 2003; WOLFENDER et al., 2005).
Sumarah et al. (SUMARAH et al., 2008) analisaram a presena de derivados policetdicos em 250
fungos endofticos isolados de Picea glauca (Moench) Voss atravs de CLAE-EM e CLAE-RMN, comparando os
dados espectroscpicos obtidos a partir dos derivados metilados isolados e a anlise do extrato original
atravs de tcnica de fluxo interrompido, permitindo a identificao de 10 substncias, sendo duas inditas,
representadas pelo 1-carboxil-metil-ster-2,8-diidroxi-3-metil-9-oxoxanteno (2) (Figura 3).
FIGURA 3 | Estrutura qumica de metablitos secundrios identificados por
tcnicas hifenadas utilizando RMN. Catuabina D (1); 1-carboxil-
metil-ster-2,8-diidroxi-3-metil-9-oxoxanteno (2); R- e S-
carnegina (3 e 4).
Recentemente, a combinao de dicrosmo circular (DC), RMN e EM, descrita por Iwasa et al. (IWASA
et al., 2008), se mostrou til na identificao e determinao da configurao absoluta dos alcaloides de
Nandina domestica Thunb. sem a necessidade de isolamento e purificao das substncias, permitindo
determinar o R- e S-carnegina (3 e 4) (Figura 3).
130
Uma abordagem interessante realizada por Dai et al. (DAI et al., 2009) levou identificao de 12
derivados flavnicos a partir de um extrato padronizado de Gossypium herbaceum L., conhecido como AB-8-
2, aps incompleta separao dos constituintes por cromatografia flash (25 fraes) e anlises integradas de
CLAE-EM e CLAE-RMN, analisando as fraes contendo os metablitos em diferentes concentraes, o que
torna possvel a identificao de sinais chaves no espetro de RMN de
1
H para identificao de substituintes no
esqueleto flavnico e completa caracterizao da estrutura.
Outros exemplos tambm so encontrados na literatura, abordando as tcnicas de CLAE-EM/RMN
aplicados a caracterizao de produtos naturais de origem marinha (DIAS et al., 2009); desenvolvimento de
novas drogas (PULLEN et al., 1995; LINDON et al., 2000) e no estudo do metabolismo de drogas essas tcnicas
vem sendo amplamente aplicadas (KAMEL et al., 2006; MA et al., 2006; WALKER et al., 2008; NEDDERMAN et
al., 2010).
CONSIDERAES FINAIS
O grande avano desta rea torna cada vez menos proibitiva a utilizao de sistemas hifenados com
capacidade de gerar grandes quantidades de informaes estruturais na rea de produtos naturais. Novas
tcnicas e equipamentos aumentam a compatibilidade entre a interface do CLAE e RMN, assim cada vez mais
se espera que essa tcnica se difunda e se torne uma grande aliada na identificao de substncias de origem
natural, diminuindo o tempo de anlise e as chances de insucesso na descoberta de novos prottipos.
A possibilidade de identificao de substncias sem a necessidade de purificao abre uma nova era
no desenvolvimento de novos produtos a partir de derivados naturais, permitindo a construo de bibliotecas
com o perfil dos metablitos, a anlise de um nmero maior de espcies em um tempo reduzido e, outro
ganho importante: a possibilidade de desreplicao, aproveitando a grande quantidade de informaes
disponveis na literatura.
Assim, cada vez mais, essas metodologias se tornam uma ferramenta de escolha na anlise de produtos
naturais.
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138
APLICAO DA CROMATOGRAFIA LQUIDA ACOPLADA A
TCNICAS ESPECTROMTRICAS NA ANLISE DE PRODUTOS NATURAIS
Eduardo de Jesus Oliveira
Jos Maria Barbosa Filho
Luiz Eldio Gregrio
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
INTRODUO
A espectrometria de massas (EM) uma
tcnica que analisa ons em fase gasosa de forma a
determinar a razo entre a massa e a carga (m/z)
desses ons. Colocado de forma mais prtica, a
espectrometria de massas uma tcnica
microanaltica (a quantidade de amostra necessria
para anlise da ordem de apenas alguns nanogramas
a picogramas, ou at menos em alguns casos) que
serve para detectar e/ou quantificar espcies
qumicas. Nesse processo, a espectrometria de
massas pode, em alguns casos, levar determinao
da composio elementar dessas espcies e, alm
disso, gerar alguma informao para fins de
determinao ou confirmao estrutural. Outro tipo
de informao importante, gerado pelo
espectrmetro de massas, a determinao da
abundncia dos ons que so gerados, o que fornece
sua dimenso quantitativa, permitindo utilizar-se a
140
tcnica para determinar, com elevada sensibilidade, a concentrao de um determinado analito em uma
amostra, desde que a resposta do detector seja calibrada com amostras do analito de concentrao conhecida.
Os ons que so analisados pelo espectrmetro de massas no precisam ser gerados em fase gasosa, mas a sua
separao (com base na razo m/z) realizada sempre em fase gasosa, e em alto vcuo (10
-4
-10
-7
Pa
1
). Como
um espectrmetro de massas no capaz de determinar a razo m/z de espcies neutras, o processo de
ionizao da amostra um pr-requisito importante que deve ser considerado na anlise de amostras
complexas como amostras biolgicas e extratos vegetais. No existem tcnicas de ionizao universais, ou
seja, no h uma tcnica de ionizao nica que exiba uma eficincia de ionizao adequada para qualquer
tipo de analito.
Do ponto de vista instrumental, existe uma diversidade bastante grande de espectrmetros de massas que
se diferenciam do ponto de vista analtico basicamente no seu poder de resoluo (ver item denominado Resoluo,
Poder de Resoluo e Determinao de Massa Exata), sensibilidade e faixa dinmica. Apesar dessa diversidade
de instrumentos, um espectrmetro de massas pode ser visto como sendo constitudo de pelo menos 4 partes
fundamentais, como esquematizado na figura 1.
FIGURA 1 | Diagrama esquemtico de um espectrmetro de massas.
A primeira destas partes a fonte de ons. Nessa fonte, sero gerados os ons que sero posteriormente
analisados para se determinar a sua razo m/z. A amostra a ser analisada, que pode ser uma substncia pura ou
uma mistura, pode ser introduzida na fonte de ons de vrios modos, mas para os fins da tcnica, objeto deste
captulo, ou seja, a cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas na anlise de produtos naturais,
a amostra (quimicamente complexa) normalmente introduzida em soluo, aps ter sido separada por
cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) ou cromatografia lquida de ultraeficincia (CLUE). Para
substncias puras, a amostra pode ser introduzida diretamente atravs do uso de uma bomba de infuso, que,
1
Pascal (Pa): unidade padro de presso e tenso no Sistema Internacional. Equivale a fora de 1N aplicada
uniformemente sobre uma superfcie de 1 m
2
.
141
alis, o mtodo mais utilizado para a introduo de substncias necessrias para calibrar a escala de massa
do equipamento (calibrantes). As amostras analisadas por CL-EM so introduzidas na fonte de ons na fase
condensada e precisam gerar as espcies inicas, que aps transferncia para a fase gasosa sero transmitidas
regio do analisador, em um processo que coletivamente chamado de ionizao presso atmosfrica
(IPA). Essa ionizao presso atmosfrica contrasta com a regio de alto vcuo do espectrmetro de massas
em que os ons sero analisados e detectados. O desenho exato de uma fonte de ons presso atmosfrica
depende do modo de ionizao especfico, que ser utilizado, e de detalhes de cada fabricante, mas
invariavelmente a fonte deve servir, no caso de CL-EM, para a transferncia seletiva das espcies inicas
geradas (excluindo as espcies neutras do solvente, por exemplo) para a regio do analisador, com a mxima
eficincia possvel, ou seja, minimizando a perda de ons entre a fonte e o analisador.
Aps serem gerados na fonte, os ons sero transmitidos ao analisador. A ptica de transmisso na
figura 1 representa um ou mais elementos, que atravs de campos eletromagnticos realiza a funo de
maximizar a eficincia de transmisso do feixe de ons gerado na fonte regio do analisador e desse ao
detector. O analisador o segundo elemento invariavelmente presente em qualquer espectrmetro de
massas. Esse pode ser considerado o elemento mais importante do instrumento, pois definir em grande
medida o poder de resoluo e outras caractersticas de desempenho do mesmo. A funo do analisador de
ons (tambm referido s vezes como filtro de ons) justamente a determinao da razo m/z dessas
espcies, que sero posteriormente transferidas com a mxima eficincia possvel ao detector. Existem
muitos tipos diferentes de analisadores de massas, cada um com suas vantagens e desvantagens, e tambm
com princpio de funcionamento prprio. Normalmente, os espectrmetros de massas so classificados de
acordo com o tipo de analisador presente no instrumento. Assim temos, por exemplo, espectrmetros de
massa do tipo quadrupolo (simples ou de triplo quadrupolo), de aprisionamento de ons (ion traps 3D e traps
lineares), de tempo de voo (time of flight mass spectrometers), Orbitrap e muitos sistemas hbridos, nos quais
mais de uma tecnologia de analisador so combinadas no mesmo instrumento. Os principais tipos de
analisadores utilizados atualmente em instrumentos de CL-EM comercialmente disponveis, sero discutidos
com maior detalhamento no item Analisadores de Massas. O outro elemento que todo espectrmetro de
massas possui o detector. Nesse, a informao sobre a abundncia (quantidade) de ons que chegam a este
elemento por unidade de tempo transformada em um sinal digital que armazenado para posterior
processamento. O detector realiza essa funo em quase todos os tipos de instrumentos comerciais atuais,
por meio da emisso secundria de eltrons, que cria o sinal eltrico que ser processado. Os detectores mais
utilizados so o multiplicador de eltrons (electron multipliers) e os detectores de microplacas, esses ltimos
utilizados com muito menos frequncia, geralmente em instrumentos com analisadores de tempo de voo.
Caractersticas importantes em um detector para utilizao em instrumentos de CL-EM so o seu ganho
(parmetro que est ligado performance do instrumento em termos de sua sensibilidade) e a sua
compatibilidade com velocidades de escaneamento elevadas. O detector de um espectrmetro de massas
possui um tempo finito de uso, pois o bombardeamento contnuo de ons em sua superfcie sensvel causa
uma progressiva diminuio do seu ganho e a necessidade de aumento da voltagem de operao, para
manuteno deste ganho eventualmente, gera um rudo eletrnico excessivamente alto. Neste momento, o
detector deve ser substitudo. Um dos tipos de detectores mais utilizados em instrumentos de CL-EM o
multiplicador de eltrons contnuo.
O ltimo, mas no menos importante componente de um espectrmetro de massas o sistema de
controle, aquisio e processamento de dados. Atualmente todos os sistemas comerciais de espectrometria
de massas se beneficiam da alta capacidade dos microprocessadores e da capacidade de armazenamento
dos computadores para garantir a aquisio de dados de forma contnua e com a alta velocidade necessria
142
para ser compatvel com os tempos de escaneamento cada vez menores dos espectrmetros de massas
modernos. Uma caracterstica importante do sistema de aquisio e processamento de dados nos
equipamentos de CL-EM a comodidade do software de permitir realizar, geralmente no mesmo mdulo ou
em mdulos diferentes do mesmo software, funes diversas como o controle dos parmetros do
cromatgrafo, monitorizao do sistema (como por exemplo o estado do vcuo), configurao dos parmetros
de ionizao e deteco do espectrmetro, configurao de mtodos de anlise, processamento dos resultados
e emisso e impresso de relatrios de anlise. Sem dvida, a popularizao do uso dos sistemas de
espectrometria de massas deve muito intuitividade e interatividade dos softwares de aquisio e
processamento de dados.
RESOLUO, PODER DE RESOLUO E DETERMINAO DE MASSA EXATA
Uma caracterstica muito importante nos espectrmetros de massas o seu poder de resoluo. Os
instrumentos podem ser divididos em espectrmetros de massas de baixa resoluo e de alta resoluo,
termos de certa forma inadequados, uma vez que o termo resoluo refere-se ao grau de separao (desde
que definido algum critrio para este grau de separao ser considerado aceitvel) entre picos com razo m/
z prxima em um espectro de massas e no capacidade do instrumento em efetuar essa separao, ou seja,
seu poder de resoluo. Desta forma, uma denominao mais apropriada seria espectrmetros de massas de
alto (ou baixo) poder de resoluo. A consequncia prtica mais importante de equipamentos de alto poder
de resoluo a possibilidade de utiliz-los na determinao da massa exata do on que est sendo registrado.
Essa determinao importante, pois o peso molecular exato de uma substncia a soma do peso atmico
de seus tomos constituintes e, a escala de peso atmico uma escala relativa, baseada no peso do istopo
mais abundante do carbono, o carbono-12. Assim, os istopos mais estveis e mais abundantes dos elementos
possuem um peso atmico que no um nmero inteiro, mas fracionrio. O peso atmico do istopo mais
abundante do oxignio no 16,0000, mas sim 15,9949 Da
2
. Desta forma, a massa exata de uma substncia
cuja frmula molecular C
6
H
12
O
3
132,0786, se considerarmos apenas o peso atmico dos istopos mais
abundantes. Esta massa geralmente chamada de massa exata monoisotpica, para diferenciar da massa
exata mdia, calculada por intermdio da mdia geomtrica que leva em conta a contribuio relativa
(abundncia) dos istopos de cada elemento. O registro grfico dos ons com uma determinada razo m/z em
funo de sua abundncia (intensidade) chamado de espectro de massas (Figura 2). No exemplo da substncia
acima, o espectro de massas da substncia exibiria (dependendo da tcnica de ionizao e das condies
utilizadas na anlise) um pico com razo m/z igual a 132,0786 (na realidade uma unidade de massa acima ou
abaixo deste valor, caso utilize-se ionizao no modo positivo ou negativo respectivamente; ver seo mais
adiante: Tcnicas de Ionizao a Presso Atmosfrica). Se o espectrmetro de massas utilizado na anlise tiver
um elevado poder de resoluo, ele ser capaz de determinar a massa exata deste on com um nmero de
casas decimais suficientes para permitir o assinalamento inequvoco a uma determinada frmula molecular.
2
Dalton (Da) ou unidade de massa atmica (u.m.a): unidade de medida para a massa de partculas atmicas
(massas atmicas de elementos ou compostos), sendo definida como 1/12 da massa de um tomo de carbono-12
em seu estado fundamental.
143
Para o exemplo mencionado anteriormente, algumas das possibilidades de frmula molecular, envolvendo
tomos de C, H e O, que podem fornecer esta massa exata, esto listadas na tabela 1.
FIGURA 2 | Representao grfica de um espectro de massas
TABELA 1 - Algumas das possibilidades de frmulas moleculares com massa nominal 132 e as diferenas em
ppm da massa exata 132,0785.
*ppm = partes por milho.
144
Pode-se perceber que a menor diferena (em ppm) entre a massa exata terica e a massa observada
para o on com m/z = 132,0785, obtido no espectro de massas, encontrada para a frmula molecular C
6
H
12
O
3
e, portanto, altamente provvel que essa corresponda de fato frmula molecular da espcie em questo.
Entretanto, a frmula molecular C
10
H
12
possui uma massa exata monoisotpica terica de 132,0939, diferindo
apenas 0,0154 Da da massa exata 132,0785 medida. Isso significa que o espectrmetro de massas utilizado
dever ser capaz de diferenciar (separar com base em algum critrio predeterminado) uma massa de 132,0785
da massa 132,0939, ou seja, uma diferena de 0,0154 Da. A caracterstica de um espectrmetro de massas
que permite essa diferenciao o seu poder de resoluo. O poder de resoluo (R) pode ser definido como
sendo a razo entre um determinado valor de massa nominal M e a diferena em termos de razo m/z de dois
ons que podem ser separados um do outro (m):
R=M/m
Qual seria o poder de resoluo necessrio para separar o on monoisotpico C
6
H
12
O
3
do on C
10
H
12
?
Para calcular, considere como a massa nominal (M) o ponto mdio entre a maior e a menor massa
(132,0785+132,0939/2 = 132,0862). Assim, o poder de resoluo necessrio ser de 132,0862/0,0154 =
8577. Assim, um poder de resoluo de no mnimo 8577 seria necessrio, valor este bem superior ao poder
de resoluo alcanado com os espectrmetros de massas do tipo quadrupolo, por exemplo, que se situa
em torno de 4000 no mximo. Entretanto, na definio de separao discutida anteriormente, algum
critrio qualificador faz-se necessrio, ou seja, que critrio deve-se utilizar para aceitar a separao entre
dois picos na escala m/z? H basicamente duas formas de definir essa separao, ou resoluo entre picos
adjacentes (Figura 3). Uma delas considerar como separados (ou resolvidos) dois picos adjacentes quando
a altura do vale formado entre esses dois picos corresponder a no mximo 10% da altura mxima dos
mesmos. Essa definio limitada a picos adjacentes de alturas comparveis, pois se assume que cada pico
contribui com cerca de 5% para esta altura, o que no se aplica a picos com alturas muito diferentes. Um
conceito mais geral o que utiliza a largura do pico a meia-altura (Full widht at half maximum, FWHM).
Assim, se a razo m/z de um determinado pico 500 e, esse pico possuir uma largura a meia-altura
correspondente a 0,1 m/z, a resoluo FWHM para esse pico de 5000 (500/0,1). Pode-se perceber pelo
pico esquerda da Figura 3, que na definio de resoluo, utilizando o conceito FWHM, o valor de m
cerca de metade do valor obtido se utilizar o conceito de vale com 10% da altura (neste caso m medido
como sendo a distncia compreendida entre os pontos mdios dos dois picos na escala m/z). Sendo assim,
os valores de poder de resoluo (R), utilizando a definio de separao entre picos FWHM so cerca de
duas vezes maiores que aqueles obtidos utilizando a definio de vale com 10% de altura, o que deve ser
levado em conta na interpretao dos parmetros de desempenho fornecidas pelos fabricantes de
equipamentos comerciais.
145
FIGURA 3. | Definies de resoluo utilizando o conceito de vale com 10%
da altura e largura a meia-altura (FWHM). Adaptado de Watson &
Sparkman (2007).
Existem espectrmetros de massas com resoluo constante e outros com poder de resoluo
constante. Por exemplo, os quadrupolos, normalmente, possuem resoluo unitria (m=1) constante atravs
de toda a escala de massas, ou seja, so capazes de diferenciar um on com razo m/z = 100 de um on com
razo m/z = 101. Para isso, ele dever ter um poder de resoluo (R) de 100/1 = 100. O mesmo instrumento
dever ter um poder de resoluo (R) de 1000 para ser capaz de diferenciar um on m/z = 1001 de um on m/
z = 1002 (R=1000/1). Desta forma, os espectrmetros de massas de quadrupolos tm resoluo constante e
poder de resoluo crescente com o aumento da razo m/z. Outros espectrmetros de massas possuem
poder de resoluo constante. Assim por exemplo, espectrmetros com analisadores de tempo de voo
possuem poder de resoluo constante, mas resoluo que varia dependendo da razo m/z considerada.
TCNICAS DE IONIZAO A PRESSO ATMOSFRICA
IONIZAO POR ELETRONEBULIZAO - IEN (ELECTROspray IONIZATION -
ESI)
J foi mencionado anteriormente que os ons gerados na fonte de ons precisam ser transmitidos com
eficincia para a regio do analisador e dessa ao detector. Isto significa que a regio por onde o feixe de ons
146
transmitido deve ser evacuada por bombas de vcuo com elevada eficincia para garantir um vcuo na
regio do analisador em torno de 10
-4
-10
-7
Pa. Uma das maiores dificuldades, que foi encontrada na tentativa
de compatibilizar a tcnica de cromatografia lquida com a espectrometria de massas, consistiu no problema
representado pela introduo de um fluxo constante de eluente (fluxos de 200 a 1000 L/min so normalmente
utilizados com CLAE) a partir do cromatgrafo lquido para a regio de alto vcuo do espectrmetro de massas
sem comprometer esse vcuo. Outra dificuldade que as tcnicas de ionizao mais utilizadas antes do
advento das tcnicas de ionizao presso atmosfrica (como ionizao por impacto eletrnico ou ionizao
qumica) requeriam que o analito estivesse em fase gasosa, uma situao completamente adversa, se a
inteno introduzir e ionizar analitos a partir do eluente que sai de uma coluna cromatogrfica de CLAE.
Muitas estratgias foram tentadas com maior ou menor sucesso para contornar essas dificuldades, resultando
em muitas interfaces diferentes. Uma das mais bem sucedidas interfaces foi quela associada ao
desenvolvimento da ionizao por eletronebulizao (IEN) ou ionizao por electrospray (IES). Nesse modo
de ionizao, os analitos so introduzidos na fonte de ons em soluo (por exemplo aps eluio em uma
coluna cromatogrfica) atravs de um fino capilar metlico (Figura 4). Esse capilar metlico mantido a um
potencial eltrico positivo ou negativo da ordem de alguns quilovolts (o que ir gerar ons positivos ou
negativos respectivamente) em relao a um contraeletrodo, formando um fino spray lquido com gotculas
carregadas. O potencial eltrico, assim como o dimetro do capilar metlico so essenciais para a formao do
spray. Esse processo conhecido por eletronebulizao (electrospray) e pode ser descrito como um processo
eletroltico, em que o capilar a extremidade oxidante e o contraeletrodo a extremidade redutora (Figura 4).
O spray que se forma assume uma forma cnica caracterstica, que foi descrita por Taylor (1964), e que ficou
conhecida por cone de Taylor. As gotculas que se formam a partir do cone de Taylor contm ons
quasimoleculares dos analitos (formados geralmente por protonao ou desprotonao). medida que o
solvente dessas gotculas sofre evaporao, a densidade de carga aumenta em cada gotcula. Eventualmente,
quando o tamanho da gotcula atinge um limite de tamanho, conhecido como limite de Rayleight
3
, as foras
de repulso dos ons na superfcie da gotcula vencem a tenso superficial dela e essa se fragmenta atravs de
um processo eletro-hidrodinmico, referido muitas vezes como exploso coulmbica, com a ejeo de ons
do analito para a fase gasosa. Outro mecanismo alternativo para explicar o processo de ionizao por
eletronebulizao (charge residue model) postula a alternncia entre ciclos de evaporao e fisso das
gotculas, eventualmente levando a produo de ons em fase gasosa. O processo de ionizao por
eletronebulizao revolucionou a espectrometria de massas por algumas razes. Em primeiro lugar, nesse
modo de ionizao ons multiplamente carregados podem se formar quando a molcula possuir vrios stios
para protonao (ons positivos) ou desprotonao (ons negativos). Isto significa que ons com razo m/z,
onde z diferente de 1 so formados. Assim por exemplo, se uma protena com 20.000 Da ionizada por
eletronebulizao e adquire 20 cargas, seu espectro de massas registrar um pico com razo m/z = 1000,
trazendo para o domnio de equipamentos baseados em analisadores de quadrupolos a anlise de substncias
polares, no volteis e de alto peso molecular como biomolculas. Depois, a tcnica permitiu o interfaciamento
da cromatografia lquida com a espectrometria de massas, uma vez que o processo de ionizao por
eletronebulizao ocorre em presso atmosfrica. Dessa forma, os equipamentos de CL-EM atuais, geralmente,
3
Em referncia ao fsico ingls Lord Rayleight, que descreveu pela primeira vez a quantidade mxima de carga
que uma gotcula de lquido pode carrear antes de se fragmentar.
147
utilizam fontes de ons mantidas a presso atmosfrica, e os equipamentos so evacuados de forma diferencial
por bombas de vcuo com capacidade diferenciada: analisadores so evacuados por bombas turbomoleculares
de alta capacidade de forma a manter o alto vcuo necessrio para a transmisso dos ons, enquanto que a
regio da interface entre a fonte de ons e o analisador pode ser mantida evacuada por uma bomba rotatria
ou turbomolecular de menor capacidade. Em reconhecimento importncia do desenvolvimento da
espectrometria de massas com ionizao por eletronebulizao para a anlise de biomolculas (FENN et al.,
1989), o prmio Nobel de qumica, em 2002, foi concedido ao qumico norte americano John Fenn, um dos
pioneiros na rea.
FIGURA 4 | Representao esquemtica do processo de ionizao por
eletronebulizao.
IONIZAO QUMICA A PRESSO ATMOSFRICA - IQPA (ATMOSPHERIC
PRESSURE CHEMICAL IONIZATION - APCI)
IQPA uma tcnica de ionizao similar ionizao qumica (IQ), muito utilizada em anlises de
Cromatografia em fase Gasosa (CG-EM), entretanto como o prprio nome sugere, ocorre em presso
atmosfrica. Esse tipo de ionizao permite altas taxas de fluxo de solvente, podendo ser facilmente
utilizado em sistemas de cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas (CL-EM). Como o
processo de ionizao ocorre a presso atmosfrica, os eltrons necessrios para a ionizao primria no
podem ser produzidos por um filamento metlico aquecido como nas fontes de ionizao qumica (IQ)
148
convencionais, pois esse filamento poderia se queimar, sofrer corroso ou oxidao. Como alternativas
para contornar ests problema podem ser utilizados emissores de partculas como o
63
Ni ou descargas
corona, que so fontes de eltrons resistentes presena de gases corrosivos ou oxidantes, sendo a descarga
corona preferencialmente utilizada nos equipamentos comercialmente disponveis, pela sua segurana e
eficcia.
A tcnica IQPA normalmente aplicada a molculas de polaridade intermediria, sendo que a massa
molecular no deve ser maior que 1500 Da (ARDREY, 2003, DE HOFFMANN & STROOBANT, 2007; DASS,
2007).
Princpio da fonte de ionizao IQPA
O analito em soluo aplicado atravs de infuso direta ou como eluente de um sistema de
cromatografia lquida (CLAE, CLUE), com fluxo de 0,2 a 2 mL/min introduzido diretamente em um
nebulizador pneumtico, sendo convertido em uma fina nvoa por um feixe de gs nitrognio em alta
velocidade. As gotas so dispersas por um fluxo de gs por meio de um tubo de quartzo aquecido que
promove a dessolvatao e vaporizao em uma cmara. O calor transferido para as gotas do spray possibilita
a vaporizao da fase mvel e da amostra no fluxo de gs. A temperatura desta cmara controlada,
possibilitando a vaporizao, independentemente, da natureza e do fluxo da fase mvel. O gs aquecido (a
cerca de 120 C) e os analitos deixam esse tubo, onde aps dessolvatao, so conduzidos para um
eletrodo (agulha) de descarga corona, o qual promove a ionizao. Os processos de ionizao em IQPA,
portanto so equivalentes aos da ionizao qumica (IQ), tendo como diferencial a ocorrncia presso
atmosfrica. No modo de ionizao positivo ocorrem a transferncia de prton ou aduo de ons do gs
reagente, sendo influenciada pela afinidade relativa aos prtons dos ons reagentes e das molculas do
analito em fase gasosa. No modo de ionizao negativo, os ons do analito so produzidos atravs de
abstrao de prton ou formao de adutos. Geralmente a fase mvel evaporada atua como gs ionizante
e os ons reagentes so produzidos a partir de uma descarga corona no solvente nebulizado e vaporizado.
Normalmente a descarga corona forma atravs de ionizao por eltrons, ons primrios como por exemplo
N
2
+
ou O
2
+
, os quais colidem com molculas vaporizadas do solvente formando os ons reagentes secundrios
na fase gasosa.
A ionizao do substrato altamente eficiente pois ocorre presso atmosfrica e com elevada
frequncia de colises. Alm disso, a alta frequncia de colises serve para termalizar as espcies reagentes.
Da mesma maneira, a rpida dessolvatao e vaporizao das gotas reduzem consideravelmente a
decomposio trmica do analito. O resultado a produo predominante de ons de espcies moleculares
com baixa fragmentao. Os ons produzidos presso atmosfrica entram no espectrmetro de massas por
meio de uma pequena entrada (inlet), ou por meio de um capilar aquecido, sendo focalizados em direo ao
analisador de massas. Essa entrada (inlet) deve possuir largura suficiente para a entrada adequada do maior
nmero possvel de ons sem comprometer a presso negativa (vcuo) necessria para a realizao da anlise.
Para contornar esse problema, a soluo mais utilizada consiste na aplicao de diversos diferenciais de
presso de vcuo (bombeamento diferencial), separados por skimmers. Na regio de vcuo intermedirio
ocorre o desagrupamento (declustering) dos ons formados. A IQPA tem se tornado uma fonte de ionizao
149
popular para aplicaes em acoplamento com a cromatografia lquida para a anlise de molculas com
polaridade intermediria.
A figura 5 apresenta um esquema e o prncipio de ionizao de uma fonte IQPA, j a figura 6 mostra
as principais reaes on-molcula que ocorrem em fase gasosa para a ionizao do analito nos modos
positivo e negativo em IQPA.
FIGURA 5 | Esquema da fonte de ionizao IQPA.
FIGURA 6 | Principais reaes on-molcula em fase gasosa para a produo
de ons positivos e negativos em IQPA Adaptado de Watson &
Sparkman (2007).
150
Comparativo IQPA X IEN
Tanto a ionizao qumica presso atmosfrica (IQPA) quanto a ionizao por eletronebulizao
ou electrospray (IEN) so consideradas tcnicas brandas de ionizao, no entanto, apresentam diferentes
aplicaes em termos de polaridade e massa molecular dos analitos. Considerando que vrias classes de
metablitos secundrios vegetais so altamente polares e apresentam de baixa a alta massa molecular, a
IEN constitui o mtodo de ionizao mais utilizado, embora no seja universal. Devido ao seu princpio, a
IEN tambm constitui um mtodo de ionizao mais brando do que a IQPA e preserva a integridade do
analito, pois ao contrrio da IQPA, no utiliza temperaturas elevadas (400 C). As desvantagens da IEN, em
comparao com a IQPA, so a sua menor robustez a interferncias da matriz e alteraes das condies de
fase mvel.
FOTOIONIZAO A PRESSO ATMOSFRICA FIPA (ATMOSPHERIC
PRESSURE PHOTOIONIZATION - APPI)
A fonte FIPA consiste em um dos mais recentes desenvolvimentos de fontes de ons presso
atmosfrica, em que utilizada a energia de ftons (hv) para ionizar molculas em fase gasosa.
Mecanismo de ionizao: a amostra em soluo vaporizada por um nebulizador aquecido similar
ao utilizado em IQPA. Existem duas abordagens para a ionizao por FIPA, na primeira abordagem, aps a
vaporizao, o analito interage com ftons emitidos por uma lmpada de descarga UV, em que estes ftons
induzem uma srie de reaes em fase gasosa que conduzem a ionizao das molculas da amostra. A
fonte FIPA, desta forma, consiste em uma fonte de IQPA modificada, que ao invs de se empregar uma
agulha de descarga corona, emprega-se uma lmpada de descarga que emite ftons. Na segunda abordagem
pode ser aplicada na razo de um dcimo do fluxo eluente da cromatografia lquida, um dopante (por
exemplo tetrahidrofurano ou tolueno) que ionizado pelos ftons emitidos pela lmpada de UV, que
posteriormente protona o analito, as duas abordagens esto representadas na Figura7. Nos ltimos anos
tm sido desenvolvidas diversas fontes de ionizao FIPA, as quais esto comercialmente disponveis. O
grande interesse ou particularidade da fotoionizao reside em seu potencial em ionizar substncias no
ionizveis atravs das tcnicas IQPA ou IEN, como por exemplo substncias muito apolares. As lmpadas de
UV geralmente utilizam fton em energia maior (10 eV) do que os potenciais dos analitos ou dos dopantes,
porm menores do que a do gs atmosfrico e dos solventes utilizados, permitindo a formao de ons do
analito, com baixa ou ausente formao de ons do solvente, o que reduz o rudo de fundo da anlise. O
emprego de CL-EM na anlise de substncias apolares foi revisado e discutido por Hayen & Karst (2003), em
que no foi eleita nenhuma fonte de ionizao universal, mas destacado o grande potencial das fontes de
ionizao a presso atmosfrica (IEN, IQPA e FIPA) para aplicaes especficas, com destaque para a FIPA,
que tem sido utilizada como uma tcnica complementar ao IQPA na anlise de substncias menos polares,
sendo que para a anlise de substncias aromticas com poucos grupos ou funes polares a FIPA
reconhecidamente superior ao IQPA. A Figura 9 apresenta um comparativo da eficincia das trs tcnicas
de ionizao presso atmosfrica mais utilizadas em acoplamento a cromatografia lquida: IEN (ESI), IQPA
(APCI) e FIPA (APPI).
151
FIGURA 7 | Reaes de ionizao em FIPA Extrado de Watson & Sparkman
(2007).
FIGURA 8 | Diagrama de uma fonte de ionizao FIPA.

1) Ionizao direta do analito (M) pela abstrao de eltron:
M + hv M
+*
+
Podendo ocorrer protonao do on radicalar pela participao de
solvente prtico (S)
M
+*
+ S MH
+
- [S-H]
-*
2) Ionizao de uma molcula dopante (D) atravs da luz UV (a)
e posterior protonao do molcula do analito (b):
(a) D
+*
+ D [D-H]* + DH
+
(b) M + DH
+
D + MH
+
152
FIGURA 9 | Eficincia dos modos de ionizao presso atmosfrica em
funo da polaridade e peso molecular dos analitos.
ANALISADORES DE MASSAS
Os analisadores de massas so responsveis pela separao dos ons no espao ou no tempo, de
acordo com a razo m/z desses ons, por meio de uma combinao de campos eltricos e/ou magnticos, de
forma que a sua abundncia possa ser medida. Existem muitos tipos diferentes de analisadores, e
convencionou-se utilizar o analisador como sinnimo de espectrmetro de massas, tamanha a sua importncia
em determinar parmetros de desempenho como poder de resoluo, sensibilidade e faixa dinmica. A rea
de pesquisa em novos analisadores de massas encontra-se em constante desenvolvimento, com novos
aperfeioamentos sendo lanados pelos fabricantes de equipamentos todo ano. A seguir, uma descrio
sucinta dos principais analisadores encontrados atualmente nos equipamentos de CL-EM comercialmente
disponveis e algumas de suas vantagens e desvantagens.
ANALISADORES COM QUADRUPOLO DE TRANSMISSO (QUADRUPOLO
SIMPLES E TRIPLO QUADRUPOLO)
O quadrupolo um filtro de ons que consiste de quatro barras de metal (geralmente ligas de
molibdnio) de seo transversal hiperblica (ideal) ou circular (aceitvel), alinhadas perpendicularmente
uma outra e conectadas aos pares a uma fonte de voltagem de corrente contnua (DC) e voltagem de
radiofrequncia (Rf ) superimpostas (Figura 10). Assim, um dos pares de barras recebe uma voltagem de
153
corrente contnua com polaridade positiva (+U) e radiofrequncia V.cost, onde a frequncia angular da
voltagem de radiofrequncia. O outro par de barras recebe uma corrente contnua com polaridade U e
radiofrequncia de mesma intensidade V.cost, mas defasada 180
o
uma da outra (+(U+Vcost) e (U+Vcost)
para os dois pares de barras respectivamente). O efeito da aplicao dessas voltagens a criao de um
campo eletromagntico oscilante no centro das barras que capaz de influenciar o movimento de ons que
podem assim ser transmitidos pelo quadrupolo se (a depender de sua razo m/z) adquirirem trajetrias
estveis ao receber a influncia do campo quadrupolar. Caso contrrio sero neutralizados ao colidir com as
barras metlicas no caso de trajetrias instveis. Variando o campo do quadrupolo (DC/Rf ), pode-se obter um
espectro de massas transmitindo-se sequencialmente (modo de varredura) ons com razo m/z diferentes,
dentro de uma determinada faixa, ao detector. Pode-se alternativamente, caso o analito seja conhecido,
operar um quadrupolo no modo SIM (Selected Ion Monitoring, ou monitoramento de ons selecionados),
onde apenas um ou poucos ons so transmitidos, mantendo-se o campo com um valor fixo ou variando-o
numa faixa estreita de algumas combinaes de valores apenas.
FIGURA 10 | Diagrama esquemtico mostrando as conexes de voltagem de
corrente contnua e radiofrequncia entre os pares de barras de
um quadrupolo.
Configuraes tpicas de instrumentos comerciais de CL-EM baseados na tecnologia de quadrupolos
incluem os sistemas de quadrupolo nico e os sistemas de espectrometria de massas de triplo quadrupolo. Os
equipamentos de triplo quadrupolo (Figura 11) possuem dois quadrupolos (Q1 e Q2) separados por uma
cmara de coliso, onde um gs inerte (por exemplo argnio) pode ser introduzido para induzir dissociao
dos ons formados na fonte de ons e transmitidos por Q1. Essa dissociao se d por meio da coliso com as
molculas do gs (collision-induced dissociation) e pode fornecer informao estrutural importante.
154
FIGURA 11 | Diagrama esquemtico representando um espectrmetro de
massas de triplo quadrupolo.
Equipamentos de triplo quadrupolo introduzem a possibilidade de realizar espectrometria de massas
em sequncia (EM/EM). Assim, como j descrito anteriormente, os quadrupolos podem ser operados no
modo de varredura (scan) ou no modo de monitoramento de ons selecionados (SIM). Com dois quadrupolos
em sequncia (algumas vezes referidos como em tandem), as possibilidades de operao desses quadrupolos
so diversas:
Varredura de ons produto (Product Ion Scan)
Neste modo o primeiro quadrupolo (Q1) operado no modo SIM, permitindo a transmisso de um
determinado on precursor com razo m/z escolhida. A cmara de coliso funcionar com certa presso de
argnio e com uma energia de coliso que pode ser variada, de modo a induzir maior ou menor fragmentao
do on precursor. Os fragmentos do on precursor so ento transmitidos por Q2 que ser operado no modo
de varredura (scan), cobrindo uma faixa de massa cujo limite superior ser a razo m/z do on precursor. O
espectro de massas assim obtido geralmente referido como espectro de massas de ons produto, antigamente
referido como espectro de ons filhos (daughter ion spectra). Esse modo de aquisio est representado na
Figura 12.
FIGURA 12 | Representao esquemtica do modo de aquisio de varredura
de ons produto em um equipamento de triplo quadrupolo.
155
Modo de monitoramento de reao selecionada (SRM, Selected Reaction
Monitoring)
Neste modo de operao, geralmente utilizado para fins de quantificao, Q1 operado no modo
SIM, permitindo a transmisso de um determinado on precursor com razo m/z escolhida. Esse on precursor
ento fragmentado na cmara de coliso. Um determinado on filho com abundncia adequada (escolhido
geralmente por meio da anlise do espectro de ons produto) ento selecionado para ser transmitido por Q2
ao detector (Figura 13). Desta forma, monitora-se a transio de um on precursor a um on produto. Qualquer
substncia presente na amostra que no produza a transio especificada no ser detectada, o que torna
essa modalidade de aquisio extremamente seletiva, sendo muito adequada para amostras complexas, tais
como amostras extradas de fluidos biolgicos como plasma, sangue e urina, ou para quantificao em
matrizes complexas como extratos de plantas. Nesse modo de aquisio, no so produzidos espectros de
massas, uma vez que apenas ons com razo m/z correspondente aos ons precursores e ons-produto esto
sendo monitorados. O monitoramento (e quantificao) de vrias substncias de forma simultnea pode ser
feito, incluindo analitos, padro interno e ainda uma ou mais transies de confirmao para cada analito. Esse
o modo de aquisio mais utilizado em equipamentos de triplo quadrupolo para fins de quantificao, tanto
pela sua elevada seletividade, quanto pela sensibilidade.
FIGURA 13 | Representao esquemtica do modo de aquisio de
monitoramento de reao selecionada em um equipamento de
triplo quadrupolo.
156
Modo de varredura de ons precursores (precursor ou parent ion scan)
Neste modo de operao, Q1 operado no modo scan, configurado para transmitir ons com uma
determinada faixa de razo m/z. A cmara de coliso utilizada para fragmentao e Q2 operado no modo
SIM, para transmitir ao detector apenas um on com uma determinada razo m/z selecionada (Figura 14). Esse
modo de aquisio normalmente utilizado para se avaliar quais ons precursores se fragmentam gerando o
mesmo on produto. Um exemplo da utilidade desse modo de deteco a investigao de substratos que
geram metablitos de um mesmo tipo, por exemplo, quais substratos serviram para glicuronidao (neste
caso os glicurondeos se fragmentam, gerando um on produto comum com m/z =177).
FIGURA 14 | Representao esquemtica do modo de aquisio de varredura
de ons precursores em um equipamento de triplo quadrupolo.
Modo de varredura por perda de neutros constante (Constant neutral loss)
Neste modo de aquisio (Figura 15), ambos os quadrupolos so operados em modo scan, mas Q2
operado com uma diferena de massa (offset) de certo valor m. Dessa forma, um sinal s ser transmitido por
Q2 e detectado, se um determinado on precursor que tenha uma razo m/z dentro da faixa de massa
selecionada para escaneamento em Q1 se fragmentar com perda de um fragmento de massa m. Esse modo
de operao pode ser utilizado para determinao de uma classe de substncias que compartilhem algum
grupo funcional comum, que no processo de fragmentao gere uma mesma espcie neutra, como por
exemplo, lcoois, com perda de um fragmento neutro de 18 Da.
157
FIGURA 15 | Representao esquemtica do modo de aquisio de varredura
por perda de neutros constante em um equipamento de triplo
quadrupolo.
ANALISADORES DE APRISIONAMENTO DE ONS (ION TRAPS)
Enquadram-se nesta categoria uma variedade grande de analisadores de massa que utilizam uma
combinao de campos eletromagnticos para armazenar e manipular ons em um volume reduzido de
eletrodos ou mesmo de multipolos (quadrupolos, hexapolos ou outros). Os ion traps se dividem em traps 3D
e traps lineares, esses ltimos utilizando quadrupolos (ou multipolos de outras ordens) com eletrodos com
potencial mais elevado nas suas extremidades. Os ion traps 3D possuem geralmente dois eletrodos nas
extremidades (endcap electrodes) por onde os ons so admitidos e ejetados respectivamente, e um eletrodo
central (ring electrode), como esquematizado na Figura 16. A introduo de certa presso de um gs inerte
no volume de confinamento dos traps leva ao aprisionamento dos ons por meio de um fenmeno conhecido
como resfriamento colisional (collisional cooling). As mesmas equaes que descrevem o movimento de
ons em um quadrupolo de transmisso (equaes de Mathieu) servem para descrever a trajetria dos ons
em analisadores de aprisionamento de ons. O desenvolvimento dessa classe de analisadores teve que superar
alguns problemas iniciais, relacionados ao confinamento em um espao limitado de um grande nmero de
ons (e a consequente repulso entre eles), em uma situao conhecida por efeito de carga/espao (space-
charge effect). A grande vantagem dos analisadores de aprisionamento de ons a possibilidade de realizar
experimentos de caracterizao estrutural atravs da induo de fragmentao colisional sequencial de um
determinado on precursor que pode ser enriquecido e aprisionado seletivamente no trap. O on precursor
pode ser, posteriormente, fragmentado, gerando um espectro de massas, e a partir desse, um novo on pode
ser escolhido para fragmentao e assim sucessivamente, em um processo conhecido geralmente por EM
n
.
158
Este fundamentalmente um processo de separao de ons no domnio do tempo, ao contrrio da
espectrometria de massas em tandem no espao, como descrito na seo intitulada Analisadores co Quadrpolos
de Transmisso (Quadrupolo Simples e Triplo Quadrupolo) para equipamentos de triplo quadrupolo. Atualmente,
tanto traps lineares quanto 3D so utilizados em uma variedade de configuraes de equipamentos, incluindo
muitos modelos de espectrmetro de massas hbridos.
FIGURA 16 | Diagrama esquemtico mostrando um corte transversal de um ion
trap 3D. Os eletrodos de entrada e de sada e o eletrodo em anel
(ring electrode) podem ser vistos, assim como a direo das
coordenadas. Adaptado de: De Hoffmann & Stroobant, 2007.
ANALISADORES DE MASSA POR TEMPO DE VOO ATV (TIME OF FLIGHT -
TOF)
Os analisadores de massas por tempo de voo foram descritos inicialmente em 1946 (STEPHENS,
1946). Entretanto, foi apenas na dcada de 1980 que o interesse por esse tipo de analisador ressurgiu, em
grande medida devido ao desenvolvimento de tcnicas de ionizao de dessoro como a ionizao por
dessoro a laser assistida por matriz (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI), e, posteriormente,
a ionizao por eletronebulizao (IEN). O analisador por tempo de voo particularmente adequado a uma
tcnica de ionizao pulsada como MALDI, e os equipamentos de MALDI-TOF foram, durante a dcada de
1980 e 1990, os principais instrumentos utilizados na anlise de biomolculas de alto peso molecular,
encontrando aplicaes importantes na rea de protemica. Os analisadores de tempo de voo se baseiam na
medida exata e precisa do tempo que ons com razo m/z diferentes levam para completar sua trajetria em
uma regio de deriva (regio do espectrmetro livre de campo, aonde os ons possuem velocidade constante)
aps sofrerem uma acelerao. Esse tipo de analisador sofreu vrios aperfeioamentos para aumentar a sua
resoluo, a sua faixa dinmica (faixa de linearidade), sua velocidade de escaneamento e a sua eficincia
global de transmisso de ons, mas atualmente uma tecnologia bem estabelecida, sendo um dos
equipamentos mais utilizados quando o poder de resoluo elevado se faz necessrio. A Figura 17 mostra um
159
diagrama esquemtico de um espectrmetro de massas comercial com analisador de tempo de voo. Um dos
aperfeioamentos importantes desse tipo de equipamento a introduo de um reflectron, ou espelho de
ons, como muitas vezes chamado. Esse equipamento se contrape disperso inicial na distribuio da
energia cintica dos ons de mesma razo m/z que ocorre no incio de suas trajetrias e que contribui para a
diminuio da resoluo, sendo um dos aperfeioamentos mais importantes para permitir o elevado poder
de resoluo dos equipamentos atualmente disponveis. O reflectron atua atravs do uso de uma srie de
placas com campo eltrico esttico crescente que reverte a direo da trajetria dos ons. O reflectron faz
com que ons com maior energia cintica penetrem mais ao longo de suas placas do que ons com menor
energia cintica inicial. Dessa forma, ons mais energticos tero uma trajetria maior do que ons de mesma
razo m/z, mas com energia cintica inicial menor, de forma que ambos acabam sendo refocados e exibem
o mesmo tempo de voo, aumentando assim a resoluo. O equipamento mostrado na Figura 16 possui ainda
um segundo espelho de ons, de forma que a trajetria do feixe de ons tem um formato em W, o que
aumenta bastante a resoluo, embora custa de perdas na sensibilidade.
FIGURA 17 | Diagrama esquemtico representando um espectrmetro de
massas de tempo de voo comercial com reflectron. As setas
tracejadas indicam o sentido do feixe de ons. Adaptado de
Watson & Sparkman, 2007.
ANALISADOR DO TIPO ORBITRAP
Este analisador de massas de alto poder de resoluo funciona de modo anlogo a um analisador de
massas por ressonncia ciclotrnica de ons por transformada de Fourier (FT-ICR MS), que o padro-ouro em
160
termos de poder de resoluo, mas com a vantagem de no necessitar de um magneto supercondutor e do
resfriamento criognico associado ao magneto para a sua manuteno. O princpio bsico da tcnica de
ressonncia ciclotrnica de ons por transformada de Fourier se baseia no fato de que ons com razo m/z
diferentes iro sofrer movimentos de precesso com frequncias diferentes quando submetidos a um campo
magntico. Nesse movimento de precesso, os ons induzem um sinal com frequncia e amplitude
caractersticos, que decai ao longo do tempo. Aps a operao de transformada de Fourier, esse sinal
convertido no domnio da frequncia, e gera o espectro de massas, de forma anloga transformao de um
sinal de decaimento livre (free induction decay) em um espectro, na tcnica de ressonncia magntica
nuclear por transformada de Fourier. O analisador do tipo Orbitrap consiste de um eletrodo externo e um
interno com forma de barril (Figura 18). Os ons so introduzidos no trap em uma posio deslocada do eixo
central do analisador com certa velocidade perpendicular ao eixo z, como mostrado na figura. Um potencial
eltrico constante aplicado entre os dois eletrodos (no existem campos magnticos ou eltricos oscilantes).
Como esses possuem uma forma assimtrica, e a distncia entre eles aumenta em direo ao centro do
Orbitrap, os ons, apropriadamente, injetados (um trap linear curvo, chamado de C trap importante no
processo de injeo dos ons no Orbitrap) assumem uma trajetria circular entre o eletrodo interno e externo,
oscilando na direo Z (devido a inomogeneidade do campo eltrico resultante do formato dos eletrodos)
com uma frequncia que proporcional massa do on. ons com diferentes razes m/z oscilam com
frequncias diferentes dentro do Orbitrap, induzindo uma corrente no eletrodo externo que pode ser medida.
Esse sinal modulado em amplitude e frequncia, e aps transformada de Fourier, de forma anloga
espectrometria de massas por ressonncia ciclotrnica, o espectro de massas gerado. O Orbitrap considerado
a nica nova tecnologia em analisadores a surgir nos ltimos 20 anos e possui caractersticas de desempenho
impressionantes, incluindo poder de resoluo acima de 70.000, uma performance comparvel tcnica FT-
ICR MS, sem a necessidade de manter um magneto supercondutor para operao.
FIGURA 18 | Representao da trajetria de ons em um analisador do tipo
Orbitrap (Adaptado de: http://ca.wikipedia.org/wiki/
fitxer:Orbitrappe.png).
161
APLICAES DA CROMATOGRAFIA LQUIDA ACOPLADA A
ESPECTROMETRIA DE MASSAS.
CL-DAD
A cromatografia lquida (CLAE ou CLUE) equipada com detector de arranjo de diodos (DAD) uma
tcnica amplamente utilizada na anlise de produtos naturais, desde que o analito apresente grupos cromforos
que possibilitem a absoro de luz na regio do ultravioleta-visvel (UV-Vis), sendo muito empregada no
controle de qualidade de produtos de origem vegetal; porm, sua utilizao na identificao de substncias
limitada, pois o CL-DAD fornece apenas o espectro UV-Vis de cada substncia como informao estrutural,
o que no suficiente para a sua caracterizao, pois vrias substncias de um mesmo grupo qumico
apresentam espectros similares, impossibilitando sua distino. Os dados fornecidos pelos espectros na regio
do UV-Vis so importantes para a verificao de algumas classes de metablitos secundrios como flavonoides,
que de acordo com o perfil de absoro no UV-Vis (Banda II de 240 - 285 nm; absoro do anel A e Banda I de
300 550 nm; absoro do anel B), podemos inferir as classes qumicas como: flavonas (Banda I: 304 350
nm), flavonis (Banda I: 328-357 nm), flavanis (Banda I: 352-385 nm), comparando-se com espectros de
referncia (bibliotecas de espectros ou com padres), conforme Campos (2005).
As informaes obtidas com essa tcnica so complementares a outras tcnicas hifenadas em
cromatografia lquida, como a espectrometria de massas (CL-EM), e a ressonncia magntica nuclear (CL-
RMN). A busca por informaes mais completas sobre a estrutura de substncias levou ao acoplamento
com o espectrmetro de massas (CL-DAD-EM). Um exemplo da aplicao da tcnica de CL-DAD na
anlise de produtos naturais foi a desreplicao por CL-DAD, complementada por CL-EM de alcaloides
colchicinoides na espcie Colchicum crocifolium Boiss. (Colchicaceae), em que foram traados os
fingerprints de quatro classes de colchicinoides, de acordo com o seu espectro de UV: tipo colchicina
(
max.
248 e 350); tipo androcimbina (UV
mx
230; 260 e 290 nm); tipo fenil etil tetrahidroisoquinolina
(UV
mx
225 e 285 nm) e fotoismeros da colchicina (UV
mx
228 e 266 nm), realizada por Alali et al.
(2008).5.2 Identificao de flavonoides por CL-EMCom o recente desenvolvimento das tcnicas de
ionizao a CL-EM
n
tornou-se uma poderosa ferramenta para a identificao de flavonoides glicosilados.
De acordo com a reviso de Vukics & Guttman (2010), a CL-EM
n
tornou possvel a determinao de vrias
caractersticas estruturais importantes como tipos de glicosilao (O, C ou mista), tipos de unidades de
acar (hexoses, desxi-hexoses ou pentoses), a distribuio dos resduos de acar, sequncia de glicanos,
ligaes interglicosdicas, posio da glicosilao e a natureza da aglicona. Apesar das grandes vantagens
na aplicao de CL-EM
n
em relao a RMN e CL-RMN, com relao a sensibilidade, custo e facilidade de
uso, o fato dessa tcnica no fornecer informaes adequadas sobre a estereoqumica das molculas,
torna necessria a utilizao de molculas de referncia ou da realizao de anlises complementares
em RMN.
A utilizao de CL-DAD-EM
n
possibilita tanto a obteno de informaes sobre a classe do flavonoide
pelo seu espectro UV-Vis, quanto os dados de fragmentao, importantssimos para as informaes
anteriormente mencionadas.
162
Como fase mvel, de acordo com a reviso de Cuyckens & Claeys (2004), a utilizao de eluentes
cidos como solues contendo cido frmico ou tampo acetato de amnio apresentam melhores
resultados, ao passo que a adio de eluentes bsicos influenciam negativamente tanto para a separao
na CL, quanto ao processo de ionizao em IEN. A tcnica de ionizao IEN proporciona maior sensibilidade
e baixa fragmentao, tornando-a mais adequada para inferir a massa molecular dos flavonoides separados,
especialmente no caso em que as concentraes so baixas. O pico com a razo massa/carga (m/z) mais
elevada nem sempre corresponde ao on quasimolecular, pois pode ocorrer a cationizao no modo positivo,
assim como a anionizao no modo negativo com as molculas do(s) solvente(s) da fase mvel. Um
aumento na tenso do cone reduz a incidncia de cationizao/anionizao. O mtodo de ionizao
positivo contm mais informaes estruturais do que no modo negativo, assim sendo o uso combinado de
ambos os modos de ionizao, fornece maior embasamento para a determinao da massa molecular,
especialmente para substncias de menor razo massa/carga, em que o nvel de rudo maior. O tempo de
reteno nas colunas de fase reversa C-8 e C-18 (as mais utilizadas) tambm podem fornecer informaes
estruturais importantes, em que as substncias mais polares eluem primeiro, o tempo de reteno
inversamente proporcional com o aumento da glicosilao e diretamente proporcional com o aumento de
metilao, acilao ou prenilao.
A coluna cromatogrfica fundamental para a qualidade da anlise, colunas com muitos grupos
silanis residuais no protegidos prejudicam a qualidade da separao. As colunas mais utilizadas so as de
fase reversa com 3 a 4,6 mm de dimetro interno, muitas vezes com um divisor de fluxo (split) para tornar
as taxas de fluxos compatveis com o espectrmetro de massas, sendo que a proporo de fluxo desviada
pode ser passada atravs de um detector de arranjo de diodos, ao invs de descart-lo, pois os flavonoides
apresentam alta e caracterstica absoro na regio do UV (200-380 nm), fornecendo informaes sobre o
tipo de aglicona e o seu padro de oxigenao e substituio nos anis A e B.
Identificao estrutural de flavonoides por EM/EM
Modo de ionizao positivo
As fragmentaes mais teis em termos da identificao da poro aglicnica de flavonoides so as
que promovem a clivagem de duas ligaes C-C do anel C, resultando nos ons informativos
i,j
A
+
e
i,j
B
+
onde
as letras i e j esquerda representam as ligaes clivadas em C (Figura 19). Estes ons podem ser racionalizados
por intermdio de reaes de retro-Diels-Alder (RDA) e so os principais fragmentos diagnsticos para a
identificao de flavonoides, uma vez que esses fornecem informaes sobre o nmero e tipo de substituintes
nos anis A e B. Alm desses ons, so observadas perdas de pequenas molculas e/ou radicais a partir do on
quasimolecular [M+H]
+
, como por exemplo H
2
O (-18 u
4
), CO (-28 u) e C
2
H
2
O (-42 u), as quais possibilitam a
identificao de grupos funcionais especficos como metxi, atravs da perda de 15 u (CH
3
) a partir do on
precursor.
4
Unidade de massa atmica (u): equivalente a Dalton (Da).
163
Modo de ionizao negativo
Fabre et al. (2001) estudaram o perfil de fragmentao no modo negativo a partir do on quasimolecular
[M-H]
-
de vrias agliconas (flavonas, flavonois e flavanonas) empregando IEN-EM
n
com a utilizao de um
analisador de massas Ion Trap. A clivagem do anel C, por mecanismo de RDA, conduz aos ons
i,j
A
-
e
i,j
B
-
,
fornecendo informaes sobre o nmero e tipo de substituintes nos anis A e B, onde as letras i e j esquerda
representam as ligaes rompidas no anel C.
O fragmento
1,3
A
-
o principal fragmento observado no modo negativo, enquanto o fragmento
0,3
B
-

caracterstico de isoflavonoides (HUGHES et al., 2001). O grau de hidroxilao no anel B influencia a
fragmentao. Em flavonis contendo uma ou mais hidroxilas no anel B, como por exemplo quercetina,
fisetina e miricetina podem ser observados os ons [
1,2
A-H]
-
e [
1,2
B+H]
-
(CUYKENS et al., 2000; FABRE et al.,
2001) enquanto no caso de um anel B no substitudo, a energia necessria para obter a fragmentao
muito maior, levando a muitos ons produto (HUGHES et al., 2001), ocorrendo em alguns casos a clivagem
direta da ligao entre os anis B e C, gerando o fragmento [M- anel B]
-
(SCHIEBER et al., 2002 ). Perdas de
pequenas molculas neutras como CO (-28 u), CO
2
(-44 u), C
2
H
2
O (-42 u), so importantes nesse processo de
caracterizao como a verificao de presena de metilas por meio da perda de 15 u, resultando em um
radical [M-H-CH3]
-
que geralmente consiste no pico base (CUYCKENS et al., 2000; FABRE et al., 2001; JUSTESEN,
2001). Justesen (2001) avaliou o perfil de fragmentao de 10 flavonoides metoxilados a partir do on
quasimolecular [M-H]
-
e verificou comportamentos de fragmentao diferentes entre ismeros, mas a posio
exata do grupo metoxila no pde ser determinada sem a comparao com padres de referncia ou anlises
de RMN. Outra observao foi a dificuldade na identificao de flavonoides prenilados em modo negativo,
pois no foi observada a clivagem do substituinte isoprenila.
FIGURA 1 | Nomenclatura de fragmentao de heterosdeos flavonoides (apigenina 7-O-rutinosdeo),
extrada de Cuyckens & Claeys (2004).
Na anlise estrutural de flavonoides os espectros obtidos no modo de ionizao positivo com
fragmentao por DIC (dissociao induzida por coliso) so os mais utilizados, por serem mais fceis de
164
interpretar em relao ao modo negativo. Com relao ao modo negativo so necessrias maiores energias
de coliso para possibilitar fragmentao adequada, alm de que alguns ons observados no modo positivo
importantes para a identificao estrutural no so observados em modo negativo (CUYCKENS & CLAEYS,
2004).
O modo de ionizao negativo, entretanto, mais sensvel em anlises envolvendo flavonoides,
devido as suas caractersticas qumicas como o presena de hidroxilas fenlicas, comumente presentes nesta
classe de metablitos que favorecem a ionizao em modo negativo, com a presena do on quasimolecular
[M-H]
-
, alm de

apresentar um padro de fragmentao diferente, fornecendo informaes adicionais e
complementares ao modo positvo (FABRE et al., 2001).
ANLISES EM CL-DAD-IQPA-EM
Li et al. (2010) desenvolveram e validaram um mtodo empregando cromatografia lquida com
deteco por arranjo de diodos (DAD) acoplada a espectrometria de massas com ionizao por IQPA, permitindo
a identificao e quantificao de iridoides glicosilados na espcie Lamiophlomis rotata (Benth. ex Hook. f.)
Kud (Labiatae), utilizada na China para promover hemostasia e aliviar dores. Essa espcie apresenta como
constituintes majoritrios iridoides e flavonoides. Conforme estudos, os flavonoides seriam os responsveis
pela atividade analgsica e os iridoides pela atividade hemosttica, indicando a necessidade de se analisar
esses constituintes na planta. Os espectros de UV caractersticos de iridoides glicosilados, contendo grupo
carboxlico na posio 4, apresentam somente uma forte absoro na regio entre 230-240 nm, sendo ento
selecionado o = 238 nm, para a deteco em DAD, a qual foi utilizada para quantificao dos iridoides
glicosilados. A deteco por espectrometria de massas foi utilizada para identificar iridoides glicosilados em
L. rotata (derivados do shanzisdeo e loganina) comparando-se os dados obtidos com padres, alm disso,
foram observados quatro iridoides no identificados por apresentarem espectros de UV caractersticos da
classe.
Ouyang et al. (2007) determinaram triptoldeo e tripdioldeo (diterpenos diepxidos) em extratos da
planta Tripterygium wilfordii Hook. f. (Celastraceae), utilizada na Medicina Tradicional Chinesa como anti-inflamatria
e imunossupressora, com a utilizao de um mtodo baseado em CLAE-IQPA-EM, desenvolvido com padres
comerciais destas substncias, onde foram observados em modo negativo de ionizao ons moleculares
desprotonados [M-H]
-
(triptoldeo: m/z 359; tripdioldeo: m/z 375) e ons desprotonados seguidos da perda de uma
molcula de gua [M-H-H
2
O]
-
(triptoldeo: m/z 341 e tripdioldeo m/z 357).
Lai et al. (2007) realizaram a identificao dos flavonoides e cidos cafeoilqunicos majoritrios em
trs espcies da famlia Asteraceae: Chrisanthemum morifolium Ramat. (folhas e flores), Chrisanthemum
coronarium L. (folhas) e Artemisia annua L. (folhas) atravs de CL-DAD-IQPA-EM, sendo a identificao das
substncias realizadas por meio da comparao do tempo de reteno, espectro de UV-Vis e espectro de
massas com padres de referncia e dados da literatura. Os principais constituintes em A. annua L. foram os
flavonoides quercetina-O-glicosdeo, rhamnetina, crisosplenol D e luteolina 7,4'-dimetil ter; em C. coronarium
o cido clorognico e os cidos 1,3; 1,5 e 3,5 di-O-cafeoilqunicos e em C. morifolium o cido clorognico,
luteolina e seus derivados glicosilados, linarina, apigenina e o cido 3,5-di-O-cafeoilqunico.
Por meio do desenvolvimento de metodologias, empregando CLAE-IQPA-EM, foram identificadas
vrias saponinas triterpnicas (astragalosideos) e isoflavonoides em razes de plantas do gnero Astragalus
165
(Fabaceae) utilizada na medicinal tradicional chinesa como antiperspirante, diurtico e tnico (XU et al., 2007;
ZHANG et al., 2007).
ANLISES EM CLAE-DAD-IEN-EM E CLAE-DAD-IEN-EM/EM
Gobbo-Neto & Lopes (2008) desenvolveram um mtodo para a identificao online de derivados do
cido qunico (cidos clorognicos), lactonas sesquiterpnicas e flavonoides em Lychnophora ericoides Mart.
(arnica brasileira), famlia Asteraceae, popularmente utilizada como anti-inflamatrio tpico, por meio de
anlises em CLAE-DAD-IEN-EM e CLAE-DAD-IEN-EM/EM, operando nos modos de ionizao negativo e positivo
e com analisador por tempo de voo (ATV), as quais foram utilizadas para a identificao dos picos
cromatogrficos em comparao com padres de referncia e dados da literatura, a partir dos dados de
absoro no UV-Vis, massa exata do on quasimolecular, perfil de fragmentao e ordem de eluio em
colunas C-18, assim como validaram um mtodo em CLAE-DAD para a quantificao de alguns destes
metablitos secundrios. Os dados de algumas substncias identificadas esto apresentados na tabela 2.
Gobbo-Neto (2007) com a aplicao de tcnicas hifenadas CLAE-DAD, CLAE-DAD-EM e CLAE-DAD-EM/EM
avaliou a influncia populacional e temporal (circadiana e sazonal) no metabolismo secundrio de Lychnophora
ericoides Mart. (Asteraceae).
TABELA 2 - Dados de UV-Vis, massa exata do on quasimolecular e perfil de fragmentao (modos negativo
e positivo utilizados na identificao de alguns flavonoides e lactonas sesquiterpnicas de Lychnophora
ericoides - dados obtidos a partir do trabalho de Gobbo-Neto (2007) e Gobbo-Neto & Lopes (2008).
sh = ombro bp = pico base
166
Moraes et al. (2009) desenvolveram um mtodo para a identificao de constituintes fenlicos
(flavonides e derivados do cido qunico) em quatro espcies do gnero Lychnophora Mart. (L. candelabrum
Sch. Bip., L. pohlii Sch. Bip., L. pseudovillosissima Semir & Leito e L. villosissima Mart.), em que os flavonoides
foram identificados comparando-se os dados de UV, EM e EM/EM com padres de referncia. Os derivados do
cido qunico foram identificados comparando-se os dados de EM e EM/EM com o esquema hierrquico de
identificao desenvolvido por Clifford et al. (2003), aliado aos espectros de UV e perfil de eluio em coluna
C-18. Tambm foram identificadas lactonas sesquiterpnicas por meio de seu perfil em UV (
max.
268 nm),
assim como a comparao de ons precursores e ons fragmentos (EM/EM) em comparao com dados da
literatura (CROTTI et al., 2005). Os cromatogramas obtidos esto apresentados na figura 20 e as substncias/
classes qumicas identificadas na tabela 3.
FIGURA 20 | Cromatogramas obtidos nas anlises em CLAE-DAD-IEN-EM
(deteco UV) dos extratos de L. candelabrum Sch. Bip., L. pohlii
Sch. Bip., L. pseudovillosissima Semir & Leito e L. villosissima
Mart., extrado de Moraes et al. (2009).
167
TABELA 3 - Comparativo das principais substncias identificadas nas anlises em CLAE-DAD-EM e CLAE-
DAD-EM/EM das espcies vegetais: Lychnophora candelabrum, L. pohlii, L. pseudovillosissima e L. villosissima,
extrada de Moraes et al. (2009).
CLAE-FIPA-EM NA ANLISE DE PRODUTOS NATURAIS
Rauha et al. (2001) aplicaram a APPI na anlise dos flavonoides catequina, isoramnetina, vitexina,
isoquercetrina e luteolina-3',7-diglicosdeo e avaliaram o efeito da fase mvel utilizada na cromatografia
lquida na eficincia da ionizao em IQPA e FIPA. Nas anlises em FIPA, operando no modo negativo foram
observados ons quasimoleculares ([M-H]
-
), indicando que reaes de transferncia de prtons em fase gasosa,
seja o principal mecanismo de ionizao. Foi tambm observada a formao de nions com cido frmico em
alguns eluentes e a presena de ons [2M-H]
-
de agliconas. Com relao ao efeito do eluente em FIPA, no
modo negativo, as melhores respostas para as agliconas foram obtidas com a gua pura. A adio de acetato
de amnio reduziu a sensibilidade, entretanto, para glicosdeos respostas significativamente maiores foram
obtidas com hidrxido de amnio, comparando-se com o eluente sem hidrxido de amnio. Os flavonoides
foram ionizados com eluentes bsicos, mas a reteno na coluna de fase reversa em C-18 torna-se fraca,
comprometendo a resoluo da separao na cromatografia lquida. O decrscimo da sensibilidade sobre
condies cidas pode estar relacionado a neutralizao das cargas negativas por ons hidrnio (H
3
O
+
). No
168
modo positivo de ionizao foram observadas, majoritariamente, molculas protonadas dos flavonoides, no
sendo observados ctions radicais, o que indica que o principal mecanismo de ionizao seja a transferncia
de prtons entre molculas protonadas do eluente e os analitos. A fragmentao dos analitos no modo
positivo foi mais intensa do que no modo negativo. Foi observado aumento da sensibilidade com o emprego
de dopantes (tetrahidrofurano e tolueno) na ordem de 10-100 vezes, indicando que a reao inicial de
ionizao seja de um ction radical do dopante, que foi observada a melhor sensibilidade com o tolueno
(cerca de 2 vezes maior), embora o THF possa ser utilizado.
Outro exemplo da aplicao da CL-FIPA-EM na anlise de produtos naturais foi o trabalho desenvolvido
por Rhourri-Frih et al. (2009) que realizaram a triagem e a quantificao de triterpenos pentacclicos dos
grupos lupano, oleano, ursano e friedelano em trs extratos de espcies vegetais. As primeiras anlises foram
realizadas no modo scan, em que os principais triterpenos foram identificados por meio de seus espectros nos
modos de ionizao positivo e negativo e dos tempos de reteno em comparao com padres. Foram
tambm comparadas as fontes de ionizao FIPA e IQPA na anlise destes triterpenos, onde foi observado que
ambas as fontes apresentaram sensibilidade na anlise dos triterpenos atravs de CL-EM. A otimizao da
fonte IQPA foi simples, bastando ajustar a temperatura da fonte e a corrente da agulha de descarga corona, j
a otimizao da fonte FIPA foi mais complicada, devido ao maior nmero de parmetros a serem avaliados,
destacando-se a temperatura da fonte e a natureza do dopante. A fonte FIPA foi mais sensvel no modo de
ionizao positivo, porm a IQPA apresentou elevada sensibilidade para cidos triterpnicos no modo negativo.
O estudo mostrou que ambas as fontes podem ser utilizadas na determinao desses metablitos em extratos
vegetais.
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FRAGMENTAO DE ALCALOIDES ISOQUINOLNICOS
POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS VIA
IONIZAO POR ELECTROSPRAY
Adrian Martin Pohlit
Carolina Maria Xaubet Olivera
Joo Luis Callegari Lopes
Mrcio Adriano Andreo
Michael Niehues
Norberto Peporine Lopes
INTRODUO
A utilizao de espectrometria de massas (EM)
com ionizao por electrospray (ESI) vem se
disseminando pelas mais diversas reas da cincia,
aparecendo como um dos principais mtodos de
ionizao comercialmente disponveis. A
espectrometria de massas, por ser um mtodo de
alta sensibilidade e especificidade, possibilita
determinar uma substncia mesmo em amostras
complexas, podendo ainda ser empregada na
elucidao estrutural quando associada
espectrometria de massas em sequncia (tandem).
O estudo dos mecanismos de fragmentao constitui
uma ferramenta para a elucidao estrutural. Neste
contexto, a compreenso do mecanismo de
fragmentao dos alcaloides isoquinolnicos possui
172
importncia para a qumica de produtos naturais e tambm para a rea biomdica. Isso se d porque a
atividade biolgica de plantas que contm estes alcaloides vem sendo explorada pela indstria farmacutica
e tambm porque muitos frmacos como a morfina, codena, papaverina entre outras pertencem classe dos
alcaloides isoquinolnicos. Esse fato cria a necessidade de explorar tcnicas e aplicaes modernas de ionizao
por electrospray acoplada a espectrometria de massas (em tandem), para a elucidao de parmetros
farmacolgicos dessas substncias como cintica e dinmica, bem como metabolismo. O presente captulo
fornece uma viso geral baseada na literatura atual sobre os mecanismos de fragmentao de alcaloides
isoquinolnicos por espectrometria de massas com ionizao por electrospray
Em termos gerais, os alcaloides so substncias tipicamente derivadas de fontes naturais, com
caractersticas bsicas, contendo um ou mais tomos de nitrognio (usualmente em anis heterocclicos).
Porm algumas substncias sintticas no encontradas em plantas podem ser classificadas como alcaloides
(p. ex.: hematropina). Frequentemente, os alcaloides apresentam efeitos fisiolgicos marcantes para o homem
e animais (EVANS, 2009).
Os primeiros alcaloides isolados datam do sculo 19, sendo eles a narcotina, isolada em 1803 e a
morfina (1) (Figura 1), um alcaloide benzilisoquinolnico, isolada em 1806 e 1816. Nos anos seguintes, vrios
alcaloides foram isolados, principalmente por Pelletier e Caventou, tais como: estricnina (1817), emetina
(1817), brucina (1819), piperina (1819), cafena (1819), quinina (1820), colchicina (1820) e coniina (1826). A
coniina foi o primeiro alcaloide a ter a sua estrutura determinada (1870) e sintetizada (1889). Atualmente,
com mtodos e equipamentos mais avanados a investigao dos alcaloides tem sido facilitada (EVANS,
2009).
FIGURA 1 | Alcaloides benzilisoquinolnicos morfina (1), derivados morfinanos
(2-11), outros derivados opioides (12-13) e isoquinolina (14).
173
Os alcaloides isoquinolnicos so substncias aromticas heterocclicas possuindo um anel benzeno
fundido a um anel piridnico (Figura 1). Os alcaloides isoquinolnicos mais conhecidos so os alcaloides do
pio, dentre os quais se destacam a morfina (1) e a papaverina (13), alm de seus derivados. A isoquinolina
(14), de odor levemente adocicado, foi isolada pela primeira vez em 1885 do alcatro de hulha. Os alcaloides
isoquinolnicos so uma famlia atualmente composta por mais de 400 substncias com as mais variadas
atividades biolgicas: antimalrica, anti-HIV, inseticida, antitumoral, antimicrobiana, antileucmica e anti-
Parkinsoniana (BENTLEY, 1992).
Por apresentarem uma grande variedade de origens botnica e bioqumica, de estruturas qumicas
e de atividade biolgicas, diferentes sistemas de classificao so possveis para os alcaloides isoquinolnicos.
Genericamente agrupados em alcaloides no-heterocclicos (pseudo-alcaloides ou aminas biolgicas) e
alcaloides heterocclicos, esse ltimo grupo pode ser ainda dividido em 14 classes, de acordo com a
estrutura do anel (EVANS, 2009).
Muitas plantas utilizadas tradicionalmente contm alcaloides isoquinolnicos, com destaque
para a Papaver somniferum L. (Papaveraceae). Paralelamente ao estudo das atividades biolgicas das
plantas utilizadas tradicionalmente, as tcnicas de isolamento e identificao de substncias extradas
de fontes naturais tiveram uma evoluo marcante no ltimo sculo, com destaque para as tcnicas
hifenadas.
As tcnicas de ESI-EM e ESI-EM
n
A ionizao por electrospray (ESI) combinada com espectrometria de massas (EM) foi introduzida em
1984 e poucos anos se passaram para que a importncia desse mtodo fosse reconhecida (YAMASHITA &
FENN, 1984; SMITH et al., 1988).
Recentemente, ESI-EM tem se difundido s mais diversas reas da cincia, aparecendo como um dos
principais mtodos de ionizao comercialmente disponveis (CROTTI et al., 2006; GATES et al., 2006). A
importncia dessa tcnica reflete-se no nmero crescente de artigos publicados, sendo a mais utilizada da
ltima dcada. Alm disso, a utilizao para o estudo de produtos naturais atinge em torno de 7% do total de
artigos que aplicam essa tcnica, seja para simples determinao do peso molecular e/ou quantificao de
substncias (CROTTI et al., 2006).
Embora os espectros obtidos nesse mtodo de ionizao forneam um baixo grau de fragmentao,
essa tcnica tambm pode ser empregada na elucidao estrutural quando associada espectrometria de
massas tandem (ESI-EM
n
) (STVIGNY et al., 2004).
Atualmente a ESI considerada um mtodo rpido de ionizao, podendo ser utilizado para uma
variedade de substncias (desde protenas e peptdeos at molculas orgnicas de baixo peso molecular, tais
como os produtos naturais). Na anlise de alcaloides, a ESI-EM foi empregada pela primeira vez h mais de
uma dcada, sendo considerada desde ento como uma tcnica poderosa na determinao estrutural de
alcaloides (WILSON et al., 1992; ZHOU & HAMBURGER, 1996).
A espectrometria de massas por ser um mtodo de alta sensibilidade e especificidade possibilita
determinar uma substncia mesmo em amostras que no apresentam alto teor de pureza. Uma das ferramentas
174
para a elucidao estrutural o estudo dos mecanismos de fragmentao, sendo esses determinados atravs
de marcaes especficas com istopos estveis (POEAKNAPO et al., 2004; HESSE et al., 1997).
Classes de alcaloides isoquinolnicos
Os alcaloides so, em sua maioria, substncias bioativas, e os alcaloides isoquinolnicos exibem grande
variedade de atividades biolgicas (BRUNETON, 1999). Praticamente todos os alcaloides isoquinolnicos (com
exceo dos naftilisoquinolnicos) so biossintetizados a partir da tirosina (BENTLEY, 1998). Podem ainda ser
divididos de acordo com o nmero de insaturaes na estrutura bsica em: isoquinolnicos, diidroisoquinolnicos
e tetra-hidroisoquinolnicos. Constituem um dos grupos mais numerosos e de maior variedade estrutural
dentre os alcaloides, podendo ser divididos e classificados em mais de 20 subgrupos, dentre os quais sero
abordados neste trabalho: benzilisoquinolnicos (morfinanos e outros), aporfnicos, oxaporfnicos, aporfino-
benzilisoquinolnicos, bisbenzilisoquinolnicos, berbernicos, protoberbernicos, secoberbernicos, tetra-
hidroprotoisoquinolnicos, benzofenantridnicos, protopnicos, ftaloisoquinolnicos, espirobenzilisoquinolnicos,
pavnicos, entre outros (BENTLEY, 1992; BENTLEY, 1998; BRUNETON, 1999).
Objetivo e escopo
A compreenso do mecanismo de fragmentao dos alcaloides isoquinolnicos possui importncia
para a qumica, mas tambm para a rea biomdica. Os estudos de plantas que contm esses alcaloides so
frequentes e de acordo com o aumento de sua utilizao pela indstria farmacutica (FABRE et al., 2000),
como o caso da Eschscholzia californica Cham. (Papaveraceae) usada como sedativa e ansioltica, sem
efeitos txicos (VINCIERI et al., 1988; ROLLAND et al., 1991).
O objetivo dessa reviso consiste em agrupar as informaes de diversos trabalhos sobre os mecanismos
de fragmentao dos alcaloides isoquinolnicos, utilizando ESI-EM, nos modos positivo e negativo, acoplados
a diversos analizadores, tais como, ion trap (IT), triplo quadrupolo (TQ), tempo de voo (TOF) e de ressonncia
ciclotrnica de ons com transformada de Fourier (FT-ICR).
Alcaloides benzilisoquinolnicos
Dentre os alcaloides isoquinolnicos, os benzilisoquinolnicos constituem um dos grupos de maior
destaque, com grande nmero de estudos qumicos e biolgicos. Tambm conhecidos como alcaloides
do pio, so representados principalmente pelos derivados morfinanos, tais como a morfina (1), a codena
(2), a morfinona (3), a codeinona (4), a neopinona (5), a tebana (6), a oripavina (7), a salutaridina (8), o
salutaridinol (9), o 7-O-acetil salutaridinol (10) e o dextrometorfano (11) (Figura 1). Embora sejam
biossintetizados a partir da tirosina, via benzilisoquinolnicos, tanto a morfina quanto a codena podem
ser considerados tambm derivados fenantrnicos (FABRE et al., 2000; HENRIQUES et al., 2002). Outros
alcaloides benzilisoquinolnicos, tais como a papaverina (13) (Figura 1), escolamidina (15), tembetarina
(16) e a reticulina (17) tambm so importantes, qumica e biologicamente (WICKENS et al., 2006)
(Figura 2).
175
FIGURA 2 | Alcaloides benzilisoquinolnicos escolamidina, tembetarina e
reticulina (15-17).
No estudo desenvolvido por Raith et al. (2003), foram obtidos espectros de alta resoluo das molculas
protonadas [M+H]
+
de derivados morfinanos. Trabalhando no modo tandem (EM
n
), foram comparados espectros
obtidos por equipamento de captura de ons (on trap IT) aos obtidos por analisadores do tipo (TQ). Os
alcaloides morfinanos possuem um nitrognio bsico, podendo ser assim investigados por ESI no modo
positivo, apresentando alta sensibilidade (< 1 ng/mL). De acordo com os resultados obtidos, os alcaloides
foram agrupados em 4 subgrupos, que sero detalhados adiante.
Morfina e codena
Os alcaloides 1 e 2 mostraram uma fragmentao bastante similar, visto que a codena (2)
possui apenas um grupo metlico adicional em comparao com a morfina (1). A maioria dos fragmentos
encontrados para 1 tambm so detectados para 2 com diferena de 14 u (Figura 3). As frmulas
moleculares para os fragmentos foram determinadas por intermdio de experimentos, usando Q-TOF
e FT-ICR (alta resoluo). Em estudo posterior do mesmo grupo, utilizando a tcnica de dissociao
multifton no infravermelho (IR-MPD), de alta resoluo acoplada a ESI, foi mostrado que a fragmentao
foi similar ao TQ (WICKENS et al., 2006). O on [M+H-H
2
O]
+
formado pela perda de H
2
O na posio 6
encontrado apenas em IT - EM
2
. Os fragmentos do tipo a so formados pela quebra do anel piperidnico
e perda de amina (CH
2
CHNHCH
3
, m = 57 u), tais fragmentos so detectados para todos os derivados
morfinanos e desempenham um papel crucial nessas vias de fragmentao. Fragmentos [a-2H]
+
no
so encontrados para IT, mas so em TQ (EM/EM). A partir do on a, a perda de H
2
O leva ao fragmento b
e a perda de CO leva ao fragmento c. Ambas as rotas convergem ao fragmento e pela perda de CO e
H
2
O/MeOH do on a, respectivamente. O on [e-H
2
O]
+
com m/z 165 representa o fragmento mais
abundante em TQ, Q-TOF e FT-ICR, enquanto o fragmento [e-CO]
+
com m/z 155 especialmente
176
abundante no TQ-EM/EM. Os ons d com m/z 185 ou 199 so gerados de forma independente a partir
de a. A partir de a ou [M+H-H
2
O]
+
, IT EM
3
gera b, mas o fragmento c s gerado a partir de a (RAITH et
al., 2003). Os ons f (m/z 58) e g (m/z 44), representando partes do anel piperidnico, so exibidos no
espectro de massa do TQ, mas no no IT (EM
2
), porque esses ons esto abaixo do limite de deteco
para o on trap (m/z < 75). Em geral, o IT (EM
2
) mostra mais fragmentos de alta massa do que as outras
tcnicas, alm disso, os fragmentos a-2H no ocorrem em IT (RAITH et al., 2003).
A marcao isotpica com
13
C dos precursores da morfina (1) e da codena (2) permitiu, por meio
da espectrometria de massas, a identificao de todos os principais ons fragmentos desses alcaloides
sem ambiguidade e tambm permitiu conhecer o destino dos tomos de istopos pesados
individualmente (Figura 3) (POEAKNAPO et al., 2004). Em experimentos de incorporao de precursores
biossintticos da codena em P. somniferum foram preparados derivados marcados em
13
C
12
,
13
C
6
,
13
C
2
e
realizados utilizando espectrometria de massas de alta resoluo ESI-IR-MPD e ESI-FT-ICR (POEAKNAPO
et al., 2004).
Morfinona, codeinona e neopinona
O espectro da morfinona (3) muito similar ao da codeinona (4), com diferena de massa de
14u (Figura 4). A codeinona e a neopinona (5) apresentam mecanismo de fragmentao similar, pois
diferem entre si pela posio de apenas uma dupla ligao, mas a intensidade dos picos o ponto
diferencial dos espectros desses ismeros estruturais (RAITH et al., 2003). Apesar dos picos principais
ocorrerem em ambos (IT e TQ), os espectros apresentam diferenas. Em relao aos mecanismos de
fragmentao, ocorre: a) eliminao de C
2
H
5
NHCH
3
formando o on do tipo a-2H, que encontrado
para morfinona (3) e codeinona (4), somente atravs de TQ (EM/EM); b) O pico base do TQ - (EM/EM) da
morfinona (m/z 227), codenona e neopinona (m/z 241) est representado pelo on do tipo a (RAITH et
al., 2003).
Tebana e oripavina
A presena de duas ligaes duplas no anel C implica numa fragmentao completamente diferente
e mais simples quando comparada com a morfina e seus anlogos at aqui discutidos (RAITH et al., 2003). No
processo de fragmentao ocorre (ver Figura 3 para referncia): a) perda de CH
3
NH
2
gerando os ons do tipo
a de m/z 281 e 267 [M+H-31]
+
para tebana (6) e oripavina (7), respectivamente, ambos picos base em IT-EM
2
;
b) o on f de m/z 58 corresponde ao pico base de ambas as substncias no espectro de massas em TQ; c)
eliminao do grupo metxi formando o on [a-CH
3
OH] ocorre na tebana; d) o on c em m/z 249 encontrado
tanto na fragmentao de tebana como oripavina, o qual derivado de [M+H-31]
+
pela perda de H
2
O ou
CH
3
OH (RAITH et al., 2003).
177
FIGURA 3 | Mecanismos de fragmentao dos alcaloides 1 e 2 utilizando ESI
baseados em experimentos de EM/EM de alta resoluo (fonte:
RAITH et al., 2003). As estruturas propostas para os fragmentos de
morfina 1 e codena 2 so baseadas em estudos com marcao
com istopos
13
C e anlises por EM de alta resoluo (fonte:
POEAKNAPO et al., 2004).
178
FIGURA 4 | Mecanismos de fragmentao proposto para os alcaloides
morfinona (3), codeinona (4) e neopinona (5) obtidos por ESI-EM
n
(fonte: RAITH et al., 2003).
Salutaridina e salutaridinol
Os mecanismos de fragmentao da salutaridina (8) e do salutaridinol (9) seguem reaes semelhantes
quelas discutidas at agora. Seguindo uma primeira rota, os alcaloides 8 e 9 perdem CH
3
NH
2,
gerando o on
[M+H-31]
+
com m/z 297 e 299, respectivamente (ver Figura 3 para referncia). Na sequncia, este on
fragmenta gerando o on i com m/z 265 e 267, pela eliminao de CH
3
OH. Pela eliminao de CO do on i, o
on i-CO com m/z 237 e 239 gerado. E, finalmente, o on i-CO se fragmenta, gerando o on i-CO-CH
3
OH pela
eliminao de metanol com m/z 205 e 207. Outra rota determinada gera o on do tipo a, assim como
observado para os outros derivados, sendo mais significativo do que para 6 e 7. O on a em EM
3
pode perder
H
2
O, gerando o on a-H
2
O com m/z 253 e m/z 255, ou perder CH
3
OH, gerando o on j com m/z 239 e m/z 241.
Ambos os ons gerados em EM
3
podem perder CH
3
OH em EM
4
. Em EM
5
gerado o on j-CO-CH
3
OH com m/z
181. Alm disso, a ausncia da ponte epxi facilita a formao de um fragmento isoquinolnico de m/z 192,
assim como a maioria dos ons detectada em IT e TQ modo tandem, porm com intensidades diferentes
(RAITH et al., 2003).
179
7-O-acetil-salutaridinol
Apesar da semelhana apresentada com o salutaridinol (9), o 7-O-acetil-salutaridinol (10) deve
ser analisado separadamente, isso porque a perda de cido actico (m=60 u) resulta no pico base m/z 312,
conduzindo a partir desse on a uma direo de fragmentao por outra via ainda no totalmente elucidada
18
.
Os ons subsequentes detectados por IT e TQ, com m/z 281, 269, 255, 249 e 221, so similares aos encontrados
para a tebana (RAITH et al., 2003).
Dextrometorfano
Strife e colaboradores definiram um mapa genealgico para as fragmentaes do
dextrometorfano (11), um derivado da morfina, utilizando ESI-IT-EM(n). Substncia 11 contm um grupo metil
e apresenta mltiplas perdas de radicais metlicos (m/z 187, m/z 172, m/z 157), mostrando que deve ocorrer
rearranjo (STRIFE et al., 2000). Analisando as reaes de fragmentao do dextrometorfano e alguns derivados
utilizando ESI-EM no modo positivo e IT, mapas geneolgicos de fragmentao foram desenvolvidos utilizando
abordagens tais como, sntese simples com derivados delterados e de
13
C, rotulagem para intensidade de
processos inesperados e anlise de produtos de oxidao (Figura 5) (STRIFE et al., 2000).
FIGURA 5 | Mecanismos de fragmentao propostos para o dextrometorfano
(11), usando ESI como fonte de ionizao e ion trap como
detector (fonte: STRIFE et al., 2000).
180
Outros alcaloides benzilisoquinolnicos
Papaverina
A papaverina (13) um dos principais alcaloides encontrados no pio, juntamente com a morfina (1)
(WICKENS et al., 2006). Assim como os derivados da morfina, que tambm apresentam boa resposta em
espectrometria de massas por ESI e APCI (Ionizao Qumica a Presso Atmosfrica) no modo positivo (FABRE
et al., 2000; HENRIQUES et al., 2002).
Os estudos da fragmentao do alcaloide 13 foram realizados por meio da marcao com deutrio
e utilizando espectrmetro de massas LCQ on trap. Os ons resultantes de EM
2
da papaverina podem ser
classificados em dois grandes grupos, aquele que envolve a perda deCH
3,
dos grupos perifricos CH
3
O e
aquele envolvendo a perda da poro dimetoxifenlico, sendo a poro isoquinolnica o fragmento que
retm a carga. Mais uma vez, o stio mais provvel de protonao desse alcaloide o nitrognio. A
papaverina ainda possui dois diferentes pontos para a perda radicalar nos substituintes CH
3
O aromticos,
um na poro isoquinolnica e o outro no ncleo benznico (WICKENS et al., 2006) (Figura 6).
FIGURA 6 | Transies EM
2
e EM
3
(ons produtos do on de m/z 202) na
fragmentao da papaverina (13) (fonte: WICKENS et al., 2006).
181
O on mais intenso de m/z 202 explicado pela perda de dimetoxibenzeno do on [M+H]
+
. Para a
estrutura formada pela protonao da papaverina no nitrognio da poro isoquinolnica, a perda requer a
transferncia do hidrognio da poro isoquinolnica para a poro dimetoxibenznico.
Dois ons resultantes em EM
2
podem ocorrer por perdas neutras de CH
3
e CH
4
, gerando os ons de m/z 325
e m/z 324, respectivamente. No possvel nesse caso distinguir em qual ponto ocorre a eliminao. A eliminao
de 15 u um processo radicalar, localizado num dos substituintes CH
3
O que esto ligados aos sistemas aromticos.
A eliminao CH
3
em ESI-EM tem sido estudada e de acordo com estudos baseados em clculos tericos a quebra
homoltica da ligao C-O devido ao enfraquecimento dessa ligao (CARDOZO et al., 2008).
O espectro EM
3
de m/z 202 contm os ons de m/z 187, 175 e 171. O primeiro e o ltimo correspondem
perda de CH
3
e CH
3
O, respectivamente. O on m/z 175 produzido pela perda de HCN, perda importante no
diagnstico das alquilpiridinas (MARX & DJERASSI, 1968; WICKENS et al., 2006) (Figura 6).
O on produto EM
2
de m/z 324 formado pela eliminao de CH
4
, ocorrendo atravs da formao
de um resduo dioximetileno, j o on produto EM
2
de m/z 325 formado pela perda de um CH
3
, enquanto
os ons EM
3
de m/z 325 tambm formam dois grupos (Figuras 7 e 8). O primeiro compreende os ons de m/
z 310, 308, 296, 294, formados provavelmente pela perda de um CH
3
O, CH
4
, CHO e CH
3
O. O segundo grupo
de ons referente perda da poro benznica. O espectro de ESI-EM da soluo de 13 e em H
2
O so
dominadas pelos ons [M+H]
+
de m/z 340 (WICKENS et al., 2006). Por outro lado, os espectros das solues
de noscapina (12) (Figura 9) e 13 em
2
H
2
O so dominadas pelos ons [M+
2
H]
+
de m/z 415 e 341, com pouca
evidncia de [M+H]
+
.
Fabre e colaboradores caracterizaram alcaloides isoquinolnicos presentes em extrato metanlico
purificado da papoula da Califrnia, Eschscholzia californica Cham. (Papaveraceae), dentre eles a escolamidina
(15). Para tanto, foi utilizado CLAE-ESI-EM(n) com detector triplo quadrupolo, no modo positivo (Fabre et al.,
2000). Outros alcaloides benzilisoquinolnicos, tais como tembetarina (16) e reticulina (17), tambm foram
estudados (ZHANG et al., 2006).
Alcaloides ftaloisoquinolnicos
Noscapina
Assim como nos derivados da morfina, o stio de protonao est no nitrognio da poro isoquinolnica.
O on molecular [M+H]
+
, pela perda de meconina gera o produto EM
2
de m/z 220, este on por sua vez, pela
perda de um radical gera o produto EM
3
de m/z 205. O mecanismo que segue, pelo qual o radical hidroxil
perdido no est claro, mas a estrutura do on resultante de m/z 188 tem sido designada como um on bi-
radical do tipo p-benzino. O espectro EM
4
do on de m/z 205 indica que ocorre perda do grupo metoxlico. O
on de m/z 188 o pico base encontrado em EM
4
(Figura 9) (WICKENS et al., 2006). Ambos os espectros de
noscapina (em H
2
O e
2
H
2
O) exibem pequena quantidade de ons [M+Na]
+
de m/z 436 e a presena de
[M+H2O]
+
de m/z 432 aparente no espectro gerado, a partir da soluo em H
2
O. As similaridades e diferenas
na abundncia relativa dos ons fragmentos da noscapina de m/z 220, 353 e 354 sugerem que a posio da
ionizao com deutrio pode ser deduzida por comparao com o espectro com e sem a incorporao do
istopo (WICKENS et al., 2006). A Figura 10 mostra mais exemplos de alcaloides que pertencem classe dos
alcaloides ftaloisoquinolnicos.
182
FIGURA 7 | Transies EM
3
(ons produtos do on de m/z 324) na fragmentao
da papaverina (13) (fonte: WICKENS et al., 2006).
FIGURA 8 | Transies EM
3
na fragmentao da papaverina, ons produtos do
on de m/z 325 (fonte: WICKENS et al., 2006)
183
FIGURA 9 | Transies EM
n
na fragmentao da noscapina (12) (fonte:
WICKENS et al., 2006)
Sturm e colaboradores utilizaram (+)-ESI-IT-EM(n) acoplada eletroforese capilar (EC) para caracterizar
os alcaloides isoquinolnicos (+)-adlumina (18), (-)--A-hidrastina (19) e (+)-corlumina (20), os quais esto
ilustrados na Figura 10, provenientes da Fumaria officinalis L. Todos esses alcaloides foram detectados como
[M+H]
+
e apresentaram perfis de fragmentao distintas (STURM et al., 2006). A adlumina (18) apresentou EM
m/z 384, EM
2
m/z 335 (58%), 323 (100%) e 206 (56%) e EM
3
(do fragmento m/z 323) m/z 292 (100%) e 276
(80%), a (-)--A-hidrastina (19) EM m/z 384, EM
2
m/z 323 (82%) e 190 (100%) e EM
3
(do fragmento m/z 323)
292 (100%) e 265 (82%) e a (+)-corlumina (20) EM m/z 384, EM
2
m/z 323 (100%) e 206 (36%) e EM
3
(do
fragmento m/z 323) m/z 292 (100%) e 276 (75%).
184
FIGURA 10 | Estrutura dos alcaloides ftaloisoquinolnicos 18-20 (da mesma
classe da noscapina (12)).
Escolamidina
A escolamidina (15) (Figura 2) um alcaloide benzoisoquinolnico do tipo quaternrio e seu on
molecular foi detectado como [M]
+
. Assim como observado para a substncia 13, ocorre a perda do grupo
fenil dissubstitudo, mas na forma de metoxihidroxibenzil radicalar. Esse alcaloide tambm possui um grupo
CH
3
O em anel aromtico na posio orto a um grupo hidroxlico, ocorrendo a eliminao neutra de metanol,
alm da eliminao de CH
3
(FABRE et al., 2000).
Tembetarina e reticulina
Assim como as substncias anteriores, a tembetarina (16) e a reticulina (17) foram analisadas em ESI-
EM
n
. Para as substncias 16 e 17 foram observados em EM
2
a presena dos fragmentos com m/z 192 e 206,
referentes perda do grupo benzil dissubistitudo, assim como nas substncias 12 e 13. Ainda em EM
2
, foram
observados para a substncia 16 os ons com m/z 329, referente perda de 15 u pela eliminao de CH
3
,
conforme j observado e discutido anteriormente, alm dos ons com m/z 301, 312 e 269, referentes s
eliminaes neutras de CO, direta de CH
3
OH (presena de substituintes em orto, CH
3
O e OH) e eliminao de
CH
3
OH aps a eliminao de CH
3
(ZHANG et al., 2006). Outro fragmento importante em EM
2
o [M-(CH
3
)
2
NH]
+
com m/z 299, este tipo de fragmentao no foi observado para 12 e 13, mas sim para 16 e 17, pois so
alcaloides tetra-hidroisoquinolnicos, sendo provvel a fragmentao mostrada na Figura 11.
Alcaloides aporfnicos
Dentre os alcaloides isoquinolnicos encontra-se um subgrupo denominado aporfnicos, esses vm
sendo cada vez mais investigados pelas atividades biolgicas que apresentam (STVIGNY et al., 2004). Os
alcaloides aporfnicos norneolitsina (21), neolitsina (22), dicentrina (22), actinodafnina (24) e cassitina (25)
(isolados de Cassytha filiformis L., Lauraceae), alm de outros obtidos comercialmente, como: boldina (26),
bulbocapnina (27), isocoridina (28) e glaucina (29) (Figura 12) foram analisados por ESI-EM
n
no modo positivo
(STVIGNY et al., 2004). O alcaloide n-metilaurotetemina (30) tambm foi estudado por ESI-EM/EM (FABRE et
al., 2000). Dentre esses alcaloides alguns (22-25) apresentam atividade citotxica contra diferentes linhagens
de clulas tumorais (BOUSTIE et al., 1998; STVIGNY et al., 2004; STVIGNY et al., 2005).
185
FIGURA 11 | Propostas de mecanismos de fragmentao para a tembetarina
(16) e reticulina (17), transies EM
n
(fonte: ZHANG et al., 2006).
186
FIGURA 12 | Estrutura dos alcaloides aporfnicos (fonte: STVIGNY et al., 2004).
Em geral, os espectros de ESI-EM
1
mostraram apenas a perda do grupo amino com seu respectivo
substituinte, com picos do on fragmento de baixa intensidade, mas atravs de espectros de ESI-EM
n
foram
obtidas maiores informaes sobre a natureza dos substituintes do grupo amino e dos substituintes perifricos
nos anis aromticos (STVIGNY et al., 2004). Todos os espectros ESI mostraram o on [M+H]
+
como o pico
principal, apresentando tambm um on fragmento importante observado como [M+H-17]
+
, pela eliminao
de NH
3
ou [M+H-31]
+
pela eliminao de CH
3
NH
2
. Na reao de fragmentao proposta para esta etapa,
Stvigny et al. (2004) propem duas rotas provveis. Por se tratarem de alcaloides tetra-hidroisoquinolnicos
pode tambm ocorrer decomposio semelhante apresentada na Figura 13.
187
FIGURA 13 | Mecanismo de fragmentao proposto para os alcaloides de 21 a
29 (esquema 1 = perda de RNH
2
; esquema 2 = vias de
fragmentao a partir do on [14+H-NH
3
]; esquema 3 = proposta
para o mecanismo de fragmentao do alcaloide 28) (fonte:
STVIGNY et al., 2004).
Os espectros EM
3
a partir dos ons [M+H-RNH
2
]
+
apresentam mecanismos de eliminao que dependem
do tipo dos substituintes do anel aromtico e a partir desses mecanismos, Stvigny et al. (2004) propuseram
188
as regras que seguem: compostos com um grupo OCH
2
O- sempre perdem CH
2
O e depois CO. Aqueles
compostos contendo um grupo OH e um grupo CH
3
O em posio vicinal, perdem CH
3
OH seguido por CO. J
aquelas substncias, contendo um ou mais grupos CH
3
O no-vicinais a um OH ou -OCH
2
O- (substncias 23 e
28, 29), iro apresentar, aps a perda de um grupo amino, perdas de CH
3
ou OCH
3
em competio com as
regras de fragmentao descritas anteriormente
5
. Esses mecanismos de fragmentao podem ser paralelos
ou consecutivos, mas a perda de um CO nunca observado diretamente de um fragmento [M+H-RNH
2
]
+
. As
fragmentaes das substncias 24 e 27 tambm seguem as regras gerais para seus principais mecanismos
(STVIGNY et al., 2004) (Figura 13). A substncia 30 apresentou fragmentao semelhante ao discutido para
os demais alcaloides aporfnicos, com perda de grupo amino em EM
2
, gerando o on com m/z 311 e na
sequncia perda de CH
3
ou OCH
3
em EM
3
, gerando os ons com m/z 296 e 280, respectivamente e por fim
perda de OCH
3
em EM
4
a partir do on com m/z 296 (FABRE et al., 2000).
FIGURA 14 | Rotas de fragmentao dos alcaloides magnoflorina (31) e
menisperina (32) por ESI-EM
n
(adaptado de ZHANG et al., 2006).

31, R=H, m/z 342
32, R=CH
3
, m/z 356
31, R=H, m/z 297
32, R=CH
3
, m/z 311
-
MS
-CH
3
OH
MS
3

31, m/z 250
31, m/z 265
31, m/z 219 31, m/z 31, m/z 194
31, m/z 237 31, m/z 209 31, m/z 191
31, m/z 222 31, m/z 205 31, m/z 181
31, m/z 311
32, m/z 325
32, m/z 279 32, m/z 264 32, m/z 236 32, m/z 206 32, m/z 178
32, m/z 248
-H
2
O MS
4
-H
2
O MS
5
-CH
3
MS
6

MS
5

MS
5
MS
5

-CO
-C
2
H
4

MS
6

-H2O
MS
4

MS
4
-CH3
-CH
3

-CH3OH
MS
6 -CO
MS
2
- OCH
3
MS
3
-CH
3
OH
MS
4

MS
4

MS
5

MS
6

MS
7

-CH
3

-OCH
3

-CO -CH
2
O -CO
H
3
CO
O
H
3
CO O
O
N
H
3
CO
RO
HO
H
3
CO
H3CO
RO
HO
H
3
CO
H3CO
HO
O
H
3
CO
O
H3CO
O
H3CO
H
3
CO
O
O
O
O
O H3CO
N
RO
HO
H3CO
H
3
CO
O
H
3
CO
O
O
O
O
O
189
As reaes de fragmentao dos alcaloides magnoflorina (31) e menisperina (32) (Figura 14) tambm
parecem seguir as regras acima mencionadas, com alguns detalhes adicionais (FABRE et al., 2000). Esses
alcaloides seguem a mesma via de fragmentao em EM
2
e EM
3
, sendo o on mais marcante em ESI aquele
gerado pela perda do grupo amino, seguido pelo on referente a perda de CH
3
OH. Outras perdas tais como
CO, C
2
H
4
e H
2
O foram observadas. Todas as vias parecem seguir as regras estabelecidas por Stevigny et al.
(2004). Alm disso, nesses alcaloides tambm foram observadas perdas de 15 u em determinadas etapas,
conforme j discutido anteriormente.
Alcaloides oxaporfnicos
Os alcaloides oxaporfnicos constituem um subgrupo dentro dos aporfnicos, possuem esqueleto
totalmente aromtico e com presena de grupo carbonlico em C-7, sendo encontrados em diferentes
espcies de Annonaceae, mas tambm podem ser encontrados em outras famlias. So importantes pelas
suas atividades biolgicas e farmacolgicas, das quais a atividade citotxica merece destaque (STVIGNY et
al., 2005; SILVA et al., 2007).
Como alcaloide oxaporfnico tercirio, a liriodenina (33) (Figura 15) apresentou em seu espectro de
ESI-EM o on quasi-molecular [M+H]
+
com m/z 276, com a provvel protonao do nitrognio. Alm disso, a
estrutura isoquinolnica no permite a perda de grupo amino, resultando em pouca informao obtida atravs
da via de fragmentao da substncia 28, pois em EM
2
foi observado apenas o fragmento [M+H-CO]
+
com m/
z 248 (LIANG et al., 2006).
FIGURA 15 | Estrutura qumica do alcaloide oxaporfnico liriodenina (33).
Alcaloides berbernicos
Alcaloides isoquinolnicos do tipo berbernicos foram encontrados na erva-chinesa jin-guo-lan
(Tinospora sagittata (Oliv.) Gagnep. and T. capillipes Gagnep.) e as propriedades desses ltimos foram estudadas
por CL-ESI-EM(n) por Zhang et al. (2006). Alguns dos alcaloides dessa classe esto apresentados na Figura 16.

N
O
O
O
190
FIGURA 16 | Estrutura dos alcaloides berbernicos 34-47.
Dados de fragmentao, utilizando ionizao por electrospray acoplada a espectrometria de
massas para os alcaloides berbernicos, foram gerados no trabalho de Zhang et al. (2006). Os dados referentes
aos fragmentos EM(n) esto apresentados na Tabela 1 para os alcaloides berbernicos encontrados em Tinospora
sagittata and T. capillipes. Pode-se observar a perda de 15 u (perda de CH
3
radicalar) como fragmentao
comum para muitos dessa classe de substncia. Tambm, o nitrognio est preso ao anel e fragmentos,
contendo nitrognio no so comuns. Reconhece-se pelo menos duas situaes que influem no perfil de
fragmentao: a existncia ou no de um ou mais substituintes de CH
3
O com ou sem OH vicinal (Figuras 17 e
18).
191
TABELA 1 - on fragmentos provenientes de ESI-EM(n) para alcaloides bebernicos encontrados em
Tinospora sagittata and T. capillipes (adaptado a partir de: ZHANG et al., 2006).
*EM m/z so referente a modo positivo EM(+) ou positivo e negativo EM(+/-). Os valores de EM2, EM3, entre
outros so de modo positivo. Os valores de m/z relatados so de intensidade relativa e50%. Onde apenas um
valor de m/z listado para determinado EM(n) o mesmo corresponde intensidade relativa (int. rel.) mxima
(100%).
192
FIGURA 17 | Esquema geral mostrando a fragmentao de alcaloides
berbernicos com substituintes de CH
3
O sem OH vizinhos.
FIGURA 18 | Esquema geral da fragmentao dos ons pseudomoleculares de
alcaloides berbernicos apresentando substituintes CH
3
O com OH
vizinhos, perda de CH
3
e CO.

N
R
2
O
R
1
O
R
3
O
O
-CH
3
MS
2
N
R
2
O
R
1
O
R
3
O
O
N
R
2
O
R
1
O
R
3
-H
MS
3
O
O
N
R
2
O
R
1
O
R
3
O
O
N
R
2
O
R
1
O
R
3
O
-H CO
MS
3
-H -H MS
4
R
1
, R
2
=H, CH
3
; R
3
=H, OH

N
R
1
O
R
2
O
OR
4
OR
3
N
R
1
O
R
2
O
OR
4
O
N
OR
1
OR
2
O
R
3
O
-CH
2
MS
2
MS
2
MS
2
-CO
-CH
2
[M-CH
3
-CO]
+
[M-CH
3
-CH
3
]
+
193
Alcaloides secoberbernicos e tetra-hidroprotoberbernicos
Sturm et al. (2007) aplicaram a tcnica de eletroforese no-aquosa (NACE) acoplada a ESI(+)-IT-EM(n)
para identificar alcaloides isoquinolnicos em Corydalis spp. encontradas na Europa Central. Essa tcnica foi
usada para caracterizar o alcaloide secoberbernico coridamina (48) (Figura 27) e o alcaloide tetra-
hidroprotoberbernico sinactina (49) (Figura 20), provenientes da Fumaria officinalis L. Essas duas substncias
foram detectadas como [M+H]
+
. A coridamina (48) apresentou EM m/z 351, EM
2
m/z 320 e EM
3
m/z 292 (88%)
e 277 (100%) e a sinactina (49) apresentou EM m/z 340, EM
2
m/z 192 (100%), 165 (90%) e EM
3
(do fragmento
m/z 192) 177 (100%) e 148 (48%) (STURM et al., 2006). A formao de um on de pico base com m/z 192 no
EM
2
da substncia 49 fragmentao anloga aquela apresentada na discusso e Figura 19 para
tetraidropalmatina (50).
FIGURA 19 | Estrutura do alcaloide secoberberinico (48) e do alcaloide
tetraidroproto-berbernico (49).
O (+)-ESI-EM de tetraidropalmatina (50) apresentou m/z 356 [M]
+
, 214 e 159 e o (+)-ESI-EM de
canadina (51) apresentou m/z 340 [M]
+
, 214 e 159. O alcaloide 50 apresentou EM
2
(do fragmento m/z 356) m/
z 340, 308, 192 (100%) e 165 e EM
3
(do fragmento m/z 192) m/z 176 (100%) e 148 (ca. 30%). O alcaloide 51
apresentou EM
2
(do fragmento m/z 340) m/z 324, 292, 176 (100%) e EM
3
(do fragmento m/z 176) m/z 161
(ca. 40%) (eliminao de CH
3
) e 148 (100%) (eliminao de H
2
CO). Sturm e colaboradores interpretaram as
fragmentaes em EM
2
e EM
3
referente a tetraidropalmatina (50) e a canadina (51) (Figura 20) e, notando que
impossvel determinar a posio exata de agrupamentos metilenodioxi em geral, concluram que ESI-EM(n)
representa ferramenta importante para anlises por fornecer informaes relevantes para atribuio de picos,
porm que no substitui espectrometria de RMN para elucidao estrutural, sem ambiguidade, de substncias
desconhecidas (STURM et al., 2007).

N
O
O
O
O
HN
N
O
O
O
O

48 Coridamina

49 Sinactina
194
FIGURA 20 | Fragmentao ESI-EM, EM
2
e EM
3
de sinactina (49),
tetraidropalmatina (50) e canadina (51).
Alcaloides benzofenantridnicos
FIGURA 21 | Estrutura dos alcaloides benzofenantridnicos 52-59 (FABRE et al.,
2000).
195
TABELA 2 - on fragmentos provenientes de experimentos em ESI-EM(n) para alcaloides benzofenantridnicos
encontrados em Fumaria officinalis (adaptado a partir de: STURM et al., 2006).
lcaloides protopnicos
Sturm e colaboradores utilizaram (+)-ESI-IT-EM(n) acoplada eletroforese capilar (EC) para caracterizar
os alcaloides isoquinolnicos protopina (60), criptopina (61) provenientes da Fumaria officinalis L. (Figura 22).
Esses alcaloides foram detectados como [M+H]
+
. A protopina (60) apresentou EM m/z 384, EM
2
m/z 188
(100%) e 149 (91%) e EM
3
(do fragmento m/z 188) m/z 159 (100%) e 130 (90%) e a criptopina (61) EM m/z
370, EM
2
m/z 204 (92%) e 165 (100%) e EM
3
(do fragmento m/z 204) m/z 188 (98%) e 140 (100%) (STURM et
al., 2006).
FIGURA 22 | Estrutura dos alcaloides protopnicos 60 e 61.
196
Alcaloides espirobenzilisoquinolnicos
Sturm e colaboradores utilizaram (+)-ESI-IT-EM (n) acoplada eletroforese capilar (EC) para caracterizar
os alcaloides espirobenzilisoquinolnicos (-)-fumaroficina (62), (-)-O-metilfumaroficina (63) e (+)-parfumina
(64) (Figura 23), provenientes da Fumaria officinalis L. [M+H]
+
(STURM et al., 2006). A fumaroficina (62)
apresentou EM m/z 398, EM
2
m/z 338 (perda de AcOH) e EM
3
m/z 323 (20%) (perda de CH
3
), 308 (100%) e 277
(90%), a (-)-O-metilfumaroficina (63) apresentou EM m/z 414, EM
2
m/z 352 e EM
3
m/z 321 (100%), 308 (10%)
e 291 (30%) e a (+)-parfumina (64) apresentou EM m/z 354, EM
2
m/z 336 (95%) e 323 (100%) e EM
3
m/z (do
fragmento m/z 323) 292.
FIGURA 23 | Estrutura dos alcaloides espirobenzilisoquinolnicos 62-64.
Alcaloides pavnicos
A Figura 24 mostra os ons produtos do tipo pavina detectatados na papoula da Califrnia, que so a
californidina (65), escholtzina (66), O-metilcariachina (67) e a cariachina (68). Esses compostos consistem em
um quaternrio, californidina (65) e trs pavinas tercirias 66-68. Para californidina (65) e escholtzina (66), os
ons fragmentos caractersticos foram encontrados em m/z 177, 205, 235, 263 e 293; para os compostos 67
e 68 foram observados dois ons diagnsticos em m/z 235 e 263 do espectro. Os ons pavinas tercirias
compartilham um on em comum em m/z 188 que poderia ser devido perda de agrupamentos benznicos
dissubstitudos, levando formao de metilenodioxi-tetraidroquinolina protonada (FABRE et al., 2000).
FIGURA 24 | Estrutura dos alcaloides pavnicos 65-68.
197
Nesses diferentes casos, essas fragmentaes podem ter ocorrido por vrias perdas neutras e/ou
radicalares. A clssica perda de amnia no foi observada, mas a primeira perda neutra de (CH
3
)
2
NH [M+H-
45] para o composto quaternrio 65 e CH
3
NH
2
[M+H-31] para as pavinas tercirias e a perda do nitrognio,
contido no heterociclo, pode ser explicada pela fragmentao de retro-Diels-Alder (FABRE et al., 2000).
Alcaloides isoquinolnicos estereomricos
Gioacchini e colaboradores caracterizaram os alcaloides isoquinolnicos diastereoisomericos sintticos
69a,b-72a,b, utilizando ESI-EM para gerar ons MH
+
no modo positivo, bem como on trap para fazer a
fragmentao sequencial (EM(n)) desses ons (Figura 25).
FIGURA 25 | Estrutura dos alcaloides isoquinolnicos diastereoisomricos
sintticos 69a,b 72a,b.
A tcnica de ESI-EM(n) funciona muito bem para a caracterizao estrutural dessa classe de alcaloide.
Em geral, estereoismeros apresentam fragmentaes bastante semelhantes em geral entre si. Assim, 69a,b
M: (m/z 569)[M+H]+ geram EM
2
de m/z 446 (perda de cido benzico) e 326 (perda de duas unidades de
cido benzico) e EM
3
[569446]: m/z 428 (perda de gua), 341. No entanto, os estereoismeros 72a,b tm
em comum os dados de fragmentao M: (m/z 372)[M+H]+ e EM
2
m/z 354 e EM
3
(m/z 372354): m/z 338,
324, 323, 322 (Figura 26). Porm, os diastereoismeros 72a (R-R) e 72b (R-S) apresentam diferenas na sua
fragmentao EM
2
. Por exemplo, o estereoismero 72a (R-R) apresenta um on fragmento em m/z 192 que
essencialmente inexiste na fragmentao EM
2
do seu estereoismero 72b (R-S), devido a fragmentao
(formalmente, retro-Diels-Alder), ver Figura 26. Os outros estereoismeros tm diferenas semelhantes no
processo de fragmentao primria, ocasionadas pelas diferenas acarretadas pelos centros estereognicos.
Por exemplo, entre os dois ismeros, o ismero R-S parece ser o ismero energeticamente mais favorvel
para sofrer fragmentao primria. Substncias que contm os grupos steres apresentam uma facilidade na
formao dos ons adutos com ons de metal [M+Na]
+
e [M+K]
+
, o que pode ser explicado tambm pelo efeito
da alta densidade eletrnica associada aos tomos de oxignio das carbonilas devido sua alta
eletronegatividade, favorecendo a formao de molculas queladas com os ons metlicos (GIOACCHINI et
al., 2000).
198
FIGURA 26 | Comparao da fragmentao de alcaloides isoquinolnicos
sintticos estereomricos 72a e 72b. Via de fragmentao que
leva formao do on m/z 192 favorecida totalmente pelo
diasteremero R-R.
Atropoismeros de alcaloides isoquinolnicos
Entre os alcaloides naftilisoquinolnicos, esto as korupensaminas e as michelaminas que so
monmeros e dmeros, respectivamente. As michelaminas so encontradas exclusivamente em plantas da
espcie Ancistrocladus korupensis D.W. Thomas & Gereau (THOMAS et al., 1993; BRINGMANN et al., 1998).
Por outro lado, Bringmann e colaboradores investigaram um grupo de alcaloides naftilisoquinolnicos
dimricos (atropodiastereomricos) usando espectrometria de massas em tandem com ionizao por ESI.
Utilizaram CLAE-ESI-EM-EM, a anlise foi feita com um triplo quadrupolo TSQ com interface ESI no modo
positivo. As estruturas dos alcaloides dimricos michelaminas A (73a), B (73b) e C (73c) com seus monmeros,
korupensaminas A (74a) e B (74b) esto demonstradas na Figura 27 (BRINGMANN et al., 1998).
199
No modo positivo, observam-se molculas protonadas [M+H]
+
em m/z 380,4 (100% abundncia
relativa) para os alcaloides monomricos, as korupensaminas A (74a) e B (74b). A coliso de baixa energia
induz a dissociao dos korupensaminas. O on produto mais abundante em m/z 363,4 (84% abundncia),
aparentemente, resultante da eliminao de amnia (-17 u). Existe a perda da poro neutra C
2
H
5
N (-43 u)
devido fragmentao retro-Diels-Alder, resultando em um on produto em m/z 337 (37% abundncia
relativa). Entretanto, os alcaloides atropisomricos 73a e 73b apresentaram um espectro idntico (BRINGMANN
et al., 1998).
FIGURA 27 | Estrutura dos alcaloides naftilisoquinolnicos dimricos
michelaminas A (73a), B (73b) e C (73c) e seus precursores
biossintticos korupensaminas A e B (74a e 74b).
200
Os alcaloides atropodiastereomricos, as michelaminas A (73a), B (73b) e C (73c), produzem molculas
duplamente protonadas [M+2H]
2+
em m/z 379,4 (100% abundncia relativa), alm de espcies
monoprotonadas [M+H]
+
m/z 757,4 (1% abundncia relativa). Foram observadas duas rotas de reao do
precursor m/z 379,4: (a) perda de um fragmento com massa 8,5 u pela perda neutra de uma unidade de
amnia produzindo um on [M+2H-NH
3
]
2+
em m/z 371 (22% abundncia relativa) e (b) perda de 21,5 u devido
a uma fragmentao retro-Diels-Alder, resultando em um on produto [M+2H-C
2
H
5
N]
2+
em m/z 358 (15%
abundncia relativa) (BRINGMANN et al., 1998).
Alcaloides aporfino-benzilisoquinolnicos
O grupo dos alcaloides aporfino-benzilisoquinolnicos derivado via oxidao fenlica de uma unidade
aporfnica com uma unidade benzilisoquinolnica. Alcaloides bisbenzilisoquinolnicos e aporfnicos-
benzilisoquinolnicos j foram encontrados nas seguintes famlias: Annonaceae, Berberidaceae, Hernandiaceae,
Lauraceae, Magnoliaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae e Rutaceae (WU et al., 2004).
FIGURA 28 | Estrutura dos alcaloides aporfino-benzoquinolnicos 75-84.
201
Os alcaloides aporfino-benzilisoquinolnicos podem ainda ser classificados em trs grupos conforme
a semelhana de suas estruturas qumicas: Grupo A, formado pela talicarpina (75), nortalicarpina (76),
acetilnortalicarpina (77), dimetiltalicarpina (78), talmelatina (79), acetiltalmelapina (80) e adiantifolina (81);
Grupo B, formado por talirevolutina (82) e talirevolina (83); e Grupo C, formado pela taliadina (84), todos
ilustrados na Figura 28. Foram utilizadas tcnicas de ESI-EM/EM em TQ para elucidar a estruturas de dez
alcaloides aporfino-benzilisoquinolnicos (WU et al., 2004).
Os alcaloides aporfino-benzilisoquinolnicos (75 a 84) foram analisados utilizando CLAE-ESI-EM/EM
com analisador de TQ, sendo todas as anlises realizadas no modo positivo (WU et al., 2004).

Os dados de ESI-
EM desses alcaloides aporfino-benzilisoquinolnos apresentam on [M+H]
+
intenso, para os alcaloides tercirios
(75-77, 79-83) e on [M]
+
intenso para o alcaloide diquaternrio 78, apresentando tambm os ons [M+H]
2+
intensos (pico base) para todas as substncias, com exceo da substncia 84 (WU et al., 2004).
Para esse grupo de alcaloides foram determinadas trs rotas principais de fragmentaes, demonstradas
com a fragmentao da talicarpina 75 na Figura 29. A clivagem da ligao no anel benzlico AB da unidade
benziltetraidroisoquinolnica E, forma ons aporfino-benzlicos (via 1, Figura 29) em ESI-EM/EM, que so similares
aos fragmentos encontrados na tcnica de espectrometria de massa por impacto por eltrons (IE-EM),
entretanto esses ons no so observados ou mostrados em pequena abundncia nas tcnicas por ionizao
qumica (IQ-EM) e ionizao via bombardeamento rpido de tomos (FAB) (WU et al., 2004). A clivagem da
ligao ter (via 2 e 3) leva formao de ons aporfino-benzlicos (talicarpina: m/z 371 e 355) ou
benziltetraidroisoquinolnicos (talicarpina m/z 325 e 341), com eliminao posterior de CO nos ons m/z 325
e m/z 355 (Figura 29).
202
FIGURA 29 | Vias de fragmentaes bsicas encontradas para os alcaloides
aporfino-benzoquinolnicos. Fragmentao da talicarpina 75 (m/z
697), proveniente de experimentos ESI-EM/EM (WU et al., 2004).
Rota 1: clivagem da ligao no anel benzlico. Rota 2 e 3: clivagem
da ligao ter entre as posies 10-aporfina e 8-
benziltetraidroisoquinolona-benzlica.
Os ons aporfino-benzlicos, dos alcaloides 76 81, formados podem perder H e metanol, mas tambm
poder ocorrer perdas e 15 u (radical metila) e 30 u (OCH
2
), depois da CH
3
OH. A presena de ons isoquinolnicos
(ex.: m/z 206, alcaloide 76) e benzlicos (m/z 151), corrobora com esta via de fragmentao (WU et al., 2004).
O espectro de massas do alcaloide 82, tambm apresenta os ons benzil-aporfnico (m/z 519),
isoquinolnico (m/z 206) e benzlico (m/z 151). Alm disso, por caractersticas estruturais j discutidas
apresentam perdas neutras de CH
3
OH e perdas de CH
3
(WU et al., 2004).

N
O
O
O
O
N
O
O
O
OH
via 1
via 2
via 3
1
2
3
m/ z 697
m/z 490
m/ z 206
m/z 355
-CO
m/z 326
N
O
O
O
O
N
O
O
O
OH
m/z 325
-CO
m/z 296
m/z 371
m/ z 341
N
O
O
O
O
N
O
O
O
O
N
O
O
O
O
O
O
N
O
O
[M+H
+
]
A B C D
E F
203
Alcaloides Bis-benzilisoquinolnicos
Os alcaloides bisbenzilisoquinolnicos podem ser encontrados nas mesmas famlias em que so
encontrados os aporfino-benzilisoquinolnicos. Esses alcaloides dimricos so importantes, pois podem exercer
atividades variadas, tais como: cardiovascular (anti-hipertensivo e antiarrtimico), antiangiognica,
antimicrobiana, analgsica, bloqueadora neuromuscular, relaxante muscular, antitumoral e anti-HIV (Wu et
al., 2004). Esses alcaloides so derivados via oxidao fenlica de duas unidades benzilisoquinolnicas (cabea-
cauda) e esto representados na Figura 30 (WU et al., 2004).
Quando estudados por ESI-EM/EM e tambm por ESI-EM
n
(com detector on trap), utilizando a troca de
hidrognio por deutrio na elucidao da identidade dos fragmentos, os alcaloides fenolo-
bisbenziltetraidroisoquinolnicos neferina (85), liensinina (86) e isoliensinina (87) (importantes por seu potencial
anti-HIV), em geral, observou-se a clivagem da ligao C1-C9, resultando na formao de fragmentos,
contendo o ncleo aromtico C e D, com perda de 4-etil-1-fenol ou 4-etil-1-metxi-benzeno aps rearranjos.
Outros fragmentos estveis formados se devem perda de H
2
O, CH
3
NH
2
, CH
3
OH e CH
3
-N=CH
2
, todos ilustrados
na Figura 31 (ZHOU et al., 2007).
FIGURA 30 | Estrutura dos alcaloides bisbenzilisoquinolnicos 85-91.
No mesmo trabalho, a substncia 85 foi incubada com microssomas hepticas, levando a identificao
de quatro derivados novos mono ou didesmetilados de 85, a saber: 6-O-desmetilneferina 88, 2-N-O-
didesmetilneferia 89, 2-N-6-O-didesmetilneferina 90, e 6,13-O-didesmetilneferina 91, cujas fragmentaes
tambm foram estudadas e seus principais mecanismos esto ilustrados na (Figura 20).
204
FIGURA 31 | Vias de fragmentao da neferina 83, estudada por ESI-EM/EM
(ZHOU et al., 2007).
CONSIDERAES FINAIS
A espectrometria ESI EM/EM uma ferramenta til na anlise de alcaloides isoquinolnicos. Em relao
ao estudo dos morfinanos, tanto ion trap quanto o triplo quadrupolo EM/EM providenciam informaes sobre
a substituio no esqueleto morfinano. No entanto, a posio das duplas ligaes no anel C, o nmero e as
posies das duplas ligaes influenciam o processo de fragmentao do on molecular. A maioria dos
fragmentos encontrada em ambos os analisadores, porm com intensidades diferentes. Em geral o ion trap
detecta fragmentos de alto peso molecular, j os fragmentos de menor peso molecular ,que so detectados
pelo triplo quadrupolo , s so identificados no ion trap em EM
3
ou EM
4
. O mecanismo principal de fragmentao
dos morfinanos consiste na clivagem do anel piperidnico e na eliminao do grupamento amina (RAITH et al.,
2003).
Os alcaloides opioides noscapina 12 e papaverina 13 podem ser analisados por ESI-EM, observando os
ons [M+H]
+
. Apesar dos analitos apresentarem esqueletos carbnicos similares, as suas fragmentaes diferem

N
O
O
OH
N
O
O
O
H
+
m/z
-18
-31
-32
-43
607 (-H2O)
594 (-CH3NH2)
593 (-CH3OH)
582 (CH3-N CH2)
m/z 625
m/z 190
m/z 206
m/z 489
m/z 297
N
O
O
N
O
O
OH
N
O
O
N
O
O
N
O
O
H
205
significantemente. A substncia 12 produz muitos produtos de ons em EM
2
, enquanto os fragmentos da
substncia 13 produzem somente ons nicos, ambos em EM
2
e EM
3
. O local da ionizao revelado vaporizando
os analitos com soluo contendo
2
H
2
O e as transies EM
n
tm sido designadas sem a despesa de utilizar
analitos isotopicamente marcados com carbonos, oxignios e nitrognios (WICKENS et al., 2006).
Em geral, as anlises de ESI/EM e EM/EM so as nicas tcnicas que provm um bom diagnstico de
ons de fragmentao para a elucidao estrutural dos alcaloides dimricos aporfnicos-benzilisoquinolnicos.
O mecanismo de fragmentao principal dos alcaloides aporfnicos-benzilisoquinolnicos consiste na clivagem
da ligao dos anis benzlicos A, B e E e eliminao (WU et al., 2004).
Alm do mais, a marcao com istopos estveis em espectrometria de massa ESI com fragmentao
por ativao colisional (CID) consiste numa ferramenta importante para a investigao dos mecanismos de
fragmentao dos alcaloides (POEAKNAPO et al., 2004).
Os ismeros R-R e R-S dos alcaloides isoquinolnicos tm sido diferenciados em relao energia
requerida para o processo de fragmentao primria; o ismero R-S parece energeticamente mais favorvel.
Substncias que contm o grupo ster, tanto para o ismero a e o ismero b (69 e 70) apresentam uma
facilidade na formao dos ons [M+Na]
+
e [M+K]
+
, o que pode ser explicado tambm pelo efeito doador dos
tomos de oxignio ou pela alta basicidade dos grupos amino presentes nas substncias 71e 72 favorecendo
a formao de molculas protonadas (GIOACCHINI et al., 2000).
Por outro lado, a fragmentao dos alcaloides aporfinoides acontece, primeiramente, pela perda do
grupo amino e seus subtituintes e, posteriormente, pela perda de grupos perifricos. As eliminaes de
metanol e CO so observadas se um OH vicinal a um OCH
3
no anel aromtico. O espectro mostra eliminaes
CH
3
ou CH
3
O. Se um grupo dioxi-metileno est presente, observa-se a perda de formaldedo seguido de CO
(STVIGNY et al., 2004).
Os alcaloides naftil-isoquinolnicos so identificados pela gerao de molculas protonadas [M+2H]
+
para korupensaminas e duplamente protonadas [M+2H]
2+
para michelaminas (BRINGMANN et al., 1998).
As reaes de fragmentao dos alcaloides isoquinolnicos propostas envolvem eliminaes neutras
e radicalares e formao de ons [M+H]
+
para os alcaloides tercirios e [M]
+
para os quaternrios (FABRE et al.,
2000).
De uma forma geral, os mecanismos de fragmentao via ESI para os alcaloides isoquinolnicos
encontrados so: a clivagem (anis piperidnicos, benzlicos), a eliminao (molculas neutras, radicais) e
RDA. Pode haver a formao dos ons [M+2H]
+
, [M+2H]
2+
, [M+H]
+
, [M]
+
, [M+Na]
+
, [M+K]
+
. Existe a tendncia
para a rota de formao de susbtncias altamente conjugadas, devido a sua estabilidade e o stio mais
provvel da protonao o N da parte isoquinolnica. Essas reaes vo depender da estrutura qumica do
alcaloide, se so tercirios ou quaternrios e tambm da natureza e posio dos substituintes.
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APLICAO DA ELETROFORESE CAPILAR NA ANLISE DE
PRODUTOS NATURAIS
Joo Carlos Palazzo de Mello
Lia Akina Ito
INTRODUO
A eletroforese definida como o movimento,
em soluo eletroltica, de substncias carregadas
eletricamente sob a influncia de um campo eltrico,
no qual a separao entre dois solutos ocorre de
acordo com diferenas entre suas mobilidades
eletroforticas (SUNTORNSUK, 2010). Essa tcnica
separa substncias baseado nas diferenas de
mobilidade eletrofortica, partio de fase, potencial
hidrogeninico (pH), tamanho molecular, ou uma
combinao de uma ou vrias dessas propriedades
(KVASNICKA, 2007).
A eletroforese capilar (EC) surgiu como um
mtodo analtico de separao e anlise de
substncias qumicas, complementando tcnicas de
separao clssicas como cromatografia lquida de
alta eficincia (CLAE), cromatografia em fase gasosa
(CG) e eletroforese em gel (PREINERSTORFER et al.,
2009).
210
As tcnicas de CLAE e CG so semelhantes EC na exibio, manipulao de dados e na automao,
tendo essencialmente a unio dos mecanismos de separao de eletroforese com os conceitos de
instrumentao e automao da cromatografia.
A EC oferece vrias vantagens quando comparada com as demais tcnicas de separao rpida e
eficiente, apresentando alta resoluo, relativamente econmica, colunas capilares duradouras, utilizao de
pequenas quantidades de amostra, baixo consumo de reagentes, instrumentao altamente automatizada e
mecanismos de separao simples (ALTRIA, 1999; LECHTENBERG et al., 2004; CAO et al., 2008; PREINERSTORFER
et al., 2009).
A EC pode ser empregada na anlise e caracterizao de uma vasta variedade de analitos, desde ons
inorgnicos, pequenas molculas orgnicas, peptdeos, protenas, cidos nucleicos, vrus, fungos e bactrias
(KVASNICKA, 2007).
A tcnica de EC frequentemente empregada na anlise de produtos naturais em extratos, formulaes
farmacuticas e suplementos alimentcios, sendo, especialmente, aplicados na anlise qualitativa e quantitativa
de metablitos secundrios de plantas (ISSAQ,1997, 1999; SUNTORNSUK, 2002; UNGER, 2009).
INSTRUMENTAO
Uma das principais vantagens da EC a utilizao de uma instrumentao simples. O equipamento
consiste de frascos de amostra, frascos de origem e destino, capilares (geralmente de slica fundida), eletrodos
(platina), uma fonte de alta tenso, um detector apropriado e um computador para o tratamento de dados
(TAGLIARO et al., 1998; SANTORO et al., 2000; SUNTORNSUK, 2010).
FIGURA 1 | Representao esquemtica de um sistema de eletroforese
capilar.
211
Na EC, o capilar, os frascos de origem e destino so preenchidos com uma soluo eletroltica,
normalmente uma soluo de tampo aquoso. A extremidade de entrada do capilar colocado no frasco
de amostra, na qual a amostra introduzida, e o capilar volta a ser colocado no frasco de origem.
Posteriormente, aplicado um campo eltrico entre os frascos de origem e destino. Os solutos migram
atravs do capilar pela interao do fluxo eletro-osmtico do tampo e da mobilidade eletrofortica dos
solutos, sendo ento detectados e os sinais transformados e representado por eletroferograma (resposta
do detector versus o tempo em minutos). Como os solutos migram atravs do capilar com velocidades
diferentes, passam pelo detector em tempos diferentes, aparecendo no eletroferograma com diferentes
tempos de migrao.
INTRODUO DA AMOSTRA
Na EC so utilizados volumes pequenos de amostra. So colocados nos frascos de amostra de poucos
microlitros a poucos mililitros, j que so introduzidos no capilar volumes na ordem de nanolitros (ISSAQ,
1997). A introduo da amostra realizada posicionando a extremidade de entrada do capilar no frasco de
amostra, podendo a amostra ser introduzida por diferentes tcnicas, sendo as mais comuns as injees
hidrodinmica e eletrocintica (LI et al., 2006).
A injeo hidrodinmica, tambm conhecida como hidrosttica, pode ser realizada por presso
ou gravidade. A injeo por presso pode ser feita colocando a extremidade de entrada do capilar no
frasco de amostra e aplicando uma presso nesse frasco, ou aplicando um vcuo no frasco de destino
enquanto a extremidade de entrada do capilar estiver no frasco de amostra (SCHMITT-KOPPLIN &
FROMMBERGER, 2003). A injeo por gravidade conhecida tambm por sifonamento, onde a
extremidade de entrada do capilar introduzida no frasco de amostra, esse frasco elevado acima do
frasco de destino, permitindo que a amostra sifone para dentro do capilar (SUNTORNSUK, 2002; LI et al.,
2006).
FIGURA 2 | Injeo hidrodinmica por presso (A); Injeo hidrodinmica por
vcuo (B) e Injeo hidrodinmica por gravidade (C).
212
A injeo eletrocintica, tambm conhecida como eletromigrao, realizada colocando o capilar e
o nodo no frasco de amostra sendo aplicada voltagem por determinado perodo de tempo. Nesse caso, a
amostragem no ser homognea, j que a quantidade de amostra injetada vai depender da mobilidade
eletrofortica de suas substncias, ou seja, como os solutos sero introduzidos com a aplicao de um campo
eltrico; solutos com alta mobilidade eletrofortica migraram mais rapidamente e em maior quantidade para
o interior do capilar do que os solutos com menores mobilidades eletroforticas (TAGLIARO et al., 1998;
SUNTORNSUK, 2002; LI et al., 2006). A injeo eletrocintica empregada quando se utiliza capilares
preenchidos com gel, pois esse oferece maior resistncia para injees por gravidade e injees por presso
podem empurrar o gel para fora do capilar (TAVARES, 1997).
FIGURA 3 | Esquema geral de uma injeo eletrocintica.
CAPILARES
Geralmente so utilizados capilares de slica fundida com dimetro interno de 50 ou 75 m e dimetro
externo de 375 m, variando o comprimento de 30 a 100 cm. O capilar de slica fundida transparente para
a luz ultravioleta e visvel, permitindo o uso de baixos comprimentos de onda, podendo-se obter a deteco
on-column, ou seja, detectando os solutos ainda dentro do capilar com o prprio capilar sendo utilizado como
clula do detector, quando for utilizado o detector UV-Vis ou de fluorescncia. O capilar de slica fundida, por
ser facilmente quebrvel, revestido por uma camada externa de polimida, portanto necessrio fazer uma
janela ptica removendo uma pequena seo de aproximadamente um centmetro desse revestimento.
Retira-se por raspagem ou pela queima desse revestimento, posicionando essa janela no caminho da luz do
detector (TAGLIARO et al., 1998).
213
DETECTORES
Na eletroforese capilar podem ser utilizados diversos tipos de detectores: ultravioleta-visvel (UV-Vis),
fluorescncia, fluorescncia induzida por laser, espectrometria de massas, condutividade, ndice
amperomtrico, ndice radiomtrico e ndice de refrao.
Os critrios para a escolha de determinado detector so os mesmos aplicados na cromatografia
lquida de alta eficincia, incluindo sensibilidade, faixa linear dinmica e seletividade.
Os limites de deteco na eletroforese capilar so aproximadamente de 1 mg/ml (ppm) a 1 mg/ml
(ppb).
Detector Ultravioleta-Visvel (Uv-Vis)
A deteco pela absorbncia na luz ultravioleta ou visvel a mais amplamente utilizada na eletroforese
capilar. A maioria das substncias apresenta grupamentos cromforos, ou seja, que absorvem luz. Assim,
quando uma luz incidida sobre a molcula, parte da luz absorvida e parte transmitida, sendo essa
detectada pelo fotodetector, apresentando eletroferogramas da absorbncia versus tempo (ZEMANN et al.,
1998).
Existem dois tipos de deteco por UV-Vis, um com comprimentos de onda fixos e outro por arranjo
de diodos (DAD). O detector por arranjo de diodos mais vantajoso, pois com a deteco nos diversos
comprimentos de onda e com a possibilidade de anlise do espectro, essa tcnica permite a determinao da
pureza e a identificao de alguns picos (TAGLIARO et al., 1998).
Detector de Fluorescncia
Fluorescncia um tipo seletivo de deteco, pois somente solutos que fluorescem so detectados.
Esses correspondem aproximadamente 10% das substncias orgnicas que tm uma eficincia quntica
suficientemente alta para ser detectado pelo detector de fluorescncia.
Quando uma energia em forma de luz atinge uma molcula, parte dessa energia dissipada como
calor e parte como luz. Essa dissipao de luz varia de acordo com as transies eletrnicas dentro da
molcula, podendo ser fluorescente, fosforescente ou quimioluminescente, e quanto maior a dissipao de
luz maior o sinal obtido no espectro.
Nesse tipo de deteco, o comprimento de onda da luz utilizado para a excitao menor do que o
comprimento de onda da luz emitido, portanto, so obtidos dois espectros de fluorescncia associados a um
mesmo composto, um espectro de excitao e um espectro de emisso. O espectro de excitao um
grfico da intensidade de luz emitida versus o comprimento de onda da luz na excitao, e o espectro de
emisso um grfico da intensidade de luz emitida versus o comprimento de onda da luz emitida.
Detector de Fluorescncia Induzida por Laser
Na deteco por fluorescncia, quanto maior a intensidade da luz emitida por uma molcula, maior a
sensibilidade da deteco e, logo, maior o pico no eletroferograma. A intensidade de luz emitida depende da
214
eficincia quntica do soluto e do nmero de molculas excitadas, enquanto que essa proporcional a
incidncia da radiao.
No detector de fluorescncia induzida por laser, ao invs da luz branca utilizado um feixe capaz
de produzir radiaes de alta intensidade para excitao das molculas, aumentando drasticamente a
sensibilidade da deteco quando comparada a deteco de fluorescncia utilizando luz branca (PAPPAS
et al., 2005)
Como so poucas as substncias que possuem fluorescncia, e as espcies que podem ser derivatizadas
so limitadas, outra forma de se aplicar essa tcnica pela deteco indireta. Nesse caso, um fluorforo
adicionado ao eletrlito, produzindo um sinal constante de intensidade de fluorescncia, a partir do momento
que um analito passa pela regio do detector, o sinal da intensidade de fluorescncia varia (WANG et al.,
2007).
Deteco por Espectrometria de Massas
O espectrmetro de massas apresenta uma boa sensibilidade e funciona como um detector universal,
detectando qualquer composto que tenha massa molecular dentro da faixa de massas do espectrmetro
(PAPPAS et al., 2005).
O espectrmetro de massas acoplado eletroforese capilar por meio de uma interface de ionizao
por eletrospray. No espectrmetro de massas, a molcula quebrada em fragmentos carregados que so
analisados e produzem um espectro de massa, apresentando a razo massa-carga (m/z) versus a intensidade
para cada fragmento. Essa fragmentao e a abundncia relativa de cada fragmento permitem determinaes
qualitativas (SUNTORNSUK, 2010).
Deteco por Condutividade
A deteco por condutividade baseada na mudana da condutividade eltrica da soluo quando
um soluto inico entra em contato com essa soluo. O detector de condutividade apresenta dois eletrodos
no frasco de destino, alm de uma fonte de energia que aplica um potencial nesses eletrodos. Depois de
passar pelo capilar, os solutos passam por esses eletrodos reduzindo a resistncia eltrica da soluo, portanto
aumentando a condutncia eltrica. O detector mede essa condutncia, fornecendo a condutividade. A
resposta do detector estar diretamente relacionada com a mobilidade inica dos solutos (HUANG et al.,
1989; ZEMANN et al., 1998).
Deteco pelo ndice Amperomtrico
A deteco pelo ndice amperomtrico mede a corrente resultante da oxidao ou da reduo de
solutos eletroativos na superfcie de um eletrodo. A extremidade do capilar de separao conectado ao
capilar de deteco por uma junta porosa, que colocado no frasco do tampo que contm o ctodo para
eletroforese. A outra extremidade do capilar de deteco posicionada em uma clula amperomtrica com
215
um eletrodo de fibra de carbono, onde ir ocorrer a oxidao ou a reduo, e um eletrodo de referncia
(WALLINGFORD & EWING, 1987).
A oxidao acontece quando um eltron transferido da molcula do soluto para a superfcie do
eletrodo contido na clula amperomtrica, aumentando a carga do soluto. Na reduo acontece o
contrrio, o eltron da superfcie do eletrodo passa para o molcula do soluto, reduzindo a carga do
soluto. A corrente que passa pelo eletrodo da clula amperomtrica proporcional ao nmero de
eltrons transferidos, portanto proporcional tambm concentrao do soluto (WALLINGFORD & EWING,
1988).
Deteco pelo ndice Radiomtrico
A deteco radiomtrica utilizada quando os solutos so radioativos. Pode-se adicionar um marcador
radioativo em uma substncia, podendo ento detect-lo (PAPPAS et al., 2005).
Na deteco radiomtrica a emisso de partculas atravessam a parede do capilar e reagem com um
semicondutor, resultando em um sinal.
Deteco pelo ndice de Refrao
A deteco pelo ndice de refrao realizada medindo a quantidade de luz emitida que defletida
depois de passar atravs do soluto em relao posio da luz passando somente pelo tampo. Utiliza-se
um laser como fonte de luz, que quando defletido medido por um sensor de posio da luz irradiada.
FONTE DE ENERGIA
A fonte de alta tenso utilizada para estabelecer um campo eltrico ao longo do capilar, permitindo
que a eletroforese acontea. As fontes podem ser operadas tenso ou corrente constante, com valores que
variam de 0 30 kV e de 0 300 A, respectivamente.
Geralmente nos capilares de slica, a direo do fluxo eletro-osmtico direcionado para o ctodo, a
polaridade normal do eletrodo positivo, nodo, para o eletrodo negativo, o ctodo. No entanto, em casos
particulares, a polaridade pode ser revertida (TAGLIARO et al., 1998).
Com o uso de altas voltagens, o controle da temperatura do capilar fundamental para uma boa
anlise. Com a dissipao efetiva do calor, o uso de altas voltagens apresenta vantagens como separaes
com alta eficincia, tempos de separao curtos e uma boa resoluo entre os picos. Porm, aumentos na
temperatura interna do capilar pela dissipao inadequada do calor causam mudanas na viscosidade do
tampo e, consequentemente, na velocidade de migrao dos analitos (LI et al., 2006).
TRATAMENTO DOS DADOS
Como na cromatografia lquida de alta eficincia, a eletroforese capilar dispe de injees de amostra
automatizadas e controle do instrumento, sendo muito til no desenvolvimento de mtodos.
216
Podem ser realizadas anlises qualitativas comparando tempos de migrao de amostras e padres,
determinando qual pico corresponde a qual padro. Porm, a eletroforese capilar no uma boa tcnica
qualitativa.
Ao contrrio, a eletroforese capilar uma excelente tcnica quantitativa, j que as alturas e reas dos
picos so proporcionais a sua concentrao. Anlises quantitativas so feitas a partir de curvas de calibrao.
TCNICAS DE SEPARAO
A eletroforese capilar apresenta uma grande versatilidade devido disponibilidade de diferentes
modos de separao. As tcnicas de separao mais comumente utilizadas na eletroforese capilar so
eletroforese capilar de zona (CZE), cromatografia eletrocintica micelar (MEKC), eletrocromatografia capilar
(CEC), isotacoforese capilar (CITP), eletroforese capilar em gel (CGE) e focalizao isoeltrica capilar (CIEF)
(SUNTORNSUK, 2002; SILVA et al., 2007; SUNTORNSUK, 2010).
ELETROFORESE CAPILAR DE ZONA (CZE)
A eletroforese capilar de zona a mais simples das tcnicas de separao, sendo tambm conhecida
como eletroforese capilar em soluo livre. a tcnica mais utilizada, pois aplicvel na separao de
substncias ionizveis na mesma corrida, embora no seja til na separao de substncias neutras (TAVARES,
1997).
Antes da corrida da amostra, normalmente feito uma lavagem com uma soluo bsica. No caso dos
capilares de slica fundida, na presena dessa soluo bsica, os grupamentos silanis (Si-OH) da superfcie do
capilar sero ionizados para grupamentos silanoatos (Si-O
-
) carregados negativamente. Aps essa ionizao,
o capilar enxaguado com tampo, assim, os grupamentos silanoatos atrairo os ctions positivamente
carregados do tampo, formando uma camada interna de ctions na parede do capilar (TAGLIARO et al., 1998;
SCHMITT-KOPPLIN & FROMMBERGER, 2003). Como esses ctions no tm uma densidade suficiente para
neutralizar todas as cargas negativas, uma segunda camada de ctions formada. A camada interna de
ctions que est fortemente ligada aos grupamentos silanoatos chamada de camada fixa, enquanto que a
camada externa de ctions, como no se encontra fortemente ligada aos grupamentos silanoatos chamada
de camada mvel. Essas duas camadas formam a camada dupla difusa de ctions (SUNTORNSUK, 2002; VALLS
et al., 2009).
Entre essas duas camadas existe um plano de cisalhamento e, quando aplicado o campo
eltrico, criado uma diferena de potencial entre essas duas camadas, chamado de potencial zeta
(). Assim, quanto maior a espessura da dupla camada, maior o potencial zeta (), e maior o fluxo
eletroosmtico. Lembrando que a espessura da dupla camada inversamente proporcional
concentrao do tampo. Quando um campo eltrico aplicado, a fase mvel de ctions atrada
em direo ao ctodo carregado negativamente, causando o fluxo eletro-osmtico (SCHMITT-KOPPLIN
& FROMMBERGER, 2003).
217
FIGURA 4 | Representao do fluxo eletroosmtico no interior do capilar.
Na eletroforese capilar de zona, tanto o capilar quanto os frascos de origem e destino so preenchidos
com o mesmo tampo. A partir do momento que a amostra introduzida no capilar e a voltagem aplicada,
os solutos vo migrar pelo capilar em forma de zonas. A diferena de potencial entre os eletrodos produz um
fluxo eletroosmtico que carrega todos os solutos pelo capilar do nodo para o ctodo, no entanto, os solutos
sero separados pela diferena entre as suas mobilidades eletroforticas. A mobilidade eletrofortica
baseada na razo massa-carga de cada soluto, sendo causada pela atrao que os solutos com carga sofrem ao
eletrodo com carga oposta a sua, ou seja, solutos carregados negativamente sero atrados pelo nodo e
solutos carregados positivamente sero atrados pelo ctodo. No entanto, o fluxo eletro-osmtico maior do
que as mobilidades eletroforticas dos solutos, carregando todos eles em direo ao detector e,
posteriormente, ao ctodo. Ou seja, a velocidade de cada soluto ser a interao da mobilidade eletrofortica
de cada soluto com o fluxo eletro-osmtico do sistema. Assim, a ordem de eluio ser ctions, neutros e
nions. Porm, os ons sero totalmente separados enquanto as substncias neutras, por apresentarem a
mesma mobilidade eletrofortica, eluiro todos no mesmo pico, sofrendo a ao somente do fluxo eletro-
osmtico (TAGLIARO et al., 1998).
CROMATOGRAFIA ELETROCINTICA MICELAR (MEKC)
A cromatografia eletrocintica micelar a tcnica de escolha para separao de substncias neutras
em eletroforese capilar, sem essa tcnica a aplicabilidade da eletroforese capilar seria restrita somente a
separao de substncias ionizveis.
218
Essa tcnica baseada na partio dos solutos entre micelas e o tampo de corrida. A diferena entre
essa tcnica e a eletroforese capilar de zona a adio de surfactantes soluo tampo, que iro produzir as
micelas (ALTRIA, 1999; SUNTORNSUK, 2002; UNGER, 2009).
Os surfactantes, tambm conhecidos como detergentes, so molculas que apresentam uma poro
hidroflica em uma extremidade da molcula e uma poro hidrofbica na outra extremidade. Quando o
surfactante est presente em soluo em uma concentrao maior do que sua concentrao crtica micelar
(CMC), as molculas do surfactante se agregam formando micelas. As micelas possuem um formato esfrico,
com as pores hidroflicas voltadas para a parte externa da micela estando em contato com a soluo tampo
aquosa, e as pores hidrofbicas voltadas para o centro da micela (SUNTORNSUK, 2002). O surfactante mais
amplamente utilizado na cromatografia eletrocintica micelar o dodecil sulfato de sdio (SDS), com o
grupamento hidroflico SO
3
em uma extremidade e o grupamento hidrofbico CH
3
-(CH
2
)
11
em outra (TAVARES,
1997; PAPPAS et al., 2005; UNGER, 2009).
FIGURA 5 | Micela de dodecil sulfato de sdio (SDS). Com grupamentos
hidroflicos O-SO
3
-
em contato com o tampo aquoso na parte
exterior da micela, e grupamentos hidrofbicos CH
3
-(CH
2
)
11
no
interior da micela. A micelas de SDS so formadas por 62
molculas de SDS, porm, as micelas foram desenhadas com
apenas 16 molculas para melhor visualizao.
Na presena das micelas, substncias insolveis em gua vo particionar nas pores hidrofbicas da
micela, ao contrrio das substncias solveis em gua que vo ficar presentes na soluo tampo. As substncias
com solubilidade intermediria iro particionar entre a soluo tampo aquosa e as micelas (ALTRIA, 1999;
VALLS et al., 2009).
219
Em uma corrida, utilizando o SDS como surfactante e considerando a presena de substncias
eletricamente neutras, quando aplicada voltagem, ser criado um fluxo eletro-osmtico que carregar a
amostra, soluo tampo e micelas do nodo para o ctodo, porm as micelas carregadas negativamente
sero atradas para o nodo, possuindo uma mobilidade eletrofortica menor do que o fluxo eletro-osmtico.
Assim, molculas hidroflicas presentes na soluo tampo sero carregadas pelo capilar, sofrendo ao do
fluxo eletro-osmtico e eluiro primeiro, enquanto que as molculas hidrofbicas eluiro juntamente com as
micelas. As molculas parcialmente solveis em gua iro particionar entre as micelas e a soluo tampo,
dependendo de sua hidrofobicidade, com tempos de reteno proporcionais ao tempo que permanecem
dentro das micelas (TAGLIARO et al., 1998).
ELETROCROMATOGRAFIA CAPILAR (CEC)
A eletrocromatografia capilar uma tcnica de separao que une caractersticas da eletroforese
capilar e da cromatografia lquida de alta eficincia (STOGGL et al., 2006; UNGER, 2009; VALLS et al., 2009;
SUNTORNSUK, 2010; YANG et al., 2010). Nessa tcnica encontra-se dentro do capilar uma fase estacionria
composta por micropartculas de slica fundida contendo um ligante hidrofbico que retm os solutos, e uma
fase mvel, geralmente uma mistura de tampes aquosos, que se movimentam atravs do capilar por um
fluxo eletro-osmtico (ALTRIA, 1999; SCHERZ et al., 2007).
A separao realizada pela diferena de partio entre as duas fases, pela diferena na eletromigrao,
ou a combinao das duas (ALTRIA, 1999; SCHERZ et al., 2007; VALLS et al., 2009; YANG et al., 2010).
ISOTACOFORESE CAPILAR (CITP)
Na isotacoforese capilar, coloca-se a amostra entre dois tampes no capilar, um eletrlito carreador
lder e um eletrlito carreador terminal, aplicando-se um campo eltrico. A separao ser realizada de
acordo com as diferenas nas mobilidades eletroforticas dos ons da amostra em relao aos ons dos
eletrlitos lder e terminal. Porm, na isotacoforese capilar no possvel separar nions e ctions na mesma
corrida, sendo aplicado somente s misturas de um ou de outro (SUNTORNSUK, 2010).
Na separao de uma mistura de ctions, deve-se selecionar um eletrlito carreador lder que possua
ctions com a mobilidade maior do que a dos ctions presentes na amostra, enquanto que o eletrlito
carreador terminal deve apresentar ctions com a mobilidade menor do que os ctions da amostra. A partir do
momento que se aplica o campo eltrico, todos os ctions, tanto da amostra quanto dos eletrlitos, migraro
em direo ao ctodo, no entanto, como as mobilidades dos ctions so diferentes, os ctions da amostra com
maior mobilidade ficaro prximos do eletrlito lder e os de menor mobilidade prximos ao eletrlito
terminal, formando zonas. Depois de formadas as zonas, os eletrlitos e os solutos da amostra migram atravs
do capilar e detector. Todos os ctions dos eletrlitos e da amostra migram na mesma velocidade do eletrlito
carreador lder, por isso o nome isotacho- que significa velocidade constante (TAVARES, 1997).
220
FIGURA 6 | Representao da isotacoforese de ctions.
ELETROFORESE CAPILAR EM GEL (CGE)
A eletroforese em placa de gel a tcnica de separao mais tradicional na biomedicina e bioqumica
para separao e caracterizao de protenas, sequenciamento de DNA e mapeamento de fragmentos de
DNA (TAGLIARO et al., 1998).
A eletroforese capilar em gel (CGE) combina os princpios da eletroforese em gel com a instrumentao
e os capilares de pequeno dimetro da eletroforese capilar. Como os capilares dissipam o calor melhor do que
as placas, pode-se utilizar maiores campos eltricos, obtendo separaes mais rpidas.
Na eletroforese capilar em gel, o capilar preenchido com um gel, normalmente um polmero
poliacrilamida/bisacrilamida reticulado ou um polmero poliacrilamida linear no reticulado.
Na eletroforese capilar de zona os solutos so separados de acordo com diferenas nas razes massa-
carga, entretanto, quando essas razes so muito prximas no possvel realizar essa separao. A eletroforese
capilar em gel aplicada nas anlises de molculas carregadas que variam no tamanho, mas no na razo
massa-carga, j que os solutos so separados por um mecanismo de peneiramento molecular com base em
seus tamanhos, molculas pequenas so capazes de atravessar o gel e eluir primeiro, enquanto que molculas
grandes so retardadas pelo gel e eluem depois (TAVARES, 1997).
FIGURA 7 | Representao da eletroforese capilar em gel no interior do
capilar.
221
Na eletroforese capilar em gel, necessrio que o gel seja covalentemente ligado parede do capilar
para que o fluxo eletro-osmtico no empurre o gel para fora do mesmo. Outro cuidado que se deve ter
com relao formao de bolhas de gs dentro do capilar que geram correntes instveis (TAGLIARO et al.,
1998).
FOCALIZAO ISOELTRICA CAPILAR (CIEF)
Na focalizao isoeltrica, os solutos so separados de acordo com seus pontos isoeltricos (pI). Essa
tcnica utilizada principalmente para separao de espcies anfteras, como protenas e polipeptdios, mas
pode ser utilizada tambm para separar qualquer mistura de substncias com diferentes pontos isoeltricos,
contanto que o gradiente de pH formado abranja os pontos isoeltricos da amostra (WU et al., 1998; LPEZ-
LORENTE et al., 2011).
Substncias anfteras so aquelas que podem ser tanto nions quanto ctions, dependendo do pH da
soluo, em que o pH dessa substncia neutra, assim denominado de ponto isoeltrico (pI). Uma soluo
de anflitos contm uma mistura de substncias com diferentes pI, normalmente formados por grupos de
aminocidos e cidos carboxlicos, que em presena de um campo eltrico formaro um gradiente de pH no
capilar.
A focalizao isoeltrica capilar realizada preenchendo o capilar com uma mistura de anflitos e
amostra. O frasco que contm o ctodo preenchido com um catlito, normalmente uma soluo bsica de
hidrxido de sdio 0,02 M, com o pH menor do que o pI do anflito mais cido, e o frasco que contm o nodo
preenchido com um anlito, uma soluo cida de cido fosfrico 0,02 M, devendo essa soluo ter um pH
maior do que o pI do anflito mais bsico. Quando uma pequena voltagem aplicada, solutos da amostra e os
anflitos migram atravs do capilar at alcanar um ponto onde eles so neutros, ou seja, onde o pH da
soluo seja igual ao ponto isoeltrico da substncia. Quando a corrente diminui para um valor de 10 a 25%
do seu valor inicial indicativo de que todas as substncias j se encontram em seu ponto isoeltrico. As
substncias ficam em estado constante, pois no sofrem ao do fluxo eletro-osmtico, j que o capilar
previamente tratado para no produzir o fluxo eletro-osmtico e nem para que ocorra a absoro da amostra
na parede do capilar (TAVARES, 1997).
222
FIGURA 8 | Representao da focalizao isoeltrica capilar. pI=ponto
isoleltrico.
Aps a focalizao da amostra, os anflitos e as zonas de solutos da amostra sofrem uma mobilizao,
ou seja, so empurrados atravs do capilar para serem ento detectados, obtendo-se um eletroferograma.
Existem dois tipos de mobilizao, a mobilizao hidrodinmica por aplicao de presso, ou a mobilizao
eletrofortica, que ocorre pela aplicao de voltagem, sendo necessria a adio de um sal em um dos
reservatrios do anlito ou do catlito. Geralmente, utilizada a mobilizao eletrofortica, devido menor
perda de resoluo das bandas pr-focalizadas (RODRIGUEZ-DIAZ et al., 1997; WU et al., 1998).
SEPARAES QUIRAIS
Separaes quirais so um dos tpicos mais promissores no emergente campo da eletroforese capilar
e permitem a observao de interaes intermoleculares fracas e at mesmo efeitos estereosseletivos fracos
nessas interaes (SUNTORNSUK, 2010). A separao de enantimeros com seletores quirais neutros realizada
por eletroforese capilar, de zona (CZE), e a separao com seletores quirais carregados realizada com
cromatografia eletrocintica (MEKC) (CHANKVETADZE, 1997).
A separao por CZE baseada na mobilidade eletrofortica dos analitos carregados numa soluo
tampo sob efeito do campo eltrico aplicado. As mobilidades eletroforticas dos analitos so resultados de
suas diferentes densidades de carga efetiva, porm, a efetiva razo massa-carga (densidade de carga) no
diferencia para os enantimeros em meio isotrpico. Logo, enantio-separao se torna impraticvel na
223
eletroforese capilar de zona original. As enantiosseparaes descritas para a eletroforese capilar de zona
envolvem a adio de um seletor quiral na soluo tampo. Logo, a enantiosseparao baseada na interao
estereosseletiva dos enantimeros com o seletor quiral e no na diferena das densidades de carga efetiva
(CHANKVETADZE, 1997).
Recentemente, tem sido mostrado que a eletroforese capilar uma excelente tcnica de separao
quiral. As principais vantagens dessa tcnica so a alta eficincia, o rpido equilbrio do sistema, e a possibilidade
de uso de seletores quirais caros, j que so necessrias poucas quantidades. Encontram-se disponveis dois
mtodos de eletroforese capilar para separao quiral: direto e indireto. O mtodo indireto baseado na
formao de diasteroismeros estveis a partir de derivatizao quiral com reagentes. Esses diasteroismeros
podem ser separados com um tampo eletroltico aquiral, baseados nas propriedades fsico-qumicas dos
diasteroismeros. Porm, o mtodo indireto necessita de muitos reagentes, e o prprio procedimento
demorado, podendo ocorrer racemizao durante o processo. Como o mtodo direto no apresenta essas
desvantagens, o mais utilizado atualmente. A determinao quiral direta realizada adicionando seletores
quirais diretamente na soluo tampo. Seletores quirais incluem sais biliares e alguns antibiticos como a
estreptomicina, mas os mais utilizados so as ciclodextrinas (CD). A cavidade da CD relativamente hidrofbica
e capaz de receber substncia de diferentes tipos, particularmente aquelas com grupos no polares. A parte
exterior da CD, por outro lado, relativamente hidroflica devido presena de grupos hidroxilas e capaz de
interagir com partes hidroflicas da molcula. Se os enantimeros se encaixarem dentro da cavidade ou
interagirem com a superfcie externa da CD, formam diferentes constantes de ligao, sendo possvel separ-
los (DEEB et al., 2008). Alm disso, so utilizados mecanismos de resoluo para separaes enantiomricas
por eletroforese capilar que incluem: complexao-incluso, troca de ligante quiral, interaes de afinidade
e pares de ons, entre outros (PAN et al., 2008; FANALI, 2009).
A seletividade da separao enantiomrica para determinado analito dependente da natureza e
concentrao das CD adicionadas soluo tampo, do seu grau de substituio e da posio dos substituintes.
Alm disso, fatores como pH, a natureza e a concentrao da soluo tampo, a superfcie do capilar, o modo
de polaridade, a voltagem aplicada tambm afetam a enantioseparao (FILLET et al., 1998).
APLICAES COM PRODUTOS NATURAIS
FLAVONOIDES
Lee & Ong (2000) realizaram uma anlise comparativa de catequinas e teaflavinas de vrios tipos de
chs chineses por eletroforese capilar (EC) e cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). Os polifenis
analisados incluram a catequina, catequina galato, epicatequina, epicatequina-3-galato, epigalocatequina,
epigalocatequina-3-galato, teaflavina, teaflavina-3-monogalato, teaflavina-3-monogalato, teaflavina-3,3-
digalato. Essas substncias foram separadas por CLAE em 27 minutos, com coluna C18 e utilizando duas fases
mveis com diferentes composies de acetonitrila e cido trifluoroactico. J a separao por EC foi obtida
em menos de 10 minutos, utilizando um eletrlito consistindo de 200 mM acetonitrila-cido brico (pH 7,2),
100 mM dihidrogenofosfato de potssio (pH 4,5), contendo 20 mM de -CD (72.5:27.5, v/v); aplicando uma
voltagem de 25 kV a 30 C. A anlise por EC foi trs vezes mais rpida, no entanto, foi cinco vezes menos
sensvel do que a CLAE. Os dois mtodos foram utilizados para quantificao de polifenis em diferentes
chs, incluindo o ch verde japons, os chs Long-jin, jasmin, chrysanthemum, pu-erh, iron buddha, oolong e
224
o ceylong. Os autores concluram que ambas as tcnicas eram confiveis e compatveis com a anlise, porm
a pequena quantidade de solvente utilizada na anlise por EC minimizava o desperdcio de solvente utilizado
na CLAE, sendo considerada a EC uma ferramenta prtica e rpida na anlise rotineira de chs.
Gotti et al. (2009) avaliaram a qualidade dos extratos de chs, alm de proporcionar a diferenciao de
amostras de chs baseadas em suas origens geogrficas, variaes sazonais e processamento. Podemos
encontrar naturalmente nos chs epicatequina e epigalocatequina, no entanto, durante o processo de fabricao
envolvendo aquecimento ou condies de estocagem precrias, essas substncias podem sofrer epimerizao
para ent-catequina e ent-galocatequina, respectivamente. Assim, ent-catequina e ent-galocatequina quando
presentes atuam como marcadores das amostras de chs que foram sujeitas a tratamento trmico. A separao
por cromatografia eletrocintica micelar (MEKC) foi otimizada para as substncias mais encontradas na
composio dos chs (figura 9), sendo elas a epicatequina [(-)-EC], epicatequina galato [(-)-ECG],
epigalocatequina [(-)-EGC], cafena [CF], epigalocatequina galato [(-)-EGCG], catequina [(+)-C], ent-catequina
[(-)-C], ent-galocatequina galato [(-)-GCG], teobromina [TB], teofilina [TF], ent-galocatequina [(-)-GC],
galocatequina [(+)-GC]. Obtiveram-se limites de deteco de 0,05 g/ml para epigalocatequina, 0,4 g/ml
para ent-galocatequina, 0,7 g/ml para galocatequina, e 0,1g/ml para as demais substncias. A porcentagem
dos desvios padres relativos dos tempos de reteno para intra-dia e inter-dia foram <0,7 e <1,6,
respectivamente. Depois de validado o mtodo, foram identificadas e quantificadas as catequinas de diversos
chs provenientes de diferentes regies da China, Japo e Ceilo; o resultado foi consistente com a informao
do fornecedor com relao a qualquer tipo de tratamento trmico resultando em epimerizao. O mtodo
aplicado possibilitou a diferenciao rpida de chs com base no contedo de catequinas associado com o
processamento e armazenamento desses produtos.
FIGURA 9 | Eletroferograma CD-MEKC de mistura de padres de catequinas e
metilxantinas. Condies de separao: 25 mM borato-fosfato (pH
2,5), com SDS 90 mM e hidroxipropil--CD 25 mM. Capilar de
slica fundida (50 m id, 30 cm comprimento total, 8,5 cm
comprimento efetivo); voltagem 15 kV; temperatura 25 C;
injeo hidrodinmica a 25 mbar por 2 s; deteco 200nm.
225
Na medicina chinesa, a raiz da Scutellaria baicalensis Georgi muito utilizada como antipirtico, anti-
inflamatrio, antitumor, antibacteriano e antioxidante. Essas atividades biolgicas so atribudas aos seus
principais constituintes ativos, a baicalina e a baicalena, devendo o medicamento apresentar pelo menos 8%
de baicalina. No entanto, as razes da S. baicalensis so frequentemente confundidas com as razes da Astragalus
membranaceus Moench, devido ao seu formato e colorao. As razes da A. membranaceus so utilizadas na
medicina chinesa para tratamento de diabetes, alm de revitalizante e cicatrizante, porm o uso errneo
dessa planta pode acarretar em efeitos colaterais. Como a raiz da S. baicalensis possui a baicalina e baicalena
que no esto presentes na raiz da A. membranaceus, Chen et al. (2000) diferenciaram as duas espcies com
relao identificao dessas duas substncias por EC, aplicando deteco eletroqumica. Os analitos foram
separados em menos de 8 minutos, utilizando como eletrlito uma soluo tampo de 100 mM borato com
pH 9,0, com uma voltagem de 12 kV. O sistema apresentou uma boa estabilidade e reprodutibilidade com um
desvio padro <5% com relao ao tempo de migrao e a corrente do pico (n=7), sendo eficiente na
diferenciao das duas espcies.
ALCALOIDES
Os alcaloides pirrolizidnicos so encontrados em uma variedade de plantas, alm de serem
identificados como carcinognicos. Yu et al. (2005) demonstraram a separao de quatro alcaloides
pirrolizidnicos txicos, senquirquina, senecionina, retrorsina e senecifilina, em dois fitomedicamentos
tradicionais chineses (Qian liguang e Kuan donghua). As condies de separao otimizadas consistiam de 20
mM borato, 30 mM SDS, 20% metanol em pH 9,1. Os alcaloides foram separados em 17 minutos, apresentando
uma boa linearidade na faixa de 8,3-166,7 g/ml com coeficientes de correlao (R
2
) entre 0,9940 e 0,9988.
Os limites de deteco foram de 2,7 g/ml para senquirquina, 1,9 g/ml para senecionina, 1,20 g/ml para
retrorsina e 1,80 g/ml para senecifilina. A determinao desses alcaloides pirrolizidnicos extrados de Qian
liguang e Kuan donghua foi realizada, porm nenhum dos quatro alcaloides foram encontrados em Qian
liguang, e somente a senquirquina foi detectada em Kuan donghua com uma quantidade de 79,1 g/g de
planta.
Yuan et al. (2010) desenvolveram um mtodo para separao de alcaloides tropnicos, entre eles
atropina, anisodamina e escopolamina, por EC no aquosa acoplada com dois detectores, o detector de
eletroquimioluminescncia (ELC) e de eletroqumica. Na busca por tempos de anlise mais rpidos, foi utilizado
um capilar curto de 18 cm e uma alta voltagem de separao (20 kV), ainda assim garantindo uma boa
eficincia de separao. Os alcaloides foram separados em 4,5 minutos, com faixas de linearidade para
atropina, anisodamina, e escopolamina de 0,5-50, 5-2000, e 50-2000 M, respectivamente. Essa metodologia
foi aplicada na determinao desses alcaloides em extrato de Flos daturae, com a identificao dos picos
realizada por adio de padres a amostra, e, de acordo com a equao linear, foi encontrada a presena de
escopolamina, atropina e anisodamina na Flos daturae nas quantidades de 1,08, 0,69 e 0,20 mg/g,
respectivamente.
Na cincia forense, diversos mtodos analticos so utilizados a fim de identificar substncias presentes
em narcticos. Um bom exemplo so as drogas opioides derivadas de Papaver somniferum L. No pio j
foram reportados mais de 40 alcaloides, sendo de importncia medicinal e forense, a morfina, codena,
tebana, papaverina e narcotina. Reddy et al. (2003) descreveram uma metodologia por CZE para anlise
226
qualitativa e quantitativa dessas cinco substncias no pio (figura 10). Os alcaloides foram separados dentro
de 25 minutos, com limites de deteco de 850 ng/ml para morfina, 450 ng/ml para tebana, 500 ng/ml para
codena e narcotina e 550 ng/ml para papaverina. Analisando cinco amostras de resina de pio, as porcentagens
na composio das amostras variavam na faixa de 14,45-15,95% na morfina, 2,0-3,45% na codena, 1,32-
2,73% na tebana, 0,92-2,37% na papaverina e de 3,85-5,77% na narcotina.
FIGURA 10 | Perfil de separao por CZE de amostra de resina de pio nas
condies otimizadas. Condies eletrlito: metanol acetato
de sdio (pH 3,1) em gua (7:3; v/v), 15 kV, deteco 224 nm.
Picos: 1-tebana, 2-codena, 3-morfina, 4-papaverina, 5-narcotina.
227
Na produo de cigarros, um parmetro na qualidade o nvel de alcaloides totais encontrados,
dentre eles a nicotina, nornicotina, anatabina e anabasina. Kodama et al. (2009) apresentaram a separao
simultnea dos enntiomeros da nicotina, cotinina, nornicotina, antabasina e anabasina, empregando a CZE
com -CDs sulfatadas como seletores quirais. A metodologia utilizava um capilar com grupamentos aminos,
fazendo com que o fluxo eletro-osmtico migrasse em direo ao polo positivo. Porm, com a adio de -
CDs sulfatadas ocorria a adsoro inica dessas com os grupamentos amino da parede do capilar, invertendo
o fluxo eletro-osmtico em direo ao polo negativo. Alm disso, ocorria a formao de complexos aninicos
estveis entre ctions e -CDs sulfatadas, fazendo com que analitos catinicos migrassem como nions. Esse
sistema foi aplicado a cinco amostras de cigarro (figura 11), sendo que apenas a cotinina no foi detectada em
nenhuma das amostras. No caso da nicotina, somente a (-)-nicotina foi detectada, no entanto a nornicotina,
anatabina e anabasina tiveram seus ismeros detectados, sendo a razo do (-)-ismero para o total de ismeros
nas faixas de 58-70, 81-85 e 59-65%, respectivamente. O sistema tambm foi testado para amostra de cigarro
aps utilizado, sendo detectado somente os ismeros (-) e (+) da nicotina na razo de 96:4, mostrando que as
altas temperaturas da queima do cigarro levam a racemizao produzindo a (+)-nicotina.
FIGURA 11 | Eletroferograma de amostra de cigarro. Condies: eletrlito 30
mM tampo acetato (pH 5,0) contendo 8% -CDs sulfatadas,
voltagem de +15 kV a 30 C, deteco direta 260 nm. (-)-NC: (-)-
nicotina; (-)-NN: (-)-nornicotina; (+)-NN: (+)-nornicotina; (-)-AT: (-)-
anatabina; (+)-AT: (+)-anatabina; (-)-AB: (-)-anabasina; (+)-AB: (+)-
anabasina.
228
TERPENOIDES
A separao quiral de monoterpenos, incluindo -pineno, -pineno, canfeno e limoneno, foi
apresentado por Gahm et al. (1997) utilizando -CDs sulfatadas e -CD como seletores quirais na CZE com
polaridade reversa. Inicialmente foi utilizado somente -CDs sulfatadas e no se observou a enantioseparao
dos terpenoides, no entanto, com a adio da -CD no eletrlito contendo 6,5 mM de -CDs sulfatadas,
obtiveram-se diferenas na mobilidade dos enantimeros dos terpenoides resultando na sua separao. As
condies otimizadas foram eletrlito 10 mM fosfato (pH 3,3) contendo 6,5 mM -CDs sulfatadas e voltagem
aplicada de 20 kV, sendo a nica diferena entre as corridas a concentrao de -CD. As separaes
enantiomricas foram obtidas para -pineno (Rs=25) e -pineno (Rs=12), usando uma concentrao de 7,5
mM de -CD; para canfeno (Rs=12), utilizando 10 mM de -CD; e para o limoneno (Rs=4), com uma concentrao
de 15,1 mM de -CD. Dos quatro monoterpenos estudados, concluiu-se que o -pineno o terpenoide que
se liga mais fortemente com os seletores quirais testados, e o limoneno o que se liga mais fracamente.
A cromatografia eletrocintica com microemulso foi utilizada para analisar oito cidos fenlicos e
cinco diterpenoides por Cao et al. (2008). Foram desenvolvidos e comparados dois tipos de mtodos da
cromatografia eletrocintica com microemulso, um utilizando uma microemulso leo-gua e outro gua-
leo (figura 12). Para otimizao dos mtodos foram estudados os efeitos do tipo e concentrao de leo, da
concentrao do modificador orgnico, SDS e tampo, na separao das substncias. Comparando os dois
mtodos, a desvantagem mais aparente do mtodo gua-leo foram baixas eficincias e simetria dos picos
relativamente pobres. As resolues dos picos para gua-leo ficou entre 0,70 e 8,73, sendo muito menores
do que as dos picos para leo-gua que ficaram na faixa de 1,50 e 37,21. Alm disso, no mtodo leo-gua se
obteve uma separao mais rpida de todos os analitos em 35 minutos comparado aos 39 minutos do mtodo
gua-leo. Com base na comparao definiu-se o mtodo leo-gua como sendo o melhor, sendo esse
validado e aplicado na anlise de um tradicional medicamento chins derivado a partir das razes e rizomas
secos de Salvia miltiorrhiza Bunge, conhecido como Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhiza (RRSM). Quando
aplicada a tcnica para as amostras de RRSM, dos cinco diterpenoides validados, o nico que no foi detectado
em nenhuma das amostras foi o miltirona enquanto que os demais apresentaram quantidades de 0,10-1,01
mg/g para diidrotanshinona I, 0,39-1,70 mg/g para criptotanshinona, 0,33-1,14 mg/g para metileno
tanshiquinona, 1,75-3,30 mg/g para tanshinona IIA.
229
FIGURA 12 | Eletroferogramas de oito cidos fenlicos e cinco diterpenoides
determinados por cromatografia eletrocintica com
microemulso pelos mtodos: (A) leo-gua e (B) gua-leo.
Condies de separao: (A) 0,6% (p/v) ciclohexano, 3,0% (p/v)
SDS, 6,0% (p/v) 1-butanol, 3,0% (p/v) acetonitrila e 87,4% (v/v)
tampo tetraborato de sdio (pH 8,0); (B) 48% (p/v) 1-butanol,
18% (p/v) SDS, 8,0% (p/v) 2-propanol, e 26% (p/v) tampo acetato
de sdio (pH 8,0). Onde: EOF - fluxo eletro-osmtico, MD
droplets da microemulso, 1 aldedo protocatquico, 2 cido
rosmarnico, 3 danshensu, 4 miltirona, 5 cido salvianlico C,
6 cido cafeico, 7 cido litosprmico, 8 cido salvianlico B,
9 cido protocatquico, 10 diidrotanshinona I, 11
criptotanshinona, 12 metileno tanshiquinona, 13 tanshinona
IIA.
Cheung et al. (2008) desenvolveram uma metodologia em eletroforese capilar de zona com adio
de CDs para separao de triterpenos, flavonoides e substncias fenlicas. Oito substncias, sendo trs
triterpenos (cido urslico, cido oleanlico, cido betunlico), trs cidos fenlicos (cido rosmarnico, cido
p-cumrico, cido cafeico) e dois flavonoides (quercetina e rutina), foram separadas dentro de 20 minutos
(figura 13). Os coeficientes de correlao das curvas de calibrao dos analitos foram todos maiores que
0,998, observando limites de deteco e quantificao para os trs triterpenos em 2,65 e 8,85 g/ml,
respectivamente. As recuperaes foram de 96,8 a 103,6%. A metodologia foi aplicada na determinao
dessas substncias em amostras de Prunella vulgaris L. e em bebidas derivadas dessa planta, sendo detectado
o cido rosmarnico e os trs triterpenos (cidos urslico, oleanlico e betunlico) nas amostras de P. vulgaris
e somente o cido rosmarnico nas bebidas.
230
FIGURA 13 | Eletroferograma dos padres. Condies: 40 mM tetraborato de
sdio (pH 9,4), 2 mM -CD, 4% (v/v) MeOH, 25 kV a 25 C, 210
nm. Picos: 1 - cido oleanlico, 2 cido urslico, 3 cido
betunlico, 4 rutina, 5 quercetina, 6 cido p-cumrico, 7
cido rosmarnico, 8 cido cafeico, IS padro interno.
CIDOS FENLICOS
Um mtodo, utilizando a isotacoforese e a eletroforese capilar de zona acoplados, foi desenvolvido
por Safra et al. (2007) para separao e determinao de cinco cidos fenlicos (rosmarnico, p-cumrico,
ferlico, cafeico e clorognico) e do flavonoide quercetrina em extrato metanlico de Melissa herba. Essa
tcnica de acoplamento de duas tcnicas de eletroforese capilar vantajosa, pois pode melhorar a eficincia
de separao e reduzir os limites de deteco devido ao efeito concentrador de solutos, proporcionada pela
tcnica de isotacoforese, podendo-se injetar grandes quantidades de amostras diludas. Posteriormente, as
amostras concentradas so direcionadas ao capilar da eletroforese capilar de zona, onde os analitos sero
melhor separados. As condies otimizadas para a isotacoforese foram eletrlito lder com 10 mM HCl, 0,2%
hidroxietilcelulose (pH 7,2) e eletrlito terminal constitudo por 50 mM H
3
BO
3
(pH 8,2), ambos eletrlitos com
20% de metanol. J as condies para a eletroforese capilar de zona foram eletrlito 25 mM cido 3-(N-
morfolino)-2-hidroxipropanosulfnico (MOPSO), 50 mM Tris, 40 mM H
3
BO
3
, 0,2% hidroxietilcelulose (pH 8,1).
Os analitos foram separados dentro de 34 minutos, apresentando limites de deteco entre 0,018 e 0,035 g/
ml. Essa metodologia foi utilizada na anlise dos constituintes do extrato de Melissa herba detectando,
quantidades 43,54 mg/g de cido rosmarnico, 3,70 mg/g de cido ferlico, 1,65 mg/g de cido cafeico, 1,25
mg/g de quercitrina, 1,0 mg/g de cido p-cumrico, 0,30 mg/g de cido clorognico.
231
Andrade et al. (2001) compararam a CZE com a CLAE com relao anlise de substncias fenlicas em
vinhos. A anlise por EC foi realizada utilizando um eletrlito constitudo de 100 mM borato de sdio (pH 9,5),
com uma voltagem aplicada de 20 kV e deteco 280 nm. Enquanto que para anlise por CLAE utilizou-se uma
coluna de fase reversa ODS-Hypersyl (20 x 2,1 mm, tamanho da partcula 5 m), fase mvel gradiente composta
por gua acidificada (5% cido frmico) e metanol, com fluxo de 0,3 mL/min e deteco 280 nm. Foram
testadas diversas amostras de vinhos Albarinho (espanhol), Alvarinho (portugus) e Loureiro (portugus), sendo
que todos apresentaram um perfil qualitativo semelhante, porm apresentaram diferentes perfis quantitativos,
dependendo da variedade da uva. As principais substncias fenlicas detectadas e identificadas foram tirosol,
epicatequina, cido sirngico, cido ferlico, cido p-cumrico, cido cafeico, cido glico, cido 3,4-
diidroxibenzico, cido tartrico cis-cumaroil, cido tartrico trans-cumaroil, cido tartrico cafeoil. Pela
comparao das metodologias, a eletroforese capilar provou ser mais conveniente para anlise rotineira desses
vinhos, devido a melhor separao das diferentes substncias, melhores formatos dos picos e menor tempo de
anlise que a CLAE (figuras 14 e 15).
FIGURA 14 | Perfil das substncias fenlicas de amostra de vinho Alvarinho por
eletroforese capilar. Picos: 1 tirosol, 2 epicatequina, 3 cido
sirngico, 4 cido ferlico, 5 cido p-cumrico, 6 cido
cafeico, 7 cido glico, 8 cido 3,4-diidroxibenzico, 9 cido
tartrico cis-cumariol, 10 - cido tartrico trans-cumariol, 11 -
cido tartrico cafeoil; a, b, c steres hidroxicinmicos.
232
FIGURA 15 | Perfil das substncias fenlicas de amostra de vinho Alvarinho por
CLAE. Picos como figura anterior.
QUINONAS
Glatz et al. (2000) apresentaram uma metodologia por eletroforese capilar de zona para separao da
quinona pirroloquinolnica (PQQ - cido 4,5-diidro-4,5-dioxi-1H-pirrolo[2,3-f ]quinolina-2,7,9-tricarboxlico).
As condies de separaes foram otimizadas com relao a diferentes parmetros incluindo pH e fora
inica do eletrlito de corrida, voltagem de separao e temperatura do capilar, obtendo-se a melhor separao,
utilizando um eletrlito constitudo de 50 mM -alanina-HCl (pH 3,0), com uma voltagem aplicada de 25 kV
a 25 C. Por essa metodologia obtiveram-se baixos limites de deteco na faixa de 0,1-0,2 M, devido as altas
eficincias de separao (N=164000). Foram analisadas amostras contendo meio de cultura de bactrias
Paracoccus denitrificans em metanol em busca de PQQ, alm disso, foram estudadas as reaes da PQQ com
os aminocidos glicina e valina. A reao da PQQ com a glicina resultou em oxazole 1, j na reao da PQQ
com valina foi gerado oxazole 2 e um pouco de PQQ que no reagiu.
Koyama et al. (2007) analisaram 11 antraquinonas do ruibarbo, entre elas emodina, crisofanol, rena,
aloe-emodina, emodina-1--D-glicosdeo, emodina-8--D-glicosdeo, crisofanol-1--D-glicosdeo, crisofanol-
8--D-glicosdeo, rena-8--D-glicosdeo, senosdeo A e senosdeo B, utilizando e comparando duas
metodologias, a CLAE e a eletroforese capilar (EC). Os limites de deteco para as antraquinonas do ruibarbo
foram entre 0,02-0,2 g/ml e 0,1-0,8 g/ml para CLAE e EC, respectivamente. Pelos dois mtodos foi possvel
separar oito das onze antraquinonas dentro de 25 minutos, delas a emodina, crisofanol, rena, aloe-emodina,
emodina-1--D-glicosdeo, emodina-8--D-glicosdeo, crisofanol-1--D-glicosdeo e crisofanol-8--D-
glicosdeo, sendo que rena-8--D-glicosdeo, senosdeo A e senosdeo B foram bem separados somente
pela eletroforese capilar. Os desvios padres relativos obtidos para reprodutibilidade com relao ao tempo
de migrao ficaram nas faixas de 0,05-5,44 e 0,90-1,99% para CLAE e EC, respectivamente. Posterior
otimizao de ambas metodologias, essas foram aplicadas ao extrato de ruibarbo, conseguindo-se identificar
as antraquinonas.
233
FIGURA 16 | (A) Cromatograma de antraquinonas por CLAE do extrato de
ruibarbo, eluente: gradiente de acetonitrila/gua, fluxo de 1,0 mL/
min, temperatura da coluna de 60 C. (B) Eletroferograma de
antraquinonas por CE do extrato de ruibarbo, eletrlito: 30 mM borato
(pH 10,0) contendo 25% (v/v) de acetonitrila com 2 mM de 2,6-di-O-
metil- -CD e 5 mM de -CD, com voltagem aplicada de 20 kV a 20
C. Picos: 1 - emodina, 2 - crisofanol, 3 - aloe-emodina, 4 - rena, 5 -
emodina-1--D-glicosdeo, 6 - emodina-8--D-glicosdeo, 7 -
crisofanol-1--D-glicosdeo, 8 - crisofanol-8--D-glicosdeo, 9 - rena-
8--D-glicosdeo, 10 - senosdeo A, 11 - senosdeo B.
CUMARINAS
A determinao simultnea de cumarinas foi descrita por Wang et al. (2007) utilizando a CZE com
deteco indireta de fluorescncia induzida por laser. Nesse trabalho foram separados a esculetina, isofraxidina,
genistena, naringina e soforicosdeo, em menos de cinco minutos com um eletrlito de 5,0 mM borato (pH
9,4), 20% (v/v) metanol, 10
-7
fluorescena de sdio, essa atuando como fluorforo de fundo para deteco
indireta. Essa metodologia foi aplicada para anlise de diversas cumarinas de amostras de Fructus sophorae
japonicae e Herb sarcandrae, porm algumas substncias no puderam ser bem separadas devido a
234
complexidade dos componentes da amostra, muitas vezes coexistindo com outras substncias desconhecidas.
No extrato de Fructus sophorae japonicae foi quantificado o soforicosdeo apresentando 87,2 mg/g, j no
extrato de Herb sarcandrae foi possvel quantificar 3 cumarinas, sendo elas a esculina, isofraxidina e esculetina,
nas quantidades de 1,06, 1,43 e 1,66 mg/g, respectivamente.
A eletrocromatografia capilar foi utilizada na anlise de extratos de camomila (Chamomilla recutita
(L.) Rauschert) por Fonseca et al. (2007). Em menos de 7,5 minutos, 11 substncias fenlicas foram bem
separadas (figura 18), sendo elas: cumarinas (herniarina, umbeliferona), fenilpropanoides (cido clorognico,
cido cafeico) e flavonoides (apigenina, apigenina-7-O-glucosdeo, luteolina, luteolina-7-O-glucosdeo,
quercetina, rutina e naringenina). A metodologia foi aplicada a diversos extratos de camomila (metanlico,
etanlico e gliclico) e todos apresentaram o mesmo perfil, sendo capaz de se identificar os cidos cafeico e
clorognico, apigenina, quercetina, umbeliferona e herniarina; as demais substncias no puderam ser
identificadas devido a baixa intensidade dos picos.
FIGURA 17 | Cromatograma capilar de substncias fenlicas padres da
camomila por eletrocromatografia capilar SCX-C18. Condies:
coluna SCX/C18, 50 m i.d., partcula de 3 m; injeo de 12 bar/
0,4 min; voltagem aplicada de 25 kV, temperatura de 25 C,
deteco 337 nm. Picos: 1 - herniarina, 2 - umbeliferona, 3 -
cido cafeico, 4 cido clorognico, 5 - apigenina, 6 - apigenina-
7-O-glucosdeo, 7 - luteolina, 8 - luteolina-7-O-glucosdeo, 9 -
quercetina, 10 - rutina e 11 naringenina.
A seguir sero apresentadas tabelas em formato de guia resumido, referentes s classes de metablitos
secundrios citadas no capitulo.
235
FLAVONOIDES
Continua
MODO ELETRLITO VOLT SUBSTNCIAS PLANTA AUTOR
CZE 100 mM borato (pH 9.0) 12 baicalina, baicalena
Scutellaria
baicalensis Georgi
Chen et al.
(2000)
MEKC
50 mM borato (pH 9.3),
100 mM SDS
25 rutina
Fagopyrum
esculentum Moench
Kreft et al.
(1999)
MEKC
20 mM borato (pH 8.5),
48 mM SDS, 1 mM
1,3-diaminopropano
20 glicosdeos de flavonoides Epimedium sp.
Liang et al.
(1996)
CZE
100 mM cido brico
(pH 9.5)
20
canferol-3-rutinosdeo,
rutina, avicularina,
quercitrina, isoquercitrina,
isoramnetina, canferol,
quercetina
mistura de padres
Simn et al.
(1995)
MEKC
50 nM fosfato, 50 mM
borato (pH 7.5),
42 mM SDS
NC
quercetina, morina, crisina,
hesperetina, naringenina,
turina, naringina
mistura de padres Ng et al. (1992)
CZE
200 mM cido brico
(pH 7.2), 10 mM
dihidrogenofosfato de
potssio (pH 4.2),
4.5 mM b-CD,
27.5 % (v/v) ACN
25 polifenis do ch
ch verde e ch
preto
Lee et al. (2000)
CZE
25 mM borato (pH 10.0),
10 % (v/v) MeOH, 2 mM
hidroxipropil-b-CD,
20 mM
hidroxipropil-y-CD
30 vestitona, medicarpina
Medicago sativa L.,
Arachis hypogaea L.
Allen et al.
(2000)
CZE
30 mM borato,
10 % ACN
25 icariina Herba epimedii
Chai et al.
(1999)
CZE
30 mM fosfato de sdio
dihidrogenado, 30 mM
fosfato de dissdio
hidrogenado (pH 8.85)
30
quercitrina, rutina,
quercetina, miricetina,
flavona, catequina,
epictequina, c. ferlico, c.
cafeico, c. clorognico
Eucommia ulmoides
Oliv., vinho tinto
Kulomaa et al.
(1997)
MEKC
200 mM cido brico
(pH 8.5), 50 mM SDS
20,9
agliconas de flavonoides
do mel
mistura de padres
Delgado et al.
(1994)
MEKC
10 mM cido brico, 10
mM tetraborato de sdio,
20 mM SDS,
15 % MeOH (pH 9.2)
20 quercetina
ma, couve-flor,
repolho
Dadkov et al.
(2001)
CZE
60 mM tetraoborato de
sdio (pH 9.2), 1,2 %
HP-y-CD, 5 % ACN
30
enantimeros de eriodictiol,
diasteremeros de
eriodictiol-7-O-b-D-
glucopiranosdeo
Balanophora
involucrata Hook.
Pan et al. (2008)
CEC
20 mM Tris-HCl (pH 6.5),
ACN, H
2
O (10:40:50)/
slica C18 3 um
25
epicatequina, miricetina,
quercetina, naringenina,
hesperetina
mistura de padres
Stggl et al.
(2006)
m
236
CZE
50 mM borato (pH 10.0),
22 % ACN
15
icariina, epimedina A,
epimedina B, epimedina C
Epimedium sp. Liu et al. (2006)
MEKC
100 mM cido brico,
100 mM KCl, 100 mM
NaOH (pH 8.3), SDS,
HS-Ciclosoforaoses
15/20
enntiomeros de catequina,
isosakuranetina e
neohesperidina
mistura de padres
Park et al.
(2005)
CZE
modo normal: 5 mM
cromato, 0.001 % HDB
(pH 9.5)/ modo inverso:
3 mM cromato
30
6-hidroxiflavona, biochanina
A, hesperetina, naringenina
mistura de padres
Bachmann et al.
(2007)
CZE
20 mM NaH
2
PO
4
-
Na
2
HPO
4
(pH 8.0),
10 % ACN, 6 % MeOH
25
rutina, canferol, quercetina,
miricetina, apigenina
Centella asiatica (L.)
Urb., Rosa hybrids,
Chromolaena
odorata (L.) R.M.
King & H. Rob.
Suntornsuk et al.
(2005)
MEKC
98.2% v/v 10 mM
Na
2
B
4
O
7
-20 mM H
3
BO
3
(pH 7.5),0.9% (w/v, 30
mM) SDS, 0.9% (w/v, 21
mM) SC, 0.9% (w/v, 121
mM) butan-1-ol, 0.6%
(w/v, 68 mM) acetato de
etila
9
puerarina, catequina,
epicatequina, liquiritina,
rutina, baicaleina,
hiperosdeo, quercitrina,
naringina, naringenina,
luteolina, silimarina,
alpinetina, wogonina
Saururus chinensis
(Lour.) Baill.
Yu et al. (2008)
CITP-CZE
CITP - lder: 10 mM HCl,
0.2 % hidroxietilcelulose
(pH 7.2), terminal: 50 mM
H
3
BO
3
(pH 8.2), CZE -
25mM MOPSO, 50mM
Tris, 40mM H
3
BO
3
, 0.2%
HEC, 20% (v/v) MeOH
(pH 8.1)
20 quercetina Melissa offcinalis L.
Safra et al.
(2007)
MEKC
10 mM fosfato de sdio
dihidrogenado, 5 mM
borato de sdio, 90 mM
SDS, 10 % ACN (pH 7.3)
16
naringenina, icariina,
tilirosdeo, icariina II,
epicatequina, icarisosideo
A, catequina, quercetina,
canferol-3-O-ramnosideo,
hesperidina
mistura de padres
Wang et al.
(2004)
CZE
40 mM tetraborato de
sdio (pH 9.4), 2 mM
b-CD, 4 % MeOH
25 rutina, quercetina Prunella vulgaris L.
Cheung et al.
(2008)
CZE
32 mM tetraborato de
sdio (pH 9.2), 4.5 mM
SDS
15
flavanona,
2'-hidroxiflavanona,
4'-hidroxiflavanona,
6-hidroxiflavanona,
7-hidroxiflavanona,
pinocembrina, naringenina,
eriodictiol, taxifolina
prpolis
Wang et al.
(2007)
CITP-CZE
CITP - lder: 10 mM HCl
(pH 7.2), Tris; terminal: 50
mM c. brico (pH 8.2).
CZE - 25 mM MOPSO,
50 mM Tris, 15 mM c.
brico, 5 mM b-CD
(pH 8.5)
27
quercitrina, rutina,
epicatequina, canferol,
catequina, quercetina,
miricetina
vinho tinto
Hamoudov et
al. (2004)
MEKC
20 mM fosfato (pH 2.5),
50 mM SDS, 15 % ACN,
5 % THF
22
agliconas de flavonoides,
glicosdeos de flavonoides
Azadirachta indica
A. Juss.
Tonin et al.
(2005)
Continua
237
CZE
30 mM tetraborato de
sdio (pH 9.0)
15
pinocembrina, acacetina,
crisina, rutina, naringenina,
galangina, luteolina,
canferol, apigenina,
miricetina, quercetina
prpolis Volpi (2004)
MEEKC
5 mM tetraborato de
sdio (pH 9.0), 0,6 %
heptano, 3.0 % SDS,
6.0 % 1-butanol,
nanotubos de carbono
25
calicosina-7-O-b-D-
glucosdeo, calicosina,
formononetina
Salvia miltiorhiza
Bunge
Cao et al. (2010)
CITP-CZE
CITP - lder: 10 mM HCl
(pH 7.2), Tris, 20 %
CH
3
OH; terminal: 50 mM
H
3
BO
3
(pH 8.2), 20 %
CH
3
OH. CZE - 25 mM
MOPS, 50 mM Tris, 55
mM H
3
BO
3
(pH 8.36)
27 quercetina, isoramnetina mistura de padres Ma et al. (2006)
CZE
25 mM tetraborato
dissdio (pH 9.4)
18
flavona, resveratrol,
catequina, quercetina,
miricetina
Myrica gale L.,
Hippophae
rhamnoides L.,
Rosa majalis
Herrm., Reynoutria
japonica Houtt.
Vaher et al.
(2003)
CEC
50 mM fosfato (pH 2.8),
50 % ACN, coluna
C18/Hypersil SCX
25
apigenina, apigenina-7-O-
glucosdeo, luteolina,
luteolina-7-O-glucosdeo,
quercetina, rutina,
naringenina
Chamomilla recutita
(L.) Rauschert
Fonseca et al.
(2007)
MEKC
25 mM fosfato, 100 mM
SDS, 6% MeOH (pH 7.0)
14
teanina, epicatequina,
catequina,
epigalocatequina,
epicatequina galato,
epigalocatequina galato
Camellia sinensis
(L.) Kuntze
Aucamp et al.
(2000)
CZE
25 mM carbonato de
amnia (pH 9.0)
30 luteolina, apigenina
leo de oliva virgem
Olea europaea L.
Carrasco-
Pancorbo et al.
(2007)
MEKC
50 mM cido actico,
acetato de sdio
(pH 5.0), 100 mM SDS
10
catequina, epicatequina,
procianidina B1,
procianidina B2,
procianidina B3
lentilha, feijo
branco, feijo preto
Cifuentes et al.
(2001)
CZE
20 mM borato (pH 9.5),
CDs como seletores
quirais
20
prunina, narirutina,
naringina, hesperidina,
neohesperidina, didimina,
eriocitrina, neoeriocitrina
Citrus sp.
Gel-Moreto et al.
(2003)
CZE
20 mM borato (pH10.0),
5 mM y-CD
30
prunina, narirutina,
naringina, hesperidina,
neohesperidina, eriocitrina
Citrus limon (L.)
Osbeck
Gel-Moreto et al.
(2001)
MEKC
25 mM fosfato-borato
(pH 2.5), 90 mM SDS, 25
mM hidroxipropil-b-CD
15
catequina, ent-catequina,
epicatequina, epicatequina
galato, epigalocatequina,
epigalocatequina galato,
ent-galocatequina,
galocatequina,
ent-galocatequina galato,
cafena, teofilina,
teobromina
Chs
Gotti et al.
(2009)
Continua
238 MEEKC
2.89% SDS,
1.36% heptano,
7.66% ciclohexanol,
2% ACN (w/v) (pH 2.0)
20
catequina, epicatequina,
galocatequina,
epigalocatequina,
epicatequina galato,
epigalocatequina galato
folhas de ch, chs
prontos, uvas,
mas, vinhos
Huang et al.
(2005)
CZE
100 mM borato (pH 8.5),
12mM 2-hidroxipropil-y-
CD
18
catequina, ent-catequina,
ent-epicatequina,
epicatequina
suco de ma,
sementes de
guaran
Kofink et al.
(2007)
CZE
200 mM cido brico
(pH 8.6)
30
genistena, genistina,
daidzena, daidzina, 2'-
hidroxigenistena, luteona,
lupinalbina A, pisatina
protenas da soja,
ervilha e tremoo
Mellenthin et al.
(1999)
MEKC
80 mM fosfato (pH 7.0),
120 mM SDS,
10 mM b-CD
22
catequina, galocatequina,
epicatequina-(4b->2)-
floroglucinol,
epigalocatequina-(4b->2)-
floroglucinol, galocatequina-
(4a->2)-floroglucinol,
epigalocatequina-3-O-
galato-(4b->2)-floroglucinol,
catequina-(4a->2)-
floroglucinol
Cistus albidus L.
Qa'dan et al.
(2006)
CITP-CZE
CITP - lder: 10 mM HCl
(pH 7.2), Tris, 0.2 %
HEC; terminal: 50 mM
H
3
BO
3
(pH 8.2). CZE - 25
mM MOPS, 50 mM Tris,
10 mM H
3
BO
3
(pH 9.0)
NC
rutina, hiperosdeo,
quercetina, isoquercitrina,
vitexina, vitexina-2-O''-
ramnoglucosdeo
Sambucus nigra L.,
Crataegus sp.
Urbnek et al.
(2002)
CZE
50 mM fosfato (pH 7.0),
30% ACN
25
luteolina-7-glicosdeo,
luteolina
Lycopus europaeus
L.
Wojciechowski
et al. (1995)
NC / Nada Consta
239
ALCALOIDES
MODO ELETRLITO VOLT CLASSE SUBSTNCIAS PLANTA AUTOR
NACE
25 mM acetato de
amnia, 1M c.
acti co em ACN
25
alcaloides
tropanos
hiosciamina,
escopolamina, litorina
Datura candida
(Pers.) Saff.,
Datura aurea
(Lagerh.) Saff.
Cherkaoui
et al .
(1999)
CZE
40 mM acetato de
amnia (pH 8.5)
20
alcaloides
tropanos
hiosciamina,
escopolamina
Datura candida
(Pers.) Saff.,
Datura aurea
(Lagerh.) Saff.,
Belladonna Mil l.
Mateus et
al. (1999)
CZE
100 mM fosfato-Tris
(pH 7.0)
30
alcaloides
tropanos
atropi na, hiosciamina,
escopolamina, litorina
Datura candida
(Pers.) Saff.,
Datura aurea
(Lagerh.) Saff.,
Datura querci folia
Kunth, Hyoscyamus
albus L.
Mateus et
al. (1998)
NACE
75 mM acetato de
sdio em MeOH,
1M c. acti co
25
alcaloides
quaternrios
berberina Rhizoma copti dis
Ji et al.
(1999)
NACE
50 mM acetato de
amnia, 10 %
tetrahidrofurano,
0.5 % c. acti co em
MeOH
30
alcaloides
qui nolizidnicos
matrina, sofocarpina,
oxi matrina,
oxi sofocarpina,
sofori di na, citi sina,
soforamina,
aloperina, lehmanni na,
dauricina
Sophora flavescens
Ai t. (Kushen),
S. alopecuroi des L.
(Kudouzi or
Kugancao),
S. tonki nensis
Gapnep
(Shandougen)
Song et al.
(1999)
CZE
50 mM fosfato
(pH 4.5 - 8.0), CDs
10
alcaloides
tropanos
atropi na, homatropi na,
ipratropium,
escopolami na,
butiscopolamina
mistura de padres
Wedig et al .
(1999)
HPCE
100 mM fosfato
(pH 7.0) em MeOH
(2:1)
30
alcaloides
quaternrios
berberina, palmati na,
jatrorrhi zina
Mahonia sp.
Ji et al.
(2000)
CZE
50 mM fosfato-Tri s
(pH 2.5), 50 % ACN
alcaloides
quaternrios
sangui nari na,
cheleri tri na
Macleaya cordata
(Willd.) R. Br.,
Dicranostigma
lactucoides Hook. F.
& Thomson
Sevci k et al .
(2000)
CZE
100 mM ci trato de
sdio (pH 2.7)
12
alcaloides
quaternrios
berberina,
isoguanosi na
Croton tigl ium L.
Liebich et
al. (1998)
CZE
25 mM borato (pH
9.3), 0.005 M b-CD
18
alcaloides
opioides
morfina, 6-
monoacetilmorfi na,
herona
mistura de padres
Gong et al.
(1999)
NACE--
ACE
EC no-aquoso:
ACN-MeOH (25:75),
25 mM acetato de
amnio, 1 M c.
Actico. EC aquoso:
0.05 M 6-ACA
(pH 4.0), 30 mM
DM-b-CD
30
alcaloides
opiides
morfina soluo de padro
Bjornsdottir
et al. (1997)
Continua
240
NACE
25 mM acetato de
amnia,
1M c. actico
25
alcaloides
opiides
morfina, codena,
tebana, noscapina,
papaverina
pio
Bjornsdottir
et al. (1995)
CZE
25 mM fosfato
(pH 2.5)
10
alcaloides do
tabaco
nicotina tabaco
Ralapati
(1997)
MEKC
6 mM fosfato de
sdio, 10 mM borato
de sdio, 100 mM
SDS (pH 9.5)
30
alcaloides do
tabaco
nicotina, nornicotina,
miosmina, anatabina,
anabasina
tabaco
Yang et al.
(1996)
CZE
120 mM fosfato
(pH 2.7)
18
alcaloides do
tabaco
nicotina, nornicotina,
anatabina
tabaco
Yang et al.
(1995)
MEKC
20 mM borato
(pH 9.0), 50 mM
SDS, 0.6 M uria,
15 % ACN
25
alcaloides b-
carbonlicos
harmana, norharmana,
harmina, harmalina,
harmol, harmalol
mistura de padres
Cheng et al.
(1997)
CZE
100 mM acetato de
amnia (pH 3.1),
ACN (1:1)
15
diversas
variedades de
alcalides
alcaloides indlicos,
protoberberinas,
benzofenantridinas,
alcaloides
b-carbonlicos,
isoquinolinas
mistura de padres
Unger et al.
(1997)
NACE
ACN-MeOH (9:1), 60
mM acetato de
amnia, 2.2 M c.
actico
30
alcaloides
isoquinolnicos
protopina, criptopina,
coridamina, adlumina,
hidrastina, corlumina,
fumaroficina,
metilfumaroficina,
parfumina, sinactina
Fumaria officinalis
L.
Sturm et al.
(2006)
NACE
40 mM acetato de
amnia, 0.1 % c.
actico em MeOH
15
alcaloides
txicos
icajina, atropina,
novacina, estriquinina,
brucina
Strychnos pierriana
A.W. Hill, Aconitum
L.
Feng et al.
(2003)
NACE
40 mM acetato de
amnia, 0.1 % c.
actico em 80 %
MeOH
15
alcaloides
txicos
aconitina,
hipaconitina,
mesaconitina,
estriquinina, brucina
Aconitum L.,
Strychnos pierriana
A.W. Hill
Feng et al.
(2002)
NACE
50 mM acetato de
amnia (pH 6.8) em
gua e ACN (50:50)
25
diversas
variedades de
alcaloides
Berberina, palmatina,
jatrorhizina,
columbamina,
epiberberina,
coptisina,
tetradehidro-
escoulerina,
tetrahidroqueilana-
tifolinium
Rhizoma coptidis
Chen et al.
(2008)
MEKC
20 mM citrato
(pH 3.5)
15
alcaloides
opiides
morfina, tebana, 10-
hidroxitebana,
codena, oripavina,
laudanina
mistura de padres
Zakaria et
al. (2003)
NACE
2.5 mM TBAP, 1M
Hac, 20 mM NaAc
em ACN e
2-propanol
20
alcaloides
tropanos
atropina,
anisodamina,
escopolamina
Flos daturae
Yuan et al.
(2009)
Continua
241
NACE
MeOH-ACN (1:1), 25
mM Tris + CH
4
SO
3
(pH 2.28)
25
alcaloides
tropanos e
quaternrios
berberina,
jateorrizaina,
pilocarpina, atropina
mistura de padres
Xu et al.
(2004)
CZE
100 mM Tris,
140 mM H
3
PO
4
,
20 mM y-CD
12
alcaloides do
ergot
enantimeros da
lisurida
mistura de padres
Kvasnicka
et al. (2005)
CZE
100 mM MeOH,
NaAc (pH 3.1) (7:3)
15
alcaloides
opioides
tebana, codena,
morfina, papaverina,
narcotina
Papaver
somniferum Lynn.
Reddy et al.
(2003)
NACE
50 mM NaAc, 1M
HAc, 10 % MeOH em
ACN
30 NC
2'-hidroxiestemofolina,
protostemonina,
oxistemoquerrina,
tuberostemonina,
estemofolina
Stemona sp.
Sturm et al.
(2008)
MEKC
15 mM NH
4
OAc,
35 mM poli-L-SUCL,
30 % ACN (pH 6.0)
30 Protoalcaloides
efedrina,
pseudoefedrina,
norefedrina,
norpseudoefedrina,
N-metilefedrina, N-
metilpseudoefedrina
Ephedra sinica
Stapf
Hou et al.
(2007)
MEKC
30 mM c. fosfrico,
75 mM SDS, 10 mM
dietilamina, ACN
(3:1) (pH 2.02)
25 Protoalcaloides
efedrina,
pseudoefedrina,
norefedrina,
norpseudoefedrina, N-
metilefedrina, N-
metilpseudoefedrina
Ephedrae herba
Chiang et
al. (2004)
MEEKC
18 mM colato de
sdio, 2.4 % butan-1-
ol, 0.6 % acetato de
etila, 10 % MeOH, 87
% 5 mM Na
2
B
4
O
7
+
10 mM NaH
2
PO
4
(pH 7.5)
20
alcaloides
isoquinolnicos
berberina, palmatina,
jatrorrizina,
sinomenina,
homoharringtonina
mistura de padres,
amostra de urina
Yu et al.
(2009)
NACE
MeOH, EtOH, ACN
(50:35:15), 80 mM
c. frmico, 20 mM
c actico, 30 mM
formato de amnio
30
alcaloides
quinolnicos
quinina,
quinidina,diidroquinin-
a, diidroquinidina,
cinchonina,
cinchonidina,
diidrocinchonina,
diidrocinchonidina
Cinchona L.
Buchberger
et al. (2010)
CZE
30 mM acetato
(pH 5.0), 8 %
b-CD sulfatada
15
alcaloides do
tabaco
nicotina, cotinina,
nornicotina,
anatabina, anabasina
cigarro
Kodama et
al. (2009)
MEEKC
90.6 % 10 mM
tetraborato de sdio,
2.0 % SDS, 6.6 % 1-
butanol, 0.8 % octano
15
alcaloides
tropanos
atropina,
escopolamina,
ipratropium,
homatropina
mistura de padres
Bitar et al.
(2007)
NACE
50 mM formato de
amnio, ACN, MeOH
(1:1) (pH 4.0)
20
alcaloides do
tabaco
nornicotina,
anabasina, nicotina,
miosmina, cotinina
mistura de padres
Chiu et al.
(2007)
MEKC
20 mM borato, 30
mM SDS, 20 %
MeOH (pH 9.1)
20
alcaloides
pirrolizidnicos
senquirquina,
senecionina,
retrorsina, senecifilina
Qian linguang,
Kuan donghua
Yu et al.
(2005)
MEKC
25 mM fosfato,
100 mM SDS,
6% MeOH (pH 7.0)
14
alcaloides
purnicos
cafena
Camellia sinensis
(L.) Kuntze
Aucamp et
al. (2000)
Continua
242
MEKC
20 mM tetraborato de
sdio, 70 mM SDS
(pH 9.3)
20
alcaloides
purnicos
cafena, teobromina,
teofilina
guaran e erva-
mate
Moraes et
al. (2003)
CZE
20 mM tetraborato de
sdio (pH 9.2)
25
alcaloides
purnicos
cafena, teobromina,
teofilina
Paulinia cupana
Mart.
Sombra et
al. (2005)
CEC
3 mM soluo de
Na
2
HPO
4
- c. ctrico
em ACN (60:40, v/v)
(pH 4.0), coluna C18
10
alcaloides
quaternrios
berberina, palmatina,
oatrorizina,
magnoflorina,
felodendrina,
candicina,
menisperina
Phellodendron
amurense Rupr.
Yang et al.
(2010)
MODO ELETRLITO VOLT CLASSE SUBSTNCIAS PLANTA AUTOR
CZE
10 mM fosfato
(pH 3.3), 6.5 mM
b-CD sulfatada
20 monoterpenos
a-pineno, b-pineno,
canfeno, limoneno
mistura de
padres
Gahm et al.
(1997)
MEKC
40 mM fosfato
dihidrogenado de
sdio, 20 mM
borato dissdio,
20 mM SDS, 5 %
MeOH (pH 9.4)
20 triterpenos
2-deoxiecdisona, 2-dexi-
20-hidroxiecdisona,
20-hidrxiecdisona
Silene otites
Large et al.
(1992)
MEKC
20 mM Li
2
B
4
O
7
,
(pH 6.0), 35 mM
SDS, 7 M uria
30 triterpenos
digoxina, deslanosdeo,
acetildigoxina,
acetildigitoxina
mistura de
padres
Debusschere
et al. (1997)
CZE
40 mM tetraborato
de sdio (pH 9.4),
2 mM b-CD,
4 % MeOH
25 triterpenos
c. betulnico,
c. urslico,
c. oleanlico
Prunella vulgaris
L.
Cheung et al.
(2008)
MEEKC
0.6% ciclohexano,
3.0% SDS, 6.0%
1-butanol, e 3.0%
ACN pH 8.0
30 diterpenoides
miltirona,
diidrotanshinona I,
criptotanshinona, metileno
tanshiquinona,
tanshinona IIA
Salvia miltiorhiza
Bunge
Cao et al.
(2008)
TERPENOIDES
NC / Nada Consta
243
MODO ELETRLITO VOLT SUBSTNCIAS PLANTA AUTOR
CITP-CZE
CITP - lder: 10 mM HCl,
0.2 % hidroxietilcelulose
(pH 7.2), terminal:
50 mM H
3
BO
3
(pH 8.2),
CZE - 25 mM MOPSO,
50 mM Tris, 40 mM H
3
BO
3
,
0.2 % HEC, 20 % MeOH
(pH 8.1)
20
c. rosmarnico,
c. p-cumrico, c. ferlico,
c. cafeico, c. clorognico
Melissa offcinalis L.
Safra et al.
(2007)
CITP-CZE
CITP - lder: 10 mM HCl, Tris
(pH 7.2), terminal: 50 mM
H
3
BO
3
(pH 8.2),
CZE - 25 mM MOPSO,
50 mM Tris, 15 mM H
3
BO
3
,
5 mM b-CD (pH 8.5)
NC
c. protocatquico, c. glico,
c. cafeico, c. vanilnico, c.
sirngico, c. ferlico, c. p-
cumrico
vinho tinto
Hamoudov-
et al.
(2004)
CZE
30 mM tetraborato de sdio
(pH 9.0)
15 c. cinmico, c. cafeico prpolis
Volpi
(2004)
MEEKC
5 mM tetraborato de sdio
(pH 9.0), 0.6 % heptano, 3.0
% SDS, 6.0 % 1-butanol,
nanotubos de carbono
25
c. rosmarnico, c.
salvianlico, c. litosprmico,
c. cafeico, c. protocatquico
Salvia miltiorhiza
Bunge
Cao et al.
(2010)
NACE
40 mM Tris-c. actico
(pH 7.9)
25
c. 2,5-diidroxibenzico, c.
2,4-diidroxibenzico, c. p-
tolico, c. 4-propilbenzico,
c. 3,5-diidroxibenzico,
c. 4-hidroxibenzico,
c. 4-heptilbenzico
mistura de padres
Lu et al.
(2010)
CEC
50 mM fosfato (pH 2.8),
50 % ACN, coluna
C18/Hypersil SCX
25 c. cafeico, c. clorognico
Chamomilla
recutita (L.)
Rauschert
Fonseca et
al. (2007)
CZE
100 mM borato de sdio
(pH 9.5)
20
c. sirngico, c. ferlico,
c. p-cumrico, c. cafeico,
c. glico, c. 3,4-
diidroxibenzico, c. tartrico
cis-cumaroil, c. tartrico trans-
cumaroil, c. tartrico trans-
cafeoil
vinho
Andrade et
al. (2001)
CEC
100 mM formato de amonia
(pH 3.0), H
2
O, ACN 5:65:30,
coluna:Cogent bidentate
C18
22
c. protocatquico, c. o-
cumrico, c. cafeico, c.
vanilnico, c. sirngico, c.
ferlico, c. p-cumrico
leo de oliva extra
virgem
Aturki et al.
(2008)
MEKC
25 mM fosfato, 100 mM
SDS, 6% MeOH (pH 7.0)
14 c. glico, c. ascrbico
Camellia
sinensis(L.) Kuntze
Aucamp et
al. (2000)
MEEKC
0.6% ciclohexano, 3.0%
SDS, 6.0% 1-butanol, and
3.0% ACN (pH 8.0)
30
c. rosmarnico, c.
protocatquico, c. salvianlico
C, c. cafeico, c.
litosprmico, c. salvianlico B,
danshensu, aldedo
protocatquico
Salvia miltiorrhiza
Bunge
Cao et al.
(2008)
CIDOS FENOLICOS
Continua
244
CZE
25 mM carbonato de amnia
(pH 9.0)
30
c. cafeico, c. vanilnico,
c. sirngico, c. p-cumrico,
c. o-cumrico, c. sinpico,
c. p-hidroxibenzico,
c. protocatquico
leo de oliva virgem
Olea europaea L.
Carrasco--
Pancorbo
et al.
(2007)
MEKC
50 mM cido actico,
acetato de sdio (pH 5.0),
100 mM SDS
10
c. cis-p-cumrico,
c. trans-p-cumrico
lentilha, feijo
branco, feijo preto
Cifuentes
et al.
(2001)
MEEKC
2.89% SDS, 1.36% heptano,
7.66% ciclohexanol, 2%
ACN (w/v) pH 2.0
20
c. sirngico, c. p-cumrico,
c. vanilnico, c. cafeico,
c. glico,
c. 3,4-diidroxibenzico,
c. 4-hidroxibenzico
folhas de ch, chs
prontos, uvas,
mas, vinhos
Huang et
al. (2005)
MEKC
20 mM fosfato (pH 7.0), 50
mM taurodeoxicolato
18 c. rosmarnico Hedera helix L.
Trute et al.
(1996)
CZE
50 mM fosfato (pH 7.0), 30%
ACN
25
c. rosmarnico, c. cafeico,
aldedo protocatquico
Lycopus europaeus
L.
Wojciecho-
wski et al.
(1995)
CZE
40 mM tetraborato de sdio
(pH 9.4), 2 mM b-CD, 4 %
MeOH
25
c. rosmarnico,
c. p-cumrico, c. cafeico
Prunella vulgaris L.
Cheung et
al. (2008)
MODO ELETRLITO VOLT SUBSTNCIAS PLANTA AUTOR
CZE
200 mM c. brico, 50 mM
tetraborato de sdio (11:9)
(pH 8.5)
25
herniarina, cumarina,
umbeliferona, esculetina,
diidrocumarina, c. cumrico,
4-hidrxicumarina
Chrysanthemum
segetum L.
Ochocka et al.
(1995)
CZE
5 mM borato (pH 9.4), 20 %
MeOH, 10
-7
M fluorescena de
sdio
20
esculina, esculetina,
isofraxidina, genistena,
naringina, soforicosdeo
Fructus sophorae
japonicae,
Herb sarcandrae
Wang et al.
(2007)
CEC
50 mM fosfato (pH 2.8),
50 % ACN, coluna
C18/Hypersil SCX
25 herniarina, umbeliferona
Chamomilla
recutita (L.)
Rauschert
Fonseca et al.
(2007)
CZE
50 mM fosfato (pH 2.5),
40 mg/ml S-b-CD
15
derivados de
diidrofuranocumarina
mistura de padres
Egger et al.
(2003)
CUMARINAS
245
MODO ELETRLITO VOLT SUBSTNCIAS PLANTA AUTOR
NACE
140 mM colato de sdio
em MeOH
NC
deoxiesquizandrina,
y-esquizandrina
Schisandra chinensis
(Turcz.) Baill.
Lu et al.
(2009)
MEKC
10 mM tetraborato
(pH 9.3),40 mM SDS,
35 % CH
3
CN
NC
deoxiesquizandrina,
esquizandrina, gomisina A,
gomisina N, esquizandrina C
Schisandra chinensis
(Turcz.) Baill.,
Schisandra
sphenanthera Rehder &
E.H. Wilson
Lu et al.
(2009)
MEKC
5 mM borato, 5 mM
fosfato, 20 mM SDS, 10
mM BMIM-BF
4
(pH 9.2)
NC
deoxiesquizandrina,
esquizandrina,
esquizanterina A,
y-esquizandrina
Schisandra chinensis
(Turcz.) Baill.
Lu et al.
(2009)
CEC
10 mM Tris, 15 mM borato,
CH
3
CN (pH 8.2), coluna
macroporosa de
poliacrilamida
22,5
esquizandrina,
esquizandrina C, gomisina A,
gomisina N
Schisandra chinensis
(Turcz.) Baill.
Lu et al.
(2009)
CEC
5 mM fosfato (pH 5.4),
ACN (60:40)
4
esquizandrina, esquizandrina
B, deoxiesquizandrina,
esquizanterina C, gomisina A
Schisandra chinensis
(Turcz.) Baill.,
Schisandra
sphenanthera Rehder &
E.H. Wilson
Lu et al.
(2009)
CZE
60 mM acetato de amnia
(pH 9.3), 5% 2-propanol
25
pinoresinol,
1-acetoxipinoresinol
leo de oliva virgem
Olea europaea L.
Carrasco--
Pancorbo
et al.
(2006)
CZE
25 mM carbonato de
amnia pH 9.0
30
pinoresinol,
1-acetoxipinoresinol
leo de oliva virgem
Olea europaea L.
Carrasco--
Pancorbo
et al.
(2007)
CZE
50 mM fosfato (pH 5.0),
5 mM carbximetil-b-CD
25 matairesinol Carthamus tinctorius L.
Muller et al.
(2008)
LIGNANAS
NC / Nada Consta
246
QUINONAS
MODO ELETRLITO VOLT SUBSTNCIAS PLANTA AUTOR
CZE 50 mM b-alanina-HCl (pH 3.0) 25
quinona
pirroloquinolina
meio de cultura de
Paracoccus denitrificans
Glatz et al.
(2000)
CZE
10 mM fosfato (pH 7.4), 5 mM
percolato de tetraetilamnio
25
quinona
pirroloquinolina e
ismeros
mistura de padres
Smith et
al. (2000)
CZE
30 mM borato (pH 10.0), 25 %
ACN, 2 mM 2,6-di-O-metil-b-CD,
5 mM a-CD
20 antraquinonas
Rheum palmatum L.,
Rheum tanguticum Maxim. ex
Balf.
Koyama
et al.
(2007)
CZE
35 mM fosfato (pH 11.0),
20 mM b-CD, 2 M uria
20 antraquinonas
Rheum palmatum L.,
Rheum hotaoense C.Y. Cheng
& T.C. Kao,
Polygonum cuspidatum Willd.
ex Spreng.
Tian et al.
(2006)
CZE
60 mM 1-butil-3-metilimizolium
tetrafluoroborato,
4 mM b-CD (pH 10.0)
20 antraquinonas
Paedicalyx attopevensis
Pierre ex Pitard
Qi et al.
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LEITURA COMPLEMENTAR
BAKER, D. R. Capillary Electrophoresis: Techniques in Analytical Chemistry. John Wiler & Sons, Inc., 1 ed.,
1995.
APLICAO DE TCNICAS BIDIMENSIONAIS DE RMN NA
INVESTIGAO DE PRODUTOS NATURAIS
Andersson Barison
Maique Weber Biavatti
INTRODUO
A elucidao estrutural de substncias naturais
diretamente em extratos vegetais apresenta uma
srie de desafios, e difere da elucidao estrutural de
substncias sintticas, entre outros, porque no h
material de partida que possibilite a deduo de uma
estrutura natural. As substncias naturais, presentes
em um extrato ou frao, dotados de certa atividade
biolgica, so inesperadas, principalmente se forem
oriundas de uma espcie ou gnero pouco
investigado quimicamente. Nesse caso h apenas
informao sobre algumas propriedades fsico-
qumicas verificadas durante o processo
cromatogrfico, como polaridade, absoro de
radiao UV, entre outras.
256
premente a necessidade econmica, cientfica e tcnica de acelerar o processo de
descoberta e desenvolvimento de novos fitofrmacos, bem como da caracterizao de componentes
de extratos bioativos, por meio da identificao de substncias em mistura. Adquirir a capacidade de
identificar, de forma rpida e segura, as substncias presentes em matrizes complexas, como extratos
e fraes semipurificadas um grande diferencial para a descoberta e o desenvolvimento de
fitofrmacos e tambm para a padronizao de extratos bioativos. Mesmo porque, h vastas evidncias
apontando para as propriedades farmacolgicas emergentes, exibidas por uma dada frao ou extrato
em detrimento da atividade das substncias isoladas.
Nesse contexto, a utilizao de experimentos bidimensionais de ressonncia magntica
nuclear (RMN 2D) de grande importncia, uma vez que esses permitem ampliar consideravelmente
a quantidade de informaes a respeito da amostra sob investigao. A proposta deste captulo
demonstrar as principais tcnicas de RMN 2D disponveis, fazendo uma breve descrio delas,
evidenciando quais dados podem ser obtidos com cada uma delas, seguida por alguns exemplos de
elucidao de substncias em misturas complexas sem necessidade de isolamento de seus
componentes. Ao final do captulo sero listados locais com espectrmetros de RMN disponveis no
Brasil e seus respectivos contatos para incentivar o uso destas ferramentas (Tabela 1). Adicionalmente,
sero fornecidas uma lista de programas computacionais especficos para processamento e explorao
de dados de RMN e simulao de espectros ( Tabela 2) e tambm uma lista com algumas bases de
dados de RMN (disponveis na internet e comerciais, Tabela 3).
TABELA 1 - Espectrmetros de RMN atualmente disponveis no Brasil: (em cinza- aguardando
autorizao)
REGIO NORTE
Cidade/Estado Contato
Manaus - AM
CBA - Centro de Biotecnologia da Amaznia
Massayoshi Yoshida myoshida@iq.usp.br (92)
3237 3870 Ramal: 2028
Belm - PA
UFPA - Universidade Federal do Par
Departamento de Qumica
Giselle Maria Skelding Pinheiro Guilhon
giselle@ufpa.br
(91) 3201 7363
Alberto Cardoso Arruda
arruda@ufpa.br
Mara Slvia P. Arruda
mspa@ufpa.br
257
REGIO NORDESTE
Cidade/Estado Contato
Macei - AL
UFAL - Universidade Federal de Alagoas
Instituto de Qumica e Biotecnologia
Antnio Euzbio Goulart
Sant'Anaaegs@qui.ufal.br
(82) 3214 1388
Edson de Souza Bento
edson.iqb@gmail.com
Salvador - BA
UFBA - Universidade Federal da Bahia
Instituto de Qumica
Elisangela F. Boffo
efboffo@yahoo.com.br
(71) 3283 6812
Frederico Guar/ Jorge David
Fortaleza - CE
UFC - Universidade Federal do Cear
Centro Nordestino de Aplicao e Uso de
Ressonncia Magntica Nuclear - CENAUREM
Edilberto Rocha Silveira
edil@ufc.br
(85) 3366 9971
Joo Pessoa - PB
UFPB - Universidade Federal da Paraba
Laboratrio de Tecnologia Farmacutica
Josean Fechine
josean@ltf.ufpb.br
Marcelo Sobral marcelosobral.ufpb@gmail.com
marcelosobral@ltf.ufpb.br
Natal - RN
UFRN - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte
Departamento de Qumica
Rosangela Balaban Garcia
balaban@digi.com.br
Recife - PE
UFPE - Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Qumica Fundamental
Fernando Hallwass
hallwass@ufpe.br
(81)2126 7470
REGIO CENTRO-OESTE
Cidade/Estado Contato
Goinia - GO
UFG - Universidade Federal de Gois
Departamento de Qumica
Luciano Moraes Lio
luciano@quimica.ufg.br
(62) 3521 1059
Braslia - DF
UnB - Universidade de Braslia
Sebastio S. Lemos
sslemos@unb.br
(61)3107 3807
Ins Sabioni
isresck@unb.br
Cuiab - MT
UFMT - Universidade Federal de Mato Grosso
Departamento de Qumica
Paulo Teixeira de Sousa Jr.
teixeira@cpd.ufmt.br
pauloteixeiradesousa@gmail.com
(65)3615 8767
Campo Grande - MS
UFMS - Universidade Federal de Mato Grosso do
Sul
Departamento de Qumica
Walmir Silva Garcez
(67) 3345 3559
walmir.garcez@ufms.br
258
REGIO SUDESTE
Cidade/Estado Contato
Belo Horizonte - MG
UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais
Departamento de Qumica
Dorila Pilo-Veloso
dorila@zeus.qui.ufmg.br
Jos Dias de Souza Filho
peixe@zeus.qui.ufmg.br
Jarbas Magalhes Resende
jarbas@netuno.lcc.ufmg.br
laremar@qui.ufmg.br
(31)3409 5695, (31) 3409 5747, (31)3409 5715
Divinpolis - MG
UFSJ - Universidade Federal de So Joo Del Rei
Campus Divinpolis
Jos Augusto Ferreira Perez
villarzevillar@ufsj.edu.br
(37)3221 1610
Juiz de Fora - MG
UFJF - Universidade Federal de Juiz de Fora
Departamento de Qumica
Prof. Adilson/ Ana Paula
quimica.qui@ufjf.edu.br
(32)2102 - 3310
Viosa - MG
UFV - Universidade Federal de Viosa
Departamento de Qumica
Luiz Claudio de Almeida Barbosa
lcab@ufv.br
(31) 3899 3068
Campos dos Goitacazes- RJ
UENF - Universidade Estadual do Norte
Fluminense
Laboratrio de Cincias Qumicas - LCQUI
Jan Schripsema
jan@uenf.br
(22)2739 7156
Rio de Janeiro - RJ
UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro
LAMAR - Laboratrio Multiusurio de Analises
por RMN
Luzineide W. Tinoco
lamar@nppn.ufrj.br
(21)2562-6793
Rio de Janeiro - RJ
UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Qumica
Rosane A. S. San Gil
Carlos R. Kaiser
rsangil@iq.ufrj.br
labrmnsolidos@iq.ufrj.br
(21)2562 7944
Rio de Janeiro - RJ
UFF - Universidade Federal Fluminense
Instituto de Qumica
Laboratrio de Aplicaes de RMN - UFFLAR
Rodrigo Bagueira de V. Azeredo
Maria Ceclia B.V. de Souza
(21)2629 2382
laremn@vm.uff.br
www.uff.br/laremn
Rio de Janeiro - RJ
UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro Nacional de RMN de Macromolculas -
CNRMN
Fbio Almeida
falmeida@cnrmn.bioqmed.ufrj.br
(21)3521-5558
http://cnrmn.bioqmed.ufrj.br
259
Seropdica - RJ
UFRRJ - Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro
Instituto de Cincias Exatas
Mrio Geraldo de Carvalho
Victor Marcos Rumjanek
mgeraldo@ufrrj.br
(21)2682 2807
Araraquara - SP
UNESP - Universidade Estadual Paulista
Instituto de Qumica
Lcia Xavier lopes
xl@iq.unesp.br
(16) 3301-9663
Campinas - SP
LNLS - Laboratrio Nacional de Luz Sncroton
Ana Carolina Zeri
ana.zeri@lnbio.org.br
(19) 3512-1119
Submisso de propostas no portal de servios:
www.lnls.br
Campinas - SP
Unicamp - Instituto de Qumica
Cludio Tormena
tormena@iqm.unicamp.br
(19) 3788-3072
Heloise Pastore
Ronaldo Pilli
lolly@iqm.unicamp.br
(19) 3521 2093 ramal 13095
Rio de Janeiro - RJ
UFRJ - Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Macromolculas
Maria Ins Bruno Tavares
mibt@ima.ufrj.br
(21)2562-7205
Rio de Janeiro - RJ
CBPF - Centro Brasileiro de Pesquisas Fsicas
Ivan dos Santos Oliveira Jr.
(21)2141-7395
ivan@cbpf.br
Rio de Janeiro - RJ
PUC-RIO - Pontifcia Universidade Catlica
Maria Isabel Pais
isapais@puc-rio.br
Rio de Janeiro - RJ
FIOCRUZ - CDTS - Centro de Desenvolvimento
Tecnolgico da Fundao Oswaldo Cruz
Jochen Junker
junker@cdts.fiocruz.br
Equipamentos em aquisio
Rio de Janeiro - RJ
FIOCRUZ - Farmanguinhos
Erika Martins de Carvalho
erikamc@far.fiocruz.br
(21) 2270 0136
Rio de Janeiro - RJ
CENPES - Petrobrs Centro de Pesquisas e
Desenvolvimento
Leopoldo Amrico Miguez de Mello
Sonia M. C. Menezes
soniac@petrobras.com.br
(21)3865 6171
Rio de Janeiro - RJ
IME - Instituto Militar de Engenharia
Jose Daniel Figueroa Villar
figueroa@ime.eb.br
(21) 2546 7057
260
REGIO SUL
Cidade/Estado Contato
Curitiba - PR
UFPR - Universidade Federal do Paran
Departamento de Qumica
Andersson Barison
andernmr@ufpr.br
(41)3361 3268
Curitiba - PR Guilherme Lanzi Sassaki
Ribeiro Preto - SP
USP - Universidade de So Paulo
Departamento de Qumica
Gil Valdo Jos da Silva
gvjdsilv@usp.br
(16)3602 3699
So Carlos - SP
UFSCar - Universidade Federal de So Carlos
Departamento de Qumica
Antnio Gilberto Ferreira
giba@dq.ufscar.br
(16)3351 8068
http://www.ufscar.br/~rmn
So Carlos - SP
Embrapa - Instrumentao Agropecuria
Luiz Alberto Colnago
colnago@cnpdia.embrapa.br
(16)33742477
So Carlos - SP
USP - Universidade de So Paulo
Instituto de Fsica
Tito Jos Bonagamba
tito@ifsc.usp.br
(16) 33739871
So Carlos - SP
USP - Universidade de So Paulo
Instituto de Qumica
Sylvana C. M. Agustinho
sylvana@iqsc.usp.br
(16)3373 9894
So Paulo -SP
IPT - Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do
Estado de So Paulo
Centro de Metrologia em Qumica
Cludia M. G. de Souza
cmgsouza@ipt.br
(11)3767-4183
www.ipt.br
So Paulo - SP
UFABC - Universidade Federal do ABC
cem@ufabc.edu.br
Mrcia T. Escote
Carlos Rittori
rettori@ifi.unicamp.br
So Paulo - SP
USP - Universidade de So Paulo
Instituto de Qumica
Mriam Uemi
uemiriam@iq.usp.br
(11)3091-3212 ramal 14
So Paulo - SP
USP - Universidade de So Paulo
Departamento de Farmcia
Hlio Alexandre Stefani
hstefani@usp.br
(11)
Vitria - ES
UFES - Universidade Federal do Esprito Santo
Departamento de Qumica
Eustquio Vinicius Ribeiro de Castro
castro@cce.ufes.br
27)4009-2846
Equipamentos em aquisio
261
Curitiba - PR
UFPR - Universidade Federal do Paran
Departamento de Bioqumica
Guilherme Lanzi Sassaki
sassaki@ufpr.br
(41)3361-1577
Maring - PR
UEM - Universidade Estadual de Maring
Departamento de Qumica
Ernani Abicht Basso
eabasso@uem.br
(44)3261-3662
Canoas - RS
ULBRA - Universidade Luterana do Brasil
Centro Petroqumico de Pesquisa e
Desenvolvimento
cepped@ulbra.br
(51) 3477 9164
Santa Maria - RS
UFSM - Universidade Federal de Santa Maria
Departamento de Qumica
Nilo Zanatta
zanatta@base.ufsm.br
(55)3220 8741
Porto Alegre - RS
UFRS - Universidade Federal do Rio Grande do
Sul
Instituto de Qumica
Paulo Henrique Schneider
paulos@iq.ufrgs.br
(51)3308-6286
Florianpolis - SC
UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento de Qumica
Miguel Soriano Balparda Caro
caro@qmc.ufsc.br
3721-6826/6827
Itaja - SC
UNIVALI - Universidade do Vale do Itaja
Pedro Pablo Perez
pedroperez@univali.br
(47)3341-7540
TABELA 2 - Programas para processamento/simulao de espectros de RMN
Nome Endereo
Bruker TopSpin http://store.bruker-biospin.com
Vnmr http://www.chem.agilent.com/
MestreNova/ NMRPredict http://mestrelab.com/
ACD/NMR Predictors http://www.acdlabs.com/products/?list=alphabetical
ACD/NMR Processor Academic Edition www.acdlabs.com/nmrproc - freeware
Spin Works ftp://davinci.chem.umanitoba.ca/pub/marat/SpinWorks -
freeware
262
TABELA 3 - Bases de dados disponveis na internet para busca e comparao de dados
Nome Endereo
NAPROC-13 http://c13.usal.es/c13/usuario/views/incio.jsp?lang=po&country=PO
Spectral
Database for
Organic
Compounds,
SDBS
http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi?lang=eng
Biological
Magnetic
Resonance Data
Bank-
http://www.bmrb.wisc.edu/formats.html
Chemspider -
Building
Community for
Chemists
http://www.chemspider.com/
Proton NMR
Chemical Shifts
Carbon NMR
Chemical Shifts
http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/handouts/nmr-h/hdata.htm
http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/handouts/nmr-c13/cdata.htm
Database of
NMR spectra
http://www.nmrdb.org/
HaveItAll NMR
(Biorad
Laboratories)*
http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?ts=1&cmd=BRCatgProductDe-
tail&vertical=INF&catID=203465
Chenomx NMR
Suite 7.0*
http://www.chenomx.com/software/software.php?pageID=65
SpecInfo on the
Internet - NMR
(John Wiley &
Sons, Inc)*
http://onlinelibrary.wiley.com/book/10.1002/9780471221692
ACD/NMR
Databases*-
http://www.acdlabs.com/products/?list=alphabetical
FT-NMR Library
(Sigma-Aldrich)*
http://www.sigmaaldrich.com/labware/learning-center/spectral-viewer/ft-nmr-lib-
rary.html
* Bases de dados comerciais
263
RMN DE
1
H
Toda identificao ou elucidao estrutural, utilizando RMN, se inicia pela aquisio de espectros de
RMN de
1
H, pois atravs dele que se tem a real noo da complexidade e diversidade de sinais presente na
amostra sob investigao, bem como da concentrao de seu(s) componente(s). Por isso, de fundamental
importncia que ele seja adquirido com boa qualidade.
A qualidade de um espectro de RMN de
1
H depende essencialmente de dois fatores: primeiro de um
bom preparo de amostra e segundo de um bom ajuste da homogeneidade do campo magntico do
equipamento (shimming).
O bom preparo de amostra envolve a solubilizao dela em um solvente, deuterado apropriado, no
qual ela seja completamente solvel, seguido da sua filtrao, por exemplo, por meio um de filtro de algodo,
o qual pode ser realizado durante a transferncia da amostra para o tubo de RMN. Esse procedimento evita
que partculas insolveis fiquem em suspenso dentro do tubo, que causam perturbao, na homogeneidade,
do campo magntico e, com isso, alargamento dos sinais e a perda da resoluo espectral. Da mesma forma,
se a amostra no for totalmente solvel, no solvente deuterado escolhido, tambm haver perda de resoluo.
A quantidade de solvente deuterado, utilizado para solubilizar a amostra, tambm deve ser cuidadosamente
avaliada, porque as sondas dos espectrmetros de RMN possuem regies definidas de deteco. Sendo
assim, se o analista estiver interessado em aumentar a sensibilidade, uma situao bastante comum na
investigao de produtos naturais, uma alternativa extremamente vivel a utilizao de microssondas que
permitem a investigao da amostra em pequenos volumes de solvente deuterado (alguns microlitros).
Como nosso interesse a identificao estrutural de substncias diretamente em extratos vegetais, mais
importante uma maior resoluo nos espectros de RMN de
1
H e no tanto a sensibilidade. Sendo assim, mais
adequado que a amostra seja solubilizada em 0,5 a 0,6 mL de solvente deuterado para tubos de RMN de 5
mm, que suficiente para deixar as regies de interface distantes da regio de deteco da sonda, facilitando
o ajuste do campo magntico do equipamento pelo operador.
O segundo fator extremamente importante para a obteno de espectros de RMN de
1
H com qualidade
satisfatria o ajuste da homogeneidade do campo magntico do espectrmetro, conhecido como shimming.
Um bom shimming alcanado quando a largura, meia altura do sinal de referncia do tetrametilsilano
(TMS), for menor que 1 Hz para equipamentos de at 600 MHz. O operador deve ajustar as bobinas de
shimming, as quais corrigem as distores, no campo magntico, causadas pela presena da amostra, atravs
dos eixos de shimming z
1
, z
2
, z
3
e seguintes, at que a condio acima seja atingida ou que esteja prxima a
esta.
Um bom shimming importante no somente para a resoluo dos espectros, mas tambm para
concentrar a precesso dos spins nucleares, magneticamente equivalentes em uma nica frequncia de
ressonncia, intensificando assim os sinais e, com isso, aumentando a sensibilidade dos experimentos
bidimensionais. Dessa forma, se os cuidados descritos acima foram tomados, tem-se um espectro de RMN de
1
H de maior resoluo, com menor sobreposio de sinais, possibilitando a extrao de informaes importantes,
tais como: a) a multiplicidade dos sinais e suas respectivas constantes de acoplamento, determinando os
sistemas de spins e b) a rea dos sinais, o que permite determinar as concentraes relativas entre as substncias
presentes na amostra, viabilizando a identificao de um maior nmero de componentes.
Para uma amostra desconhecida, o analista deve solicitar inicialmente somente a aquisio de um
bom espectro de RMN de
1
H e no solicitar uma srie de experimentos de RMN simultaneamente. Somente
aps a anlise do espectro de RMN de
1
H que possvel definir quais experimentos adicionais sero
264
necessrios para a elucidao estrutural. Sugere-se uma sistemtica de trabalho para a anlise de amostras
complexas no fluxograma 1. Esta sistemtica foi proposta porque as amostras de produtos naturais apresentam
metablitos secundrios em baixas concentraes e a aquisio de espectros de RMN de
13
C dessas amostras
despendem grande tempo de uso dos espectrmetros de RMN, devido a baixa abundncia natural do istopo
de
13
C, cerca 1,1%. Por exemplo, frequentemente se observa a solicitao de espectros de RMN de
13
C
conjuntamente com experimentos de correlao
1
H-
13
C, sendo que os deslocamentos qumicos dos ncleos
de carbono j esto presentes nos experimentos de correlao
1
H-
13
C, os quais so adquiridos de forma bem
mais rpida, quando comparado aos espectros de RMN de
13
C. Alm disso, a prvia anlise do espectro de
RMN de
1
H fundamental para o correto ajuste dos parmetros de aquisio dos experimentos bidimensionais
de RMN, discutidos mais adiante.
FLUXOGRAMA 1 | Sistemtica de trabalho, sugerida para elucidao estrutural, de
produtos naturais diretamente em extratos e frao
semipurificadas.
265
Em amostras de extratos vegetais ou fraes, alm da baixa concentrao de metablitos secundrios,
inerente a presena de clorofilas, evidenciada pela colorao verde intensa. No entanto, a presena dessas
substncias no interfere na obteno dos espectros de RMN. A presena do tomo de magnsio paramagntico
em suas estruturas causa a relaxao extremamente rpida dos spins nucleares, tornando-as invisveis a
RMN. Por isso, no h problema na aquisio de espectros de fraes ou extratos de cor escura.
A seguir, ser demonstrada a importncia de uma explorao prvia consistente de um espectro de
RMN de
1
H. A figura 1 traz o espectro de uma frao semipurificada de um extrato hidroalcolico de caules de
Vernonia scorpioides (Lam.) Pers., o qual apresenta sinais bem definidos, sem grande sobreposio ou alta
complexidade, portanto passvel de identificao de diversos componentes. Este espectro apresenta diversos
sinais na regio de 6,5 a 8,0 ppm, caractersticos de substncias aromticas. O espectro tambm apresenta
sinais na regio de 5,7 a 6,4 ppm, caractersticos de duplas ligaes. O sinal em 9,79 ppm indica a presena de
um grupo aldedo. Alm disso, possvel identificar a presena de grupos metoxilas na amostra atravs dos
simpletos intensos na regio de 3,5 a 4,5 ppm. Os sinais presentes, na regio de 0,5 a 2,5, indicam a presena
de substncias alifticas, provavelmente terpenos.
FIGURA 1 | Espectro de RMN de H da frao semipurificada a partir de
extrato hidroalcolico de caules de Vernonia scorpioides (Lam.)
Pers. (400 MHz, CDCl
3
).
266
Analisando este espectro detalhadamente pode-se perceber, em princpio, dois dupletos em torno
de 7,60 ppm (Figura 1b). Esses dupletos apresentam constantes de acoplamento (J) de 9,5 Hz (mais intenso)
e 16,0 Hz (menos intenso), tpicos de dupla ligao cis (em maior proporo) e de dupla ligao trans (em
menor proporo), respectivamente. Prximo a esses sinais, se observa um dupleto em 7,44 ppm (J= 1,9 Hz)
e um duplo dupleto em 7,38 ppm (J= 8,1 e 1,9 Hz). A constante de acoplamento de 1,9 Hz indica que ambos
sinais acoplam em uma relao meta, enquanto a constante de 8,1 Hz indica que este hidrognio acopla com
um terceiro em uma relao orto. O mais prudente neste momento encontrar este terceiro sinal na regio
de hidrognios aromticos com a mesma constante de acoplamento, o qual encontrado em 7,02 ppm, e
tambm em 6,88 ppm, uma vez que ambos so dupletos de 8,1 Hz (Figura 1b). Provavelmente, apenas um
deles faz parte do mesmo sistema de spins, o que ser elucidado pelos experimentos bidimensionais. Esses
trs sinais e suas respectivas multiplicidades indicam a presena de uma substncia, contendo um anel
aromtico 1,2,4 trisubstitudo (Figura 1b). Da mesma forma, recomendvel que o analista procure os demais
sinais das duplas ligaes cis e trans, os quais podem ser encontrados na regio de 6,27 ppm (Figura 1c).
O segundo exemplo referente a um extrato etanlico de Ginkgo biloba L., que apresenta um
espectro de RMN de
1
H com uma maior complexidade de sinais na regio de 2,0 a 6,0 ppm (Figura 2). No
entanto, existem sinais livres de sobreposio na regio de 6,0 a 8,0 ppm que indicam a presena de uma ou
mais substncia(s) aromtica(s) presente(s) na amostra. Tambm notvel a presena de dois sinais na regio
de 12,0 a 14,0 ppm, os quais so referentes a hidrognios de hidroxilas queladas, bastante comuns em
flavonoides, porm tambm presentes em algumas outras classes de substncias. Em geral, somente
hidrognios de hidroxilas queladas apresentam simpletos intensos na regio de 13 a 16 ppm nos espectros de
RMN de
1
H. Alm de hidrognios de hidroxilas, os flavonoides apresentam hidrognios aromticos em seus
esqueletos e, portanto, de acordo com sinais presentes na regio de 6,0 a 8,0 ppm (Figura 2).
FIGURA 2 | Espectro de RMN de H do extrato etanlico de Ginkgo biloba L.
(400 MHz, DMSO-d
6
), evidenciando a presena de sinais de
flavonoides .
267
Alm disso, a diferena de intensidade dos sinais, na regio de 12,0 a 14,0 ppm, indica tratar-se de
dois flavonoides, e a integrao de suas reas permite sua quantificao relativa (Figura 2b). Nesse ponto,
onde o analista suspeita da presena de determinada classe de substncias, fundamental que ele se familiarize
com os sinais caractersticos dela. Por exemplo, os flavonoides apresentam dois dupletos caractersticos com
constantes de acoplamento (J) em torno de 2 Hz, na regio de 6,1 a 6,5 ppm, referente aos hidrognios do
anel A em acoplamento meta (Figura 2b). Ao analisarmos, em detalhes, essa regio do exemplo da Figura 2,
podemos ver claramente a presena de dois conjuntos de sinais (em 6,41 e 6,18 ppm, maior intensidade, e
em 6,39 e 6,19 ppm, menor intensidade), demonstrando a presena de dois flavonoides em diferentes
propores (8:2, Figura 2b). A continuao da explorao do espectro de RMN de
1
H desta amostra
provavelmente resultar na quase ou, at mesmo, na completa elucidao estrutural desses flavonoides.
Neste momento, no podemos deixar de destacar que o bom ajuste da homogeneidade do campo
magntico (shimming) foi fundamental para se ter um espectro com suficiente resoluo, que permitisse
identificar os dois dupletos em torno de 6,20 ppm (Figura 2b). Caso o shimming no tivesse sido bem
ajustado, provavelmente no teria sido possvel identificar com clareza os dois dupletos devido a sobreposio
de sinais, gerando dvida ao analista. Como concluso, pode-se perceber que uma boa e exaustiva explorao
dos espectros de RMN de
1
H, permite a soluo de grande parte do problema de elucidao estrutural. A
explorao adequada dos espectros de RMN e a extrao do mximo de informaes somente so possveis
com o auxlio de programas desenvolvidos especificamente para o processamento de dados de RMN. A
tabela 2 lista alguns programas computacionais, dedicados ao processamento e explorao de dados de
RMN.
RMN 2D: CORRELAO HETERONUCLEAR
1
H-
13
C
A explorao exaustiva dos espectros de RMN de
1
H permite extrair uma grande quantidade de
informaes sobre a amostra. No entanto, em muitos casos essas informaes no so suficientes para a
completa elucidao estrutural, principalmente no caso de misturas complexas tais como as observadas nos
extratos vegetais ou fraes semipurificadas, em que a sobreposio de sinais pode gerar dvidas na elucidao
estrutural. A forma mais conveniente de aumentar a quantidade de informaes por meio da aquisio de
experimentos bidimensionais de RMN (RMN 2D). Os experimentos bidimensionais de RMN so essenciais
para a elucidao estrutural porque fornecem duas informaes importantes: 1) os deslocamentos qumicos
de RMN de
13
C eliminam, assim, na maioria das vezes, a necessidade de aquisio de espectros de RMN de
13
C
e 2) permitem conectar os fragmentos estruturais de uma molcula. Nesse contexto, os dois experimentos
mais importantes so o HSQC e o HMBC. O experimento de HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence)
essencial porque permite estabelecer as conexes diretas entre hidrognio e carbono, a uma ligao de
distncia (
1
J
H,C
) (Figura 3). O experimento de HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) o mais
importante para a elucidao estrutural de produtos naturais porque permite detectar correlaes entre
hidrognio e carbono a longa distncia, a vrias ligaes (
n
J
H,C
ou
LD
J
H,C
) e, com isso, estabelecer as conexes
entre os fragmentos estruturais (Figura 3). Dessa forma, esses dois experimentos devem ser obtidos e analisados
sempre em conjunto; a aquisio de apenas um deles no permite avanos na elucidao estrutural. claro
que existem diversos outros experimentos, que fornecem essas mesmas informaes. No entanto, at o
presente, esses so os experimentos de maior sensibilidade para a investigao de produtos naturais.
268
FIGURA 3 | Correlaes
1
H-
13
C fornecidas pelos experimentos de HSQC e
HMBC.
As verses mais modernas desses dois experimentos utilizam um recurso denominado gradiente de
campo, que deve estar disponvel tanto no console quanto nas sondas que equipam os espectrmetros de RMN.
Sem entrar em detalhes, el permite aumentar consideravelmente a sensibilidade das correlaes
1
H-
13
C,
principalmente para o experimento de HMBC, mas preciso estar atento porque alguns espectrmetros e
sondas mais antigas podem no contar com este recurso. Nesse caso, a realizao dos experimentos de HSQC
e HMBC, nesses equipamentos, ser extremamente limitada, a ponto de no serem recomendados. Nos novos
equipamentos, este recurso j faz parte da configurao bsica dos espectrmetros.
Antes de dar continuidade preciso situar o leitor sobre os diferentes tipos de sondas utilizadas nos
espectrmetros de RMN. Existem dois tipos de sondas: 1) deteco direta, na qual a bobina de deteco
mais prxima da amostra (interna, de maior sensibilidade) est dedicada observao do ncleo de carbono
em que a bobina de observao do ncleo de hidrognio est posicionada externamente a esta e 2)
deteco inversa, na qual a bobina interna, de maior sensibilidade, agora est dedicada a observao do
ncleo de hidrognio. As sondas de deteco inversa foram desenvolvidas especificamente para a aquisio
de experimentos de RMN 2D. A deteco dos experimentos de HSQC e HMBC foi planejada para ocorrer
atravs do ncleo de
1
H, devido as suas altas abundncia natural e constante giromagntica, quando
comparado ao ncleo do
13
C. Portanto, se a bobina mais prxima da amostra for a responsvel pela deteco
do sinal do ncleo de
1
H, a sensibilidade dos experimentos bidimensionais aumentar consideravelmente.
Isso no significa que as sondas de deteco direta no possam ser empregadas para aquisio de
experimentos de RMN 2D, ao contrrio, principalmente se possurem gradiente de campo, porm
apresentaro sensibilidade de cerca de 50% inferior, quando comparadas s sondas de deteco inversa.
Esta perda de sensibilidade pode ser compensada, em parte, aumentando o nmero de scans do
experimento. Em resumo, para experimentos bidimensionais, as sondas ideais so aquelas de deteco
inversa e que possuem gradiente de campo.
A seguir, o leitor ter uma noo de como ajustar os experimentos de RMN HSQC e HMBC, visando
obter um maior nmero de correlaes possveis. Para isso, necessrio ter uma ideia de como gerada
a segunda dimenso nos experimentos de RMN 2D. Essa gerada com auxlio de sequncias de pulsos que
modulam a intensidade ou a fase dos sinais conforme o experimento repetido. Se marcarmos o pice de
cada sinal na sequncia de espectros, mostrado na figura 4 com pontos e depois removermos os espectros,
deixando apenas os pontos, o que nos resta uma figura que nos lembra um FID (Free Induction Decay).
Portanto, possvel aplicar uma segunda transformada de Fourier sobre esses pontos, gerando assim a
segunda dimenso nos experimentos de RMN 2D (Figura 4).
269
FIGURA 4 | Gerao da segunda dimenso dos experimentos de RMN 2D.
necessrio que o leitor compreenda que cada ponto representa um espectro de RMN, o qual pode
ser adquirido com a quantidade de scans que o analista desejar, e que o nmero de pontos resultar em maior
ou menor resoluo espectral da segunda dimenso. Nos experimentos de HSQC e HMBC, a segunda dimenso
traz a informao dos deslocamentos qumicos de
13
C. Portanto, se o nmero de pontos, tambm chamados
incrementos, utilizados para gerar a segunda dimenso, for demasiadamente baixo, a resoluo na segunda
dimenso tambm ser baixa, resultando em dificuldade na distino dos deslocamentos qumicos de RMN
de
13
C. Porm, no h motivo algum para se utilizar um nmero de pontos ou incrementos demasiadamente
grandes. Uma vez que a faixa espectral dos espectros de RMN de
13
C bastante ampla (~220 ppm), dificilmente
haver sobreposio severa de correlaes. Quanto maior for o nmero de pontos, utilizado para gerar a
segunda dimenso, maior ser o tempo necessrio para a realizao do experimento. Portanto, o analista
dever considerar a utilizao de um maior nmero de pontos, somente quando o espectro de RMN de
1
H
indicar tratar-se de terpenos ou carboidratos, uma vez que essas classes de substncias apresentam vrios
deslocamentos qumicos tanto de
1
H quanto de
13
C bastante prximos. Perceba que a anlise prvia do
espectro de RMN de
1
H fundamental para o correto ajuste dos parmetros de aquisio dos experimentos de
RMN 2D. No caso do experimento de HSQC, como cada sinal de RMN de
1
H apresentar apenas uma nica
correlao com
13
C (
1
J
H,C
), no h necessidade da utilizao de um grande nmero de pontos, de 100 a 250
pontos so suficientes para gerar uma segunda dimenso com boa resoluo. Em se tratando de terpenos ou
carboidratos, o nmero de pontos pode ser aumentado para 300-350. No caso do experimento de HMBC,
como cada sinal de RMN de
1
H apresentar vrias correlaes com
13
C (
n
J
H,C
), h a necessidade da utilizao de
270
um nmero maior de pontos, de 300 a 500 so suficientes para ter uma segunda dimenso com boa resoluo
espectral. Nos espectrmetros Bruker, o nmero de pontos para gerar a segunda dimenso ajustado pelo
parmetro TD em F1, enquanto que, nos equipamentos Varian, ajustado pelo parmetro NI em T1.
Agora resta ao analista decidir com quantos scans cada ponto ou incremento ser adquirido. Essa a
etapa fundamental para o sucesso dos experimentos bidimensionais, uma vez que o nmero de scans est
diretamente relacionado com a sensibilidade do experimento. Se a amostra estiver concentrada poucos
scans so suficientes para cada ponto. Por outro lado, se a amostra estiver diluda, h a necessidade de se
utilizar um maior nmero de scans, mas, como fazer a escolha correta da quantidade de scans ou como saber
se amostra est concentrada ou diluda? Essa resposta est no espectro de RMN de
1
H: o analista deve
comparar a intensidade do sinal do solvente deuterado com a intensidade dos demais sinais no espectro de
RMN de
1
H. Se a intensidade do sinal do solvente for menor que a dos demais sinais, isso significa que a
amostra est bastante concentrada. Ao contrrio, se o sinal do solvente for mais intenso que os demais sinais,
isso significa que a amostra est diluda. Informaes baseadas na quantidade de amostra colocada no tubo
podem conduzir a concluses precipitadas, considerando que trata-se de misturas. Por isso, recomendou-se,
no incio deste captulo, que o analista se preocupasse, inicialmente, somente com a aquisio de um bom
espectro de RMN de
1
H, pois somente aps a avaliao deste que se dar seguimento anlise estrutural,
verificando se h a necessidade da realizao de experimentos adicionais e quais experimentos so necessrios
bem como program-los adequadamente.
Analisando a relao de intensidade do sinal do solvente versus demais sinais nos espectros de RMN
de
1
H das figuras 1 e 2, observa-se que o espectro de RMN de
1
H da figura 1, obtido em CDCl
3
, apresenta um
sinal residual de CHCl
3
em 7,26 ppm mais intenso que os demais sinais. Da mesma forma, o espectro de RMN
de
1
H da figura 2, obtido em DMSO-d
6
, tambm apresenta um sinal residual de DMSO no deuterado em 2,51
ppm e mais intenso que os sinais de interesse. Portanto, ambas amostras esto diludas, significando que o
nmero de scans utilizados nos experimentos bidimensionais no deve ser demasiadamente pequeno. Nesses
dois casos, 16 scans so suficientes para a deteco dos sinais no experimento de HSQC. Se os sinais de
interesse so muito inferiores ao sinal do solvente, o analista dever aumentar gradualmente a quantidade de
scans para 32, 64, 128 e assim sucessivamente. J para o experimento de HMBC necessria a utilizao de
um nmero maior de scans. Uma boa escolha utilizar o dobro de scans, no experimento de HMBC, do que
aquele utilizado no experimento de HSQC, porque a deteco das correlaes
1
H-
13
C a longa distncia de
mais difcil percepo. Em resumo, ambos espectros de RMN de
1
H das figuras 1 e 2 indicam que os experimentos
de HSQC e HMBC podem ser adquiridos com 16 e 32 scans, respectivamente.
Aliando essa informao com a discusso anterior sobre o nmero de pontos para gerar a segunda
dimenso, a anlise dos espectros de RMN de
1
H das figuras 1 e 2 indica que pode-se utilizar 16 scans para
cada um dos 128 pontos para se obter um bom mapa de correlao direta
1
H-
13
C no experimento de HSQC e
32 scans para cada um dos 400 pontos no experimento de HMBC. Essas concluses foram tomadas, tendo por
base um espectrmetro equipado com uma sonda de deteco inversa e com gradiente de campo. Caso o
espectrmetro seja equipado com uma sonda de deteco direta, tambm com gradiente de campo, o
nmero de scans de ambos os experimentos de HSQC e HMBC deve ser, respectivamente, dobrado para 32
e 64. Se o analista deparar-se com uma situao como a apresentada na figura 5, em que a intensidade dos
sinais da amostra so quase imperceptveis quando comparados ao sinal do solvente, o caso de se aumentar
drasticamente o nmero de scans, bem como reduzir um pouco o nmero de pontos para gerar a segunda
dimenso e no tomar muito tempo do espectrmetro. Uma escolha prudente neste caso seria utilizar 100
271
scans por 80 pontos para a aquisio do experimento de HSQC e 250 scans por 160 pontos para a aquisio do
experimento de HMBC.
FIGURA 5 | Espectro de RMN de
1
H de uma amostra de extrato metanlico
de Annona amazonica R.E. Fr., evidenciando a baixa concentrao
de suas substncias (400 MHz, CDCl
3
).
Se o analista perceber que correlaes
1
H-
13
C importantes podem estar faltando, isto significa que o(s)
experimentos foi(ram) adquirido(s) com uma quantidade de scans insuficiente. Recomenda-se assim que
o(s) experimento(s) seja(m) repetido(s) com um maior nmero de scans. Nos espectrmetros Bruker, o
nmero de scans ajustado pelo parmetro NS, enquanto que, nos equipamentos Varian, ajustado pelo
parmetro NT.
Finalmente, antes de adquirir cada experimento de RMN 2D necessrio que o analista ajuste a
sintonia da sonda para ambos os ncleos de
1
H e
13
C. Se a sintonia no for ajustada, os pulsos de radiofrequncia
no sero eficientemente transmitidos amostra, ocasionando perda de sensibilidade do experimento.
A seguir, sero discutidos exemplos da aplicao dos experimentos de HSQC e HMBC na elucidao
estrutural de substncias naturais diretamente em fraes semipurificadas ou extratos vegetais. Voltando
figura 1, correspondente ao espectro promissor de uma frao semipurificada de Vernonia scorpioides (Lam.)
Pers., a mesma foi submetida a aquisio de experimentos de RMN 2D (HSQC e HMBC, Figuras 6 e 7,
respectivamente).
A explorao do experimento de correlao direta
1
H-
13
C do experimento de HSQC (Figura 6)
permitiu verificar que o hidrognio em 9,79 ppm est ligado a um carbono em 191,2 ppm, confirmando
a presena do grupo aldedo (Figura 8a). Da mesma forma, foi possvel determinar que os hidrognios
em 7,44, 7,38 e 7,02 ppm esto ligados aos carbonos em 114,1, 126,3 e 115,3 ppm, respectivamente
(Figura 8a). J os hidrognios da dupla ligao cis em 7,62 e 6,28 ppm esto conectados aos carbonos
em 143,5 e 113,6 ppm, respectivamente, enquanto que os hidrognios da dupla ligao trans em 7,54
272
e 6,26 ppm esto diretamente ligados aos carbonos em 144, 7 e 115,7 ppm, respectivamente.
Analisando a regio de hidrognio aromticos dessa frao (Figura 1), conjuntamente com o
experimento de HSQC, um segundo conjunto de sinais que nos remete a um novo anel aromtico
1,2,4 trisubstitudo pode ser encontrado. Esses sinais em 7,10, 7,00 e 6,87 ppm, no espectro de RMN
de
1
H (Figura 1), correlacionam respectivamente com os carbonos em 114,2, 122,4 e 115,6 ppm,
conforme evidenciou o mapa de correlao direta
1
H-
13
C (Figura 6). Alm disso, existem ainda outros
dois simpletos intensos em 6,85 e 6,93 ppm (Figura 1), os quais, segundo o experimento de HSQC,
possuem correlaes com os carbonos em 107,5 e 103,3, respectivamente. Ambos deslocamentos
qumicos de RMN de
1
H e
13
C so caractersticos de substncias aromticas. Duas interpretaes so
coerentes com os dois simpletos: 1) dois anis aromticos pentasubstitudos ou 2) ambos os
hidrognios esto no mesmo anel aromtico em uma relao para. Porm, anis aromticos
pentasubstitudos so um tanto raros em produtos naturais, portanto optaremos pela segunda opo.
Alm disso, voltando ao espectro de RMN de
1
H (Figura 1) e analisando com maior critrio esses dois
sinais, nota-se que os mesmos so um pouco mais alargados que os demais, indicando que
possivelmente podem estar acoplando entre si em uma relao para. O acoplamento entre hidrognio
em relao para em anis aromticos muito pequeno, da ordem de 0,2 Hz, o que pode causar
apenas alargamento dos sinais, sem desdobr-los.
FIGURA 6 | Mapa de correlao direta
1
H-
13
C, proveniente do experimento
de HSQC da frao semipurificada de caules de Vernonia
scorpioides (Lam.) Pers. (400 MHz, CDCl
3
).
273
FIGURA 7 | Mapa de correlao
1
H-
13
C a longa distncia, proveniente do
experimento de HMBC da frao semipurificada de caules de
Vernonia scorpioides (Lam.) Pers. (400 MHz, CDCl
3
).
Neste ponto necessrio alertar ao leitor que as figuras 6 e 7 foram inseridas neste captulo
apenas para ilustrar os experimentos bidimensionais, pois nenhuma das informaes citadas neste texto
poderiam ter sido extradas sem que cada regio do mapa fosse adequadamente ampliada. A explorao
completa de dados de RMN somente possvel com o auxlio de programas computacionais, os quais
permitem no somente observar em detalhes cada regio dos mapas de correlao, mas tambm
aumentar ou diminuir os nveis de corte, possibilitando assim a observao das correlaes menos
intensas, provenientes daqueles componentes em menor concentrao ou de correlaes menos
favorecidas. A tabela 2 lista alguns programas computacionais dedicados ao processamento e explorao
de dados de RMN.
274
Recomenda-se que o analista tome nota dos fragmentos identificados, incluindo a atribuio de
deslocamentos qumicos de RMN de
1
H e
13
C, como mostrado na figura 8a, pois ser de fundamental
importncia para estabelecer as conexes entre esses fragmentos.
FIGURA 8a | Alguns fragmentos estruturais identificados na frao
semipurificada de caules de Vernonia scorpioides (Lam.) Pers., a
partir da anlise do espectro de RMN de
1
H e do experimento de
HSQC.
Aps determinadas as correlaes diretas
1
H-
13
C via HSQC, o analista dever voltar a ateno para
o mapa de correlaes
1
H-
13
C a longa distncia, proveniente do experimento de HMBC (Figura 7). A
explorao do experimento de HMBC, permitiu verificar que o hidrognio em 7,10 ppm possui correlaes
com os carbonos em 122,4, 146,2, 144,7 e 144,0 ppm, o hidrognio em 7,00 ppm com os carbonos em
146,2, 114,2 e 144,7 ppm, e o hidrognio em 6,87 ppm apresenta correlaes com os carbonos em
127,5 e 144,0 ppm. Todas as correlaes
1
H-
13
C a longa distncia, observadas no experimento de HMBC,
sero descritas ao lado de cada deslocamento qumico de RMN de
1
H nos fragmentos estruturais
apresentados na figura 8a, atualizando a mesma para a figura 8b. Recomenda-se que o analista utilize
esta sistemtica em sua elucidao estrutural.
275
FIGURA 8b | Atualizao da figura 8a, incluindo as correlaes
1
H-
13
C a longa
distncia, a partir da anlise do experimento de HMBC.
Ao analisar as correlaes
1
H-
13
C a longa distncia dos sinais em 7,10 e 7,00 ppm (fragmento D, figura
8b), percebe-se que ambos hidrognios correlacionam com o mesmo carbono em 144,7 ppm, o qual
exatamente um dos carbonos da dupla ligao trans (fragmento C, figura 8b). Portanto, o fragmento C pode
ser conectado posio 4 em R
3
do anel aromtico no fragmento D (Figura 8c). Essa conexo pode ser
276
confirmada pela correlao do hidrognio em 7,54 ppm com os carbonos do anel aromtico em
114,2 e 122,4 ppm no fragmento D. Alm dessas, o hidrognio em 7,54 ppm apresenta uma correlao
com um carbono em 167,7 ppm, indicando haver um grupamento ster ligado ao fragmento C em
R
2
. As correlaes do hidrognio em 6,26 ppm com os carbonos em 167,7 e 127,5 ppm permitiram
confirmar a presena do grupo ster conectado ao fragmento C, bem como atribuir o deslocamento
qumico de RMN de
13
C do carbono na posio 4 do fragmento D, como sendo 127,5 ppm. O
hidrognio em 7,00 ppm tambm apresenta duas outras correlaes com os carbonos em 114,2 e
146,2 ppm. Em um sistema aromtico, as correlaes mais intensas so aquelas entre hidrognios e
carbonos distantes a trs ligaes. Dessa forma, como o deslocamento qumico de 114,2 ppm j
est atribudo a C-3 (fragmento D, Figura 8b), resta atribuir o deslocamento qumico em 146,2 ao
carbono 1, o qual est distante trs ligaes do hidrognio em 7,00 ppm (Figura 8b). O hidrognio
em 6,87 ppm apresenta duas correlaes em 127,5 e 144,0 ppm, permitindo assim confirmar a
atribuio do carbono 4, bem como atribuir o deslocamento de 144,0 ppm a C-2, o qual est distante
trs ligaes do hidrognio em 6,87 ppm (Figura 8b). Para confirmar se as atribuies dos carbonos
1 e 5 esto corretas, o analista deve verificar se o hidrognio em 7,10 ppm apresenta correlaes
intensas com os carbonos em 122,4 e 146,2 ppm os quais esto distantes trs ligaes dele. Analisando
o mapa de correlao da figura 7, observa-se que exatamente esta a situao. Os deslocamentos
qumicos dos carbonos, nas posies 1 e 2 em 146,2 e 144,0 ppm, respectivamente, indicam que
ambos esto ligados aos tomos de oxignio (Figura 8c).
Boa parte da elucidao estrutural de um dos componentes desta frao foi resolvida, restando
determinar se os tomos de oxignios, nas posies 1 e 2 do fragmento D, se referem a hidroxilas ou
se h algum grupamento ligado ao(s) mesmo(s), bem como qual grupamento est ligado ao grupo
ster. Ao analisarmos o espectro de RMN de
1
H desta frao (Figura 1), observa-se que existem
simpletos intensos na regio de 3,5 a 4,5 ppm (caracterstico de metoxilas). Porm, a anlise do
mapa de correlao
1
H-
13
C, a longa distncia, mostra que nenhum dos sinais da regio de metoxila
apresenta correlao com os carbonos em 144,0 ou 146,2 ppm. Sendo assim, pode-se concluir que
h dois grupos hidroxilas nas posies 1 e 2 desta estrutura (Figura 8c). Por outro lado, a explorao
do experimento de HMBC evidenciou que o quarteto em 4,25 ppm correlaciona com o carbono em
167,7 ppm. Pelo experimento de HSQC os hidrognios desse quarteto esto diretamente ligados ao
carbono em 60,5 ppm, caracterstico de carbonos alifticos ligados ao oxignio. O sinal em 4,25
ppm, por ser um quarteto de 7, 1 Hz, indica um acoplamento com outros trs hidrognios
quimicamente equivalentes, muito provavelmente de um grupo metila. Alm disso, os hidrognios
em 4,25 ppm apresentam somente uma segunda correlao a longa distncia com um carbono em
14,4 ppm, o qual por sua vez esta diretamente conectado aos hidrognios de um tripleto em 1,33
ppm (J=7, 1 Hz). Essas informaes revelaram, portanto, que existe um grupo etila ligado ao
grupamento ster (Figura 8c). Repare que ambos, o quarteto e o tripleto, esto em regies bastante
congestionadas no espectro de RMN de
1
H (Figura 1), demonstrando que os experimentos de RMN
2D foram fundamentais para as concluses acima. Uma vez estabelecida uma estrutura molecular,
ela deve ser verificada, confrontando os deslocamentos qumicos de RMN de
1
H e de
13
C com aqueles
descritos na literatura. Se a substncia for indita, a confirmao da estrutura poder ser realizada
por meio da espectrometria de massas.
277
FIGURA 8c | Atualizao da figura 8b, conectando os fragmentos estruturais,
a partir da anlise do experimento de HMBC.
278
Elucidada a substncia, contendo a dupla ligao trans, passa-se a analisar a estrutura da substncia,
contendo a dupla ligao cis, iniciando justamente por observar as correlaes
1
H-
13
C a longa distncia dos
hidrognios do fragmento B. O hidrognio em 7,62 ppm apresenta correlaes a longa distncia com os
carbonos em 107,5, 150,2 e 161,8 ppm. Perceba que o deslocamento qumico de RMN de
13
C de 107,5
ppm est localizado na posio 3 do fragmento A (Figura 8b). J o hidrognio em 6,85 ppm, localizado no
fragmento A, apresenta trs correlaes com os carbonos em 149,6, 150,2 e 143,5, sendo este ltimo
localizado no fragmento B. Essas informaes so suficientes para conectar o fragmento B posio 4 do
fragmento A em R
3
(Figura 8c), bem como detectar que existe um grupo ster ligado ao fragmento B em
R
2
. Como ambos hidrognios em 6,85 e 7,62 ppm apresentaram correlao com o carbono em 150,2 ppm,
este somente pode estar localizado na posio 5 do fragmento A, restando atribuir o valor de 149,6 ppm
posio 1 do fragmento A (Figura 8c). O hidrognio, na posio 6 do fragmento A em 6,93 ppm (Figura 8b),
apresenta uma correlao com um carbono em 144,1 ppm, a qual somente pode ser atribuda ao carbono
da posio 2 do fragmento A (Figura 8c). O hidrognio em 6,28 ppm (fragmento B) apresentou correlaes
com os carbonos em 111,5 e 161,8 ppm, possibilitando, assim, atribuir o deslocamento de 111,5 ppm ao
carbono da posio 4 do anel aromtico do fragmento A, bem como confirmar a presena do grupo ster
ligado ao fragmento B (Figura 8c).
Os deslocamentos qumicos de RMN de
13
C em 144,1, 149,6 e 150,2 ppm indicam que os carbonos
das posies 1, 2 e 5 esto ligados aos tomos de oxignio. Analisando, novamente, o mapa de correlaes
do experimento de HMBC, foi encontrada somente uma correlao de um simpleto em 3,96 ppm com o
carbono em 144,1 ppm (Figura 7). Portanto, existe um grupo metoxila ligado posio 2 do fragmento A,
enquanto as posies 1 e 5 esto ocupadas por hidroxilas (Figura 8c). Da mesma forma, a explorao exaustiva
do experimento de HMBC permitiu verificar que nenhum outro hidrognio apresentou correlao com o
carbono em 161,8 ppm, possibilitando concluir que, na verdade, se trata de um grupo cido carboxlico ao
invs de um grupo ster como originalmente proposto (Figura 8c).
Os hidrognios de aldedo em 9,79 ppm, bem como os hidrognios aromticos em 7,44, 7,38 e 7,02
ppm no apresentaram correlaes com os carbonos das duas estruturas anteriores, sugerindo assim haver a
presena de uma nova estrutura. O hidrognio em 9,79 ppm apresentou correlaes com carbonos em
130,1, 114,1 e 126,3 ppm, sendo que os dois ltimos esto localizados no fragmento E (Figura 8b). Da mesma
forma, ambos hidrognios em 7,44 e 7,38 ppm correlacionaram com o carbono de aldedo em 191,2 ppm,
confirmando assim que o fragmento F est conectado ao carbono da posio 4 em R
3
do fragmento E. Alm
da correlao com o carbono em 191,2 ppm, o hidrognio em 7,44 ppm tambm apresentou correlao com
o carbono em 126,3 ppm, o qual j est atribudo posio 5, e tambm com o carbono em 150,5 ppm,
indicando que as trs ligaes somente podem ser atribudas ao carbono na posio 1 do anel aromtico do
fragmento E. As correlaes do hidrognio em 7,38 ppm permitem confirmar as atribuies dos carbonos das
posies 1 e 3. J o hidrognio em 7,02 ppm apresenta correlaes com os carbonos em 144,1 e 130,1 ppm
permitindo atribuir esses deslocamentos aos carbonos 2 e 4 do fragmento E, respectivamente (Figura 8c). Os
dois deslocamentos esto distantes trs ligaes do hidrognio em 7,02 ppm e, portanto, as atribuies das
posies 2 e 4 poderiam estar trocadas entre si. No entanto, o hidrognio em 9,79 ppm, somente pode
apresentar correlao com o carbono em 130,1 ppm se ele estiver na posio 4 do fragmento E (Figura 8c).
Da mesma forma que nas estruturas anteriores, os deslocamentos qumicos de
13
C em 144,1 e 150,5 ppm
indicam que os carbonos das posies 1 e 2 possuem tomos de oxignio ligado aos mesmos. A explorao
rigorosa do mapa de correlao
1
H-
13
C, a longa distncia, no evidenciou nenhuma correlao adicional com
esses carbonos, permitindo assim concluir que existem duas hidroxilas nessas posies (Figura 8c).
279
Perceba que foi possvel realizar a completa e inequvoca atribuio de deslocamentos qumicos de
RMN de
1
H e
13
C de todas as substncias por meio dos experimentos de correlao heteronuclear
1
H-
13
C, sem
necessidade alguma da aquisio de espectro de RMN de
13
C. Dessa forma, o analista deve considerar a
aquisio de espectros de RMN de
13
C somente aps a explorao exaustiva dos mapas de correlao de
HSQC e HMBC. Por outro lado, se o espectro de RMN de
1
H indicar a presena de terpenos ou carboidratos, a
aquisio de espectros de RMN de
13
C recomendada, devido a grande similaridade de deslocamentos tanto
de
1
H, quanto de
13
C, nesses casos.
Outra forma de identificar substncias em um extrato ou frao por meio da comparao de seus
dados espectrais, com aqueles de substncias isoladas anteriormente na mesma espcie ou gnero. Neste
contexto, a explorao prvia dos experimentos de RMN 2D pode auxiliar na identificao de correlaes j
conhecidas, direcionando assim a anlise.
A explorao do mapa de correlao
1
H-
13
C, proveniente do experimento de HMBC (Figura 7), revelou
que os hidrognios do simpleto em 4,36 ppm (Figura 1) possuem cinco correlaes com carbonos quaternrios
na regio de 60,2 a 75,6 ppm (Figura 7). Da mesma forma, ambos hidrognios em 2,76 e 2,77 ppm, que
apresentaram correlao direta
1
H-
13
C com o mesmo carbono em 26,3 ppm, no experimento de HSQC
(portanto um grupo CH
2
), tambm apresentaram correlaes com alguns dos mesmos carbonos na regio de
60,2 a 75,6 ppm (Figura 7). Essas constataes permitem suspeitar da presena de poliacetilenos j identificados
em Vernonia scorpioides (Lam.) Pers.. Portanto, bastou comparar (sobrepor) o espectro de RMN de
1
H dessa
frao com aqueles de poliacetilenos isolados e identificados anteriormente (Figura 9). Novamente vamos
enfatizar que essa comparao de espectros somente foi possvel com o auxlio de softwares especficos para
explorar dados de RMN. A sobreposio de mapas de correlao tambm possvel.
FIGURA 9 | Comparao entre os espectros de RMN de
1
H: A) da frao
semipurificada, a partir do extrato hidroalcolico de caules de
Vernonia scorpioides (Lam.) Pers. e B) de um poliacetileno
previamente isolado das partes areas da mesma planta (400
MHz, CDCl
3
).
280
De forma anloga, por meio da extrao de algumas informaes dos experimentos de HSQC e
HMBC (Figuras 6 e 7) e da comparao do espectro de RMN de
1
H (Figura 1) com aqueles de substncias
isoladas previamente na mesma planta, foi possvel identificar uma quinta e ltima substncia nessa mesma
frao. Os hidrognios em 4,83 e 4,96 ppm, ambos dupletos de 12,9 Hz (caracterstico de acoplamento
geminal), correlacionaram com o mesmo carbono em 54,9 ppm, no experimento de HSQC, confirmando a
presena de um grupo CH
2
. J, no experimento de HMBC, estes hidrognios apresentaram correlaes com
carbonos em 127,2, 154,6, 167,2 e 170,2 ppm (Figura 7). Tambm foi observado um simpleto em 5,89 ppm
que mostrou correlaes com os carbonos em 154,6, 144,1 e 83,4 ppm no experimento de HMBC. Essas
informaes foram suficientes para indicar a presena de lactonas sesquiterpnicas caractersticas do
gnero Vernonia Schreb., j isoladas e identificadas pelo grupo de pesquisa. Sendo assim, novamente
bastou comparar o espectro de RMN de
1
H desta frao com aqueles isolados anteriormente para concluir
que se tratava da lactona sesquiterpnica piptocarfina-D. Portanto, o analista deve ficar atento s substncias
j identificadas pelo grupo de pesquisa, bem como com aquelas descritas na literatura para a espcie,
gnero ou famlia.
Outro exemplo notvel da importncia do emprego da RMN 2D, na identificao de substncias
diretamente em extratos, foi na investigao do extrato etanlico das flores da espcie Pyrostegia venusta
(Ker Gawl.) Miers. No espectro de RMN de
1
H deste extrato (Figura 10), existe um sinal em 5,42 ppm,
aparentemente insignificante entre os demais. No entanto, no experimento de HSQC, este hidrognio
apresentou correlao direta com o carbono em 63,8 ppm e, a longa distncia, com os carbonos em 158,9,
160,3 e 174,0 ppm no experimento de HMBC (Figura 11). Essas informaes foram suficientes para concluir
que estes dados se referem substncia alantona, j descrita em literatura para outra espcie de Pyrostegia
C. Presl.
FIGURA 10 | Espectro de RMN de
1
H do extrato etanlico das flores de
Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers (400 MHz, MeOD).
281
FIGURA 11 | Mapas de correlao
1
H-
13
C direta (HSQC) e
longa distncia (HMBC) do extrato etanlico das flores
de Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers (400 MHz, MeOD),
enfatizando as correlaes para
o hidrognio em 5,42 ppm.
Alm do sinal mencionado anteriormente, o espectro de RMN de
1
H deste extrato apresenta
diversos outros sinais intensos e ntidos, principalmente na regio de hidrognios aromticos (Figura
10). Portanto, se o analista seguir o procedimento descrito, neste captulo, ser possvel identificar as
outras substncias presentes neste extrato, como o verbascosdeo (majoritrio). No entanto, possvel
notar sinais de menor intensidade, como dois dupletos em 6,22 e 6,42 ppm (nas setas, Figura 10), os
quais possuem constantes de acoplamento de 2,1 Hz, indicando estarem em relao meta em um anel
aromtico. O experimento de HSQC revelou que os hidrognios destes dupletos esto ligados aos
carbonos em 99,8 e 94,5 ppm, respectivamente (Figura 12). O experimento de HMBC revelou que o
hidrognio em 6,42 ppm possui correlaes com os carbonos em 99,8, 105,2, 158,1 e 165,4 ppm,
enquanto o hidrognio em 6,22 ppm possui correlaes com os carbonos em 94,5, 105,2 e 162,4 ppm
(Figura 12). Os deslocamentos qumicos de RMN de
13
C em 158,1, 162,4 e 165,4 ppm indicam que trs
carbonos desse anel aromtico possuem tomos de oxignio ligados. Essas informaes foram
suficientes para revisar a literatura sobre o gnero e descobrir que esses dados coincidem com aqueles
do flavonoide rutina.
282
FIGURA 12 | Mapas de correlao
1
H-
13
C direta (HSQC) e longa distncia
(HMBC) do extrato etanlico das flores de Pyrostegia venusta (Ker
Gawl.) Miers (400 MHz, MeOD), enfatizando as correlaes para os
hidrognios em 6,22 e 6,42 ppmindicados pelas setas e
fragmentos estruturais propostos a partir destes experimentos.
283
RMN 2D: CORRELAO HOMONUCLEAR
1
H-
1
H
At este ponto, discutiu-se que espectros de RMN de
1
H juntamente com experimentos de
HSCQ e HMBC podem ser suficientes para a elucidao estrutural de diversas substncias. No espectro
de RMN de
1
H das figuras 1, 2 e 10, no houve dificuldade na identificao dos sistemas de spins. No
entanto, em espectros de RMN de
1
H que apresentam alta sobreposio de sinais, pode haver
dificuldade na identificao de alguns sistemas de spins. Nesses casos, o analista deve considerar a
aquisio de experimentos de COSY ou TOCSY.
O experimento de COSY (COrrelation SpectroscopY) permite detectar somente os hidrognios
que esto diretamente acoplando entre si, enquanto o experimento de TOCSY (TOtal Correlation
SpectroscopY) permite detectar todos os hidrognios que pertencem ao mesmo sistema de spins,
mesmo no acoplando entre si (Figura 13). Isso porque o experimento de TOCSY mostra correlaes
entre hidrognios distantes, podendo estar a vrias ligaes um do outro, desde que faam parte do
mesmo sistema de spins. Em outras palavras, a correlao no TOCSY vai se propagando pela estrutura,
enquanto houver tomos de hidrognios adjacentes. Dessa forma, o experimento de TOCSY permite
extrair cada sistema de spin individual em um espectro de RMN de
1
H com alta sobreposio de
sinais.
FIGURA 13 | Correlaes
1
H-
1
H fornecidas pelos experimentos de COSY e
TOCSY.
A segunda dimenso, nos experimentos de COSY e TOCSY, gerada da mesma maneira que nos
experimentos de HSQC e HMBC. Portanto, o ajuste para a aquisio desses experimentos se d da mesma
forma, escolhendo o nmero de scans com o qual cada ponto ser adquirido e com quantos destes pontos
ser gerada a segunda dimenso. Como a abundncia natural do istopo de
1
H alta, no h a necessidade de
utilizar um grande nmero de scans. De 1 a 4 scans so suficientes para amostras concentradas (com os sinais
de interesse de mesma ou maior intensidade que o sinal do solvente). J para amostras diludas (sinais de
interesse inferiores ao sinal do solvente), de 4 a 8 scans so suficientes. Em amostras extremamente diludas
o analista poder utilizar 16 scans. Com relao ao nmero de pontos, recomendada a utilizao de 100 a
284
250 pontos para evitar perda de resoluo na segunda dimenso. No caso de experimentos de correlao
1
H-
1
H, no haver perda de sensibilidade para prejudicar os experimentos se o espectrmetro for equipado com
uma sonda de deteco direta. Mas importante que a sonda possua gradiente de campo. Embora no seja
um impeditivo para a execuo dos experimentos de COSY e TOCSY, o gradiente de campo permite obter
experimentos com qualidade superior.
O prximo exemplo discute o emprego de experimentos de COSY e TOCSY na identificao de
substncias em um extrato alcalodico de Annona foetida Mart., cujo espectro de RMN de
1
H (Figura 14)
mostrou sobreposio de sinais na regio de hidrognios aromticos, dificultando o estabelecimento dos
sistemas de spins.
FIGURA 14 | Espectro de RMN de
1
H do extrato alcalodico de Annona foetida
Mart., enfatizando a regio de hidrognios aromticos (400 MHz,
CDCl
3
).
O experimento de COSY permitiu determinar com preciso que o dupleto em 8,91 ppm apresentava
correlao com o dupleto em 7,80 ppm (J=5,2 Hz) (Figura 15) e um segundo dupleto, de menor intensidade,
em 8,93 ppm se correlacionava com o dupleto em 8,20 ppm (J=5,3 Hz). Constantes de acoplamento (J) da
ordem de 5,0 a 5,4 Hz so caractersticas de sistemas de spins de hidrognios em anis piridnicos de
alcaloides. Com base nessas evidncias, foi possvel afirmar que a amostra continha pelo menos dois alcaloides
piridnicos. O sinal em 8,69 ppm, aparentemente um dupleto, apresentou correlao somente com o sinal
em 7,78 ppm, severamente sobreposto, o qual por sua vez mostrou correlao adicional com o sinal em 7,60
ppm, tambm sobreposto, que mostrou correlao com o sinal em 8,60 ppm, aparentemente um duplo-
dupleto, que no mostrou correlao adicional. Portanto, o sistema de spins formado apenas por estes
quatro hidrognios aromticos, permitindo assim determinar a presena de um anel aromtico 1,2 disubstitudo
(Figura 15).
285
FIGURA 15 | Mapa de correlao
1
H-
1
H (COSY) extrato do alcalodico de
Annona foetida Mart. (400 MHz, MeOD), enfatizando as
correlaes dos hidrognios aromticos e fragmentos estruturais
determinados.
286
Alm desse, foi possvel determinar um segundo sistema de spins similar, atravs da correlao do
hidrognio em 8,57 ppm com o hidrognio em 7,53 ppm, o qual apresentou correlao adicional com o
hidrognio em 7,73 ppm, severamente sobreposto. Este ltimo, por sua vez, apresentou correlao com o
hidrognio em 8,61 ppm tambm severamente sobreposto, que no mostrou correlao adicional (Figura
15). O espectro de RMN de
1
H evidenciou a presena de singletos intensos na regio de 3,5 a 4,5 ppm e de 6,0
a 6,5 ppm, indicando respectivamente a presena de metoxilas e metilenodixidos, grupamentos caractersticos
de alcaloides. Finalmente, por meio dos experimentos de correlao heteronuclear
1
H-
13
C de HSQC e HMBC,
utilizando a sistemtica discutida anteriormente, foi possvel conectar todos esses fragmentos estruturais,
resultando nos alcaloides liriodenina, em maior proporo, e 3-metoxi-liriodenina, em menor proporo
(Figura 14). A comparao desses dados com aqueles descritos na literatura confirmou as estruturas propostas.
Da mesma forma, esses experimentos possibilitaram realizar a completa e inequvoca atribuio de
deslocamentos qumicos de RMN de
1
H e
13
C, sem necessidade alguma da aquisio de espectros de
13
C, nem
do isolamento das substncias.
possvel identificar um nmero maior de substncias por meio dessa sistemtica, empregando
experimentos de COSY. Por exemplo, no extrato alcalodico de Annona amazonica R.E. Fr. (Figura 16), foram
identificados os alcaloides liriodenina, 11-metoxi-liriodenina, oxonuciferina e 3-metoxi-liriodenina.
FIGURA 16 | Espectro de RMN de
1
H do extrato alcalodico de Annona
amazonica R.E. Fr., enfatizando a regio de hidrognios
aromticos (400 MHz, CDCl
3
).
Outra forma interessante de estabelecer os sistemas de spins por meio de experimentos de TOCSY.
Como neste experimento as correlaes se propagam atravs dos hidrognios adjacentes, basta encontrar
apenas um hidrognio, que apresente deslocamento qumico no sobreposto, para ser utilizado como ponto
de partida no estabelecimento do sistema de spins. Esse experimento foi utilizado na investigao de um
287
extrato alcalodico de Guatteria hispida R.E. Fr. para o qual o espectro de RMN de
1
H mostrou haver severa
sobreposio de sinais na regio de hidrognios aromticos (Figura 17). Entre as diversas observaes, o
experimento de TOCSY permitiu observar que o hidrognio no sobreposto em 8,74 ppm apresentava
correlaes com outros trs hidrognios em 7,62, 7,83 e 8,46 ppm. Tambm foi observado que o hidrognio
no sobreposto em 9,26 ppm apresentava correlaes com outros trs hidrognios em 8,48, 7,84 e 7,63
ppm. Estas informaes associadas com aquelas das correlaes heteronucleares
1
H-
13
C dos experimentos de
HSQC e HMBC, permitiram inicialmente propor dois fragmentos do tipo daqueles, mostrados na figura 15. Em
resumo o espectro de RMN de
1
H, juntamente com os experimentos de RMN 2D homo e heteronucleares,
possibilitaram extrair uma grande quantidade de informaes sobre a amostra, as quais foram confrontadas
com a literatura, bem como com dados obtidos anteriormente sobre substncias isoladas, possibilitando a
identificao dos alcaloides liriodenina, asimilobina, lisicamina, lanuginosina, 3-metoxi-liriodenina e 11-metoxi-
liriodenina.
FIGURA 17 | Espectro de RMN de
1
H do extrato alcalodico de Guatteria
hispida R.E. Fr., enfatizando a regio de hidrognios aromticos
(400 MHz, CDCl
3
).
CONSIDERAES FINAIS
A explorao dos aspectos qumicos da biodiversidade brasileira extremamente desafiante, h
muito por ser investigado. O Brasil dispe de ferramentas e infraestrutura adequada e vem formando recursos
humanos especializados, para os quais este captulo pretendeu contribuir por meio das discusses apresentadas.
Espera-se ter transmitido ao leitor uma ideia sobre a sistemtica de elucidao estrutural de produtos naturais,
tendo como base a explorao adequada dos espectros de RMN de
1
H e dos experimentos de RMN 2D de
HSQC, HMBC, COSY e TOCSY.
288
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Francinete R. Campos e Carlos E. M. Campos pelas contribuies e revises
deste captulo, ao CNPq e INCT_if.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
Esta lista contm sugestes de leitura para aprofundar o tema:
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CROMATOGRAFIA EM CONTRACORRENTE
Marcelo Aparecido da Silva
Wagner Vilegas
HISTRIA DA CROMATOGRAFIA
LQUIDO-LQUIDO
Em meados da dcada de 40, dois qumicos
ingleses, Archer John Porter Martin e Richard
Laurence Mi l li ngton Synge, el aboraram um
aparelho capaz de manter em contato uma mistura
de lquidos imiscveis. O contato entre os lquidos
aconteci a de forma que as duas fases
apresentavam, durante o processo de anlise, fluxo
contrri o entre si . Esse equi pamento foi
desenvol vi do com o obj eti vo de separar
aminocidos de misturas complexas. No entanto,
as separaes no foram muito promissoras, pois o
aparelho era muito complexo, os lquidos saiam
muito facilmente do sistema de separao e os
processos de separaes exigiam um longo tempo
de anlise. Sendo assim, esse equipamento foi
rapidamente abandonado, devido aos resultados
no muito promissores apresentados (MACIUK,
2005).
290
Lyman Creighton Craig, durante sua pesquisa, a qual buscava substncias antimalricas, resgatou a
ideia j abordada por Martin & Synge, de colocar dois lquidos imiscveis em contato entre si, mas agora de
forma mais eficiente. O aparelho de Craig, (Figura 1), assim denominado, consiste de um aparato de vidro
organizado de tal modo que ele se encontra interconectado ao longo de um eixo. Essa ampola de vidro,
quando agitada, proporciona maior contato entre os dois lquidos imiscveis. Aps a separao das fases, basta
uma rotao para que haja a transferncia de uma das fases para a ampola seguinte ou para fora do aparelho
(FROM et al., 1974; JBC, 2005).
FIGURA 1 | (A) Foto do aparelho de Craig tipo tubo. (B) Esquema do
funcionamento do aparelho de Craig.
Martin & Synge, usaram o aparelho de Craig para separar diferentes tipos de N-acetil-aminocidos,
preparados por reao de acetilao. Durante os experimentos, a transferncia manual dos lquidos das
ampolas, gerava dificuldade, dentre elas a perda de grande quantidade de solvente, alm do longo tempo
gasto nas separaes. Por isso, os pesquisadores comearam a pensar na possibilidade de fixar uma das fases
em um suporte slido, tentando com isso evitar os transtornos ocasionados durante as anlises. No decorrer
do desenvolvimento, foram testados vrios suportes slidos, como fibra, slica, celulose, entre outros. O
suporte slido era destinado a reter a fase estacionria (constituda pela fase aquosa de um sistema imiscvel),
enquanto que a fase orgnica entrava em contato com o lquido retido no suporte slido. Esse mecanismo
proporcionava o aumento da superfcie de contato entre as duas fases lquidas e solucionava os problemas
ocasionados pelo uso do aparelho de Craig.
A partir do uso desse sistema, comeou a ser empregado o termo cromatografia de partio. Por essa
nova abordagem do mecanismo de separao cromatogrfica, Martin & Synge foram agraciados com o
Prmio Nobel de Qumica em 1952 (JBC, 2005; MACIUK, 2005).
Concomitantemente aos experimentos de Martin & Synge, Lyman C. Craig desenvolveu um aparelho
que apresentava 20 ampolas acopladas em srie, chamado de extrator quantitativo. O mecanismo de
separao desse equipamento seria semelhante a colocar 20 funis de separao acoplados em srie

291
simultaneamente (Figura 2). Dezenove funis possuam somente fase inferior, enquanto que um
apresentava as duas fases. O processo de agitao decantao transferncia se repetia para todos os
funis. Mas somente a fase superior era transferida para o funil subsequente. Esse processo descontnuo,
pois as fases passam pelas etapas de agitao decantao transferncia durante todo o tempo
necessrio para o experimento. O processo descontnuo provoca a perda das fases, durante as
transferncias, e, alm disso, exige longo tempo para a separao. Apesar dessas desvantagens, em
1947, Craig e Vincent du Vigneaud separaram a penicilina, a partir de um extrato obtido por processo
fermentativo (JBC, 2005).
FIGURA 2 | Foto do aparelho de Craig tipo tubo com 20 ampolas
acopladas em srie.
Em 1950 Craig acoplou 200 ampolas em srie no aparelho de extrao, e em 1958, acoplou
1000 ampolas. A partir de ento, o aparelho de Craig foi utilizado para extrair e examinar vrias substncias
biologicamente importantes, tais como gramicidina, bacitracina, insulina, cidos biliares, albumina srica,
hormnios da tireide, RNA, ribonucleases, oxitocinas, vasopressina, adenocorticotropicos e hormnios
lactognicos.
O aparelho de Craig foi usado por Robert Halley, na Universidade de Cornell, para o fracionamento
do extrato bruto de RNA, levando obteno do tRNA puro. O tempo de fracionamento do RNA foi
reduzido, implicando, assim, em uma reduo do tempo gasto para o subsequente sequenciamento do
tRNA (JBC, 2005).
Desde ento, a cromatografia em contracorrente vem sofrendo avanos significativos. Esses
avanos sempre buscaram melhorar a resoluo cromatogrfica e a diminuir o tempo das separaes. A
tabela 1 apresenta a evoluo dos aparatos usados nas extraes lquido-lquido, at as tcnicas mais
modernas de separaes cromatogrficas (MANDAVA & ITO, 1988; CONWAY, 1989; MARSTON &
HOSTETTMAN, 1991).
292
TABELA 1 - Desenvolvimento das tcnicas de separaes cromatogrficas lquido-lquido
CLASSIFICAO DOS INSTRUMENTOS DE CROMATOGRAFIA EM
CONTRACORRENTE (FIGURA 3)
I) Sistema de equilbrio hidrosttico (HSES).
II) Sistema de equilbrio hidrodinmico (HDES).
EQUIPAMENTO
AUTORES QUE
DESENVOLVERAM
ANO DO
DESENVOLVIMENTO
U - Tube cascade unit Jantzen 1932
Partition chromatography Martin & Synge 1941
Cascade percolator train Kies & Davis 1951
Compartmental perculator column Keppes 1954
High efficiency continuous mix settle Hietala
1960
Coil planet centrifuge Ito e colab. 1966
Countercurrent distribution centrifuge Tavel & Bollinger 1968
Helix CCC Ito & Bowman 1970
Dopler CCC Tanimera e colab. 1970
Locular CCC - rotation and gyration Ito & Bowman 1970
Flow-through coil planet centrifuge-pelley
drive
Ito & Bowman 1971
Eluition centrifuge-planetary pulley drive Ito e colab. 1972
Angle rotor CCC Ito & Bowman 1975
Preparative CCC-slow rotating helix Ito & Bowman 1977
Horizontal flow-through cail planet
centrifuge
Ito & Bowman 1978
Nonsynchronous coil planet centrifuge Ito e colab. 1979
Toroidal coil planet centrifuge Ito 1980
Rotating coil assembly Ito & Bhatnagar 1981
Centrifugal partition chromatography
cartridge
Ito e colab. 1981
High-speed CCC Ito 1982
293
SISTEMA DE EQUILBRIO HIDROSTTICO
No sistema de coluna esttica (com campo gravitacional constante), a coluna preenchida com a fase
estacionria de um sistema de solventes imiscveis. Em seguida, bombeia-se a fase mvel, obtida desse
mesmo sistema de solventes, o que leva a uma ejeo de aproximadamente 50% da fase estacionria. A partir
desse ponto de equilbrio hidrosttico, o sistema est pronto para receber a amostra (MANDAVA & ITO, 1988;
CONWAY, 1989; FOUCAULT, 1994; HOSTETTMANN et al., 2001).
Contudo, o sistema de equilbrio hidrosttico apresenta algumas desvantagens:
- o processo de separao lento;
- h pouca reteno da fase estacionria dentro da coluna;
- baixa resoluo nas separaes (devido a pouca reteno da fase estacionria);
- alto consumo de solvente.
SISTEMA DE EQUILBRIO HIDRODINMICO
Para solucionar essas desvantagens, foram desenvolvidas tcnicas que usam um sistema de equilbrio
hidrodinmico. Esse sistema baseia-se no uso de um campo gravitacional varivel, o qual permite reter at
80% da fase estacionria dentro da coluna cromatogrfica. Isso leva a uma sensvel melhora na resoluo
cromatogrfica, associada uma reduo no tempo de anlise e menor consumo de solventes.
O princpio desse sistema envolve uma fora centrfuga que atua na coluna cromatogrfica que a
responsvel por evitar a perda excessiva da fase estacionria e por uma contnua mistura do soluto entre as
duas fases imiscveis (MANDAVA & ITO, 1988; CONWAY, 1989; HOSTETTMANN et al., 2001; ITO, 2005).
FIGURA 3 | Classificao dos diferentes instrumentos de CCC segundo
Hostettmann et al., (2001). DCCC: Cromatografia em
contracorrente de gotejamento. RLCCC: Cromatografia em
contracorrente de rotao locular HSCCC: Cromatografia em
contracorrente de alta velocidade. CPC: Cromatografia de partio
centrfuga.
294
A cromatografia em contracorrente de partio centrfuga CPC um sistema de equilbrio
hidrodinmico, no qual a fora centrfuga pode ser variada. As colunas utilizadas pelos equipamentos, nesse
tipo de sistema, podem ser: 1) espiral (Coil Planet Centrifugal) ou 2) cartucho (Centrifugal Partition
Chromatography) (Figura 4). Na coluna em espiral, o equilbrio hidrodinmico dos solventes ocorre devido ao
movimento planetrio, enquanto que nas colunas em cartucho o equilbrio se d pelo movimento axial
central (Figura 4) (CONWAY, 1989).
FIGURA 4 | Classificao do aparelho segundo o tipo de coluna. (A) Aparelho
FCPC Kromaton Technologis

, velocidade de rotao 200-2000


rpm, capacidade da coluna 200 mL, (B) Detalhe da coluna do
Kromaton, (C) Aparelho de HSCCC P.C.Inc

, capacidade da coluna
325 mL, velocidade de rotao 0-1200 rpm, (D) Detalhe da
coluna e do contra peso do equipamento de HSCCC, onde ocorre
o movimento planetrio.
295
Dentre os equipamentos que usam o sistema hidrodinmico, o mais utilizado, nas separaes de
produtos oriundos de plantas, fungos e organismos marinhos, a cromatografia em contracorrente de alta
velocidade (High Speed Countercurrent Chromatography, HSCCC) (SUTHERLAND & FISHER, 2009).
CROMATOGRAFIA EM CONTRACORRENTE DE ALTA VELOCIDADE - HSCCC
A cromatografia em contracorrente de alta velocidade (HSCCC) uma tcnica baseada na
partio de um soluto entre dois lquidos imiscveis. A proporo do soluto que passa para cada uma
das fases determinada pela constante de distribuio (K
D
) de cada uma das substncias presentes na
amostra. A constante de distribuio uma constante fsica, caracterstica de cada substncia, e dada
pela formula:
Cada substncia dissolvida reparte-se em equilbrio entre as duas fases lquidas no miscveis de
uma forma constante e reprodutvel. Essa distribuio depende tambm da temperatura. A constante de
distribuio a principal ferramenta usada para otimizar os sistemas de solventes utilizados nas separaes
cromatogrficas (THOMAS & ROBERT, 1991; FOUCAULT & CHEVOLOT, 1998; HOSTETTMANN et al., 2003;
SUTHERLAND & FISHER, 2009).
A cromatografia em contracorrente de alta velocidade um mtodo de separao que
emprega apenas lquidos durante as separaes. A ausncia de suporte slido implica em algumas
vantagens quando comparada com outras tcnicas cromatogrficas convencionais: No ocorre
adsoro irreversvel da amostra; H recuperao total da amostra introduzida na coluna do
equipamento; Menor risco de degradao das substncias; Maior rapidez e eficincia das separaes;
Maior versatilidade na escolha dos sistemas de solventes usados nas separaes; Maior economia de
solventes e colunas; Boa resoluo em separaes semipreparativas; Aumento da rea de interface
entre as duas fases imiscveis.
No equipamento de HSCCC, a bobina (coluna) construda com tubos de PTFE (politrafluoroetileno)
enrolados em torno de um suporte central, formando camadas mltiplas (SHINOMIYA et al., 2002; ITO,
2005).
A coluna gira em torno do eixo central da centrfuga e, simultaneamente, em redor do seu prprio
eixo (Figura 5). O movimento planetrio da coluna provoca uma agitao vigorosa das fases do sistema de
solvente, gerando um processo de mistura repetitiva, que induz a formao de zonas de mistura e zonas de
separao das fases (MANDAVA & ITO, 1988; FOUCAULT & CHEVOLOT, 1998). Esse intercmbio rpido
possibilita separaes eficazes com pequenos volumes de solvente. Um dos parmetros experimentais
mais importantes () definido como a proporo entre o raio da coluna (r) e o raio do giro da coluna no
movimento planetrio (R) (Figura 5).
296
FIGURA 5 | Esquema do movimento da coluna do HSCCC.
A cromatografia em contracorrente de alta velocidade uma tcnica preparativa amplamente
empregada em laboratrios de universidades e indstrias. No campo dos produtos naturais, pode ser usada
para fracionar extratos brutos e fraes semipuras, em quantidades que variam de miligramas a gramas
(MARSTON et al., 1990; HOSTETTMANN et al., 2001; SHI et al., 2008; TONG et al., 2010). Ela particularmente
importante para separar substncias de polaridade elevada. Isto possvel, pois evita a adsoro irreversvel
da amostra na fase estacionria, fato comum em tcnicas cromatogrficas que usam suportes slidos como
fase estacionria. Por isso, tambm tem sido usada na obteno de padres qumicos de alta pureza, com
rapidez, eficincia e economia de solventes (ZHANG et al., 2003; LEITO, 2005; SUTHERLAND & FISHER,
2009).
ESCOLHA DO SISTEMA DE SOLVENTE
A correta escolha dos sistemas de solventes crucial para o xito das separaes por HSCCC.
As combinaes de solventes mais eficazes so aquelas que proporcionam uma constante de
distribuio prxima de 1 (CONWAY, 1989; FOUCAULT & CHEVOLOT, 1998). A escolha tem que obedecer
alguns pr-requisitos para que a separao seja eficiente, tais como: As misturas tm que formar sistemas
imiscveis; Os sistemas de solventes devem solubilizar a amostra; As duas fases devem separar rapidamente
aps agitao (<30 s); Se possvel, o sistema deve formar volumes iguais de fase superior e inferior; O sistema
deve proporcionar uma constante de distribuio prxima de 1; O sistema no deve formar emulses; Deve
apresentar misturas pouco viscosas; O sistema deve apresentar pequena diferena de densidade entre a fase
aquosa e a fase orgnica.
297
As misturas de solventes podem ser binrias (pouco usada, devido a grande diferena de polaridade
entre os solventes), tercirias, quaternrias, entre outras. A adio de um terceiro ou de um quarto solvente,
miscvel com os outros solventes, diminui a diferena de polaridade entre as duas fases (HOSTETTMANN et al.,
1984). Assim, consegue-se aumentar a seletividade do sistema, permitindo a separao de substncias com
fator de reteno (Rfs) prximos. A adio de um solvente auxiliar provoca, ainda, diminuio da tenso
interfacial e da viscosidade do sistema (MANDAVA & ITO, 1988; ITO, 2005). A figura 6 apresenta alguns
solventes auxiliares usados nas otimizaes de sistemas de solventes para separaes por HSCCC.
LEGENDA:
n-BuOH n-Butanol;
EtOAc Acetato de Etila;
MeOH Metanol;
n-PrOH n-Propanol;
EtOH Etanol.
FIGURA 6 | Solventes auxiliares usados nas otimizaes de sistemas de
solventes aplicados em HSCCC.
A constante de distribuio pode ser facilmente determinada, a partir da anlise da distribuio da
amostra entre a fase superior e inferior de uma mistura de solventes. Essa anlise pode ser realizada por
diversas formas: por gravimetria, por cromatografia em camada delgada ou por cromatografia lquida. Um dos
processos mais simples est descrito resumidamente na figura 7.
298
FIGURA 7 | Etapas para a determinao da constante de distribuio de uma
amostra no sistema de solvente escolhido.
299
Aproximadamente 1 mg da amostra particionada em 2 mL do sistema de solvente escolhido. As
fases inferior e superior so separadas e aplicadas em propores iguais em uma placa cromatogrfica. Aps
a eluio em um sistema de solvente que proporcione boa resoluo cromatogrfica, a placa revelada sob
luz ultravioleta e/ou com reagente adequado.
Numa situao ideal, os componentes devem se distribuir em propores aproximadamente iguais
(K
D
=1) entre as duas fases lquidas (Figura 7), (FOUCAULT & CHEVOLOT, 1998; HOSTETTMANN et al., 2003; ITO,
2005).
A tabela 2 apresenta vrios exemplos de sistemas de solventes usados em CCC, com destaque para as
fases utilizadas em DCCC, RLCCC e HSCCC.
TABELA 2 - Exemplos de sistemas de solventes utilizados em CCC para as separaes de produtos
naturais e outras amostras, transcritas segundo as literaturas: Conway, 1989; Hostettmann et al., 2001; Ito,
2005; Sutherland & Fisher, 2009
AMOSTRAS SISTEMA DE SOLVENTE (PROPORES)*
Agliconas de flavonoides CHCl
3
:MeOH:H
2
O(4:3:2)
1
CHCl
3
:MeOH:H2O(13:7:4)
3
CHCl
3
:MeOH:n-BuOH:H2O(10:10:1:6)
2, 3
EtOAc:n-PrOH:H2O(140:8:80)
1
Isoflavonas CHCl
3
:MeOH:H
2
O (7:13:8)
2, 3
EtOAc:EtOH:H2O (5:1:5)
1
EtOAc:n-BuOH:EtOH:H
2
O (30:6:10:50)
1
Hex:EtOAc:n-BuOH:MeOH:AcOH:H
2
O (1:2:1:1:1:5)
1
Flavonoides glicosilados CHCl
3
:MeOH:H
2
O (7:13:8)
2
CHCl
3
:MeOH:iso-PrOH:H
2
O (5:6:1:4)
2
CHCl
3
:MeOH:n-PrOH:H
2
O (5:6:1:4)
2
CHCl
3
:MeOH:n-BuOH:H
2
O (10:10:1:6)
2
EtOAc:n-PrOH:H
2
O (140:8:80)
1
EtOAc:n-PrOH:H
2
O (4:2:7)
3
EtOAc:n-BuOH:H
2
O (3,5:1,5:5)
1
EtOAc:n-BuOH:H
2
O (1:4:5)
1
EtOAc:n-BuOH:H
2
O (2:1:3)
1
Hex:EtOAc:MeOH:H
2
O (1:3:2:4)
1
Hex:EtOAc:MeOH:H
2
O (1:4:3:4)
1
Hex:n-BuOH:MeOH:H
2
O (1:4:2:6)
1
n-BuOH:AcOH:H
2
O (4:1:5)
2
Catequinas CHCl3:MeOH:iso-PrOH:H
2
O (8:7:1:6)
3
CHCl3:MeOH:H
2
O (7:13:8)
2, 3
EtOH:n-PrOH:H
2
O (4:2:7)
3
EtOAc:n-PrOH:H
2
O (140:8:80)
1
EtOAc:n-PrOH:H
2
O (4:2:7)
3
EtOAc:EtOH:H
2
O (25:1:25)
1
300
EtOAc:EtOH:H
2
O (25:1:25)
Hex:EtOAc:H
2
O (1:10:10)
1
Hex:EtOAc:MeOH:H
2
O (1:1:1:1)
1
n-BuOH:n-PrOH:H
2
O (2:1:3)
2
cido glico CHCl3:MeOH:H2O (7:13:8)2
EtOAc:n-BuOH:H2O (5:1,8:6)1
Alcaloides CHCl
3
:MeOH:H
2
O (7:13:8)
2
CHCl
3
:MeOH:H
2
O (5:5:3)
3
CHCl
3
:MeOH:NaAc pH 3,6 (9:12:8)
2
CHCl
3
:MeOH:HCl 5% (5:5:3)
2
CHCl
3
:MeOH:HCl 0,3M (4:1,5:2)
1
CHCl
3
:NaP 0,07M pH 6,4 (1:1)
1
CHCl
3
:NaP 0,07M pH 5,08 (1:1)
1
Hex:EtOH:H
2
O (6:5:5)
1
Hex:EtOH:MeOH:H
2
O (1:1:1:1)
1
Hex:EtOH:MeOH:H
2
O (3:7:5:5)
1
(C
2
H
5
)
2
O:(CH
3
)
2
CO:H
2
O (2:2:1)
3
Antraquinonas CHCl
3
:MeOH:n-PrOH:H
2
O (5:6:1:4)
2
CHCl
3
:MeOH:H
2
O (4:3:2)
1
Hex:EtOH:MeOH:H
2
O (9:1:5:5)
1
Hex:EtAOc:EtOH:H
2
O (5:2:4:1)
2
Lignanas CHCl
3
:MeOH:n-PrOH:H2O (5:6:1:4)
2
Hex:EtOH:MeOH:H2O (10:5:5:1)
1
Hex:EtOH:MeOH:NaCl 0,5% (7:3:5:5)
1
Hex:CHCl
3
:MeOH:NaCl 1,2% (1:4:4:2)
1
Esteroides EtOAc:n-PrOH:H
2
O (6:6:1)
3
Hex:EtOAc:MeOH:H
2
O (5:1:5:1)
1
Hex:EtOAc:MeOH:H
2
O (12:24:16:9)
1
Hex:EtOH:H
2
O (6:5:2)
1
Hep:C
2
H4Cl
2
:MeOH (47:6:72)
2
Hep:Me
2
CO:MeOH (5:1:4)
2
Hep:CH
2
Cl
2
:CH
3
CN (10:3:7)
2
Saponinas CH
2
Cl
2
:MeOH:H
2
O (8:13:7)
2
CHCl
3
:MeOH:NH
3
1% (7:12:8)
2
CHCl
3
:MeOH:n-BuOH:H
2
O (5:6:1:4)
1
CHCl
3
:MeOH:iso-PrOH:H
2
O (5:6:1:4)
2
CHCl
3
:MeOH:n-PrOH:H
2
O (5:6:1:4)
2
CHCl
3
:MeOH:n-PrOH:EtOH:H
2
O (9:6:1:8:8)
2
EtOAc:n-BuOH:H
2
O (1:1:2)
1
EtOAc:EtOH:H
2
O (2:1:2)
3
Estilbenos glicosilados EtOAc:EtOH:H
2
O (50:1:50)
1
Lipdios Hex:EtOH:H
2
O (6:5:4)
1
Hex:MeOH:H
2
O (6:5:3)
1
301
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2
Hex:CHCl
3
:CH
3
CN (5:1:4)
1
Hex:EtOAc:MeOH:H
2
O (6:5:5:5)
1
Hex:EtOAc:EtOH:H
2
O (3:5:3:4)
1
Hep:C2H
4
Cl
2
:MeOH (47:6:72)
2
Hep:CH
3
CN:AcOH:MeOH (4:5:1:1)
1
Acares n-BuOH:AcOH:H
2
O (4:1:5)
1
n-BuOH:EtOH:H
2
O (4:1:4)
1
Vitaminas Hex:CH
2
Cl
2
:CH
3
CN (20:7:13)
1
Hex:CHCl
3
:CH
3
CN (10:3:7)
1
n-BuOH:EtOH:KH
2
PO
4
0,15M (8:3:8)
1
iso-octano:MeOH (1:1)
1
302
MARSTON, A.; SLACANIN, I.; HOSTETTMANN, K., 1990, Centrifugal partition chromatography in the separation
of natural products. Phytochememical Analysis 1, 317.
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from natural products by CCC. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 26, 1986
1995.
PESQUISADORES | ENDEREOS
305
Adrian Martin Pohlit
Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia
Av. Andr Arajo, 2936, Petrpolis
69083-000 Manaus AM
E-mail: ampohlit@gmail.com
Andersson Barison
Universidade Federal do Paran
Departamento de Qumica
Centro Politcnico - Laboratrio de Ressonncia
Magntica Nuclear
81530-900 Curitiba - PR
E-mail: andernmr@ufpr.br
Camila Gambini Pereira
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Departamento de Engenharia Qumica
59072-970 Natal RN
E-mail: camila@eq.ufrn.br
Carlos Alexandre Carollo
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
Centro de Cincias Biolgicas e da Sade
Laboratrio de Farmacognosia
Cidade Universitria s/n - Caixa Postal 549
79070-900 - Campo Grande MS
E-mail: carollo@ufms.br
306
Carolina Maria Xaubet Olivera
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto
Ncleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintticos
Avenida do Caf s/n
14040-903 - Ribeiro Preto SP
E-mail: cxaubet@gmail.com
Daniel Pecoraro Demarque
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
Centro de Cincias Biolgicas e da Sade
Laboratrio de Farmacognosia
Cidade Universitria s/n - Caixa Postal 549
79070-900 - Campo Grande MS
E-mail: danieldemarque@hotmail.com
Daniel Petinatti Pavarini
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto
Ncleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintticos
Avenida do Caf s/n
14040-903 - Ribeiro Preto SP
E-mail: danielpetpav@hotmail.com
307
Denise Brentan da Silva
Lychnoflora Pesquisa e Desenvolvimento em
Produtos Naturais LTDA
Incubadora Supera - Campus da USP
Avenida dos Bandeirantes, 3900
14040-900 - Ribeiro Preto - SP
E-mail: denisebrentan@lychnoflora.com.br
Eduardo de Jesus Oliveira
Universidade Federal da Paraba
Laboratrio de Tecnologia Farmacutica
Cidade Universitria - Campus I
58051-970 Joo Pessoa PB
E-mail: eduardo@ltf.ufpb.br
Fernando Batista da Costa
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto
Departamento de Cincias Farmacuticas
Avenida do Caf s/n
14040-903 - Ribeiro Preto SP
E-mail: febcosta@fcfrp.usp.br
308
Joo Carlos Palazzo de Mello
Universidade Estadual de Maring
Departamento de Farmcia
Avenida Colombo, 5790
87020-900 - Maring PR
E-mail: mello@uem.br
Joo Luis Callegari Lopes
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto
Ncleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintticos
Avenida do Caf s/n
14040-903 - Ribeiro Preto SP
E-mail: joaoluis@usp.br
Jos Maria Barbosa Filho
Universidade Federal da Paraba
Laboratrio de Tecnologia Farmacutica
Cidade Universitria - Campus I
58051-970 Joo Pessoa PB
E-mail: jbarbosa@ltf.ufpb.br
309
Lia Akina Ito
Universidade Estadual de Maring
Departamento de Farmcia
Avenida Colombo, 5790
87020-900 - Maring PR
E-mail: lia_akina@hotmail.com
Luiz Eldio Gregrio
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri
Laboratrio de Farmacognosia e Fitoqumica
Campus JK
Rodovia MGT 367, km 583, n. 5000 - Alto da Jacuba
39100-000 Diamantina MG
E-mail: luiz.gregorio@ufvjm.edu.br
Maique Weber Biavatti
Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento de Cincias Farmacuticas
Campus Trindade - Laboratrio de Farmacognosia
88040-900 Florianpolis - SC
E-mail: maique@ccs.ufsc.br
310
Marcelo Aparecido da Silva
Universidade Federal de Alfenas
Faculdade de Cincias Farmacuticas
Departamento de Alimentos e Medicamentos
Rua Gabriel Monteiro da Silva, 700
37130-000 Alfenas MG
E-mail: marcamosilva@gmail.com
Mrcio Adriano Andreo
Universidade Federal de So Paulo
Campus Diadema
Rua Prof. Artur Riedel, 275
09972-270 - Diadema SP
E-mail: andreom2002@yahoo.com.br
Marcus Tullius Scotti
Universidade Federal da Paraba - Campus IV
Departamento de Engenharia e Meio Ambiente
Rua Mangueira s/n
58297-000 - Rio Tinto PB
E-mail: mtscotti@ccae.ufpb.br
311
Michael Niehues
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto
Ncleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintticos
Avenida do Caf s/n
14040-903 - Ribeiro Preto SP
E-mail: m_niehues@hotmail.com
Norberto Peporine Lopes
Universidade de So Paulo
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto
Ncleo de Pesquisa em Produtos Naturais e Sintticos
Avenida do Caf s/n
14040-903 - Ribeiro Preto SP
E-mail: npelopes@fcfrp.usp.br
Wagner Vilegas
Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho
Instituto de Qumica - Campus de Araraquara
Departamento de Qumica Orgnica
Laboratrio de Fitoqumica
Caixa Postal 355
14801-970 Araraquara SP
E-mail: vilegasw@gmail.com
Esta obra foi impressa pela Imprensa Universitria da Universidade Federal de Ouro Preto,
composta na fonte Myriad-Pro e Ottawa,
em papel 100% reciclado, capa 380 g/m
2
e miolo 90 g/m
2
,
em maio de 2012.
APOIO
ISBN 978-85-288-0285-6
9 788528 802856