Curso Levaduras Médico Difusión

CURSO A DISTANCIA Y TALLER: MDULO: Determinacin de la susceptibilidad por difusin
Agosto- Noviembre, 2012
Curso a Distancia y Taller: Identificacin presuntiva de Levaduras de inters mdico. Determinacin de la susceptibilidad por difusin Departamento Micologa INEI. ANLIS Dr. C. G. Malbrn
Departamento Micolog a INEI. Dr. C. G. Malbr Malbrn
CURSO A DISTANCIA Y TALLER:

Identificacin presuntiva de levaduras de inters mdico. Determinacin de la susceptibilidad por difusin
13 de Agosto al 23 de Noviembre, 2012
MDULO Determinacin de la susceptibilidad por difusin
Directora del curso: Graciela Davel. Coordinadora: Susana Crdoba. Coordinador de Trabajos Prcticos: Walter Vivot. Ayudante de Trabajos Prcticos: Wanda Szusz.
Agradecimientos
Agradecemos a Walter Vivot y Wanda Szusz por la preparacin de todo el material utilizado en la parte prctica del curso.
AUTORES
Susana B. Crdoba Responsable del Laboratorio de Antifngicos. Departamento Micologa. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. Dr. C. G. Malbrn. Prof. Adjunto. Ctedra de Micologa Mdica e Industrial. Carrera de Microbilogo Clnico e Industrial. Facultad de Ciencias Veterinarias. UNLP. Graciela Davel Jefe del Departamento Micologa. Departamento Micologa. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. Dr. C. G. Malbrn. Mara Guillermina Isla. Laboratorio de Antifngicos. Departamento Micologa. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. Dr. C. G. Malbrn.
NDICE Programa Taller presencial Mtodos por microdilucin para levaduras. Documentos M27-A3, E.Def 7.2 Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. Concepto Pruebas en medio lquido y medio slido Pruebas de sensibilidad a los antifngicos. proceso de estandarizacin Mtodo de referencia para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifngicos. Estndar aprobado. Documento M27-A3, CLSI. Introduccin Antifngicos Preparacin de las soluciones madre Utilizacin de solventes diferentes del agua Filtracin Almacenamiento Intervalo de concentraciones Seleccin de los antifngicos para analizar e informar de forma rutinaria Procedimientos Preparacin de las diluciones de los antifngicos Preparacin del inculo Inoculacin del medio de cultivo (RPMI 1640) Incubacin Lectura de los resultados Interpretacin de los resultados Modificaciones al estndar Impacto del tiempo de lectura: 24 versus 48 horas Control de calidad Documento EDef. 7.2 EUCAST Medio de cultivo
Pgina 9 11 12 13 15 17
17 17 18 18 19 19 20 20 21 22 25 25 26 26 27 31 32 34 38 38
Curso a Distancia y Taller: Identificacin presuntiva de Levaduras de inters mdico. Determinacin de la susceptibilidad por difusin Departamento Micologa INEI. ANLIS Dr. C. G. Malbrn Inculo Placas de microdilucin Lectura. Eleccin de la CIM Interpretacin de resultados. Puntos de corte. El problema de Cryptococcus neoformans como ejemplo de levadura no fermenta la glucosa Referencias Mtodo de difusin con disco en medio slido Introduccin Propiedades del agar Caractersticas de la zona limtrofe Factores que influyen en las pruebas de difusin Mtodo de difusin en medio slido Documento Estndar M44-A2 del CLSI Preparacin de los discos de papel de filtro Inoculacin de las placas Siembra de las placas Colocacin de los discos de antimicrobiano Incubacin de las placas Lectura de la zona de inhibicin Problemas con la lectura de la zona lmite Interpretacin de resultados Cmo se obtienen los puntos de corte? Otras tcnicas de difusin Referencias Difusin en agar con discos fluconazol Malbrn. Procedimientos de laboratorio Introduccin Medios de cultivo y reactivos Procedimiento Parte I Preparacin del stock de Medio Agar Mueller-Hinton Modificado 74 75 75 45 50 50 50 52 52 57 58 59 59 60 60 60 61 61 62 63 70 74 39 40 40 42 42
Curso a Distancia y Taller: Identificacin presuntiva de Levaduras de inters mdico. Determinacin de la susceptibilidad por difusin Departamento Micologa INEI. ANLIS Dr. C. G. Malbrn Parte II. Preparacin de las placas de Mueller-Hinton Modificado Control de calidad del lote stock de medio de cultivo Preparacin del inculo Siembra de la placa con Mueller-Hinton con suplemento de 2% de glucosa y azul de metileno Colocacin de los discos de 25 g de Fluconazol Lectura Interpretacin de los resultados Referencias ATLAS Resistencia a los antifngicos Introduccin Definicin de sensibilidad o resistencia Bases moleculares de la resistencia a los antifngicos Antifngicos Polienos Mecanismos de accin Espectro de actividad y resistencia intrnseca Resistencia primaria Resistencia secundaria Mecanismos de resistencia Importancia mdica de la resistencia a anfotericina B 5-Fluorocitosina Mecanismos de accin Espectro de actividad y resistencia intrnseca Resistencia primaria Resistencia secundaria Importancia clnica de la resistencia a 5-fluorocitosina Azoles 80 81 81 82 83 85 85 85 87 89 90 90 91 93 94 95 95 96 98 98 99 99 100 100 76 77 79 80
Curso a Distancia y Taller: Identificacin presuntiva de Levaduras de inters mdico. Determinacin de la susceptibilidad por difusin Departamento Micologa INEI. ANLIS Dr. C. G. Malbrn Mecanismos de accin Espectro de actividad y resistencia intrnseca Resistencia primaria Resistencia secundaria Mecanismos de resistencia Importancia clnica de la resistencia a los imidazoles y triazoles Nuevas molculas antifngicas de uso clnico REFERENCIAS APNDICE EJERCICIOS EVALUACIN 101 104 108 109 109 112 114 116 120 124 126
Programa del taller presencial 20 al 23 de noviembre, 2012

ACTIVIDAD TERICA HORA 8.30-9.00 h MARTES 20 Presentacin y objetivos del curso. Susana Crdoba Infecciones sistmicas por levaduras. Importancia clnica. Susana Crdoba Epidemiologa de las micosis por levaduras. Constanza Taverna Recoleccin, conservacin y transporte de muestras. Constanza Taverna CAF Identificacin presuntiva de levaduras de importancia mdica. Constanza Taverna Mtodos de identificacin definitiva y nuevas tcnicas. Constanza Taverna Vigilancia de la resistencia: estado actual en Argentina. Susana Crdoba MIRCOLES 21 JUEVES 22 VIERNES 23
9.00- 10.30 h
10.30-11.00 h 11.00-12.30 h
CAF -Pruebas de sensibilidad a los antifngicos. -Concentracin Inhibitoria Mnima: mtodos de referencia: M27-A3 (CLSI) y E. Def. 7.2 (EUCAST). -Puntos de corte. Susana Crdoba -Mtodos de difusin en agar: Documento M44-A2 del CLSI. Discos con fluconazol (Malbrn, Oxoid), Tabletas Neo-Sensitabs Rosco, Etest (bioMrieux). Susana Crdoba ALMUERZO
CAF Antifngicos. Clasificacin. Mecanismos de accin y resistencia. Importancia clnica de la resistencia. Susana Crdoba
CAF Evaluacin. Discusin. Entrega de certificados y cierre del Curso. Susana Crdoba Constanza Taverna Walter Vivot
12.30-14 h
ALMUERZO
ALMUERZO
ACTIVIDAD PRCTICA HORA 14.0015.30 h MARTES 20 - Preparacin de inculo y siembra de ID32C. -Concentracin Inhibitoria Mnima: mtodos de referencia: M27-A3 (CLSI) y E.Def. 7.2 (EUCAST). -Preparacin del inculo. Siembra de la microplaca. CAF -Mtodos de difusin en agar: Documento M44-A2 del CLSI. -Preparacin del inculo. Siembra de placas con agar para difusin. (Mueller Hinton, RPMI agar). -Discos con fluconazol (Malbrn,) -Tabletas NeoSensitabs Rosco. -Tiras Etest (bioMrieux). MIRCOLES 21 -Identificacin presuntiva de levaduras. Medios cromognicos. Pruebas de ureasa, Trehalosa y fenoloxidasa. -Observacin macro y microscpica de levaduras. Cultivo en lmina y extracto de malta lquido. - Lectura de 24 h ID32C CAF -Lectura 24 h difusin: M44-A, Discos, Tabletas, Tiras de Etest. -Lectura 24 h: E. Def. 7.2. -Lectura 24 h: M27-A3 JUEVES 22 -Lectura de 48 h ID 32C. -ID32C. Pruebas de asimilacin y fermentacin -Observacin de ascosporas -Pruebas rpidas de Identificacin de Cryptococcus sp. -Interpretacin de resultados CAF -Lectura 48 h: M27-A3 -Interpretacin de resultados. -Discusin VIERNES 23
LIBRE
15.3016.00 h 16.0018.00 h
10
Mtodos por microdilucin para levaduras
Documentos de referencia
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Mtodo de referencia para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifngicos. CLSI document M27-A3. 2008.
The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) Definitive Document E.Def 7.2 revision (2012). Mtodo para la determinacin de CIM por dilucin de agentes antifngicos para levaduras.
11
Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos Concepto

El objetivo primordial de las pruebas de sensibilidad es conocer si los microorganismos ensayados son sensibles o resistentes a los antimicrobianos. Las condiciones de realizacin de estas pruebas son completamente diferentes a lo que ocurre en el organismo humano. Sin embargo, cuando los resultados se interpretan con sentido comn, son de utilidad para el clnico. El laboratorio de Microbiologa debe ofrecer una informacin particular que afecte al microorganismo y a su hospedador, y otra global, que recoja y distribuya los perfiles generales de sensibilidad y resistencia de las combinaciones que resultan entre el microorganismo y el antimicrobiano, de forma que se pueda conocer la evolucin de dichos perfiles en la infeccin comunitaria y en la infeccin nosocomial. Asimismo, los resultados obtenidos tras analizar la sensibilidad de los microorganismos deben servir para elegir de forma ptima el tratamiento emprico. Hay que reconocer que en muchos hospitales no se aslan suficientes microorganismos de una especie como para tener datos fiables de los perfiles de sensibilidad y resistencia frente a los antimicrobianos indicados para su tratamiento. En estos casos, son los Laboratorios de Referencia los que deben de ocuparse de recopilar microorganismos de todo el territorio, realizar las pruebas de sensibilidad y disear un mtodo de informacin que alcance a todos los profesionales involucrados en dicha patologa.
Utilidad
Es una de las funciones ms importantes de los laboratorios de Microbiologa Mdica. Los resultados obtenidos con estas pruebas tienen aplicaciones que influyen en el tratamiento emprico, en el directo y en la poltica de control de la infeccin. Asimismo, son pruebas cruciales para el descubrimiento y desarrollo de nuevos antimicrobianos. Una de las preguntas que ms importancia tiene es si estas pruebas pueden predecir la evolucin clnica de los pacientes. La respuesta es fundamental en el campo de la Microbiologa y de las Enfermedades Infecciosas, pero est muy lejos de ser uniforme debido a que interaccionan un gran nmero de factores que no son controlables. Sin embargo, y a pesar de que los resultados no son siempre alentadores, es necesario que se realicen estudios que intenten correlacionar los resultados que obtenemos con estas pruebas y la evolucin clnica de los pacientes.
12
Pruebas en medio lquido y medio slido

Existen tres procedimientos generales para determinar la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos y estos son:
Dilucin en caldo
Se procede a la dilucin del antimicrobiano en una serie de tubos que contienen un caldo adecuado para el crecimiento del microorganismo que se va a ensayar. Se inocula el microorganismo, se incuba a una temperatura determinada y se determina la concentracin del antimicrobiano que produce la inhibicin del crecimiento del microorganismo.
Dilucin en agar
Se procede a la dilucin del antimicrobiano en un medio de cultivo apropiado y solidificado con agar. Se inoculan los microorganismos en la superficie del medio. Se incuba a una temperatura adecuada y se determina la concentracin del antimicrobiano que produce la inhibicin del crecimiento.
Difusin en agar con disco

Se inocula el microorganismo en la superficie del agar. Se deposita un disco con una concentracin conocida de antimicrobiano. Se incuba a una temperatura adecuada. Se produce una zona de inhibicin del crecimiento del microorganismo alrededor del disco. Dependiendo del tamao de la zona, se puede determinar si el microorganismo es sensible, intermedio, indeterminado o resistente al antimicrobiano. Antes de seleccionar el procedimiento que se va a realizar en el laboratorio para determinar la interaccin entre un antimicrobiano y un microorganismo es necesario tener en claro si los resultados se quieren expresar de forma cuantitativa (CIM) o cualitativa (sensible, intermedio, indeterminado o resistente). La tabla resume las ventajas e inconvenientes de los mtodos cualitativos y cuantitativos.
Caractersticas comparables entre los mtodos de difusin y dilucin

Mtodo de determinacin de la sensibilidad Difusin con disco Deteccin de la contaminacin de la tcnica Deteccin de los miembros ms resistentes del inculo Efecto inculo Resultado cuantitativo Determinacin de la Concentracin Microbicida Mnima Resultados directos con muestras clnicas Utilizacin con microorganismos de crecimiento lento Posibilidad de automatizacin S No No No
b
Dilucin en agar S No No S No ? S ?
Dilucin en caldo No S S S S No S S
a
No S No No
13
a b
la contaminacin se puede detectar s se sub cultiva el caldo en medios apropiados Los dimetros tienen una relacin inversa con la CIM, requiriendo anlisis de la regresin para poder desarrollar pautas interpretables (sensible, intermedio o indeterminado y resistente).
Con relacin a los antibacterianos se puede elegir entre cualquiera de estos mtodos ya que existen estndares para todos. Sin embargo, para levaduras existen a la fecha los documentos del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 y M44-A2, para dilucin en caldo y difusin en agar respectivamente (5, 22), y el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) E.Def 7.2 (9). La determinacin de la sensibilidad mediante un procedimiento cuantitativo tiene ms ventajas que inconvenientes. Con las tcnicas cuantitativas en caldo se puede determinar adems de la CIM, la Concentracin Bactericida Mnima (CBM) o la Concentracin Fungicida Mnima (CFM). Adems, estos valores cuantitativos o parmetros farmacodinmicos se puede utilizar junto con la farmacocintica del antimicrobiano, para calcular ndices teraputicos. La principal ventaja de la difusin con disco es el bajo costo unido a la simplicidad de la tcnica y esto incluye desde la realizacin, la lectura y en la mayora de las ocasiones, la interpretacin.
Limitaciones
La primera y fundamental limitacin de cualquiera de las tcnicas que se mencionaron ms arriba es que el procedimiento se realiza en una atmsfera artificial. Por lo tanto, existe poca relacin con las complejas interacciones que ocurren entre el microorganismo y el hospedador. Asimismo, hay que tener en cuenta el tipo de hospedador (normal, inmunocomprometido por corticoides, por quimioterpicos, etc.) y el tipo de microorganismo que causa la infeccin (de crecimiento normal o lento, si necesita suplementos especiales para crecer, etc.). Por ltimo, hay que considerar que en el laboratorio la concentracin del antimicrobiano es constante y el inculo del microorganismo tambin. En el hospedador, un nmero indeterminado de microorganismos (pequeo o grande) est expuesto a concentraciones fluctuantes del antimicrobiano entre cada dosis del mismo. En resumen, las condiciones in vivo difcilmente se pueden modificar y as la evolucin del paciente depende de un gran nmero de factores entre los que se encuentra la inherente sensibilidad del microorganismo a los antimicrobianos. En el laboratorio, se pueden manipular distintos elementos que influyen en los resultados de las pruebas de sensibilidad. Por tanto, es indispensable la estandarizacin de stas para que, con independencia de donde se realicen los valores obtenidos resulten equiparables.
14
En la tabla se retoman los factores que pueden modificar los resultados de las pruebas de sensibilidad.
Factores que influyen en los resultados de las pruebas de sensibilidad

Dilucin en caldo Esquema de la dilucin Dobles y seriadas vs intervalos aritmticos Composicin del Medio de cultivo pH Concentracin de cationes Osmolaridad Suplementos Volumen Tamao del inculo y fase de crecimiento Temperatura de incubacin Duracin de la incubacin Variaciones en el control de calidad y en los procedimientos de estandarizacin Profundidad del agar Difusin en agar Interaccin entre el antimicrobiano y el agar Tiempo transcurrido entre la inoculacin del medio y la aplicacin del disco de antimicrobiano Composicin del Medio de cultivo pH Electrolitos
Pruebas de sensibilidad a los antifngicos. Proceso de estandarizacin Introduccin

El proceso de estandarizacin de las pruebas de sensibilidad a los antifngicos comenz en 1981, cuando la Sociedad Francesa de Micologa Mdica publica un artculo con recomendaciones para estandarizar la sensibilidad in vitro a los antifngicos (6,18). En 1982, el Comit de Microbiologa del NCCLS constituye el Subcomit de Sensibilidad a los antifngicos. En 1985, este Subcomit publica su primer informe que recoge los resultados de una encuesta y un pequeo estudio cooperativo cuyos resultados son los siguientes: Aproximadamente, el 20% de los hospitales que eran miembros del CLSI con ms de 200 camas realizaban pruebas de sensibilidad a los antifngicos. 1. La mayora utilizaban dilucin en caldo. 2. La mayora de las cepas ensayadas eran C. albicans u otras especies de levaduras. 3. La mayora de los centros analizaban pocos aislamientos por ao. 4. La concordancia entre los resultados entre los laboratorios que participaron en el estudio cooperativo fue inaceptablemente baja. Tras estos hallazgos, el Subcomit decidi que haba que desarrollar un procedimiento de referencia ms reproducible. Se comenz con los siguientes aspectos bsicos.
15
1. Mtodo en macrodilucin con caldo. 2. Medio sinttico para evitar antagonismos con algn antifngico. 3. Se adoptaron, con muy pocas variaciones, los procedimientos utilizados con los antibacterianos relativos a la preparacin, almacenamiento y dilucin de los antifngicos. A pesar de estos acuerdos, se necesitaban estandarizar otros factores que influyen en los resultados y que comentaron ms arriba. Estas variables son las siguientes: 1. Preparacin del inculo 2. Tamao del inculo 3. Eleccin del medio sinttico 4. Temperatura de incubacin 5. Duracin de la incubacin 6. Mtodo de lectura y definicin de la CIM Para ello se realizaron una serie de estudios cooperativos que se publicaron (8, 11, 29, 32) y que fueron recogidas en 1992 en el primer estndar del CLSI, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts documento M27-P (17). En los siguientes cuatro aos se eligieron, entre varias, 2 cepas para realizar el control de calidad y se establecieron sus CIMs de referencia. Adems se compar el mtodo en macrodilucin con una tcnica en microdilucin (8). Toda est informacin se public en un nuevo estndar denominado M27-T (18). Durante estos ltimos aos la actividad del Subcomit se concentr en el desarrollo de puntos de corte para los antifngicos (38). Estos puntos de corte se publicaron en el documento M27-A aparecido en 1997 (20). En 2002, el CLSI public el documento M27-A2 con la incorporacin de nuevos antifngicos y unas pocas modificaciones (21) a las que se suman las modificaciones an vigentes del documento M27-A3 (5.a).
16
Mtodo de referencia para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifngicos. Estndar aprobado. Documento M27-A3. 2008 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Introduccin
El mtodo que describe este estndar se usa para evaluar levaduras que causan infecciones invasoras. Estas levaduras abarcan todas las especies de Candida y Cryptococcus neoformans. Este mtodo no se aplica para evaluar la fase levaduriforme de los hongos dimrficos como Blastomyces dermatitidis o Histoplasma capsulatum var. capsulatum. El documento M27-A3 es un ESTNDAR DE REFERENCIA. Se desarroll a travs de un proceso de consenso para facilitar un acuerdo sobre la forma de evaluar la sensibilidad de las levaduras a los antifngicos. Un objetivo primordial de un estndar de referencia es sentar las bases de forma que se puedan desarrollar otros mtodos ms accesibles pero que obtengan resultados similares al estndar. En conclusin, cualquier mtodo que proporcione resultados equivalentes al M27-A3 se debe de considerar en conformidad y por tanto su utilizacin debe ser aceptada.
Antifngicos Origen
Los estndares de los antifngicos o el polvo de referencia se pueden obtener comercialmente o directamente del fabricante. Los productos almacenados en farmacias u otras preparaciones clnicas del producto no se deben de utilizar. El polvo base enviado por el fabricante suele llevar una etiqueta en la que consta el nombre genrico del frmaco, su potencia (normalmente en g/ml o Unidades Internacionales por mg de polvo) y su fecha de caducidad. El polvo base se debe de almacenar como recomienda el fabricante, a 20C o menos, en ambiente seco (desecador y preferentemente a vaco). Para evitar la condensacin de agua, cuando el polvo base se saca del congelador, y antes de abrir el desecador, se debe permitir que transcurra el tiempo necesario para que alcance la temperatura ambiente.
Procedimiento para pesar del polvo base de los antifngicos

La actividad de los antimicrobianos se expresa en Unidades estndar. Las Unidades de ensayo difieren del peso del polvo base y tambin lo hacen entre lotes. Por tanto, cada laboratorio debe de estandarizar las soluciones madre de cada antimicrobiano basndose en la potencia de cada lote de antimicrobiano que estn utilizando. Cualquiera de estas 2
17
frmulas se pueden utilizar para determinar la cantidad de polvo base o diluyente que se necesita para obtener una solucin estndar o madre de cualquier antimicrobiano:
Volumen (ml) = Peso (mg) Potencia del antimicrobiano (g/ml) Concentracion (g/ml)
El polvo base del antimicrobiano se pesa en una balanza analtica que haya sido calibrada y aprobada con pesos de referencia. Es recomendable que se pesen al menos 100 mg de polvo base. Ejemplo: si se necesita preparar 100 ml de una solucin madre de un antimicrobiano que contenga 1280 mg/l y el polvo base tiene una potencia de 750 mg/l procederemos de la siguiente forma
Peso (mg) =
Volumen 100ml Concentracin 1280 g/ml = 170,7 mg Potencia del antimicrobiano 750 g/ml
Es conveniente pesar en exceso, por eso depositamos en la balanza hasta 182,6 mg. Con dicha cantidad de polvo base pesado necesitamos el volumen de disolvente que calculamos con la otra frmula:
Volumen (ml) =
Peso 182,6 mg Potencia del antimicrob iano 750 g/ml = 107 ml Concentrac in deseada 1280 g/ml
Por tanto, los 182,6 mg del polvo base del antimicrobiano se deben de disolver en 107 ml del disolvente.
Preparacin de las soluciones madre

Las soluciones madre de los antifngicos se deben de preparar a concentraciones de al menos 1280 mg/l o 10 veces la concentracin mayor ensayada. Sin embargo, hay que tener en cuenta que varios antifngicos tienen una solubilidad limitada que puede requerir la preparacin de soluciones madre menos concentradas. En cualquier caso, se debe de tomar en cuenta la informacin del fabricante para determinar el grado de solubilidad del frmaco.
Utilizacin de solventes diferentes del agua

En la tabla se muestran los disolventes adecuados segn el antifngicos. En todos los casos, una vez realizada la disolucin, los antifngicos se deben diluir en el medio de cultivo apropiado.
18
Solventes recomendados para algunos antifngicos

Antifngico Anfotericina B Ketoconazol Itraconazol Posaconazol Ravuconazol Voriconazol Fluconazol 5-Fluorocitosina Caspofungina Micafungina Anidulafungina Disolvente Dimetilsulfxido Dimetilsulfxido Dimetilsulfxido Dimetilsulfxido Dimetilsulfxido Dimetilsulfxido Agua Agua Agua Agua Dimetilsulfxido Diluyente Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo Medio de cultivo
La informacin relativa a la solubilidad del antimicrobiano debe estar incluida con el frmaco. Estos antifngicos se deben de disolver a una concentracin 100 veces mayor que la concentracin mayor que se va a emplear. Los solventes que se utilizan con ms frecuencia son: dimetilsulfxido (DMSO), carboximetilcelulosa, alcohol etlico y polietilenglicol. Cuando se utilizan estos solventes, desde la solucin madre se deben de hacer una serie de diluciones 100 veces el intervalo final de concentraciones que se va a utilizar. Estas soluciones intermedias son las que se diluirn 100 veces con el medio de cultivo. Este procedimiento evita precipitacin de los compuestos de baja solubilidad en el medio de cultivo. En las tablas 1 y 2 del apndice se esquematizan los pasos para preparar diluciones de los antifngicos solubles e insolubles en agua.
Filtracin
Se puede asumir que las soluciones madre son estriles ya que es muy difcil que crezcan microorganismos en ellas. Si queremos asegurarnos se deben de filtrar a travs de un filtro de membrana. No se deben de utilizar filtros de papel, de asbesto o de fibra de vidrio ya que pueden absorber cantidades apreciables del antimicrobiano. Cuando se decida filtrar el antimicrobiano es importante cerciorarse de que la forma de filtracin no va a disminuir la concentracin de la solucin madre.
Almacenamiento
La solucin madre se divide en pequeos volmenes en tubos de polipropileno o polietileno estriles. Se sellan con cuidado y se almacenan siempre a temperaturas por debajo de
19
20C, de ser posible a menos de 60C. Los viales que se retiren se deben de utilizar el mismo da. No se pueden volver a congelar. Deben ser eliminados convenientemente. Las soluciones madre de los antifngicos se pueden almacenar a 60C durante 6 meses o ms sin ninguna prdida aparente de actividad. En cualquier caso, las instrucciones del fabricante deben ser tomadas en consideracin y no deben sustituir ninguna otra indicacin. Cualquier prdida de actividad de los antifngicos se reflejar en los resultados de las pruebas de sensibilidad. Esto quedar especialmente reflejado al analizar los resultados de las cepas de control de calidad utilizadas.
Intervalo de concentraciones
El intervalo de concentraciones elegidos para cada antimicrobiano debe incluir los puntos crticos, si estos estn definidos, y los resultados esperados para las cepas de Control de Calidad. Basados en estudios previos, se recomiendan las siguientes concentraciones de antifngicos que estn recogidas en la siguiente tabla.
Intervalo de concentraciones recomendadas para cada antifngico

Antifngico Anfotericina B 5-fluorocitosina Ketoconazol Fluconazol Itraconazol Voriconazol Posaconazol Ravuconazol Anidulafungina Caspofungina Intervalo (g/ml) 16-0,0313 64-0,125 16-0,0313 64-0,125 16-0,0313 16-0,0313 16-0,0313 16-0,0313 16-0,0313 16-0,0313
Seleccin de los antifngicos para analizar e informar de forma rutinaria

No se recomienda la realizacin rutinaria de estas pruebas, aunque se hayan determinado los puntos de corte para algunas combinaciones de antifngicos y microorganismos. En cada Institucin, la decisin de realizar estas tcnicas debe obtenerse por consenso entre los especialistas en enfermedades infecciosas, el comit de farmacia, los microbilogos y el comit para el control de la infeccin nosocomial.
Nombres genricos
Para evitar confusiones, se utilizarn los nombres genricos de los antifngicos.
20
En ningn caso, se deben de utilizar nombres comerciales.
Nmero de antifngicos a ensayar

El nmero debe limitarse a los que se pueden utilizar para cada proceso infeccioso. No parece razonable, por ejemplo, ensayar 4 imidazoles para evaluar una levadura aislada de un exudado vaginal.
Directrices genricas para realizar las pruebas de sensibilidad

Se puede recomendar la realizacin de estas pruebas en las siguientes circunstancias: 1. Estudios epidemiolgicos temporales para conocer la sensibilidad a los antifngicos de especies patgenas dentro de una Institucin. 2. Ayudar en el tratamiento de la candidosis orofarngea refractaria al tratamiento antifngico estndar. 3. Ayudar en el tratamiento de la candidosis invasora causada por especies de levaduras en las que no se puede prever su sensibilidad a los azoles. 4. Existen puntos crticos recomendados para especies del gnero Candida frente a fluconazol, itraconazol, voriconazol y 5-fluorocitosina. Adems, se propusieron puntos de corte para candinas (5). La relevancia clnica de evaluar la sensibilidad de otros microorganismos es incierta. Las muestras para cultivo y otros procedimientos diagnsticos deben ser obtenidas antes de comenzar el tratamiento.
Procedimientos Medio de cultivo

El medio recomendado es completamente sinttico: RPMI con glutamina, sin bicarbonato y rojo fenol como indicador de pH. La recomendacin de este medio se produjo tras el anlisis de los resultados obtenidos en un estudio comparativo entre varios medios sintticos (11,32). En el apndice, se recoge la composicin del medio RPMI 1640.
Preparacin del Medio de cultivo (RPMI-1640 tamponado con 0,165 mol/l MOPS, 1 litro)
RPMI 1640 Tampn MOPS 10,4 g 34,53 g
1. Disolver el medio en 900 ml de agua destilada estril. 2. Aadir el tampn MOPS (cido morfolino propanosulfnico) para alcanzar una concentracin 0,165 mol/l. 3. Agitar hasta disolver completamente.
21
4. Mientras se agita, ajustar el pH a 7 a temperatura ambiente (25C) utilizando NaOH 1 mol/l. 5. Aadir el agua destilada estril necesaria para alcanzar 1 litro de medio. 6. Esterilizar por filtracin. 7. Almacenar a 4C hasta su utilizacin.
Tampones
El medio de cultivo se debe tamponar a pH 7 a 25C. El tampn elegido no debe ser antagonista de los antimicrobianos empleados. Por ejemplo, el tampn Tris no es adecuado ya que es antagonista de la 5-fluorocitosina. Es preferible utilizar tampones Zwitterion a otros que son capaces de atravesar la membrana celular. Por ejemplo no es recomendable utilizar tampones fosfato porque son capaces de atravesar las membranas celulares y producir reacciones inesperadas con los antifngicos. Un tampn que es adecuado es el cido morfolino propanosulfnico (MOPS; 3(Nmorpholino) propanesulfonic acid). La concentracin final que se debe de utilizar es 0,165 mol/l. Tras la finalizacin de la preparacin del medio es imprescindible comprobar que el pH final est entre 6,9-7,1 a 25C. Se debe de realizar un control de calidad de cada lote de medio mediante la determinacin de la sensibilidad de 2 cepas control de calidad.
Preparacin de las diluciones de los antifngicos

Los pasos que hay que realizar para preparar y almacenar los antifngicos diluidos son los siguientes: 1) Utilizar tubos de plstico estriles (12 x 75 mm) para realizar los ensayos. 2) Utilizar un tubo de control de crecimiento con RPMI 1640 sin antifngico para cada microorganismo ensayado. Si se utilizan solventes (por ej. DMSO) a concentraciones determinadas y fijas en toda la serie de tubos, se debe de incluir la misma concentracin en el tubo control de crecimiento. 3) Cerrar los tubos con tapn a rosca de plstico o de metal pero asegurndose de que puede pasar aire. 4) Cuando se van a utilizar diluciones dobles y para minimizar errores se aconseja utilizar los esquemas de dilucin de las Tablas 1 y 2 del apndice. Hay que tener en cuenta que los procedimientos para realizar las diluciones de los antifngicos que son solubles en agua son distintos de aquellos que no lo son. En la Tabla 2 del apndice se puede
22
consultar un procedimiento para realizar de forma adecuada las diluciones de antifngicos insolubles en agua. El volumen total de cada dilucin del antifngico depende del nmero de pruebas que se vayan a realizar. Se va a utilizar 0,1 ml de cada dilucin de antifngico. Hay que tener en cuenta que los antifngicos se van a diluir 1:10 cuando sean combinados con el inculo. Por tanto, todas las diluciones de trabajo de los antifngicos estarn 10 veces concentradas. Como ya se coment, para aquellos antifngicos que no puedan ser disueltos en agua (ketoconazol, itraconazol, anfotericina B) se debe de hacer una serie de diluciones 100x en el solvente apropiado (en este caso DMSO). Estas diluciones se deben de diluir 1:10 en RPMI-1640. Por ejemplo, si se quiere preparar una serie de diluciones de antifngico cuyo intervalo de concentraciones sea ente 16 mg/l y 0,0313 mg/l tendramos que realizar los siguientes pasos: I. Preparar una serie de diluciones del antifngico en DMSO desde 1.600 a 3,13 mg/l. II. Pipetear 0,9 ml de RPMI 1640 en once tubos estriles. III. Aadir 0,1 ml de DMSO a un tubo con 0,9 ml de RPMI. Este ser el tubo con el que se harn los controles de crecimiento. IV. Para utilizar una sola punta de pipeta, empezar por la dilucin ms pequea, es decir del tubo con 3,13 mg/l del antifngico. Tomar 0,1 ml y aadrselos a los 0,9 ml de uno de los tubos con RPMI y as sucesivamente. Quedarn una serie de tubos con 1 ml con concentraciones del antifngico entre 160 y 0,313 mg/l. V. Repartir 0,1 ml de estas concentraciones en series de tubos. Cuando se aada el inculo, el antifngico se diluir 10 veces y quedar a la concentracin adecuada.
23
Solucin madre Esquema de diluciones
1:2
1:4
1:2
1:4
1:8
1:2
1:4
1:8
1:2
1:4
1:8
1600 g/ml 1:10
0,1ml
3,13 g/ml
0,9 ml RPMI 160 g/ml 0,31 g/ml
24
Preparacin del inculo

Los pasos para preparar el inculo deben de ser los siguientes:
1. Todos los microorganismos se deben de subcultivar en agar Sabouraud. Hay que

asegurarse de su absoluta pureza y que los aislamientos no estn contaminados. La temperatura de incubacin debe ser de 35C.
2. El inculo se debe preparar tocando 5 colonias de 1 mm de dimetro de cultivos

incubados durante 24 h para Candida spp. y 48 h para Cryptococcus neoformans. Las colonias deben ser suspendidas en 5 ml de solucin salina estril 0,85% (0,145 mol/l de NaCl; 8,5 g/l=0,85% solucin salina).
3. La suspensin resultante se debe de agitar vigorosamente durante 15 segundos. La

densidad de la suspensin celular se debe de ajustar a la transmitancia que produzca un 0,5 de la escala de McFarland a 530 nm. Este ajuste produce una solucin salina que contiene entre 1-5 x 10
6
UFC/ml. Esta suspensin se diluye 1:2000 con RPMI 1640 lo
que produce una concentracin celular entre 0,5 x 103 2,5 x 103 UFC/ml.
Sabouraud
Incubacin 35-37C 24 h Candida spp. 48 h C. neoformans
Sabouraud
3-5 colonias 1 mm en 5 ml de agua destilada estril
1-5 x 106 UFC/ml
Ajustar a la DO del 0,5 McFarland a 530 nm
Inoculacin del Medio de cultivo (RPMI 1640)

1. Antes de que se ajuste el inculo, se han preparado los tubos con 0,1 ml de las diversas diluciones del antifngico en tubos de 12 x 75 mm. El tubo destinado a ser control de crecimiento de cada cepa recibe 0,1 ml de RPMI 1640 + solvente sin antifngico. 2. El inculo se puede guardar un mximo de 15 minutos a temperatura ambiente y de 2 h a 4C.
25
3. Se aade a cada tubo 0,9 ml del inculo ajustado y diluido 1:2000 en RPMI 1640. Se agita vigorosamente para mezclar bien. Este paso produce una dilucin 1:10 de cada dilucin del antifngico, que como se recordar fueron preparados y distribuidos en concentraciones 10x.
Inoculacin del medio de cultivo

1- 5 x 106 CFU/ml 0,5 - 2,5 x 103 CFU/ml
1: 2000
0,9 ml
16
0,12
0,06
CC
0,1 ml RPMI + solvente
Incubacin
1. Candida spp. se debe de incubar, sin agitacin, a 35C durante 24-48 h en atmsfera normal. 2. Cryptococcus neoformans se debe de incubar, sin agitacin, a 35C durante 70-74 h en atmsfera normal. 3. Tras este periodo de incubacin se proceder a leer los resultados.
Lectura de los resultados

La CIM es la concentracin ms baja de antifngico que inhibe sustancialmente el crecimiento del microorganismo detectado visualmente. Se compara el crecimiento en cada concentracin de antifngico con el crecimiento en el tubo control de crecimiento y se califica de la siguiente forma: 0: pticamente claro 1: ligeramente turbio
26
2: prominente disminucin de la turbidez (50%) 3: Ligera reduccin de la turbidez 4: sin disminucin de la turbidez
Anfotericina B
La determinacin de la CIM para la anfotericina B es bastante fcil. Por tanto, la CIM se corresponde con aquel tubo en el que no se detecta ningn crecimiento (valor 0). Cuando se utiliza este antifngico no se detecta crecimiento residual en ninguno de los tubos y as, la visualizacin de cualquier tipo de crecimiento reflejara resistencia.
5-fluorocitosina y azoles
Con la 5-fluorocitosina y en especial con los azoles la inhibicin del crecimiento nunca es completa y puede ser muy difcil elegir la CIM. Tras los estudios cooperativos realizados, se lleg a la conclusin de que se debera elegir una CIM que expresara un coeficiente de inhibicin (50%) (valor 2) ms que la ausencia visible de crecimiento.
Candinas
La determinacin de la CIM se realiza tras la incubacin de 24 h y se expresa como la menor concentracin que produce un prominente descenso de la turbidez (valor 2), lo que significa una reduccin del crecimiento aproximadamente del 50% con respecto al control de crecimiento.
Interpretacin de resultados
Por el momento, para levaduras, solo se existen puntos de corte para algunos antifngicos y se retoman en la tabla de ms abajo.
Puntos de corte (mg/l) recomendados por el CLSI. Documento M27-A3 (S3) 2008
Antifngico Fluconazol d Itraconazol
f e
Sensible Sensible dependiente (S) de la dosis (S-DD) a 8 0,125 4 1

c
Intermedio (I)b --------8-16 -----------------
Resistente ( R) 64 1 32 4 -------------
No sensible (NS)
16-32 0,25-0,5 ----2 -------------
5-fluorocitosina Voriconazol
c
Anidulafungina Caspofungina Micafungina

a
2 2 2
>2 >2 >2
La sensibilidad depende del nivel mximo alcanzado en sangre. Para fluconazol se requieren dosis de 400 mg/da en adultos con funcin renal normal. Para itraconazol, se requieren concentraciones plasmticas >0,5 g/ml para una respuesta ptima. b La sensibilidad de estos aislamientos es incierta y los datos disponibles no permiten categorizarlos claramente como sensibles o resistentes.
27
Curso a Distancia y Taller: Identificacin presuntiva de Levaduras de inters mdico. Determinacin de la susceptibilidad por difusin Departamento Micologa INEI. ANLIS Dr. C. G. Malbrn Para estas drogas, los datos se basan en experiencia con pacientes no neutropnicos con candidemia, y su relevancia clnica en otras patologas es incierta. Para fluconazol, estas guas se basaron en una amplia experiencia con infecciones invasoras y mucosas debidas a Candida spp. Los aislamientos de C. krusei son considerados intrnsecamente resistentes a fluconazol, y la CIM no debe interpretarse usando esta escala. Mientras que para C. glabrata hay que considerar que si la CIM es 32, el paciente debera recibir la dosis mxima de fluconazol. e Los puntos de corte de flucitosina se basan en abundantes datos histricos y en la farmacocintica de la droga. f Para itraconazol, los datos se basan en experiencia con infecciones mucosas, no hay datos disponibles que soporten los puntos de corte en infecciones invasoras debidas a Candida spp.
c
Anfotericina B
La experiencia acumulada indica que las CIMs de anfotericina B para Candida spp. se agrupan entre 0,25 y 1 mg/l. Cuando se evaluaron, mediante el M27-A3, aislamientos que parecen resistentes en modelos experimentales de infeccin, se obtuvieron ocasionalmente CIMs mayores de 1 mg/l. El mtodo del M27-A3 no permite la deteccin consistente de estos aislamientos y, de momento, lo nico que se puede concluir es que cuando se obtiene una CIM >1 mg/l para un aislado de Candida spp., es posible que sea resistente a la anfotericina B. Por otra parte, se publicaron una serie de artculos que sugieren que la utilizacin del Medio antibitico n 3 (AM3) con 2% de glucosa permite la deteccin de aislamientos resistentes (10, 35, 44). Los laboratorios que decidan emplear este ltimo mtodo deben comparar cuidadosamente sus resultados con aquellos obtenidos con aislamientos de los que se conoce su respuesta a la anfotericina B.
5-fluorocitosina
Basados en datos histricos y de forma parcial en los datos de farmacocintica, se establecieron los puntos de corte para Candida spp. que se retoman en la tabla de ms arriba.
Fluconazol
Los puntos de corte establecidos para el fluconazol estn basados en numerosos datos suministrados por el fabricante. Estos datos se obtuvieron principalmente de estudios clnicos de candidosis orofarngea y de infecciones invasoras causadas por Candida spp. en pacientes no neutropnicos (38). Por tanto, en otros contextos clnicos la relevancia clnica es incierta. Estos puntos de corte no son aplicables a C. krusei. La utilidad de evaluar los aislamientos de Cryptococcus neoformans est en estudio, aunque datos recientes sugieren que puede existir cierto grado de correlacin entre CIMs elevadas y fracaso clnico (1, 12, 45).
28
Ketoconazol
La experiencia acumulada hasta la fecha con el M27-A3 indica que las CIMs de las levaduras varan entre 0,0313 y 16 mg/l. Sin embargo, no hay datos disponibles que indiquen de la existencia de una correlacin entre la CIM y la evolucin clnica del paciente.
Itraconazol
Los puntos de corte establecidos para el itraconazol estn basados en numerosos datos suministrados por el fabricante (38). Estos datos provienen nicamente de estudios clnicos de candidosis orofarngea. Por tanto, en otros contextos clnicos la relevancia clnica es incierta. Por otro lado, hay que destacar que la insolubilidad de este compuesto puede producir errores en la estimacin de las CIMs. Por tanto, hay que poner extrema atencin cuando se preparan las diluciones del antifngico para que no se produzca precipitacin del frmaco que podra dar lugar a sustanciales errores. Es evidente que hay que seguir el esquema de diluciones de la Tabla 1 y 2 del apndice no pudindose utilizar otros solventes diferentes a los aconsejados.
Voriconazol
Basados en los datos que presenta el laboratorio productor de voriconazol se establecieron los puntos de corte para Candida spp. (5). Estos datos surgieron de tests in vitro, modelos animales y ensayos clnicos, la mayora de ensayos clnicos con pacientes no neutropnicos con candidemia, de modo que su relevancia clnica en otras situaciones es desconocida (14).
Nuevos triazoles
La experiencia con posaconazol y ravuconazol indica que la CIM para las levaduras vara entre 0.03 y 16 mg/l, mientras que la mayora de los aislamientos son inhibidos por concentraciones 1 mg/l con ambos agentes.
Candinas (Anidulafungina, Caspofungina, Micafungina)

Los datos obtenidos de CIM de ms de 2500 aislamientos clnicos de Candida spp. indican que la CIM varia entre 0,007 y 8 mg/l con 99.99% de los aislamientos inhibidos por 2 mg/l (27, 28). Con base en esos estudios, las CIMs con valores 2 mg/l son consideradas como sensibles. Sin embargo, las bases de datos contienen poca informacin de la evolucin del tratamiento en infecciones con CIM mayores para permitir la creacin de una categora de resistencia.
29
Modificaciones realizadas para el mtodo en microdilucin

En la actualidad se cuenta con un buen nmero de datos y de estudios que documentan la excelente concordancia obtenida al comparar el mtodo en macrodilucin con una adaptacin a microdilucin (4, 7, 8, 30, 31, 37). Las caractersticas de la tcnica en microdilucin son las siguientes: las diluciones de los antifngicos que se utilizaban 10X para la macrodilucin se deben diluir con RPMI 1640 1:5 para alcanzar las concentraciones 2X necesarias para esta tcnica. El inculo se prepara de la misma forma que para la macrodilucin. Se agita vigorosamente durante 15 segundos y luego se diluye 1:50 y 1:20 para obtener una concentracin de clulas de 1-5 x 103 UFC/ml. Este inculo es diluido 1:2 cuando los pocillos se inoculan y por tanto el inculo final es 0,5 2,5 x 103 UFC/ml. Se utilizan placas de microdilucin estriles, de un solo uso y de 96 pocillos en forma de U. Se dispensan 100 l de los antifngicos a una concentracin 2x en las columnas de la 1 a la 10 con una pipeta multicanal. La columna 1 contiene la concentracin ms alta del antifngico (64 o 16 mg/l) y la fila 10 la ms baja (0,12 o 0,03 mg/l). Las placas se deben de guardar en bolsas de plstico selladas y se almacenan congeladas a 70C hasta un mximo de 6 meses sin que el antifngico pierda ninguna actividad.
Placa de microdilucin
1 A B C D E F 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
G H 16 8 4 2 1 0, 0,2 0,1 0,06 0,03 CC CE
Rango de concentraciones en mg/l
El da del ensayo, cada pocillo de la placa se inocula con 100 l de la suspensin del inculo 10X, lo que produce una dilucin 1:2 del inculo y del antifngico. En el pocillo control de crecimiento, que solo contiene 100 l de RPMI 1640, se aaden 100 l del inculo. Las cepas de control de calidad son evaluadas de la misma forma y se incluyen siempre que se ensaye un aislado. El pocillo 11 o 12 se puede utilizar como control de esterilidad de la tcnica y por tanto debe contener solo RPMI.
30
Las placas se incuban (sin agitacin) a 35C durante 24-48 h para Candida spp. y 70-74 h para Cryptococcus neoformans. Tras la incubacin se procede a determinar la CIM de la siguiente forma:
1. Las placas se colocan en un espejo para lectura de placas de microdilucin. 2. Se compara el crecimiento en cada pocillo con el pocillo control de crecimiento. 3. Se les da una puntuacin a cada pocillo con arreglo a la siguiente clasificacin:
0 = pticamente claro 1 = ligeramente turbio 2 = disminucin prominente de la turbidez 3 = ligera disminucin de la turbidez 4 = sin disminucin de la turbidez La CIM para la anfotericina B, se define como la concentracin ms baja que tiene una puntuacin de 0 (pticamente claro). Para la 5-fluorocitosina, los azoles y las candinas es la concentracin ms baja que tiene una puntuacin de 2 (disminucin prominente de la turbidez). Para las candinas la lectura de la CIM debe realizarse luego de 24 h de incubacin. Para aquellos aislamientos que producen grumos en el fondo, la dispersin de los mismos pipeteando o agitando puede ayudar a la interpretacin de los resultados (2, 31).
Modificaciones al estndar
Como respuesta a problemas especficos se realizaron algunas modificaciones fundamentales del mtodo que se describen en la tabla de ms abajo. No todas las modificaciones forman parte del actual mtodo, sin embargo, aquellos laboratorios que estn interesados pueden explorar su relevancia clnica. En la tabla de ms abajo se pueden consultar las modificaciones para circunstancias especiales.
Modificaciones del mtodo para circunstancias especiales

Antifngico Microorganismo Modificacin La utilizacin del Medio antibitico n 3 puede mejorar la deteccin de la resistencia. Este medio no est estandarizado y pueden aparecer sustanciales variaciones entre lotes La utilizacin del medio base de nitrgeno para levaduras (Yeast nitrogen base) puede aumentar el crecimiento de Cryptococcus neoformans y mejorar la relevancia clnica de las CIMs El agregado de glucosa a concentracin final de 20 g/l puede simplificar la determinacin del punto de corte. Referencia
Anfotericina B
Candida spp.
15, 35, 44
Todos los antifngicos
Cryptococcus neoformans
13, 45
Todos los antifngicos
Todos los microorganismos
42
31
Tiempo de lectura
El trabajo original del M27 focalizaba la lectura a las 48 h de incubacin. Debido a que la lectura a las 24 h ofrece una clara ventaja para los pacientes crticos, los lmites de las cepas Control se establecieron tanto a las 24 como a las 48 h. En paralelo a este documento, la lectura a las 24 h es posible y en algunos casos, hasta preferible. Por ejemplo, la CIM para las candinas debera leerse a las 24 h. En conclusin, las lecturas debern ser a las: 24 h para las candinas 24 a 48 h para anfotericina B y fluconazol 48 h para 5- fluorocitosina, itraconazol, voriconazol, ravuconazol y posaconazol 72 h para la mayora de los aislamientos de Cryptococcus neoformans frente a los agentes antifngicos mencionados. En la tabla se resumen los tiempos de lectura que se sugieren para los distintos antifngicos
Antifngico Tiempo de lectura de CIM aceptado si el crecimiento fngico es adecuado 24 h Anfotericina B Equinocandinas Fluconazol Flucitosina Itraconazol Posaconazol Ravuconazol Voriconazol SI (1) SI (2) SI (3) NO (4) NO (4) NO (4) NO (4) NO (5) 48 h SI (1) NO SI SI SI SI (1) SI (1) SI
Notas: 1) No hay puntos de corte disponibles. 2) Los puntos de corte sugeridos se definieron para la lectura de las 24 h. 3) Los puntos de corte se definieron sobre la base de la CIM obtenida con el mtodo de referencia a las 48 h. Los anlisis recientes indican que la interpretacin es similar cuando la CIM se lee a las 24 h. 4) La evaluacin de la utilidad de la lectura de la CIM a las 24 h no es clara an para estas drogas. 5) Los trabajos para evaluar la utilidad de la lectura de la CIM a las 24 h se encuentran en desarrollo.
Impacto del tiempo de lectura: 24 versus 48 h

El mtodo del M27-A3 recomienda para Candida spp. la lectura a 48 h, tanto para la macro como para la microdilucin. Para la mayora de los aislados, las diferencias entre la lectura a 24 y 48 h es mnima y no altera la interpretacin de la categora (p. ej. no cambia si el
32
aislado debe ser categorizado sensible o resistente). Sin embargo, en estudios recientes se incluy la lectura a 24 h debido a: 1. A menudo la CIM puede leerse a las 24 h. 2. Las lecturas hechas a las 24 h pueden ser clnicamente ms relevantes para algunos aislamientos. Algunos aislamientos pueden mostrar un incremento marcado entre las 24 y 48 h debido a un significativo efecto de arrastre (trailing) (inhibicin parcial del crecimiento que abarca un amplio rango de concentraciones del antifngico). Esta situacin se estima en un 5% de los aislamientos (3) y el efecto de arrastre puede ser tan grande que un aislamiento sensible a las 24 h puede aparecer como resistente a las 48 h. En trabajos con modelos murinos de candidiasis diseminada se mostr que estos aislamientos deben considerarse sensibles y no resistentes (3, 36). Este concepto fue corroborado por Marr (16) eliminando el efecto de arrastre mediante la disminucin del pH a 5 o menos del medio de cultivo utilizado en la prueba. Adems, por la demostracin clnica que la candidiasis orofarngea debida a esos aislamientos responde a las bajas dosis de fluconazol utilizadas en el tratamiento convencional (34). Teniendo en cuenta estas observaciones, en la tabla al pie, se proveen los rangos de CIM a 24 y 48 h de dos cepas control de calidad y ocho antifngicos (5).
33
Rangos de CIM a 24 y 48 h de dos cepas control de calidad

24 h Microorganismo Antifngico Anfotericina B Anidulafungina Caspofungina 5-fluorocitosina C. parapsilosis ATCC 22019 Fluconazol Itraconazol Ketoconazol Posaconazol Ravuconazol Voriconazol Anfotericina B Anidulafungina Caspofungina 5-fluorocitosina C. krusei ATCC 6258 Fluconazol Itraconazol Ketoconazol Posaconazol Ravuconazol Voriconazol Rango CIM 0,25-2 0,25-2 0,25-1 0,06-0,25 0,5-4 0,125-0,5 0,03-0,25 0,06-0,25 0,016-0,12 0,016-0,12 0,5-2 0,03-0,12 0,12-1 4-16 8-64 0,12-1 0,12-1 0,06-0,5 0,06-0,5 0,06-0,5 % dentro del rango 97,1 95 96,7 99,2 98,2 95,8 97,5 96,7 95,8 100 100 97,9 98,8 97,5 100 95,8 95,4 100 93,3 98,3 48 h Rango CIM 0,5-4 0,5-2 0,5-4 0,125-0,5 1-4 0,125-0,5 0,06-0,5 0,06-0,25 0,03-0,25 0,03-0,25 1-4 0,03-0,12 0,25-1 8-32 16-128 0.25-1 0,12-1 0,12-1 0,25-1 0,12-1 % dentro del rango 91,7 95 92,9 97,9 98,1 97,5 98,3 98,8 98,3 100 100 97,5 97,5 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100
Control de calidad Propsito

Los objetivos del programa de control de calidad son los siguientes:
1. La precisin y exactitud del procedimiento de ensayo. 2. El rendimiento adecuado de los reactivos, de las condiciones del ensayo y de las
instrucciones utilizadas en el procedimiento.
34
3. El rendimiento adecuado del personal que realiza las tcnicas y lee los resultados.
Estos objetivos se alcanzan si se utilizan cepas de control seleccionadas por su estabilidad gentica y por su utilidad para controlar el mtodo que se est ensayando (26).
Responsabilidades del Control de Calidad Fabricantes

Los fabricantes son responsables de lo siguiente: 1) Estabilidad de los antifngicos. 2) Identificacin adecuada de los antifngicos. 3) Potencia de los antifngicos. 4) Conformidad con las buenas prcticas de fabricacin. 5) Integridad del producto. 6) Responsabilidad y facilidad de localizacin del consignatario.
Laboratorio
El laboratorio es responsable de lo siguiente: 1. Almacenamiento adecuado del frmaco. 2. Adecuado nivel de competencia del operador. 3. Estricta adherencia al protocolo (preparacin del inculo, incubacin durante el tiempo y la temperatura adecuadas, etc.).
Responsabilidad mutua
Los fabricantes deben de disear y recomendar programas de control de calidad que permitan, por un lado, que el usuario evale las variables que con mayor frecuencia causan problemas y por otro la comprobacin de que el ensayo se realiza correctamente cuando se adhiere al protocolo establecido.
Seleccin de las cepas de referencia

Las cepas de referencia ideales para realizar el control de calidad deben de tener CIMs en la mitad de intervalos de concentraciones ensayadas de todos los antifngicos. La cepa control ideal tiene la CIM en la 5 dilucin doble de una serie de 9 diluciones. Sin embargo, tambin es aceptable que est entre la tercera y la sptima dilucin. Antes que una cepa sea aceptada como de referencia debe ser evaluada el nmero de veces necesario para demostrar que su patrn de sensibilidad a los antifngicos es estable. El documento M23-A del CLSI suministra las pautas para la adecuada seleccin de las cepas de control de calidad y la determinacin de intervalos aceptables de CIMs (19).
35
Coleccin de las Cepas de Referencia

Las cepas de referencia se deben de almacenar de tal forma que se minimice la posibilidad de mutacin.
Periodos prolongados
Las levaduras se pueden subcultivar en tubos de agar papa dextrosa y luego congelar a 70C Excepto Cryptococcus neoformans, el resto de cepas de referencia se pueden guardar en una solucin al 50% de glicerol a 70C (25).
Perodos cortos
Las cepas de referencia se pueden crecer en tubos de agar Sabouraud o papa dextrosa. Se guardan entre 2-8C. Cada 2 semanas se preparan nuevos tubos. Cuando se obtienen resultados inesperados se vuelve a sacar una cepa de 70C.
Origen de las cepas de referencia

Estas cepas se deben de obtener de organismos reconocidos como Colecciones Nacionales o Internacionales reconocidas (American Type Culture Collection, ATCC; National Collection of Pathogenic Fungi; NCPF, Coleccin Espaola de Cultivos Tipo, etc.). Tambin se pueden adquirir de forma comercial o de Instituciones con demostrada habilidad para almacenar y utilizar estos organismos de forma correcta.
Preparacin de las cepas para su almacenamiento

Se procede de la siguiente forma:
1. Subcultivar las cepas durante 18-24 h en placas de agar Sabouraud o agar papa
dextrosa.
2. Realizar las pruebas de sensibilidad para comprobar que se obtienen las CIMs
esperadas.
3. Subcultivar las cepas con resultados adecuados en placas de agar Sabouraud hasta que
alcancen un buen crecimiento (48-72 h).
4. Comprobar que los cultivos son puros. 5. Suspender una buena cantidad del microorganismo en el medio elegido para la
conservacin. Repartir el medio en viales. Congelar a 70C o en nitrgeno lquido. Las cepas conservadas de esta forma pueden permanecer indefinidamente sin riesgo significativo de variacin en su perfil de sensibilidad.
Uso rutinario de las cepas de referencia

Se recomienda realizar los siguientes pasos para utilizar de forma rutinaria estas cepas: 1. Sacar un tubo del congelador. 2. Dejar que se descongele.
36
3. Subcultivarlo en agar Sabouraud o agar papa dextrosa a 35C durante el tiempo necesario para que se alcance un crecimiento adecuado. 4. Una vez crecidas hay que utilizarlas segn los procedimientos recomendados.
Control del lote de medio y del plstico 1. Cada nuevo lote de medio y de tubos de plstico se evalan con una cepa de control de
calidad para comprobar que las CIMs estn dentro del intervalo aceptado.
2. Una alcuota del medio de cultivo se incuba a 35C durante 18-24 h para comprobar que
est estril.
3. Hay que comprobar que el pH del medio una vez que ha sido preparado estar entre 6,97,1.
4. Anotar y registrar el nmero de lote y los resultados obtenidos con cada evaluacin. Frecuencia del Control de Calidad Intervalos de las CIMs
En general 1 de cada 20 evaluaciones de las cepas de control de calidad puede estar fuera del intervalo recomendado. Si esto ocurre 2 veces consecutivas o ms de 2 veces en 20 evaluaciones hay que tomar medidas de correccin. Transcurrida la accin correctiva, comienzan a contar las 20 veces.
Frecuencia del ensayo de Control de Calidad

Todos los das que se realiza una prueba se deben de utilizar cepas de control de calidad.
37
Documento E.Def 7.2 revision. 2012. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)
Como ya menciona el documento M27-A3, la adicin al medio de cultivo de glucosa hasta una concentracin de 20 g/l puede simplificar la determinacin de la CIM (5, 42). Adems de este punto hay otra serie de circunstancias que pueden mejorar la realizacin y la interpretacin de estas pruebas. En este capitulo las vamos a repasar con detenimiento. El mtodo propuesto por el EUCAST es muy similar al recomendado por el documento M27A3. Sin embargo, una de las diferencias ms notorias entre ambos mtodos, es que en el E.Def 7.2 se adiciona al medio de cultivo glucosa hasta una concentracin de 20 g/l, lo que puede simplificar la determinacin de la CIM (5, 42). Las modificaciones que se realizaron quedan recogidas en la tabla de ms abajo (5, 9).
Diferencias entre los mtodos 27-A3 (CLSI) y E.Def. 7.2 (EUCAST)

M27-A3 Mtodo Medio Microorganismos Inculo Temperatura de incubacin Tiempo de incubacin Macrodilucin en caldo, 1 ml Microdilucin en caldo, 0,2 ml RPMI 1640 con 0,165 M MOPS, pH 7 Candida spp., Cryptococcus neoformans 0,5-2,5 x 103 UFC/ml 35 C Candida, 24 y 48 h Cryptococcus 70-74 h E.Def. 7.2 Microdilucin en caldo, 0,2 ml RPMI 1640-2% glucosa con 0,165 M MOPS, pH 7 Candida spp., Cryptococcus neoformans 0,5-2,5 x 105 UFC/ml 35 C Candida, 24 y 48 h Cryptococcus 48 h Espectrofotomtrica Fondo plano
Determinacin de Visual la CIM Microplacas Fondo U
Medio de cultivo
El medio de cultivo RPMI 1640 es un medio sinttico, es decir, de composicin completamente conocida y estandarizada, que tiene una concentracin de glucosa del 0,2%. La mayora de los medios de cultivos empleados en Micologa tienen concentraciones de glucosa que oscilan entre el 1% y el 6%, si bien estas ltimas se utilizan para identificar algunas especies que son capaces de crecer a esta concentracin tan elevada. Todas las levaduras asimilan la glucosa como fuente de carbono y por tanto parece razonable que el
38
medio de cultivo tenga una concentracin adecuada que permita el desarrollo de estos microorganismos. Por esta razn, se adiciona 2% de glucosa al medio recomendado, RPMI 1640, manteniendo la utilizacin y la concentracin del tampn MOPS. En la tabla de ms abajo se puede observar la densidad ptica alcanzada en RPMI versus RPMI2% glucosa de 40 aislamientos de C. albicans (43).
Comparacin del crecimiento de C. albicans en RPMI vs. RPMI 2% glucosa

DO control de crecimiento en DO control de crecimiento en RPMI RPMI-2% glucosa Media AMB 5FC KTZ FCZ
a
0,02 0,03 0,03 0,03
IC-95% 0,30-0,32 0,37-0,39 0,38-0,4 0,38-0,4
Media 0,93 0,98 0,96 1,02
0,16 0,08 0,07 0,11
IC-95% 0,88-0,98 0,95-1,01 0,93-0,98 0,98-1,06
pa <0,001 <0,001 <0,001 <0,001
0,31 0,38 0,39 0,39
t de Student
Como se puede observar el crecimiento es mejor y con significacin estadstica en RPMI-2% de glucosa. Esto tambin se observ para las siguientes especies analizadas: C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii y C. lusitaniae. La excepcin a este punto la forman la mayora de levaduras que no fermentan la glucosa (Cryptococcus neoformans, Trichosporon beigelii, etc.), en las que el agregado de este compuesto no produce una mejora significativa del crecimiento. Tras esta observacin faltaba comprobar que las CIMs obtenidas con esta metodologa eran equivalentes a las del documento M27-A3. La realizacin de una serie de trabajos, que no se van a comentar aqu, demostr la similitud de ambos mtodos (33, 40-43).
Inculo
Durante los primeros aos se utiliz un inculo de 104 UFC/ml. Con posterioridad, se comprob que se obtenan resultados similares con 105 UFC/ml. La preparacin de este inculo es mucho ms fcil y exacta ya que no hay que hacer ninguna dilucin. Adems, el crecimiento a las 24 h es ms homogneo entre especies. Por ltimo, es el mismo inculo que se utiliza para las pruebas de sensibilidad de bacterias. Se eligi para que aumentaran las posibilidades de detectar clones resistentes dentro de una poblacin heterognea. Es sabido que se inhibe peor una poblacin de microorganismos grande que una pequea y por tanto, la probabilidad de la aparicin de mutantes resistentes aumenta con el tamao de la misma. Para conseguir esto es necesario que el inculo no sea pequeo y as se ha recomendado la utilizacin de al menos 105 UFC/ml. Otra forma de detectar estos particulares clones es la prolongacin de la incubacin ms all de 18-24 h y
39
por esa razn, en el E.Def 7.2 se recomienda realizar la lectura a las 24 y 48 h aunque se informe, si no existen discrepancias, la CIM obtenida a las 24 h.
Placas de microdilucin
Otro aspecto a valorar es la eleccin de las placas de microdilucin. Es importante tener en cuenta varias cosas. En primer lugar, no se pueden elegir placas de microdilucin que estn diseadas para pruebas de ELISA ya que reciben tratamientos especiales en su superficie para que los anticuerpos o los antgenos se fijen de forma adecuada. En general, se desconoce como se comportan los antifngicos en estas superficies y por tanto no se deben de utilizar. Se recomiendan placas diseadas especficamente para pruebas de sensibilidad que, si no estn identificadas de esta forma, suelen coincidir con las placas dedicadas para cultivo celular. Adems son ms baratas que las placas de ELISA. Otro aspecto a considerar son las tapas de las placas de microdilucin. Es importante tener en cuenta que las levaduras son microorganismos aerobios, aunque algunos tengan capacidad de fermentacin. Por esta razn, se debe de evitar la utilizacin de tapas que eviten la evaporacin, ya que su diseo produce un menor intercambio de oxgeno. Esto no es un problema para las bacterias pero s para algunos hongos. Se incuban las placas dentro de una caja con atmsfera hmeda (papel de filtro empapado en agua) que permita el intercambio de aire, la evaporacin del medio de cultivo es mnima. Por ltimo, hay que mencionar el tema de la forma del pocillo. El CLSI recomienda la utilizacin de placas con pocillos de fondo redondo. Estas placas tienen algunos inconvenientes que es conveniente mencionar. En primer lugar, el volumen de estas placas es menor y por tanto cuando se utilizan 200 l por pocillo, como recomienda el CLSI, no se pueden agitar para suspender el cultivo. En segundo lugar, es ms difcil suspender el cultivo en estas placas que en las de fondo plano. Cuando se procede a determinar la CIM de los azoles de forma visual, si las placas de fondo redondo no se agitan, se visualiza un botn de crecimiento en todos los pocillos. Si es una cepa sensible, este botn va disminuyendo segn va aumentando la concentracin del antifngico. Sin embargo, la eleccin de la CIM es bastante difcil. Por ltimo, si se determina la CIM mediante espectrofotometra, el fondo redondo de estas placas ejerce un efecto de lupa que aumenta de forma irreal la densidad ptica. Por tanto, en el E.Def 7.1 se recomienda la utilizacin de placas de fondo plano que evitan la aparicin de los inconvenientes reseados ms arriba.
Lectura. Eleccin de la CIM

Con respecto al coeficiente de inhibicin a elegir, existen variadas y diversas opiniones. El CLSI se decidi por la determinacin visual de la CIM. Esta eleccin no puede quedar exenta de crticas. Cuando se recomend la macrodilucin se pudo haber diseado la prueba de forma que se hubieran empleado 3 ml de medio de cultivo en los tubos
40
recomendados y as se podan haber ledo en un espectrofotmetro. Sin embargo, el volumen final es de 1 ml con lo que la nica alternativa es la lectura visual. Tras comprobar que dicha lectura visual generaba poca reproducibilidad con los azoles, se decidi inventar una forma ms objetiva de interpretar la CIM y as se recomend la dilucin 1:5 del tubo control de crecimiento (80% de inhibicin) y su comparacin con toda la batera de tubos para elegir como CIM aquel que tuviera una turbidez similar (21). Con la anfotericina B no hubo problemas ya que se elije una inhibicin completa del crecimiento. Al pasar a la microdilucin, el problema, si cabe, se agrava ya que se mantiene la eleccin visual de la CIM con arreglo a una clasificacin en 4 categoras que es bastante difcil de interpretar, especialmente para grupos poco experimentados en el tema (5, 21). Es evidente que la lectura visual constituye una limitacin importante al momento de elegir el punto de CIM. Sin embargo, parece que la lectura mediante un espectrofotmetro es lo ms adecuado. Cualquier laboratorio de Microbiologa que realice tcnicas de ELISA dispone de uno de estos aparatos. La lectura de las placas de microdilucin, mediante este mtodo, es objetiva y permite la eleccin de cualquier coeficiente de inhibicin. Adems, informa de la curva de inhibicin que produce el antifngico sobre cada una de las cepas ensayadas (24, 40, 42, 43). La eleccin de que coeficiente de inhibicin elegir con los azoles es un tema tambin controvertido. Es evidente que hay que considerar con detenimiento las recomendaciones del CLSI. Sin embargo, es importante detenerse y analizar las cepas que tienen un mayor crecimiento residual (trailing effect). Se observa que dependiendo del criterio aplicado en la determinacin de la CIM (80% vs. 50%) estas cepas son resistentes o sensibles. En algunos casos, no documentados de forma adecuada, los pacientes respondan a un tratamiento estndar a pesar de que el aislado tena una CIM-80% > 128 mg/l. Cuando se determinaba la CIM 50% era 0,25 o 0,5 mg/l. Este tipo de observaciones fueron analizadas de forma detenida en 2 trabajos publicados por Odds et al. (24) y Rex et al. (36). En el primero de ellos se afronta esta problemtica desde una perspectiva in vitro y en el segundo se correlaciona los resultados in vitro de estas cepas peculiares con la respuesta al tratamiento en un modelo experimental de infeccin fngica. En ambos se alcanza la conclusin que, para los azoles y la 5-fluorocitosina, la determinacin de la CIM-50% puede ser ms adecuada. Hay que tener en cuenta que estas observaciones estn determinadas in vitro y en un modelo experimental y que por tanto la extrapolacin al humano deber ser cautelosa. Hay que sealar que las CIMs no varan de forma sustancial si se excepta este tipo especial de aislamientos. Esta es una ms de las razones por las que la determinacin de la CIM se debe de realizar con espectrofotmetro ya que se puede calcular el coeficiente de inhibicin que se requiera y hacer estudios de correlacin in vitro - in vivo que determinen
41
con exactitud cual es el mtodo ms adecuado. El E.Def 7.2 recomienda medir la absorbancia a una longitud de onda de 530 nm, aunque tambin pueden utilizarse 405 o 450 nm. El valor del blanco deber restarse a la lectura del resto de los pocillos.
Interpretacin de resultados. Puntos de corte

En 2008 el EUCAST public notas tcnicas en las que recomienda los puntos de corte para fluconazol y voriconazol, nicamente para C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata y C. guilliermondii. Recientemente se dieron a conocer los puntos de corte para anfotericina B, anidulafungina y posaconazol. La informacin se encuentra disponible en el sitio http://www.srga.org/eucastwt/MICTAB/index.html En la siguiente tabla se muestran los puntos de corte sugeridos por EUCAST Puntos de corte de CIM. E.Def 7.2 revision. EUCAST, 2012
Puntos de corte (S/R>) Candida albicans Anfotericina B Anidulafungina Fluconazol Posaconazol Voriconazol 1/1 0,03/0,03 2/4 0,06/0,06 0,125/0,125
b
Candida glabrata 1/1 0,06/0,06 I/E I/E I/E
Candida krusei 1/1 0,06/0,06 ----I/E I/E
Candida parapsilosis 1/1 ----2/4 0,06/0,06 0,125/0,125

b
Candida tropicalis 1/1 0,06/0,06 2/4 0,06/0,06 0,125/0,125

b
Candida guilliermondii I/E I/E I/E I/E
Otras especies
(S/R>)a I/E I/E 2/4 I/E I/E
S: sensible R: resistente a. Los puntos de corte de otras especies fueron determinados sobre la base de datos de farmacocintica /farmacodinamia y son independientes de la distribucin de la CIM de especies especficas. Son para usar en microorganismos que no tienen punto de corte especfico. b. Cepas con valores de CIM sobre S/I son raros o an no fueron comunicados. Si el resultado se confirma debera repetirse la identificacin y la prueba de sensibilidad del aislamiento en el laboratorio de referencia. Los aislamientos con valores de CIM mayores (en itlica) debern ser considerados como resistentes. -- = no se recomienda hacer la prueba de sensibilidad frente al antifngico debido al pobre target de la especie para la terapia con esa droga. "I/E": hay insuficiente evidencia que indique que la especie en cuestin es un buen target para la terapia con la droga.
El problema de Cryptococcus neoformans como ejemplo de levaduras que no fermentan la glucosa

El mayor problema que ofrece Cryptococcus neoformans es su escaso crecimiento en todos los medios ensayados para determinar la sensibilidad. El CLSI (5) incluye en su mtodo estndar a este microorganismo recomendndose que la lectura de la CIM se haga a las 7074 h. Este hecho ya indica de por s su lento crecimiento que es equivalente a otros microorganismos que tampoco fermentan la glucosa. Otra alternativa, que recomienda el
42
CLSI es la utilizacin de Base de nitrgeno para levaduras (Yeast Nitrogen Base) como medio de cultivo. Ghannoum et al. (13) en un trabajo compara distintos medios de cultivo y variables, y de ese trabajo surgen las siguientes consideraciones. La tabla de ms abajo es una transcripcin de la tabla original publicada en dicho artculo en el que se recoge el crecimiento de 21 Cryptococcus neoformans a las 48 h con un inculo inicial de 104 UFC/ml. Comparacin del crecimiento de Cryptococcus neoformans en varios medios de cultivo N de cepas con Coeficiente de Medio de cultivo DO420 variacin (%) DO420 0,01 BYNB 7 YNB 5,4 SAAMF RPMI 0,062 0,03 0,072 0,04 0,031 0,01 0,045 0,02 42 55 39 49 1 2 0 3
Como se puede observar el crecimiento que obtuvo fue muy escaso en todos los medios de cultivo ensayados. Se asume que una cepa crece de forma adecuada cuando la DO alcanza el 0,5. Odds et al., (23) demuestra que el factor limitativo del crecimiento de Cryptococcus neoformans es la disponibilidad de oxgeno. En la siguiente tabla se puede ver como la adicin de glucosa mejora el crecimiento de C. albicans y la agitacin el de Cryptococcus neoformans. Es decir, que la disponibilidad de oxgeno, consigue que, con independencia de la concentracin de glucosa, se alcance un crecimiento adecuado. Sin embargo, en otro trabajo realizado en tubos con 5 ml de medio, tambin se observa como la glucosa incrementa el crecimiento de la mayora de los Cryptococcus neoformans utilizados (23). En la tabla siguiente se puede observar la comparacin del crecimiento de Cryptococcus neoformans y C. albicans con RPMI, RPMI-2% glucosa, con y sin agitacin. Comparacin del crecimiento de Cryptococcus neoformans y C. albicans con RPMI, RPMI-2% glucosa, con y sin agitacin Media SD / OD 405 (48 h a 37C) 0,2 % glucosa C. neoformans (n=15) Sin agitacin A 20 r.p.m. C. albicans (n=12) Sin agitacin A 20 r.p.m. 0,17 0,10 0,31 0,16 0,37 0,06 0,48 0,14 2% glucosa 0,18 0,05 0,39 0,17 0,8 0,17 0,97 0,14
43
Recientemente Zaragoza et al., en su trabajo compara la cintica de crecimiento y la sensibilidad in vitro de levaduras no fermentadoras tales como Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Cryptococcus albidus, Rhodotorula spp., Yarrowia lipolytica, Geotrichum spp., y Trichosporon spp. Adems, analiz el efecto del medio de cultivo en el desarrollo (RPMI versus yeast nitrogen base [YNB]), concentracin de glucosa (0,2% versus 2%), fuente de nitrgeno (sulfato de amonio), temperatura (30C versus 35C), agitacin y tamao del inculo (103, 104, y 105). De cada experimento se analiz la tasa de crecimiento, la fase log, la mxima densidad ptica, y luego de un anlisis multivariado, el medio YNB demostr una significativa mejora en el desarrollo de las levaduras. Por otra parte, la agitacin, el inculo de 105 UFC/ml, y la incubacin a 30C tambin mejoraron la cintica de crecimiento de los organismos. No se observaron modificaciones significativas en el crecimiento con la suplementacin con sulfato de amonio o glucosa 2%. En conclusin, el YNB como medio de cultivo, la agitacin de las placas, la lectura a las 48 h de incubacin, el inculo de 105 UFC/ml, y una incubacin a 30C facilitaron la realizacin de la determinacin de la CIM. Por lo tanto, Zaragoza et al., recomienda la implementacin de estos cambios para determinar la CIM en organismos no fermentadores (46). Estos resultados se tomaron en consideracin para incluir a Cryptococcus neoformans en la ltima versin del documento E.Def 7.2 del EUCAST (9)
44
Referencias
1. 2. Aller AI., Martin-Mazuelos E., Lozano F., et al. 2000. Correlation of fluconazole MICs Anaissie E., Paetznick V., Bodey GP. 1991. Fluconazole susceptibility testing of with clinical outcome in cryptococcal infection. Antimicrob Agents Chemother; 44(6):1544-8. Candida albicans: microtiter method that is independent of inoculum size, temperature, and time of reading [published erratum appears in Antimicrob Agents Chemother 1992 36(5):1170]. Antimicrob Agents Chemother. 35(8):1641-6. 3. Arthington-Skaggs BA., Warnock DW., Morrison CJ. 2000. Quantitation of Candida albicans ergosterol content improves the correlation between in vitro antifungal susceptibility test results and in vivo outcome after fluconazole treatment in a murine model of invasive candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 44:2081-2085. 4. Barchiesi F., Colombo AL., McGough DA., and Rinaldi MG. 1994. Comparative study of broth macrodilution and microdilution techniques for in vitro antifungal susceptibility testing of yeasts by using the National Committee for Clinical Laboratory Standards' proposed standard. J Clin Microbiol. 32(10):2494-500. 5. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard Third Edition. CLSI document M27-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania 190871898 USA, 2008. 5.a. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Third Information Supplement. CLSI document M27-S3. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2008. 6. Drouhet E., Dupont B. Standarization of the antifungal sensitivity test. Report of the study group of the French Society for Medical Mycology. Bull. Soc. Fr. Med. Mycol. 10, 131134, 1981. 7. Espinel Ingroff A., Kerkering TM., Goldson PR., et al. 1991. Comparison study of broth macrodilution and microdilution antifungal susceptibility tests. J Clin Microbiol. 29(6):1089-94. 8. Espinel Ingroff A., Kish CW Jr., Kerkering TM., and et al. 1992. Collaborative comparison of broth macrodilution and microdilution antifungal susceptibility tests. J Clin Microbiol. 30(12):3138-45. 9. EUCAST Definitive Document E.Def 7.2, revision: method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for yeasts. Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). www.eucast.org.
45
10. 11.
Favel A., Michel-Nguyen A., Datry A., et al. 2004. Susceptibility of clinical isolates of Fromtling RA., Galgiani JN., Pfaller MA., and et. al. 1993. Multicenter evaluation of a
Candida lusitaniae to five systemic antifungal agents. J Antimicrob Chemother 53(3):526-9. broth macrodilution antifungal susceptibility test for yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 37:39-45. 12. 13. 14. Ghannoum MA. 1996. Is antifungal susceptibility testing useful in guiding fluconazole Ghannoum MA., Ibrahim AS., Fu Y., et al. 1992. Susceptibility testing of Kullberg BJ., Sobel JD., Ruhnke M et al. 2005. Voriconazole vs. a regimen of therapy? Clin Infect Dis. 22 Suppl 2:S161-5. Cryptococcus neoformans: a microdilution technique. J Clin Microbiol. 30:2881-2886. amphotericin B followed by fluconazole for candidemia in nonneutropenic patients: a randomized non- inferiority trial. Lancet; 366:1435-1442. 15. Lozano-Chiu M., Nelson PW., Lancaster M., et al. 1997. Lot-to-Lot variability of antibiotic medium 3 used for testing susceptibility of Candida isolates to amphotericin B. J Clin Microbiol. 35:270-272. 16. 1386. 17. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1992. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Proposed Standard M27- P. National Committe for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pennsylvania. 18. 19. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1995. Reference method for National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1994. Development of in vitro broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Tentative standard M27-T. susceptibility testing criteria and quality control parameters; approved guideline. Approved guideline M23-A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pennsylvania. 20. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard M27. National Committe for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pennsylvania. 21. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2002 Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard. Document M27A2. Villanova, Pa. USA. 22. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2009. Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; Approved Guideline, Document M44-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pa, USA. Marr KA., Rustad TR., Rex JH., et al. 1999. The trailing end point phenotype in antifungal susceptibility testing is pH-dependent. Antimicrob Agents Chemother. 43:1383-
46
23. 24.
Odds FC., De Backer T., Dams G., et al. 1995. Oxygen as limiting nutrient for growth Odds FC., Vranckx L., Woestenborghs F. 1995. Antifungal susceptibility testing of
of Cryptococcus neoformans. J Clin Microbiol. 33(4):995-7. yeasts: evaluation of technical variables for test automation. Antimicrob Agents Chemother. 39(9):2051-60. 25. 26. Pasarell L., McGinnis MR. (1992). Viability of fungal culturs maintained at -70C. J Pfaller MA., Bale M., Buschelman B., Lancaster M., et al. 1995. Quality control Clin Microbiol. 30:1000-1004. guidelines for National Committee for Clinical Laboratory Standards recommended broth macrodilution testing of amphotericin B, fluconazole, and flucytosine. J Clin Microbiol. 33(5):1104-7. 27. Pfaller MA., Boyken L., Hollis RJ., et al. 2005. In vitro activities of anidulafungin against more than 2500 clinical isolates of Candida spp., including 315 isolates resistant to fluconazole. J Clin Microbiol. 43:5425-5427. 28. Pfaller MA., Boyken L., Hollis RJ., et al. 2006. Global surveillance of in vitro activity of micafungin against Candida and comparison by CLSI- recommended methods. J Clin Microbiol; 44:3533-3538. 29. Pfaller MA., Buschelman B., Bale M., et al. 1988. Multicenter evaluation of four methods of yeast inoculum preparation. J Clin Microbiol. 26:1437-1441. Chemother. 34:1648-1654. 30. Pfaller MA., Grant C., Morthland V., et al. 1994. Comparative evaluation of alternative methods for broth dilution susceptibility testing of fluconazole against Candida albicans. J Clin Microbiol 32(2):506-9. 31. Pfaller MA., Messer SA., Coffmann S. 1995. Comparison of visual and spectrophotometric methods of MIC endpoint determinations by using broth microdilution methods to test five antifungal agents, including the new triazole D0870. J Clin Microbiol. 33(5):1094-7. 32. 33. Pfaller MA., Rinaldi MG., Galgiani JN., et al. 1990. Collaborative investigation of Polanco AM., Rodriguez Tudela JL., Baquero F., et al. 1995. Improved method of variables in susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 34:1648-1654. determining the susceptibility of Candida albicans to fluconazole. J Antimicrob Chemother. 35(1):155-9. 34. Revankar SG., Kirkpatrick WR., McAtee RK, et al. 1998. Interpretation of trailing end points in antifungal susceptibility testing by the National Committee for Clinical Laboratory Standard method. J. Clin Microbiol. 36:153-156.
47
35. 36.
Rex JH., Cooper CR Jr., Merz WG., et al. 1995. Detection of amphotericin B-resistant Rex JH., Nelson PW., Paetznick VL., et al. 1998. Optimizing the correlation between
Candida isolates in a broth-based system. Antimicrob Agents Chemother. 39(4):906-9. results of testing in vitro and therapeutic outcome in vivo for fluconazole by testing critical isolates in a murine model of invasive candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 42(1):12934. 37. Rex JH., Pfaller MA., Barry AL., et al. 1995. Antifungal susceptibility testing of isolates from a randomized, multicenter trial of fluconazole versus amphotericin B as treatment of nonneutropenic patients with candidemia. NIAID Mycoses Study Group and the Candidemia Study Group. Antimicrob Agents Chemother. 39(1):40-4. 38. Rex JH., Pfaller MA., Galgiani JN., et al .1997. Development of interpretive breakpoints for antifungal susceptibility testing: conceptual framework and analysis of in vitro-in vivo correlation data for fluconazole, itraconazole, and Candida infections. Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing of the National Committee for Clinical Laboratory Standards [see comments]. Clin Infect Dis. 24(2):235-47. 39. Rex JH., Pfaller MA., Lancaster M., et al. 1996. Quality control guidelines for National Committee for Clinical Laboratory Standards--recommended broth macrodilution testing of ketoconazole and itraconazole. J Clin Microbiol. 34(4):816-7. 40. Rodriguez Tudela JL., Berenguer J., Martinez Suarez JV., et al. 1996. Comparison of a spectrophotometric microdilution method with RPMI-2% glucose with the National Committee for Clinical Laboratory Standards reference macrodilution method M27-P for in vitro susceptibility testing of amphotericin B, flucytosine, and fluconazole against Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 40:1998-2003. 41. Rodriguez Tudela JL., Donnelly JP., Pfaller MA., et al. 2007. Statistical Analyses of Correlation between Fluconazole MICs for Candida spp. Assessed by Standard Methods Set Forth by the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (E.Dis. 7.1) and CLSI (M27-A2). J Clin Microbiol., p. 109111 42. 43. Rodriguez Tudela JL., Martinez Suarez JV. 1994. Improved medium for fluconazole Rodriguez Tudela JL., Martinez Suarez JV. 1995. Defining conditions for microbroth susceptibility testing of Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 38(1):45-8. antifungal susceptibility tests: influence of RPMI and RPMI-2% glucose on the selection of endpoint criteria. J Antimicrob Chemother. 35(6):739-49. 44. Wanger Mills AK., Nelson PW., Rex JH. 1995. Comparison of Etest and National Committee for Clinical Laboratory Standards broth macrodilution method for antifungal susceptibility testing: enhanced ability to detect amphotericin B-resistant Candida isolates. Antimicrob Agents Chemother. 39(11):2520-2.
48
45.
Witt MD., Lewis RJ., Larsen RA., et al. 1996. Identification of patients with acute
AIDS-associated cryptococcal meningitis who can be effectively treated with fluconazole: the role of antifungal susceptibility testing [see comments]. Clin Infect Dis. 22(2):322-8. 46. Zaragoza O, Mesa-Arango AC, Gmez-Lpez A, Bernal-Martnez L, RodrguezTudela JL, Cuenca-Estrella M. Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts. Antimicrob Agents Chemother 2011 55(4):1563-70.
49
47.
Mtodo de difusin con disco en medio slido Introduccin

En las ltimas dcadas se desarrollaron y realizaron numerosos trabajos con el fin de mejorar las pruebas de sensibilidad de los antifngicos in vitro. En la actualidad existen tcnicas de referencia disponibles para levaduras y hongos filamentosos (5, 6, 11, 11.a). No obstante, distintos grupos de trabajo en todo el mundo desarrollaron pruebas de sensibilidad en medio slido, en la intencin de obtener tcnicas que pudieran llevarse a cabo en el laboratorio clnico (1-3, 24-29, 32, 33). En 2004 el CLSI public su documento M44-A que sienta las bases para realizar las pruebas de sensibilidad de los antifngicos en medio slido con discos de papel. En 2009 se dio a conocer la segunda versin del documento (M44-A2) (23). Adems de la difusin en agar con discos de papel, la aparicin de las tiras de Etest en el mercado, constituye una herramienta potencial al momento de realizar pruebas de sensibilidad en los laboratorios de rutina, que por otra parte, cuenta con el aval de numerosos trabajos (3, 15, 28, 38). Sin embargo, es conveniente recordar que el Etest nunca formar parte de un estndar ya que su origen es comercial. Es imprescindible que los estndares incluyan mtodos asequibles para cualquier laboratorio y alejada de cualquier inters comercial (9). Para lograr la estandarizacin de las pruebas de sensibilidad en medio slido se tuvieron en cuenta las mismas variables que para la estandarizacin de los antibacterianos. Por esta razn es conveniente repasar, de una forma general, estos aspectos. Las pruebas en medio slido y en especial las de difusin con disco son simples de realizar y los resultados se obtienen de forma rpida, siendo, en teora, muy fciles de interpretar. No obstante, en este punto hay que ser muy estrictos, pues si las tcnicas no se realizan siguiendo rigurosamente las instrucciones sugeridas por los fabricantes, es posible que se obtengan resultados errneos.
Generalidades Propiedades del agar

Prcticamente todos los medios se solidifican con agar al 1,5-2%. El agar es un polisacrido complejo que procede de distintas especies de algas marinas rojas. Las caractersticas fsicas de este producto lo hacen muy til ya que es lquido cuando se mantiene a temperaturas elevadas y permanece en este estado hasta los 45-50C. A partir de esta
50
temperatura se solidifica y no se lica hasta que se calienta cerca de los 100C. Asimismo, el crecimiento de los microorganismos no lo afecta. Al ser un producto natural su composicin vara y as no todos los lotes son iguales. Esta ltima caracterstica hace que no se pueda esperar que los resultados obtenidos sean 100% reproducibles. Debido a estas consideraciones se est intentando encontrar un compuesto equivalente pero qumicamente definido. Si bien se ensayaron el Separan N P 10, Gelrite, y Neutra gel, entre otros, no alcanzaron el desarrollo necesario para que estn disponibles comercialmente.
Difusin de los agentes antimicrobianos a travs del agar

Las pruebas de difusin de agar se realizan inoculando, con el microorganismo problema, un medio de cultivo adecuado. A continuacin, se aade el antimicrobiano contenido en el reservorio predeterminado para tal fin. Tras un tiempo apropiado de incubacin aparece una zona de inhibicin del crecimiento alrededor del reservorio. Los reservorios que se utilizan son variados e incluyen, pocillos en el agar, cilindros que contienen el antimicrobiano, tabletas o discos. La aparicin del disco de papel de filtro impregnado de antimicrobiano revolucion esta tcnica. En la actualidad es el reservorio de eleccin para las pruebas de sensibilidad. Sin embargo, para la determinacin de las concentraciones de antimicrobianos en suero por bioensayo se siguen utilizando pocillos en el agar. El tamao de la zona de inhibicin se mide para determinar si el microorganismo es sensible o resistente (prueba de sensibilidad) o para determinar la concentracin del antimicrobiano en el reservorio (bioensayo). Para realizar estas pruebas es necesario que los antimicrobianos sean capaces de difundir de forma adecuada a travs del agar. Existen una serie de conceptos tericos que se deben tener en cuenta para comprender todas las variables que influyen en la formacin de la zona de inhibicin del crecimiento del microorganismo alrededor del antimicrobiano.
Concentracin del antimicrobiano en el reservorio

Cada antimicrobiano difunde a travs del agar a una tasa predecible que depende directamente de su concentracin en el reservorio. Al inicio del proceso de difusin la concentracin del antimicrobiano es mayor en la zona limtrofe del reservorio que en la solucin inoculada. Segn va difundiendo el antimicrobiano la concentracin dentro del reservorio disminuye y va aumentando alrededor del mismo. Este proceso depende del antimicrobiano y de la naturaleza del agar. Al final se produce un gradiente de concentracin alrededor del reservorio que impide el crecimiento del microorganismo inoculado hasta una zona determinada.
51
En la mayora de los casos la difusin se termina luego de 6-8 h de iniciado el proceso. Para cualquier antimicrobiano, la tasa de difusin a travs de un medio determinado bajo condiciones controladas, se puede calcular y expresar como una constante, lo que se denomina, coeficiente de difusin. Con condiciones estandarizadas, la difusin de un antimicrobiano es proporcional a la concentracin del mismo en el reservorio, es decir, a mayor concentracin, mayor distancia de difusin. Otras variables como el tamao y forma de la molcula, la carga inica, la viscosidad del agar, la temperatura, y la concentracin inica del medio tambin influyen en el coeficiente de difusin. Por ejemplo, el coeficiente de difusin de la estreptomicina a 35C es de 1,06 mm2 por hora mientras que a 25C disminuye a 0,84 mm2 por hora. Esta disminucin del coeficiente de difusin se debe al efecto que la temperatura ejerce sobre la viscosidad del agar y sobre la tasa de crecimiento de los microorganismos.
Caractersticas de la zona limtrofe

En las pruebas de difusin, se considera, en teora, que cuando una poblacin de microorganismos se enfrenta a un gradiente de concentracin decreciente de un antimicrobiano, se produce una inhibicin completa de dicho microorganismo y as, la zona de inhibicin que aparece est perfectamente definida. En la prctica, muchos antimicrobianos (por ejemplo los azoles) producen una zona de inhibicin parcial. En realidad, la zona limtrofe abarca todo el espectro de respuestas que comienza con una zona de inhibicin completa, seguida de otra de crecimiento retardado, inhibicin parcial y crecimiento vigoroso. Esta ltima zona tiene una mayor disponibilidad de nutrimento que difunde desde el agar sin crecimiento y as, en esta zona limtrofe, se ve un crecimiento ms vigoroso apareciendo ms engrosada que la zona adyacente. Si la incubacin se prolonga, la zona de inhibicin va disminuyendo de tamao. Por esta razn, el periodo de incubacin debe estar estandarizado permaneciendo constante. Asimismo, el mtodo por el cual las placas son examinadas (intensidad y ngulo de la luz) debe estar tambin estandarizado para obtener resultados reproducibles.
Factores que influyen en las pruebas de difusin

Muchas variables influyen en los resultados finales de las pruebas de difusin y lo hacen al mismo tiempo y de diferentes formas. Algunos se pueden controlar en el laboratorio y son los que discuten en los siguientes prrafos.
Composicin del medio de cultivo

La composicin del medio de cultivo influye en el tamao de la zona de inhibicin de 3 formas: 1. En la actividad del antimicrobiano.
52
2. En la velocidad de difusin del antimicrobiano. 3. En la velocidad de crecimiento del microorganismo. Debido a esto, se acord que el medio de cultivo debe reunir las siguientes caractersticas: 1. La receta del medio debe especificar la composicin de productos sin estandarizar como la peptona y el agar. 2. El medio debe permitir el crecimiento de la mayora de los patgenos. 3. El medio debe estar tamponado de forma que no se produzca un cambio significativo en su pH cuando los microorganismos crezcan. 4. El medio no debe ser antagonista de ninguno de los antimicrobianos ensayados. 5. El medio debe ser isotnico con la sangre, de forma que se pueda aadir sangre completa para permitir el crecimiento de microorganismos fastidiosos. 6. El medio debe producir resultados satisfactorios en los ensayos de sensibilidad con las cepas de control de calidad. 7. El medio debe ser reproducible, es decir el uso de diferentes lotes debe producir resultados similares. Para los antibacterianos el medio recomendado es agar Mueller-Hinton (21), mientras que para los antifngicos, se recomienda el uso de agar Mueller-Hinton con 2% glucosa y 0,5 mg/l Azul de Metileno (23).
pH y electrolitos
En el caso de los hongos el pH del medio debe ser de 7 0,1. No se estudi el comportamiento de los electrolitos con los antifngicos. Con las bacterias se sabe que el calcio, el magnesio y otros cationes metlicos influyen en la actividad de algunos antimicrobianos frente a algunas especies de bacterias. Por ejemplo, una concentracin baja de calcio y magnesio produce CIMs elevadas y pequeas zonas de inhibicin por lo que bacterias sensibles se clasifican como resistentes.
Humedad en la superficie del agar

La superficie del agar no debe mantener exceso de humedad, pues interferira con la correcta difusin del antimicrobiano.
Interacciones entre los antimicrobianos y el agar

Se sabe que los antimicrobianos con estructuras moleculares que albergan cationes se unen electrostticamente a los grupos cidos o sulfato del agar y, en consecuencia, la velocidad de difusin disminuye y se producen zonas de inhibicin ms pequeas. Por tanto, este es otro factor a considerar con los hongos y los antifngicos.
53
Tamao del inculo

Es una de las variables que ms influye en el resultado. El tamao de la zona de inhibicin se determina cuando de alcanza la masa celular crtica. Si el inculo es pequeo, la masa celular crtica tarda ms tiempo en desarrollarse y el antimicrobiano tiene ms tiempo para difundir siendo el resultado una gran zona de inhibicin. Con un inculo grande el efecto es el contrario. Si el inculo sobrepasa la masa celular crtica, el antimicrobiano solo puede difundir durante el tiempo que transcurre entre la siembra de la placa y el inicio de la fase exponencial. Con las bacterias puede ser menos de 1 hora y con las levaduras alrededor de 2 o 2 h y media. Tras colocar el antimicrobiano en la placa, la distribucin del mismo comienza de forma brusca hasta que se alcanza el proceso de difusin equilibrado. Por esta razn, es poco probable que se alcancen procedimientos estandarizados con inculos muy densos, si bien hay que considerar que tardan ms en alcanzar la fase exponencial de crecimiento y por tanto a lo mejor se pueden utilizar inculos ms elevados. Por el momento, solo se estandariz el inculo para levaduras del Gnero Candida para realizar difusin en agar con discos de papel.
Profundidad del medio de cultivo

Se recomienda que la profundidad del medio de cultivo sea de 4 mm. Cuando la profundidad del mismo es de 2-3 mm, se observan pequeas variaciones que dan lugar a grandes cambios en la zona de inhibicin.
Temperatura de incubacin
Para los hongos tambin se recomend una temperatura de incubacin de 35-37C. Para las bacterias se hizo esta recomendacin ya que se demostr que a menor temperatura tardaban ms en crecer y por tanto, el antimicrobiano difunda ms. Asimismo, algunos antimicrobianos difunden ms lentamente a bajas temperaturas. Este hecho, es en parte debido al aumento de la viscosidad del medio. En consecuencia, en las primeras h de incubacin, que son las ms crticas, una temperatura baja produce dos fenmenos contrapuestos. El primero es la aparicin de una zona de inhibicin grande debido a la menor velocidad de crecimiento del microorganismo y el segundo es una zona de inhibicin pequea debido a la disminucin de la velocidad de difusin del antimicrobiano. En general, tiende a prevalecer el primer efecto. Con los hongos, este factor es muy importante, ya que muchas especies crecen mejor a 2830 C que a 35-37C. La mayora de los autores insisten en que con los hongos estas pruebas se hagan a 35-37C. Valga como ejemplo, que algunos bacilos Gram negativos no fermentadores crecen a mayor velocidad a 30C. Por tanto, la zona de inhibicin puede ser muy grande a 37C y en consecuencia se clasifica a un microorganismo resistente como
54
sensible. Este hecho, al igual que ocurre con las bacterias, tiene que ser determinado con aquellos hongos que crecen mucho mejor a 28-30C y cuyo patgeno ms representativo es Cryptococcus neoformans. Por ltimo, un factor importante, que no suele considerarse, es el tiempo que tarda en alcanzar una placa de Petri la temperatura de la estufa. Si es una placa sola, el tiempo aproximado es de una hora, sin embargo, si se colocan apiladas de 5 en 5, la placa central tarda 4 h en alcanzar la temperatura deseada. Este hecho puede influir de forma significativa en el tamao de la zona de inhibicin. Por tanto, se recomienda que nunca se apilen ms de tres placas en el incubador, o bien, apilarlas en forma intercalada, formando pirmides de modo que se permita la libre circulacin del aire caliente.
Velocidad de crecimiento del microorganismo

Es evidente que no todos los microorganismos, aunque pertenezcan al mismo Gnero, crecen a la misma velocidad. Aquellos, que por las razones que sean, crecen ms lentamente, bajo condiciones estandarizadas, no pueden ser ensayados de forma adecuada ya que pueden aparecer zonas de inhibicin muy grandes que pueden indicar que son sensibles o simplemente que no crecen. Por el contrario, si se puede clasificar a una cepa, con estas caractersticas, como resistente si no hay zona de inhibicin. De todas formas, se recomienda que este tipo de microorganismos se ensaye en medio lquido.
Tiempo de incubacin
La zona de inhibicin se determina en las primeras h de la incubacin. As, en teora, las placas se pueden leer en cuanto se detecte crecimiento. Con las bacterias se puede detectar en 5-6 h. Sin embargo, se recomienda que la lectura se haga entre las 20 a 24 h y si el crecimiento no es suficiente, leer a las 48 h, ya que todos los factores que influyen en las caractersticas de la zona limtrofe tuvieron tiempo suficiente para ejercer su influencia y por tanto la reproducibilidad es mayor. Aunque no hay nada decidido por el momento, las levaduras del Gnero Candida se pueden leer a partir de las 18 h, aunque algunas especies pueden necesitar una prolongacin de la incubacin a las 48 h (Candida parapsilosis).
Cundo se debe de colocar el disco de antimicrobiano?

Tras la inoculacin del agar con el microorganismo, y antes de colocar el disco del antimicrobiano, se debe permitir que la humedad superficial producida por la inoculacin se seque. Es esencial el secado de la superficie para que no se filtre el antimicrobiano a la capa de humedad. Sin embargo, durante el periodo de secado los microorganismos comienzan a reproducirse lo que conlleva una disminucin del tiempo de difusin del antimicrobiano. Algunos procedimientos (por ejemplo el bioensayo para determinar las concentraciones sricas de antimicrobianos en lquidos orgnicos) requieren un periodo de
55
predifusin del frmaco que le permita difundir antes de que el microorganismo alcance la masa crtica. La predifusin retarda la aparicin de la fase exponencial, lo que permite aumentar el tiempo en el que se establece la zona de inhibicin. La predifusin aumenta la zona de inhibicin y la preincubacin la disminuye. Como conclusin, el intervalo entre la inoculacin de la placa y la colocacin del disco del antimicrobiano debe ser cuidadosamente controlado.
Presencia de protenas sricas

Esta situacin solo se produce cuando se est utilizando un medio de cultivo con sangre. En este caso, el antimicrobiano se puede unir a las protenas sricas y entonces solo puede difundir la fraccin libre del frmaco. Este proceso retarda la velocidad de difusin ya que no se libera ms antimicrobiano hasta que la parte libre no alcanza el medio de cultivo. Con los antifngicos no debera considerar este hecho ya que, de momento, no se usa ningn medio con sangre, pero es evidente que es importante conocerlo y tenerlo en cuenta.
56
Mtodo de difusin en medio slido. Documento M44A2 del CLSI Discos de antimicrobianos
Por el momento, para las levaduras, solo se estandariz el mtodo de difusin en agar con discos para del Gnero Candida (23). En el documento M44-A2 se incluyen los puntos de corte para fluconazol, voriconazol, caspofungina y posaconazol. Para el gnero Candida se establecieron categoras de sensibilidad, basadas en la respuesta in vitro de un organismo frente a un determinado antimicrobiano a una concentracin equivalente a la circulante en sangre o tisular. Las categoras son las siguientes: Sensible (S): cuando el aislamiento que causa la infeccin puede ser tratada con la Sensible dependiente de dosis (SDD): incluye los aislamientos que poseen CIMs dosis recomendada para ese tipo de infeccin y especie. aproximadas a los niveles de concentraciones tisulares y en sangre, y la tasa de respuesta de las mismas sera menor que para un aislamiento sensible. Intermedio (I): incluye los aislamientos que poseen CIMs aproximadas a concentraciones tisulares y en sangre y la tasa de respuesta a las mismas sera menor que para un aislamiento sensible y/o la no disponibilidad de datos hacen que el mismo no permita clasificarlos claramente en sensible o resistente. NOTA: se incluyen aquellos microorganismos que por algn factor tcnico causan discrepancias en las interpretaciones de los resultados. Resistentes (R): son los aislamientos que no son inhibidos por las dosis o concentraciones normales programadas o cuando la eficacia clnica no fue la esperada con el tratamiento. No sensible (NS): esta categora incluye a los aislamientos que comnmente poseen solo aislamientos sensibles, pero no SDD, ni I, ni resistentes. NOTA: esta categora es utilizada cuando para un nuevo antimicrobiano no se encontraron, an, aislamientos no resistentes.
57
Puntos de corte para Candida spp. Dimetro de inhibicin de crecimiento y correlacin con Concentracin Inhibitoria Mnima.
Halo de inhibicin (mm)

Antifngico Caspofungina Fluconazol Voriconazol Concentracin en el disco 5 g 25 g 1 g S* 11 19 17 S-DD* -15-18 14-16 R* - 14 13 NS S* 2 8 1
CIM (mg/l)
S-DD* -16-32 2 R* - 64 4 NS >2
* S: Sensible *S-DD: Sensible-dependiente de dosis *R: Resistente Los aislamientos de Candida krusei son considerados intrnsecamente resistentes o insensibles al Fluconazol, por lo que su CIM no deberan ser interpretada utilizando esta tabla.
Placas con medio de cultivo

Como ya se mencion, el medio de cultivo en las placas de Petri debe de tener una profundidad de 4 mm (1). Para lograr esa profundidad, si la placa es de 9 cm de dimetro se necesitan 25 ml de medio y si es de 15 cm, 60 ml. El pH del medio debe ser controlado y debe ser de 7,2-7,4, despus de que el mismo se halla solidificado y a temperatura ambiente Las placas se deben guardar en bolsas de plstico a 2-8C. En todos los casos se recomienda su uso antes de las 2 semanas de elaboradas, aunque hay trabajos en los que se pudo comprobar que la estabilidad del Mueller-Hinton se mantiene hasta 30 das, dando resultados aceptables, siempre que se respeten las condiciones de almacenaje (24). Es necesario secar la superficie antes de utilizarlas, colocando las placas durante media hora, en la estufa de 37C boca abajo y con las tapas ligeramente abiertas para permitir que la humedad se evapore. Comprobar esterilidad de las placas, con una muestra que represente al lote, a 30-35 C por al menos 24 h y someterlas a un control de calidad.
Preparacin de los discos de papel de filtro

De acuerdo a las recomendaciones de la United States Food and Drug Administration Standards, el papel de filtro debe pesar 30 4 mg/cm2 y debe tener la suficiente capacidad para absorber 2-3 veces su propio peso en agua. Los discos deben tener un dimetro de 6,35 mm. Para prepararlos se puede utilizar un sacabocados cuyo dimetro interno sea de 6,35 mm. Lo ms prctico es adquirirlos en el comercio. Para la correcta impregnacin del disco con la concentracin del antibitico, los discos se colocan en una red de aluminio y se aade a cada uno de ellos 25 g y 1 g de la solucin de fluconazol y voriconazol respectivamente, en el centro del mismo. Se secan al aire en
58
una cmara que evite la contaminacin con sustancias extraas, luego se colocan entre hojas de papel secante y se almacenan en un desecador a 20C. Actualmente todos los discos de antimicrobianos estn disponibles en el comercio. Se deben guardar a 20C, aunque para algunos es satisfactorio entre 2-8C. Existen aparatos dispensadores de discos, el cual debe ser conservado en el refrigerador cuando no se lo utiliza. En general duran 6 meses. Los discos deben ser utilizados antes de su fecha de caducidad, de caso contrario deben ser desechados. Despus de su uso, descartar lo no utilizad. Es importante realizar control de calidad de cada lote de discos que se utilice. Por ltimo, antes de utilizarlos es muy importante que permanezcan durante 15 minutos a temperatura ambiente para evitar la condensacin.
Turbidez estndar para la preparacin del inculo.

Para la elaboracin del inculo se utiliza escala que est constituida por una solucin de BaSO4 con una turbidez equivalente al 0,5 McFarland. Para la elaboracin de la escala agregar 0,5 ml de 0,048 mol/l BaCl2 (1,175% p/v BaCl2 H2O) a 99,5 ml de 0,18 mol/l H2SO4 (1% v/v) en constante movimiento para mantener la suspensin. Para verificar la correcta densidad de la turbidez se utiliza un espectrofotmetro, en el cual la absorbancia a 625 nm debe ser de 0,08 a 0,10. Cada mes se debe verificar la densidad y si es necesario, debe reemplazarse. Distribuir 4 - 6 ml por tubo de ensayo, del mismo tamao que el utilizado para la preparacin del inculo, y precintarlo.

Para la preparacin del inculo se parte de un cultivo de 24 h, en Agar Sabouraud dextrosa a 35 ( 2 C). De este cultivo, se tocan cinco colonias y se suspenden en 5 ml de solucin salina estril (8,5 g/l NaCl; 0,.85%). El resultado de la suspensin se homogeneiza durante 15 segundos, y su turbidez se ajusta a 0,5 de la escala McFarland (equivalente a 1 x 106 a 5 x 106 UFC/ml).
Inoculacin de las placas

Para permitir el secado de las placas se dejan entreabiertas de 3 a 5 minutos, pero no ms de 15. Las placas se deben de inocular dentro de los 15 minutos de ajustada la turbidez del inculo, si esto no es tcnicamente posible, se debe conservar a 4 C, por no ms de 2 h. La utilizacin de inculos grandes que producen una zona limtrofe engrosada o inculos pequeos que producen colonias separadas no es adecuada ya que la zona de inhibicin resultante no refleja la sensibilidad o resistencia real del aislado.
59
Siembra de las placas Siembra por dispersin con hisopo

Se debe aplicar el siguiente procedimiento: se sumerge un hisopo de algodn estril en el inculo. El exceso de lquido es eliminado girando el hisopo varias veces contra las paredes interiores del tubo. El inculo se extiende por toda la superficie de la placa 3 veces seguidas. En cada repeticin, se gira la placa 60, de forma que se asegure la distribucin uniforme del inculo.
Siembra por inundacin

Una vez que se prepar el inculo, se realiza una dilucin 1/10, se extraen entre 2-4 ml del mismo y se vuelcan en la placa de Petri. Se distribuyen homogneamente por la superficie. El exceso de lquido se retira con una pipeta Pasteur estril. Se deja secar la superficie durante 15 minutos a temperatura ambiente. Esta tcnica es ms peligrosa y no debe ser utilizada con microorganismos dentro del nivel 2 pero ms patgenos de lo habitual (Cryptococcus neoformans).
Colocacin de los discos de antimicrobiano

Los discos de antimicrobianos se deben colocar no ms de 15 minutos tras la inoculacin de las placas, de esa forma la difusin y el crecimiento ocurren en simultneo. Se pueden aplicar con la ayuda de un dispensador o con pinza estril. Para asegurar un completo contacto se aconseja presionar el disco contra la superficie del agar. Se deben de colocar al menos a una distancia de 15 mm del borde de la placa y separados entre s por una distancia de 24 mm. Esta disposicin reduce la posibilidad de superposicin de zonas de inhibicin, que dificulta la lectura e interpretacin. Una vez colocados en el agar, es importante no moverlos ya que la difusin comienza de forma inmediata.
Incubacin de las placas

Las placas inoculadas deben ser incubadas a 35 2C durante 20-24 y hasta 48 h en una posicin invertida. Ya se coment antes la influencia de la temperatura en estas pruebas.
Lectura de las zonas de inhibicin Lectura visual

Cada placa es examinada a las 20 a 24 h de incubacin. Si el crecimiento es confluente y satisfactorio, las zonas de inhibicin son uniformemente circulares. La placa se mide tapa abajo y con luz reflectada. El dimetro de cada zona de inhibicin se mide con una regla, calibre, plantilla o instrumental electrnico. Para obtener resultados reproducibles, los mtodos empleados para el examen de las placas y la medicin de las zonas deben estar estandarizados. Si la lectura de la zona de inhibicin requiere condiciones especiales de iluminacin (intensidad y ngulo de la luz), o hay que mirarla con lupa, la interpretacin es
60
diferente y por tanto estos procedimientos requieren un acercamiento distinto que solo puede ser considerado bajo circunstancias especiales. Se leen a las 48 h solo los aislamientos que a las 24 h presentan crecimiento insuficiente.
Lectura automatizada
Varias compaas comercializaron equipos con cmaras de vdeo y sistemas de procesamiento de imgenes que automticamente leen el tamao de las zonas de inhibicin (13,18).
Problemas con la lectura de la zona limtrofe

En este tipo de ensayos, la zona de inhibicin no puede medirse con mucha precisin. Cuando se va a medir, es muy importante que la intensidad y el ngulo de la luz estn estandarizados. Por causas diversas, la zona de inhibicin no se encuentra siempre demarcada con claridad. Cuando el aislado es de crecimiento lento o no hay inhibicin completa, el borde de la zona de inhibicin es irregular. Esta situacin es frecuente y lo que se debe de medir es el borde exterior de la zona donde no hay crecimiento (23).
Interpretacin de resultados
Con el mtodo de difusin en disco no se puede determinar una CIM ya que nicamente se mide el dimetro del halo de inhibicin. Por tanto, se establecieron las siguientes categoras: 1. Sensible 2. Intermedio/ Sensible dependiente de dosis 3. No sensible 4. Resistente Estas categoras estn basadas en los puntos de corte que se establecieron mediante el mtodo de dilucin en caldo, las concentraciones sricas que el antibitico alcanza en suero y la distribucin de las CIMs para la especie estudiada. En resumen, es un acercamiento complejo que se hace de la siguiente forma. Se realizan en forma paralela el mtodo de dilucin en caldo y la difusin con disco para 100 aislamientos de cada especie que representen todas las CIMs posibles, desde la absoluta sensibilidad a la completa resistencia. Una vez realizado este proceso se representa en el eje de ordenadas (eje Y) los dimetros obtenidos y en el eje de abscisas (eje X) el log de la concentracin del antibitico. Se calcula el coeficiente de regresin y la recta de regresin mediante el procedimiento de mnimos cuadrados. La frmula de la recta de regresin es la siguiente. a= pendiente de la recta b= coeficiente y (variable dependiente)= dimetro de la zona de inhibicin x (variable independiente)= -log10 CIM
61
Nota: es importante tener presente que esta recta de regresin es negativa ya que a un dimetro pequeo le corresponde una CIM elevada y viceversa. Asimismo parece que es ms exacto representar el log10 CIM versus el cuadrado del dimetro de la zona de inhibicin, aunque la forma normal es como se expres. Dimetro = a (-log10 CIM) + b Para que los dimetros de las zonas de inhibicin se puedan interpretar es necesario que se hayan determinado los puntos de corte mediante el mtodo de referencia. Cada punto de corte de sensibilidad y resistencia corresponder con un dimetro y por tanto se podr clasificar a las cepas con un dimetro dado dentro de cada categora. Tambin es posible, conociendo la frmula de la recta de regresin, calcular, con los dimetros de la zona de inhibicin, la CIM equivalente.
Cmo se obtienen los puntos de corte?

Los puntos de corte se establecen basndose en 3 aspectos: Criterio farmacolgico: para el criterio de sensibilidad la CIM lmite debe permanecer por debajo de la concentracin del antibitico que se alcanza en sangre o en los tejidos tras dosis convencionales y aceptadas. Hay que tener en cuenta que las concentraciones que se alcanzan en los tejidos son diferentes a las alcanzadas en sangre y esto puede crear problemas en la eleccin de los puntos de corte. Criterio epidemiolgico: el punto de corte elegido debe estar incluido dentro del intervalo de CIMs que una especie exhibe frente al antibitico en cuestin. Para ello es necesario conocer el intervalo de CIMs de un nmero significativo de aislamientos de cada especie. Criterio clnico: la poblacin de cepas caracterizada, con arreglo a sus CIMs, como sensible o resistente debe comportarse in vivo de forma similar, es decir, la poblacin sensible debe responder al tratamiento y la poblacin resistente no debe hacerlo.
Control de calidad
El control de calidad tiene un propsito, que es monitorear la precisin y la exactitud del procedimiento, reactivos utilizados y personal que realiza el test como el que interpreta los resultados. Estos objetivos se logran utilizando microorganismos con sensibilidad conocida. Los microorganismos de referencia para tal fin son: Candida albicans ATCC 90028 Candida parapsilosis ATCC 22019 Candida tropicalis ATCC 750 Candida krusei ATCC 6258
62
Estos microorganismos se utilizan con los mismos reactivos y en el mismo procedimiento en el que se evala a microorganismos clnicos. Deben ser conservados por algn mecanismo que minimice la posibilidad de que se produzca alguna mutacin. Se aconseja la conservacin a -70 C en solucin 50% glicerol. Un cultivo de trabajo puede ser conservado en Sabouraud glucosa a 2 8 C, con repiques una vez por semana, pero no ms de tres veces. Cada vez que se realice una prueba de sensibilidad a los antifngicos en medio slido se evala si los resultados de las mismas son satisfactorios o no, y se documenta. Para seleccionar la concentracin adecuada del antimicrobiano se realiz el ensayo a 100 aislamientos de la especie con CIM conocidas frente a 4 discos con concentraciones diferentes del antimicrobiano. Una vez medida la zona de inhibicin que produjo cada concentracin se hizo una representacin grfica del dimetro versus el log de la CIM y se escogi la concentracin ms adecuada. Los resultados fueron los siguientes: Rangos de dimetros (mm) para las cepas control de calidad (1,27). Antifngicos Caspofungina Fluconazol Posaconazol Voriconazol Concentracin en el disco 5 g 25 g 5 g 1 g Candida albicans ATCC 90028 18-27 28-39 24-34 31-42 Candida parapsilosis ATCC 22019 14-23 22-33 25-36 28-37 Candida tropicalis ATCC 750 20-27 26-37 23-33 -* Candida krusei ATCC 6258 19-26 -* 23-31 16-25
Los rangos de control de calidad de estos aislamientos no han sido establecidos para estos antimicrobianos debido a la extensa variabilidad inter laboratorio (23, 27) Otras tcnicas de difusin
Existen varias tcnicas estandarizadas que se utilizan en otros pases. No se consideran que unas sean superiores a las otras. Las diferencias residen en la eleccin del medio, concentracin del antimicrobiano en el disco, inculo y puntos de corte. Tambin hay otras que son absolutamente diferentes a las propuestas por el International Collaborative Study. De todas ellas solo vamos a describir las tabletas de antibiticos Neo-Sensitabs (37) y las tiras de Etest (bioMrieux).
TM
Rosco
Tabletas de antibiticos
El antibitico, en forma cristalina, se mezcla con una sustancia inerte sin actividad antimicrobiana que tampoco interfiere con ningn aspecto del proceso. La principal ventaja de este procedimiento es la estabilidad de las tabletas ya que duran 4 aos en refrigerador.
63
Se garantiza que la concentracin del antimicrobiano en la tableta es del 90 al 110%. El fabricante es Neo-SensitabsTM Rosco (37).
Etest (bioMrieux)
Es una tcnica cuantitativa. Consiste en la utilizacin de una tira de plstico que, en una de sus caras, lleva un gradiente de concentracin del antimicrobiano. Tras la incubacin, la interseccin entre el crecimiento del microorganismo y la zona de inhibicin en forma de elipse indican la CIM.
Antifngicos y difusin en medio slido

Los primeros trabajos con difusin en medio slido fueron comunicados por Barry et al., en 1996 en los que analiza la sensibilidad de levaduras mediante difusin con un disco de fluconazol (2). En otros estudios se comparan los resultados del mtodo de referencia en macrodilucin con la difusin con un disco de fluconazol y con el Etest (20, 22). Como datos ms destacables de la tcnica empleada en este estudio cabe mencionar los siguientes: La tcnica en macrodilucin se realiz siguiendo de forma estricta el documento M27. El medio empleado para la difusin con el disco de fluconazol y el Etest fue RPMI-2% glucosa con 1,5% de Bacto agar. La preparacin del inculo sigui las directrices del CLSI (22). Las placas de medio slido se sembraron con un hisopo mojado en una suspensin ajustada a la turbidez del 0,5 de McFarland lo que equivale aproximadamente a 106 UFC/ml. En cada placa se coloc un disco de fluconazol de 25 g y una tira de E-test de fluconazol. Las placas se incubaron a 35 y se leyeron a las 48 h. Los aislamientos incluidos pertenecan a las siguientes especies: C. albicans (n=30), C. krusei (n=13), C. tropicalis (n=13), C. parapsilosis (n=13), C. guilliermondii (n=9) y C. kefyr (n=1). No se incluyeron C. glabrata y Cryptococcus neoformans. Las cepas de control de calidad incluidas fueron C. albicans ATCC 90028, C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei ATCC 6258. Los criterios de interpretacin fueron los siguientes (34): 1. Sensible: aquella cepa con una CIM 8 mg/l. 2. Indeterminada: aquella cepa con una CIM de 16 o 32 mg/l. 3. Resistente: aquella cepa con una CIM 64 mg/l. La conclusin que se puede extraer de este estudio es que el mtodo con E-test es adecuado y equivalente, de forma aceptable, al de referencia. Sin embargo, la tcnica de difusin con disco, aunque ofrece resultados prometedores, necesita ms desarrollo. La correlacin entre el disco de fluconazol y la macrodilucin y el Etest es adecuada con coeficientes de regresin de 0,84 y 0,95 respectivamente. Los clculos efectuados con la
64
recta de regresin indican que un dimetro >19 mm identifica a una cepa sensible y un dimetro < 14 mm una cepa resistente. Las cepas de control de calidad se comportan de forma adecuada en todos los ensayos. En un intento de simplificar este procedimiento, el estudio sigue la misma tcnica que se utiliza para bacterias. Sin embargo, encuentra una serie de inconvenientes que hay que solucionar antes de recomendarlo: 1. Subjetividad en la lectura de los halos debido a la falta de inhibicin total que se produce con los azoles. 2. Subjetividad de la lectura visual de la CIM eligiendo un coeficiente de inhibicin del 80%. 3. Para algunas especies es mejor la lectura a las 24 h y para otras a las 48 h. 4. Todas las especies no crecen bien en agar RPMI 2% glucosa. 5. Es necesario identificar el inculo ms adecuado para el medio slido y la carga de antifngico apropiada. 6. Es imprescindible realizar estudios a gran escala de reproducibilidad inter e intra laboratorio. Si bien este primer trabajo de Barry sienta un precedente, a la fecha existen numerosos reportes en los que se hace revisin de los puntos de corte de CIM tanto para FCZ y VCZ, y su correspondencia con los puntos de corte para difusin en medio slido por discos (31). En conclusin, este estudio demuestra que las pruebas de sensibilidad con disco son factibles en el campo de los hongos y los antifngicos y que se pueden utilizar de forma rutinaria en el laboratorio clnico, siempre y cuando se tengan en cuenta todos los parmetros de control de calidad, como as tambin los datos de referencia. Existen numerosas publicaciones que avalan el uso de los discos de papel para la determinacin de sensibilidad (29,36). Con respecto al uso de Etest, es mayor el nmero de publicaciones referentes a su utilidad para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifngicos (3, 8, 14, 15, 26, 28, 31), inclusive para especies de aislamiento poco frecuente como para las no fermentadoras (4, 7, 10, 12, 16, 17, 19). En todas ellas se indica el gran potencial de esta metodologa para realizar la sensibilidad de estos microorganismos. Como ejemplo de estos trabajos hemos elegido el que compara la reproducibilidad inter e intralaboratorio del Etest con las 2 cepas de control de calidad, C. krusei ATCC 6258 y C. parapsilosis ATCC 22019 (33). Las principales caractersticas de este trabajo quedan resumidas: 1. Se utilizaron los siguientes antifngicos: anfotericina B, 5-fluorocitosina, fluconazol, ketoconazol e itraconazol. 2. Cada aislado se ensay 20 veces en cada uno de los 4 laboratorios participantes. 3. El medio de cultivo utilizado fue agar RPMI 2% glucosa.
65
4. La preparacin del inculo sigui las directrices del CLSI (22). Las placas de medio slido se sembraron con un hisopo mojado en una suspensin ajustada a la turbidez del 0,5 de McFarland lo que equivale aproximadamente a 106 UFC/ml. La reproducibilidad interlaboratorio se determin calculando el porcentaje de CIMs que estaban dentro de un intervalo de 3 diluciones para cada antifngico y aislado. En general, el intervalo de 3 diluciones lo formaban la CIM moda determinadas. El acuerdo entre el mtodo de referencia (22) y el Etest se defini como el porcentaje de CIM en el Etest que estaban incluidas en el intervalo de CIMs de referencia. 1 log2 de la dilucin. Si esto no era as se elega el intervalo de 3 diluciones que agrupaba a la mayora de las CIMs
66
En la tabla siguiente se puede consultar estos valores. Intervalo de CIMs obtenido con el Etest para las 2 cepas de control de calidad recomendadas por el CLSI CIM (mg/l) Microorganismo Antifngico Moda 1 32 256 0,5 0,75 0,75 0,5 2 0,125 0,06 % de CIMs en Intervalo que el intervalo de engloba a 95% de 3 diluciones los valores 0,5-2 32 256 0,25-1 0,5-2 0,5-2 0,25-1 2-8 0,06-0,25 0,03-0,12 100 100 100 100 100 99 99 98 100 100
Anfotericina B 5-fluorocitosina C. krusei ATCC 6258 Fluconazol Itraconazol Ketoconazol Anfotericina B 5-fluorocitosina C. parapsilosis ATCC 22019 Fluconazol Itraconazol Ketoconazol
Los resultados demuestran que la reproducibilidad inter e intralaboratorio del Etest con estas 2 cepas es excelente. Nunca fue menor del 98%. Se obtuvo un intervalo de concentraciones muy ajustado que queda recogido en la tabla de ms abajo. En algunas combinaciones la moda no est en el centro del intervalo de 3 diluciones como se puede observar en la tabla.
67
En la tabla siguiente se puede observar la comparacin entre los intervalos de referencia de la macrodilucin para las cepas de control de calidad y el Etest Comparacin entre los valores obtenidos con el mtodo M27 y el Etest para las cepas de control de calidad % de la CIM dentro del Intervalo de CIMs intervalo de referencia Antifngico Microorganismo de referencia Macrodilucin Etest Anfotericina B 5-fluorocitosina C. krusei ATCC 6258 Fluconazol Itraconazol Ketoconazol 0,5-2 4-16 16-64 0,12-0,5 0,12-0,5 99 97 99 94 100 100 0 0 100 49
Anfotericina B 5-fluorocitosina C. parapsilosis ATCC 22019 Fluconazol Itraconazol Ketoconazol
0,25-1 0,12-0,5 2-8 0,06-0,25 0,06-0,25
99 99 99 99 98
86 98 98 100 75
Como se puede observar en esta tabla, los resultados con el Etest se correlacionan con el mtodo de referencia para algunos antifngicos mientras que con otros el resultado deja de ser equivalente. Por ejemplo con ketoconazol y ambos aislamientos la falta de acuerdo se debi a un grupo de CIMs que eran una dilucin ms baja (C. parapsilosis ATCC 22019) o una dilucin ms alta (C. krusei ATCC 6258) que los lmites respectivos del intervalo de referencia. Por tanto, el aumento en una dilucin de los lmites de referencia aumentara el acuerdo entre el 94% y el 100%. Por el contrario, no se obtuvo ninguna correlacin con C. krusei ATCC 6258 y 5-fluorocitosina y fluconazol ya que todas las CIMs fueron ms elevadas con el Etest. La reproducibilidad intralaboratorio fue excelente con estos antifngicos y esta cepa. Los autores no tienen explicacin para este fenmeno pero argumentan que puede haber influido el medio enriquecido con glucosa. Sin embargo, no parece ser correcto, ya que los intervalos de CIMs que dan estas 2 cepas con RPMI 2% glucosa son equivalentes a las del M27 (35) y por tanto no parece que esta sea la causa. Puede ser que el agar influya en las CIMs. Sin embargo, existira otra explicacin derivada de la interpretacin de la CIM por ambos mtodos. La CIM determinada por el Etest es una CIM 100%. Con el mtodo de referencia se eligi en ese trabajo, la CIM 80% y eso puede dar lugar a que se obtengan CIMs ms bajas con esta ltima tcnica. Con el mtodo propuesto por EUCAST en RPMI 2% de glucosa se recomienda la lectura a las 24 h ya que
68
no es necesario la incubacin a las 48 h, excepto para especies de lento crecimiento como por ejemplo C. parapsilosis. Es notable que no hayan existido diferencias con C. parapsilosis ATCC 22019. Con C. krusei, la explicacin a esta falta de correlacin con 5-fluorocitosina y fluconazol puede ser una combinacin de estos 2 hechos. Primero, la eleccin de una CIM 100% y segundo, la lectura a las 48 h que permite que la cepa siga creciendo ya que es resistente a estos antifngicos. Las razones de por qu no ocurri con los otros antifngicos son evidentes. La anfotericina B es fungicida y en este caso especial, con C. krusei y el itraconazol, no existe el denominado crecimiento residual lo que indica que in vitro, si la cepa es sensible, la CIM permanece idntica a las 24 y a las 48 h. En resumen, con las salvedades ya analizadas, el Etest se comporta de forma adecuada con estas 2 cepas. Con otras cepas salvajes y de referencia, incluyendo C. albicans, los resultados tambin fueron aceptables (10). Algunos aspectos quedan por investigar como la reproducibilidad interlaboratorio con un gran nmero de cepas salvajes. Asimismo, no queda claro cual es la composicin final del medio recomendado para este procedimiento. Con la anfotericina B se hicieron estudios intentando identificar cual es el mejor medio, RPMI 2% glucosa o AM3. Asimismo, en varios estudios se han utilizado diferentes tampones, fosfato o MOPS, en la preparacin del RPMI 2% glucosa. En conclusin, como quedan bastantes aspectos por analizar, se recomienda ser cautelosos. No se puede olvidar que todos estos trabajos estn realizados en laboratorios donde la experiencia con la sensibilidad a los antifngicos es extensa. Por tanto, si se decide utilizar el Etest en la rutina diaria habr que controlar exhaustivamente la tcnica utilizando siempre cepas de control de calidad como las descritas en estos estudios (10, 33).
69
Referencias
1. Barry A, Bille J, Brown S, et al. (2003) Quality control limits for fluconazole disk susceptibility tests on Mueller-Hinton agar with glucose and methylene blue. J Clin Microbiol; 41:3410-2. 2. Barry AL., Brown SD. (1996). Fluconazole disk diffusion procedure for determining susceptibility of Candida species. J Clin Microbiol. 34(9):2154-7. 3. Barry AL., Pfaller MA., Rennie RP., et al. (2002) Precision and accuracy of fluconazole susceptibility testing by broth microdilution, Etest, and disk diffusion methods. Antimicrob Agents Chemother.; 46:1781-4. 4. Blaschkehellmessen R. (1996). Antifungal susceptibility testing of clinical yeast isolates and algae of the genus Prototheca to fluconazole and itraconazole by Etest. Mycoses. 39(Suppl 2):39-43. 5. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2008). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi. Approved standard Second Edition. CLSI document M38-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2008. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2008). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard Third Edition. CLSI document M27-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2008. 7. Colombo AL., Barchiesi F., McGough DA., et al. (1995). Comparison of Etest and National Committee for Clinical Laboratory Standards broth macrodilution method for azole antifungal susceptibility testing. J Clin Microbiol. 33(3):535-40. 8. Cuenca-Estrella M., Gomez-Lopez A., Mellado E., et al. (2005). Correlation between the procedure for antifungal susceptibility testing for Candida spp. of the European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST) and four commercial techniques. Clin Microbiol Infect. 11(6):486-92. 9. Dannaoui E. (2006). Methods for in vitro antifungal susceptibility testing. Therapie. 61(3):201-7 10. Espinel Ingroff A., Pfaller M., Erwin ME., et al. (1996). Interlaboratory evaluation of Etest method for testing antifungal susceptibilities of pathogenic yeasts to five antifungal agents by using Casitone agar and solidified RPMI 1640 medium with 2% glucose. J Clin Microbiol. 34(4):848-52. 11. EUCAST Definitive Document E.Def 7.2, revision: method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts. Subcommittee on Antifungal
70
Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) 2012. www.eucast.org 11.a. EUCAST DEFINITIVE DOCUMENT E.DEF 9.1: Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for conidia forming moulds 12. Favel A., Michel Nguyen A., Chastin C., et al (1997). In-Vitro Susceptibility Pattern of Candida lusitaniae and Evaluation of the Etest Method. J Antimicrob Chemother. 39(5):591-596. 13. Geiss HK., Klar UE. (2000) Evaluation of the BIOMIC video reader system for routine use in the clinical microbiology laboratory. Diagn Microbiol Infect Dis; 37:151-5. 14. Law D., Moore CB., Denning DW. (1997). Amphotericin B Resistance Testing of Candida spp - a Comparison of Methods. J Antimicrob Chemother. 40(1):109-112. 15. Matar MJ., Ostrosky-Zeichner L., Paetznick VL., et al. (2003) Correlation between E-test, disk diffusion, and microdilution methods for antifungal susceptibility testing of fluconazole and voriconazole. Antimicrob Agents Chemother.; 47:1647-51. 16. Maxwell MJ., Messer SA., Hollis RJ., et al. (2003). Evaluation of Etest method for determining fluconazole and voriconazole MICs for 279 clinical isolates of Candida species infrequently isolated from blood. J Clin Microbiol ;41(3):1087-90. 17. Maxwell MJ., Messer SA., Hollis RJ., et al. (2003). Evaluation of Etest method for determining voriconazole and amphotericin B MICs for 162 clinical isolates of Cryptococcus neoformans. J Clin Microbiol. 41(1):97-9. 18. Meis J., Petrou M., Bille J., et al. (2000). A global evaluation of the susceptibility of Candida species to fluconazole by disk diffusion. Global Antifungal Surveillance Group. Diagn Microbiol Infect Dis;36(4):215-23. 19. Moran GP., Sullivan DJ., Henman MC., et al. (1997). Antifungal Drug Susceptibilities Of Oral Candida dubliniensis Isolates From Human Immunodeficiency Virus (Hiv)-Infected and Non-Hiv-Infected Subjects and Generation Of Stable Fluconazole-Resistant Derivatives In Vitro. Antimicrob Agents Chemother. 41(3):617-623. 20. National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1995). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Tentative standard M27-T. National Committe for Clinical Laboratory Standards,Villanova, Pennsylvania. 21. National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1996). Protocols for Evaluating Dehydrated Muller-Hilton Agar; Approved standard M6-A. National Committe for Clinical Laboratory Standards,Villanova, Pennsylvania. 22. National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1997). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard M27. National Committe for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pennsylvania.
71
23. Clinical and Laboratory Standards Insitute (CLSI). (2009). Method Antifungal Disk Diffusion Suceptibility Testing of Yeasts. Approved Guideline-Second Edition. CLSI document M44-A2. Clinical and Laboratory Standards Insitute,Waynea, Pennsylvania. 24. Pfaller MA., Boyken L., Messer SA., et al (2004). Stability of Mueller-Hinton agar supplemented with glucose and methylene blue for disk diffusion testing of fluconazole and voriconazole. J Clin Microbiol. 42(3):1288-9. 25. Pfaller MA., Boyken L., Messer SA., et al. (2005). Comparison of results of voriconazole disk diffusion testing for Candida species with results from a central reference laboratory in the ARTEMIS global antifungal surveillance program. J Clin Microbiol. 43(10):5208-13. 26. Pfaller MA., Diekema DJ., Boyken L., et al. (2003). Evaluation of the Etest and disk diffusion methods for determining susceptibilities of 235 bloodstream isolates of Candida glabrata to fluconazole and voriconazole. J Clin Microbiol. 41(5):1875-80. 27. Pfaller MA., Diekema DJ., Gibbs DL., et al and the Global Antifungal Surveillance Group Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study, 1997 to 2005: an 8.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida Species and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole Determined by CLSI Standardized Disk Diffusion Testing. Clin Microbiol. 2007; 45(6): 17351745. 28. Pfaller MA., Diekema DJ., Messer SA., et al. (2003) Activities of fluconazole and voriconazole against 1,586 recent clinical isolates of Candida species determined by Broth microdilution, disk diffusion, and Etest methods: report from the ARTEMIS Global Antifungal Susceptibility Program, 2001. J Clin Microbiol.; 41:1440-6. 29. Pfaller MA., Diekema DJ., Messer SA., et al. (2003) Activities of fluconazole and voriconazole against 1,586 recent clinical isolates of Candida species determined by Broth microdilution, disk diffusion, and Etest methods: report from the ARTEMIS Global Antifungal Susceptibility Program, 2001. J Clin Microbiol.; 41:1440-6. 30. Pfaller MA., Diekema DJ., Messer SA., et al., and International Fungal Surveillance Participant Group. (2003). In vitro activities of voriconazole, posaconazole, and four licensed systemic antifungal agents against Candida species infrequently isolated from blood. J Clin Microbiol. ;41(1):78-83 31. Pfaller MA., Diekema DJ., Sheehan DJ. (2006). Interpretative breakpoints for fluconazole and Candida revisited: a blueprint for the future of antifungal susceptibility testing. Clin Microbiol Rev. 19(2):435-47. 32. Pfaller MA., Hazen KC., Messer SA., et al. (2004) Comparison of results of fluconazole disk diffusion testing for Candida species with results from a central reference laboratory in the ARTEMIS global antifungal surveillance program. J Clin Microbiol; 42:3607-12.
72
33. Pfaller MA., Messer SA., Bolmstrom A., et al. (1996). Multisite reproducibility of the Etest MIC method for antifungal susceptibility testing of yeast isolates. J Clin Microbiol. 34(7):1691-3. 34. Rex JH., Pfaller MA., Galgiani JN., et al. (1997). Development of interpretive breakpoints for antifungal susceptibility testing: conceptual framework and analysis of in vitro-in vivo correlation data for fluconazole, itraconazole, and Candida infections. Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing of the National Committee for Clinical Laboratory Standards [see comments]. Clin Infect Dis. 24(2):235-47. 35. Rodriguez Tudela JL., Berenguer J., Martinez Suarez JV., et al. (1996). Comparison of a spectrophotometric microdilution method with RPMI-2% glucose with the National Committee for Clinical Laboratory Standards reference macrodilution method M27-P for in vitro susceptibility testing of amphotericin B, flucytosine, and fluconazole against Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 40:1998-2003. 36. Testore GP., Dori L., Buonomini AR., et al. (2004). In vitro fluconazole susceptibility of 1565 clinical isolates of Candida species evaluated by the disk diffusion method performed using NCCLS M44-A guidelines. Diagn Microbiol Infect Dis. 37. Users Guide NEO-SENSITABS Diagnostica A/S. www.rosco.dk 38. Vandenbossche I, Vaneechoutte M, Vandevenne M, et al. (2002) Susceptibility Testing of Fluconazole by the NCCLS Broth Macrodilution Method, E-Test, and Disk Diffusion for Application in the Routine Laboratory. J Clin Microbiol; 40: 918-921.
TM
Suceptibility testing, Document: 18.1.0. 2009. Rosco
73
Difusin con discos de fluconazol Malbrn Introduccin

El mtodo que se describe en esta gua fue desarrollado para detectar nicamente especies de Candida sensibles al fluconazol, aisladas de muestras clnicas. No se recomienda su utilizacin en otras especies de levaduras, as como tampoco en la fase levaduriforme de los hongos dimrficos ni en los hongos miceliales. Es necesario seguir estrictamente los pasos que a continuacin se describen para obtener resultados reproducibles.
Laboratorio de microbiologa Operaciones preliminares:

El laboratorio deber contar con los siguientes elementos: Materiales: Vidrio estril Erlenmeyer x 1 litro Probeta x 1 litro Botellas de 1 litro con tapa a rosca Pipeta graduada de 10 ml Placas de Petri descartables de 90 mm X 20 mm Canasto de alambre Mechero Recipiente con agua para Bao Mara Trpode Equipos: Balanza analtica Autoclave pHmetro Incubador regulado a 36 2 C Dispensador de volumen Refrigerador
74
Medios de cultivo y reactivos: Agar Mueller Hinton* con la siguiente formulacin en gramos por litro
Infusin de carne Peptona cida de casena Almidn Agar Glucosa (DIFCO) Azul de metileno solucin stock 5 mg/ml en agua destilada Agua destilada (pH 7,00) 300,0 g 17,5 g 1,5 g 15,0 g 20 g 100 l 1000 ml
*Suspenda 38 g del producto en 1000 ml de agua destilada. Mezcle bien, caliente hasta lograr la disolucin del medio. Autoclave a 121C, 15 minutos.
Solucin stock de azul de metileno (SS-AM)

Azul de metileno estado slido 0,1g Agua destilada 0,1 g 20 ml
Para preparar la solucin stock, agregue 0,1 g de Azul de Metileno a 20 ml de agua destilada (5 mg/ml) concentracin final en el medio de cultivo SS-AM (5 g/ml).
Procedimiento PARTE I: de la preparacin del stock de Medio Agar Mueller-Hinton Modificado (MHM)
1, Observe el cumplimiento de las caractersticas propias de la droga deshidratada en relacin a color y aspecto. 2, Prepare el medio de cultivo base siguiendo las indicaciones del fabricante con el agregado de la glucosa y la solucin stock de azul de metileno. Precaucin: disuelva completamente los slidos antes de colocar a bao de agua a 100C, retire del fuego cuando se logre su total homogeneizacin evitando sobre calentamiento. 3, Evale el pH sobre una alcuota de 10 ml y, si fuese necesario, ajuste a pH 7,2 +/- 0,3 a antes de fraccionar.
4, Fraccione a razn de 240 ml en botellas de 1000 ml con tapa a rosca, Reserve un

volumen de 30 ml, para evaluar el pH y la sensibilidad despus de completado el ciclo de esterilizacin.
75
5, Esterilice el medio dispensado en autoclave a 121C durante 15 minutos, en forma conjunta con el volumen reservado para la evaluacin del pH. 6, Identifique cada botella con un rtulo con los siguientes datos: Nombre del medio de cultivo. Fecha de vencimiento. N de Lote.
7. Distribuya en urnas con un rtulo con los siguientes datos. URNA 1 DE (nmero total de urnas que contienen botellas del mismo lote). Nombre del medio de cultivo. Nmero de botellas X 240ml. Lote N. Fecha de elaboracin. Fecha de vencimiento. Fecha de liberacin. Responsable.
8. Lleve a cabo el Control de Calidad definido para el "Stock" de medios. Controle el pH y la promocin de crecimiento y utilidad de uso sobre la alcuota sometida a esterilizacin en forma conjunta con el total del volumen del lote que se quiere liberar (ver tem control de calidad). 9. Conserve las urnas en la heladera hasta el momento de su liberacin en el sector destinado a lotes en control. 10. Coloque el medio liberado para su uso en el sector de la heladera destinado para tal fin, anotando la fecha de liberacin del lote en la etiqueta de cada urna, "Stock" de medio.
Condiciones de conservacin:
El "Stock" de medios liberado para su uso, se conserva durante un perodo de dos meses a una temperatura de 4-8C y al abrigo de la luz.
PARTE II: de la preparacin de las placas de Mueller Hinton Modificado (MHm)

A- Directa 1, Deje a temperatura ambiente la botella a con el medio fundido, tras la esterilizacin en el autoclave, hasta que se puede tomar con la mano (aproximadamente 55C). 2, Introduzca las botellas en un bao de agua regulado a 45-48C (temperatura idnea para mantener el medio siempre lquido y reducir la formacin de agua de condensacin en el momento de la distribucin en placas). Esta temperatura (45-48C) puede
76
controlarse, colocando un termmetro en un frasco de agar expuesto a las mismas condiciones que los otros frascos del mismo tipo de agar. 3, Mantenga las botellas en el bao de agua hasta que el medio de cultivo haya alcanzado dicha temperatura, homogeneice el contenido del frasco. 4, Distribuya aspticamente, dentro de la cabina de seguridad biolgica o en flujo laminar, 25 ml de medio de cultivo MHM en cada placa de Petri, con ayuda de una pipeta graduada o de un dispensador de modo de obtener un espesor de 4 1 mm. 5, Deje solidificar sobre la superficie nivelada de la cabina de flujo laminar, dejando destapadas las placas durante aproximadamente unos 10-20 minutos (ISO/ TC 34/ SC 9, 1993) para permitir su secado. 6, Coloque las placas dentro de una bolsa de polietileno, cerradas hermticamente, con un rtulo con los siguientes datos BOLSA 1 DE (nmero total de bolsas del mismo sub-lote Nombre del medio de cultivo Nmero de placas de 20 ml Sublote N Lote de medio y nmero de la botella (por ejemplo Lote 20, botella 1 sera el sub-lote 20-1) Fecha de elaboracin Fecha de vencimiento Fecha de liberacin Responsable 1. Almacene las placas, siguiendo las indicaciones que se detallan ms abajo, en el sector destinado a lotes en control, durante el perodo en que se realizan los controles de calidad correspondientes que permitan la liberacin para su uso. 8. Lleve a cabo el Control de Calidad definido para las placas, Controle el pH, la Promocin de crecimiento y la esterilidad del lote (ver tem control de calidad). 9. Coloque el lote de placas liberado para su uso en el sector de la heladera destinado para tal fin, anotando la fecha de liberacin del lote en la etiqueta de cada bolsa.
Condiciones de conservacin:
El lote de placas liberado para su uso, se conserva dentro de las bolsas durante un perodo de dos semanas a una temperatura de 4-8C y al abrigo de la luz.
I- Control de calidad del lote stock de medio de cultivo:

Determinacin de pH 1,- Antes del proceso de esterilizacin: Una vez finalizada la preparacin del medio, antes de su fraccionamiento, se determina el pH con tira de papel pH rango 5,5-9,0 o con pHmetro con compensacin de temperatura sobre la alcuota reservada en punto 3.
77
Lleve a cabo la determinacin de pH travs de a) Tira de papel pH rango 5,5 -9,0. b) Haciendo una papila con igual volumen de agua estril pH:7,0. c) Con un electrodo para pH de slidos. El valor de pH debe ser de 7,2 +/- 0,3, de lo contrario debe ser ajustado antes de su esterilizacin. 2,- Despus del proceso de esterilizacin: Realice esta determinacin sobre la alcuota reservada en el punto 3 y sometida a esterilizacin en forma conjunta con el total del volumen del lote que se quiere liberar. Lleve a cabo la determinacin de pH travs de d) Tira de papel pH rango 5,5 -9,0. e) Haciendo una papila con igual volumen de agua estril pH:7,0. f) Con un electrodo para pH de slidos. Este valor debe ser de 7,2 +/-0,3
CRITERIO DE ACEPTACIN PARA LA DETERMINACIN DE pH

El lote de agar MHM producido se considera apto para su empleo si: el valor de pH es de 7,2 +/- 0,3 una vez sometido al proceso de esterilizacin. Ensayo de promocin del crecimiento y utilidad de uso para deteccin de la sensibilidad a fuconazol por el mtodo de difusin con discos: 1.- Prepare dos placas a partir del la alcuota reservada en el punto 4 y proceda como se indica en los tems 1 a 5 de PARTE II: de la preparacin de las placas de Mueller Hinton Modificado A- Directa 2.- Realice el Procedimiento de control de calidad del mtodo de antibiograma por difusin con discos de papel de fluconazol para especies de del gnero Candida aplicado a Candida parapsilosis ATCC 22019 y el disco de referencia. Cada vez que utilice nuevo lote de discos Fluconazol Malbrn y de MHM debe realizar el control de procedimiento utilizando las cepas Candida parapsilosis ATCC 22019 y Candida krusei ATCC 6258. Los valores de halo de inhibicin para estas cepas son: Candida parapsilosis ATCC 22019 Candida krusei ATCC 6258 Halo de inhibicin en mm 25-32 8-12
78
CRITERIO DE ACEPTACIN PARA EL ENSAYO DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO Y UTILIDAD DE USO PARA DETECCIN DE LA SENSIBILIDAD A FUCONAZOL POR EL MTODO DE DIFUSIN CON DISCOS
El lote de agar MHM producido se considera apto para su empleo si: Candida parapsilosis desarrolla dentro de las 48 h de incubacin a 36 2C y se delimita ntidamente un halo de inhibicin de 25-32 mm alrededor del disco control de fluconazol.
Si se verificaron los criterios de aceptacin definidos para la determinacin de pH y para la prueba de promocin del crecimiento y utilidad de uso para deteccin de la sensibilidad a fuconazol por el mtodo de difusin con discos, el lote de medio de cultivo puede ser almacenado o utilizarse para la preparacin de tubos y/o placas. La fecha final de estos ensayos corresponde a la fecha de liberacin del lote de medio.
II. Control de calidad del lote de placas de cultivo preparadas a partir del lote stock de medio de cultivo: Esterilidad
1-Se selecciona, al azar, el 10% de placas respecto del total de unidades del lote. 2-La mitad de unidades muestreadas se incuban a 36 2C durante 48 h y el resto se conservan a en incubador a 26 2C (temperatura ambiente = durante 7 das). 3-Se observa crecimiento o no crecimiento en ambas condiciones.
Criterio de aceptacin para la determinacin de esterilidad

El lote de agar MHM producido se considera apto para su empleo si: Al finalizar el ensayo de esterilidad no se observa desarrollo bacteriano y/o fngico.

1) Realice un repique del aislamiento, cuya sensibilidad se desea ensayar, en tubos estriados en bisel o placas con agar Sabouraud e incubar a 36 2C durante 24 h. Observacin: el aislamiento debe purificarse previamente. 2) A partir del cultivo prepare un inculo de turbidez 0,5 McFarland en solucin 0,15 M de cloruro de sodio estril (solucin salina 0,85%) (1-5 x 106 UFC/ml). Suspensin del inculo. 3) Mantenga a temperatura ambiente hasta su uso. Observacin: el inculo debe ser usado dentro de los 30 minutos de su preparacin. 4) Embeba un hisopo estril con el inculo y esparza sobre la superficie de la placa de Petri en tres direcciones. 5) Coloque la placa inoculada en incubador de 36 2C durante 10 - 15 minutos.
79
6) Retire la placa del incubador y coloque dos discos Fluconazol Malbrn por placa con la ayuda de una pinza estril. 7) Incube 24 h (48 h para C. parapsilosis) a 36 2C.
Siembra de la placa con Mueller-Hinton con suplemento de 2% de glucosa y azul de metileno (MHM) (ver preparacin de medio de cultivo)
a-Primer Mtodo: por hisopado 8. Coloque el hisopo dentro del tubo que contiene la suspensin del inculo. Embeba y rote contra las paredes del tubo para eliminar el exceso de lquido. 9. Siembre cuidadosamente (sin presionar el hisopo) la placa de MHM en tres direcciones, para obtener crecimiento uniforme en toda la superficie de la misma. 10. Coloque la placa con la tapa hacia arriba en incubador durante 10-15 minutos, para que se absorba la humedad, Precaucin: evite tiempos ms prolongados de secado. 11. Retire del incubador y coloque inmediatamente el disco de fluconazol segn punto 6 de este procedimiento, b- Segundo Mtodo: por inundacin 12. Extraiga 0,5 ml de la suspensin del inculo y coloque en el tubo con 4,5 ml de solucin salina, con el fin de obtener una dilucin 1/10 del inculo. Inculo diluido. 13. Inunde la placa de MHM con los 5 ml del inculo diluido (dejando que cubra toda la superficie). Deje en contacto 5 minutos y extraiga el lquido excedente con punta de pipeta (tip). 14. Siga los pasos 10 y 11 del mtodo de siembra por hisopado.
Colocacin de los discos de 25 g de fluconazol

15. Deje a temperatura ambiente el frasco con los discos durante 5-10 minutos. 16. Extraiga el disco del frasco con una pinza estril de punta fina. 17. Apoye el disco en la superficie del agar, de la placa previamente inoculada por el mtodo de hisopado o inundacin, y presione suavemente en el centro del disco con la punta de la pinza. Distribuya los discos de modo que queden a 20 mm del borde de la placa, y separados entre s por 40 mm. Ver esquema. 18. Coloque la placa invertida en el incubador a 36 2C e incube durante 24 h. 19. Si transcurridas las 24 h de incubacin, los halos no son claramente distinguibles, prolongue la incubacin 24 h ms para dar lugar al crecimiento de especies de desarrollo ms lento.
40 mm 20 mm
80
Lectura
20. Mida el dimetro del halo externo de la zona de inhibicin con una regla. 21. Importante: la zona a medir es la definida por las colonias de desarrollo confluente. Dentro de la zona de inhibicin pueden desarrollar colonias con crecimiento inhibido que muestran un dimetro menor al de las colonias externas. Estas colonias no deben ser consideradas mutantes resistentes.
Interpretacin de los resultados

Los puntos de corte fueron establecidos por recta de regresin construida con los datos obtenidos a partir de la determinacin de la Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM) en medio lquido y las mediciones de halos de inhibicin por el mtodo de difusin con discos, y son los siguientes: Dimetro del halo en mm (CON AZUL DE METILENO) Discos (Malbrn) Fluconazol 25 g Sensible 16 A determinar por CIM <16
Cuando el halo observado en el laboratorio sea menor de 16 mm; enviar la cepa al Departamento de Micologa de la ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrn" para la determinacin de la CIM
81
Referencias:
1. Barry A., Bille J., Brown S., Ellis D., Meis J., Pfaller M., Rennie R et al, (2003), Quality control limits for fluconazole disk susceptibility tests on Mueller-Hinton agar with glucose and methylene blue. J Clin Microbiol; 41:3410-2. 2. Clinical and Laboratory Standards Insitute (CLSI). (2009). Method Antifungal Disk Diffusion Suceptibility Testing of Yeasts. Approved Guideline-Second Edition. CLSI document M44-A2. Clinical and Laboratory Standards Insitute,Waynea, Pennsylvania. 3. Pfaller MA., Diekema DJ., Messer SA., Boyken L., Hollis RJ. (2003) Activities of fluconazole and voriconazole against 1,586 recent clinical isolates of Candida species determined by Broth microdilution, disk diffusion, and Etest methods: report from the ARTEMIS Global Antifungal Susceptibility Program. 2001. J Clin Microbiol.; 41:1440-6, 4. Pfaller MA., Diekema DJ., Rinaldi MG., Barnes R., Hu B., Veselov AV., et al. (2005) Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study: a 6,5-year analysis of susceptibilities of Candida and other yeast species to fluconazole and voriconazole by standardized disk diffusion testing. J Clin Microbiol; 43:5848-59. 5. Pfaller MA., Hazen KC., Messer SA., Boyken L., Tendolkar S., Hollis RJ., et al. (2004) Comparison of results of fluconazole disk diffusion testing for Candida species with results from a central reference laboratory in the ARTEMIS global antifungal surveillance program. J Clin Microbiol.; 42:3607-12. 6. Rodero L., Crdoba S., Vivot W., Campo M., Corfield P., Olgun C., Cuirolo A., Soria M., Guelfand L., Canteros C.E., Davel G. y participantes de la RED WHONET (2006). Mtodo de difusin con discos para la determinacin de sensibilidad a fluconazol en aislamientos de Candida spp Rev Arg Microb. 38: 155-163.
82
ATLAS
83
Difusin con disco de papel de fluconazol Mueller Hinton con Azul de Metileno
Candida albicans SENSIBLE CIM FCZ <0,13 mg/l
Candida krusei RESISTENTE CIM FCZ 64 mg/l
25 ug Halo 43 mm 25 ug Halo 8mm
Candida albicans SDD (con trailing) CIM FCZ (50%) 16 mg/l CIM FCZ (80%) >128 mg/l
25 ug Halo 33 mm
84
Resistencia a los antifngicos

Introduccin
La resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos es un fenmeno bien conocido, sobre todo en el campo de las infecciones bacterianas. El incremento de la poblacin infectada por el virus de la inmunodeficiencia humana, del nmero de pacientes transplantados y de otro tipo de pacientes inmunosuprimidos, produjo un aumento paralelo de las infecciones fngicas, del uso de antifngicos y de la aparicin de hongos resistentes a los mismos. Antes de avanzar con el tema de la resistencia, es conveniente recordar una serie de conceptos.
Definicin de sensibilidad o resistencia

La forma ms habitual de determinar si un hongo es sensible o resistente a los antifngicos es mediante la determinacin de la concentracin mnima inhibitoria (CIM). Existen dos puntos de vista a tener en cuenta, el microbiolgico y el clnico. Desde un punto de vista microbiolgico una cepa es resistente a un antimicrobiano cuando su CIM es ms elevada que la habitual para esa especie. Para conocer y definir la CIM habitual del antifngico frente a esa especie es necesario realizar la sensibilidad frente a un nmero representativo de cepas y determinar cual es la distribucin de las CIMs y la CIM moda. De esta forma se determina los que se denomina CIM elevada desde el punto de vista microbiolgico. En la figura siguiente se puede observar un ejemplo grfico.
85
Distribucin de las CIMs de fluconazol de 898 aislamientos de C. albicans
nmero de aislamientos
300
200
100
0
6 25 8 12 64 32 16 8 4 2 1 5 0, 25 0, 2 1 0, 6 0 0, 3 0 0,
CMIs de Fluconazol
En este grfico se muestra la distribucin de las CIMs de fluconazol frente a 898 aislamientos de C. albicans. Como se puede observar, la distribucin tiende a ser bi modal, con dos picos. La moda de esta distribucin est en 0,25 mg/l, con el 54,3% de las cepas entre 0,03 y 0,5 mg/l. Por lo tanto, desde un punto de vista microbiolgico y atendiendo a este ejemplo, un aislamiento de C. albicans con una CIM de 1 mg/l es microbiolgicamente resistente puesto que ya no est dentro de los lmites (0,06-0,5 mg/l) de la poblacin habitualmente sensible de C. albicans. Desde el punto de vista clnico hay que tener en cuenta que cepas consideradas resistentes microbiolgicamente pueden responder perfectamente a un tratamiento, ya que la concentracin del frmaco en el lugar de la infeccin puede ser mucho ms elevada que la CIM del microorganismo. En consecuencia para clasificar a un microorganismo como resistente clnicamente es acertada la definicin propuesta por Kerridge y cols (22) un hongo es resistente a un antifngico cuando contina creciendo y produciendo sntomas a pesar de que la concentracin del frmaco es mxima en el lugar de la infeccin. En condiciones ideales, para clasificar a un microorganismo como clnicamente resistente se debera conocer la CIM del mismo y la concentracin que est alcanzando el antifngico en la zona de infeccin. Asimismo, se debera seguir recuperando dicho microorganismo del lugar de la infeccin.
86
Con independencia de la situacin clnica en particular, cuando se hable de resistencia, los siguientes conceptos deben estar claros: Resistencia intrnseca: cuando ningn miembro de una especie es sensible a un antifngico. En este caso, en realidad, corresponde utilizar el trmino insensibilidad, ya que se trata de toda una especie y no de alguno de sus miembros. Ejemplo: C. krusei y fluconazol (29). Resistencia primaria: este trmino se aplica cuando una cepa perteneciente a una especie normalmente sensible al antifngico, posee una resistencia natural al mismo sin necesidad de haber estado en contacto con el compuesto. Ejemplo: cepas de C. albicans y 5fluorocitosina (8). Resistencia secundaria: cuando una cepa previamente sensible adquiere resistencia al compuesto tras haber entrado en contacto con l. Ejemplos: C. albicans y 5-fluorocitosina (42) y fluconazol (30).
Bases Moleculares de la resistencia a los antifngicos

Se describen cuatro mecanismos bioqumicos de resistencia a antifngicos: 1. Alteracin de la membrana celular que conlleva una menor permeabilidad a los antifngicos (azoles). 2. Defecto de alguna enzima, que el antifngico necesita para sufrir una modificacin estructural, que lo hace activo o para ser transportado al interior del hongo y ejercer su accin (5-fluorocitosina). 3. Aumento de la sntesis de compuestos naturales del hongo que compiten con el antifngico o con sus derivados activos formados en el interior celular. Este aumento en la sntesis se debe a una mayor actividad de las enzimas responsables de la misma, o a una prdida en su regulacin (5-fluorocitosina). 4. Desaparicin de la diana o cambio estructural de la misma, de forma que el antifngico no puede ejercer la accin sobre la misma (polienos y azoles). En cuanto a la base gentica, se conocen distintos mecanismos:
1. Mutaciones cromosmicas: en la mayora de los casos la resistencia a antifngicos se

debe a mutaciones cromosmicas puntuales. En general, se requieren varias mutaciones sucesivas para la expresin completa de la resistencia. Tambin puede ocurrir que los genes de resistencia estuvieran presentes en un pequeo nmero de clulas de la poblacin, o bien en el caso de hongos diploides y herencia recesiva en uno solo de los dos alelos.
87
2. Mutaciones extracromosmicas: en mutantes de laboratorio de Saccharomyces

cerevisiae resistentes al miconazol se demostr el origen mitocondrial de esta resistencia (34).
3. Segregacin mittica de homocigotos resistentes: en el caso de la 5-fluorocitosina se

sabe que existen heterocigotos de C. albicans que son menos sensibles (resistencia parcial) que los homocigotos sensibles normales. Estos heterocigotos se seleccionan en presencia de concentraciones muy bajas del antifngico, con lo que aumenta la probabilidad de que aparezcan por segregacin mittica nuevos homocigotos totalmente resistentes (49,50).
88
Antifngicos
En la tabla se muestra una clasificacin de los antifngicos disponibles y en desarrollo. Antifngicos de uso sistmico y tpico Antifngicos 1. a. i. i. 1. 2. 3. 4. b. c. i. 1. i. Antifngicos empleados en micosis sistmicas Polienos Anfotericina B Presentaciones lipdicas Anfotericina B liposomal Anfotericina B en complejo lipdico Anfotericina B en dispersin coloidal Nistatina liposomal Fluorocitosina Azoles Imidazoles Ketoconazol, Miconazol Triazoles Fluconazol, Itraconazol,
Antifngicos empleados en micosis superficiales Polienos i. Nistatina b. Azoles i. Imidazoles 1. Butoconazol, bifonazol, clotrimazol,,, i. Triazoles 1. Terconazol, fluconazol, itraconazol,,, c. Griseofulvina d. Alilaminas e. Tiocarbamatos f. Benzilaminas g. Morfolinas h. Hidroxipiridonas i. Haloprogina j. Undecilenato Agentes qumicos 3. a. b. c. d. i. i. i. e. i. i. i. v. Nuevos antifngicos Caspofungina Anidulafungina Micafungina Nuevos triazoles de uso sistmico Voriconazol Posaconazol Ravuconazol Molculas en fases experimentales de desarrollo Derivados lipopeptdicas Sordarinas Pradimicinas Otras molculas antifngicas
2. a.
89
Polienos
Los polienos son molculas macrlidas con cadenas insaturadas que presentan un amplio espectro de actividad antifngica. Se conocen ms de 200 compuestos dentro de esta clase, los cuales muestran varias caractersticas comunes, como son escasa biodisponibilidad digestiva, lo que conlleva que no existan presentaciones orales de estos frmacos, baja solubilidad en agua que crea problemas para obtener formulaciones intravenosas y su toxicidad, lo que oblig a detener el desarrollo farmacolgico de casi todas estas molculas.
Anfotericina B
Este antifngico fue descubierto en muestras telricas durante unos trabajos de prospeccin antibitica llevados a cabo en el valle del Ro Orinoco en Venezuela. Es sintetizado por Streptomyces nodosus, un microorganismo actinomicetal aerobio. En 1957 se licenci como frmaco de uso clnico, a pesar de su toxicidad, escasa solubilidad y sensibilidad a la luz ultravioleta. Slo existe la presentacin parenteral del frmaco, en la que el principio activo se mezcla con deoxicolato acuoso, que consigue que la solucin sea ms estable y homognea.
Mecanismos de accin
El mecanismo de accin de la anfotericina B, de la nistatina y de otros polienos macrlidos, consiste en la unin con diversos compuestos de la membrana plasmtica de los microorganismos sensibles, especialmente el ergosterol. Tras la unin se produce la rotura de la membrana plasmtica. El anillo macrlido sera el responsable de la actividad antibitica de estos compuestos. Los polienos se unen irreversiblemente, siendo su tasa de absorcin dependiente de la temperatura y de la energa. Anfotericina B es un frmaco fungicida, pero slo a concentraciones elevadas, las cuales no suelen alcanzarse in vivo. A concentraciones ms bajas, detiene o lentifica el crecimiento del hongo. La especificidad de estos antibiticos por los hongos es debida a la existencia de esteroles en la membrana plasmtica de los mismos. La unin de estos antibiticos a la membrana celular afecta a los sistemas de transporte de las pequeas molculas. De esta forma, los microorganismos son incapaces de concentrar metabolitos y se produce una prdida de iones y azcares. Los efectos letales de estos antibiticos son el resultado final del dao producido en la membrana. Con algunos polienos, como la anfotericina B y la nistatina, las concentraciones bajas incrementan la permeabilidad de pequeas molculas o iones como el potasio. Este aumento de la permeabilidad es reversible (fungistasis). Por el contrario, a altas concentraciones la prdida de molculas grandes conduce a la prdida irreversible de la
90
viabilidad celular (fungicida). Con otros compuestos, como la natamicina o la filipina, la accin fungisttica y fungicida es simultnea. La afinidad de los polienos por los diferentes lpidos que componen las membranas celulares es diferente. As, la anfotericina B tiene ms afinidad por el ergosterol, que es el principal esterol de las membranas plasmticas de los hongos. Por el contrario, la filipina tiene mucha ms afinidad por el colesterol que es el principal esterol de las clulas humanas.
Espectro de actividad y resistencia intrnseca

A la fecha, solo el EUCAST defini punto de corte para la anfotericina B para algunas especies de Candida. Sin embargo, no existe consenso en el mtodo que hay que seguir para identificar a las cepas resistentes. La resistencia de las levaduras a la anfotericina B es un fenmeno bastante raro, aunque, hay especies que son capaces de exhibir CIMs elevadas como por ejemplo C. lusitaniae y C. haemulonii. La mayora de los hongos patgenos oportunistas son inhibidos, in vitro, por concentraciones de anfotericina B de 1 mg/l o menos. Como estas concentraciones se alcanzan en sangre tras dosis habituales, la mayora de los hongos se consideran sensibles a este compuesto. Existen excepciones como Trichosporon spp. (48), Candida haemulonii (37), Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Scedosporium prolificans y Fusarium spp, (1, 4, 7, 9). Otros hongos dematiceos causantes de feohifomicosis y cromoblastomicosis tambin pueden tener CIMs elevadas (27).
Uso clnico
La anfotericina B deoxicolato se usa en su presentacin intravenosa, a dosis de 0,2-1,5 mg/kg/d. Tras la inyeccin parenteral, el principio activo se disocia del deoxicolato y ms del 90% del mismo se une a las protenas plasmticas. Las concentraciones plasmticas mximas con dosis teraputicas se sitan entre 1-1,5 mg/l. Asimismo penetra en tejidos, especialmente en hgado, bazo y en menor cantidad, en riones y pulmones. Atraviesa mal la barrera hematoenceflica y apenas penetra en la cavidad ocular y en los lquidos orgnicos. En trminos generales, anfotericina B es el tratamiento de eleccin para las micosis diseminadas graves y en las infecciones fngicas en enfermos inmunodeprimidos. Se utiliza en las candidosis invasoras aunque los triazoles constituyen una magnfica alternativa teraputica en los casos en los que la infeccin no se deba a una especie con resistencia a los azoles (C. glabrata o C. krusei). Tambin se emplea sola o en combinacin con la fluorocitosina en la terapia de la criptococosis grave o del sistema nervioso central. Asimismo, se usa en el tratamiento de las micosis primarias cuando stas revisten gravedad
91
o afectan a enfermos inmunodeprimidos. Por ltimo, las infecciones oportunistas por hongos miceliales (aspergilosis, zigomicosis) tambin deben tratarse con anfotericina B, a pesar de su escasa actividad in vitro. En infecciones localizadas como queratitis, endoftalmitis, artritis y abscesos cerebrales pueden emplearse inyecciones intraoculares, intrarticulares o intratecales del frmaco.
Efectos adversos
La anfotericina B es una molcula txica para las clulas de los mamferos, puede ocasionar dao renal irreversible e indefectible. La infusin de este polieno ocasiona fiebre, escalofros, hipotensin y tromboflebitis hasta en un 70% de los enfermos. Los efectos relacionados con la infusin pueden minimizarse con la administracin de antihistamnicos, corticoides y paracetamol, La toxicidad renal limita la dosis total que puede utilizarse en los pacientes. As, 5-10 g de anfotericina B es el lmite mximo de dosificacin, por encima de l, el dao renal puede hacer peligrar la vida del enfermo. Para disminuir su nefrotoxicidad se recomienda aplicar un litro de suero salino antes de infundir el frmaco. No obstante, cuando las cifras de creatinina alcanzan 2,5 mg/dl se debe interrumpir la medicacin. La nefrotoxicidad se caracteriza por dao glomerular y prdidas tubulares de potasio. Tras ello aparece insuficiencia renal, hiperpotasemia y acidosis metablica por uremia. Otros efectos adversos relacionados con la anfotericina B son hipomagnesemia, anemia, leucopenia y trombopenia.
Nistatina
La nistatina produce unos efectos txicos tan graves que no puede emplearse en infusin parenteral. Su mecanismo de accin es similar al de la anfotericina B, as como su espectro de actividad in vitro. Su uso se reserva para tratamiento tpico, principalmente en candidiasis orofarngea y vaginal.
Presentaciones lipdicas de los polienos

La toxicidad de las formulaciones intravenosas de los polienos constituye una de las principales razones del mal pronstico de algunas infecciones fngicas profundas. A finales de los aos 80 se logr modificar la estructura de las micelas con las que se vehiculizaba la anfotericina B. Se sustituy el deoxicolato por esteroles, principalmente colesterol. De esta forma se publicaron varios trabajos experimentales indicando que la solucin coloidal de anfotericina B con colesterol era menos txica, pero con similar actividad que la formulacin con deoxicolato. Otros grupos de investigacin disearon formulaciones que intercalaban molculas de anfotericina B en membranas con fosfolpidos distribuidos en doble capa, formando lminas lipdicas, vesculas unilamelares o liposomas multilamelares que incluan el antifngico. Estas presentaciones mostraban como caracterstica fundamental una menor
92
toxicidad que la anfotericina B deoxicolato, incluso a dosis elevadas (5 mg/kg/d). Existen distintas presentaciones con anfotericina B y una con nistatina: AmBisome, anfotericina B liposomal (Gilead Science), Abelcet, anfotericina B en complejo lipdico (Elan), Amphocil o Amphotec, anfotericina B en dispersin coloidal (Alza Pharmaceuticals) y Nyotran, nistatina liposomal (Aronex Pharmaceuticals). Las formulaciones lipdicas con anfotericina B permiten aumentar la dosis del frmaco a 3-5 mg/kg/d, disminuyendo sus efectos txicos. Se desconoce cules son sus dosis mximas, ya que en enfermos con micosis profundas pueden utilizarse tratamientos con 15 mg/kg/d de anfotericina B liposomal, sin que aparezcan efectos adversos graves. En los estudios comparativos publicados en los ltimos aos, todas las formulaciones lipdicas mostraron una eficacia similar a la anfotericina B convencional y un menor porcentaje de efectos adversos. Sin embargo, hay que considerar que las formulaciones lipdicas tienen un precio mucho ms elevado que el de la presentacin convencional, motivo por el que es necesario tener muy en claro en que situaciones deben prescribirse.
Principales indicaciones de las formulaciones lipdicas de la anfotericina B Indicaciones como terapia inicial
Micosis en neonatos o en nios. Micosis en enfermos con insuficiencia renal. Fiebre sin filiar en enfermos con neutropenia intensa (< 500 neutrfilos/ml). Aspergilosis, zigomicosis o micosis graves por otros hongos miceliales en enfermos inmunodeprimidos.
Indicaciones de cambio de terapia de anfotericina B convencional a una formulacin lipdica

Aumento de la cifra de creatinina srica por encima de 2,5 mg/dl. Graves efectos adversos relacionados con la infusin del frmaco. Progresin de la infeccin tras 500 mg de anfotericina B convencional.
Resistencia primaria
En la revisin de Scholer & Polak (42) se asume que la resistencia primaria a la anfotericina B no ocurre dentro de aquellas especies sensibles. Tras el anlisis de la sensibilidad de anfotericina B frente a 900 C. albicans se encuentra que todos los aislamientos se inhiban con concentraciones entre 0,5-1 g/ml. Con 248 C. tropicalis, 72 C. krusei y 51 C. parapsilosis la inhibicin se produca entre 0,5-2 mg/l. Solo un estudio analizado en esta
93
revisin (42) encuentra 2 C. albicans de 257 con CIMs > 64 mg/l. Con otras especies los resultados son similares.
Resistencia secundaria
A pesar de la amplia utilizacin de estos compuestos durante los ltimos 40 aos, la incidencia de resistencia secundaria es muy baja. Dick et al., (11) analizan la sensibilidad a anfotericina B y nistatina de 1372 aislamientos pertenecientes a las siguientes especies: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii, Saccharomyces spp. y Trichosporon spp. Se compar la sensibilidad de los aislamientos obtenidos de 238 pacientes control versus los de 70 pacientes oncolgicos. Se consider que un aislado era resistente a la anfotericina B cuando tena una CIM 2 g/ml y a la nistatina cuando la CIM era 16 mg/l. En el grupo de pacientes oncolgicos se detectaron un 7,4% de aislamientos resistentes a la anfotericina B y nistatina (55/747) que pertenecan a las siguientes especies: C. albicans (27 cepas pertenecientes a 3 pacientes), C. tropicalis (3 cepas pertenecientes a 1 paciente) y C. glabrata (25 cepas pertenecientes a 2 pacientes). Los 55 aislamientos se recuperaron de 6 de los 70 pacientes (8,6%). Estos pacientes haban recibido quimioterapia para cncer hematolgico con una prolongada estancia hospitalaria. El aislamiento de cepas resistentes a la anfotericina B ocurri en una poblacin de pacientes muy especfica. El anlisis del contenido de ergosterol de los aislados resistentes mostr que estas cepas tenan una marcada disminucin de este compuesto en su membrana. Todos los pacientes sufrieron periodos prolongados de hospitalizacin, neutropenia y tratamiento con frmacos citotxicos que son mutgenos. Adems, recibieron tratamiento antibitico incluyendo polienos. Todos los pacientes con aislados resistentes estaban colonizados previamente con cepas sensibles de la misma especie, Este hecho sugiere que estas cepas terminaron desarrollando resistencia secundaria a la anfotericina B y descarta un origen exgeno de las mismas. Merz y Sandford estudiaron el contenido de esteroles de cepas resistentes de C. lusitaniae y C. tropicalis que haban desarrollado resistencia tras tratamiento con anfotericina B y encuentraron que el ergosterol estaba ausente de las membranas de las cepas resistentes. Concluyeron diciendo que la resistencia se desarrolla como resultado de la acumulacin de otros esteroles en la membrana plasmtica con poca afinidad por la anfotericina B (28). Pierce et al., (33) indican que, adems de la alteracin en la composicin de fosfolpidos y esteroles, existen otros factores en la resistencia a los polienos asociados con la pared celular. El tipo de esterol es importante pero no el grado de esterificacin ya que cepas con 8 esteroles son ms resistentes que los que tienen 7 o 5,7 .
94
En conclusin, existe una relacin directa entre la dosis de anfotericina B necesaria para inhibir los aislamientos y la tasa de reemplazo en la membrana plasmtica del ergosterol por otros esteroles metilados cada vez ms prximos al lanosterol, por el que la anfotericina B no tiene afinidad. Sin embargo se detectaron casos de cepas resistentes (Cryptococcus neoformans y C. albicans) que no tienen una alteracin asociada de los lpidos de la membrana (42). Se comprob que algunos glucanos de la pared celular impiden el acceso de los polienos a la membrana plasmtica (42). As, se sabe que en la fase estacionaria de crecimiento C. albicans es menos sensible a la anfotericina B y que esta disminucin se debe al aumento del glucano en dicha pared que acta como una barrera impermeable.
Mecanismos de resistencia
La base bioqumica de la resistencia a los polienos es la sustitucin del ergosterol por varios precursores que tienen grupos metilo en posiciones 4 y 14 y que estn ms cercanos al lanosterol, Se postulan adems, otras bases bioqumicas, En general, los aislamientos resistentes a los polienos tienen menor cantidad o carecen de ergosterol en la membrana. Este hecho ocurre en Saccharomyces cerevisiae, C. albicans, Aspergillus fennelliae y Neurospora crassa. Las excepciones son C. albicans y Cryptococcus neoformans. Las mutantes resistentes a la anfotericina B y que permanecen sensibles a la nistatina y natamicina no tienen cambios substanciales en la composicin de los esteroles de la membrana. Por tanto, los esteroles de la membrana no juegan un papel significativo en la resistencia de Cryptococcus neoformans a la anfotericina B. La conclusin alcanzada tras estas excepciones es que la modificacin o ausencia de algunos de los esteroles de la membrana plasmtica de los hongos no son la nica explicacin bioqumica de la resistencia. En Saccharomyces cerevisiae se identificaron 6 genes involucrados en la resistencia a los polienos y todos ellos estn implicados en la sntesis del ergosterol. Con otros microorganismos no se consigui un anlisis satisfactorio.
Importancia Mdica de la resistencia a anfotericina B

La incidencia de resistencia primaria y secundaria es muy baja. La explicacin hipottica a este hecho podra ser: La mayora de los mutantes resistentes a la anfotericina B son menos vigorosos que sus parientes sensibles. In vivo, este hecho significa que los mutantes resistentes son ms vulnerables a las defensas del hospedador. Esta situacin se comprob en modelos animales de experimentacin. Por tanto, las posibilidades de supervivencia de un mutante
95
resistente en un hospedador son incluso menores que en un medio de cultivo, excepto cuando las defensas estn muy comprometidas. En teora, los pacientes que deberan ser vigilados, de forma estrecha, son los que estn infectados por especies diferentes de C. albicans y especialmente por C. tropicalis y C. parapsilosis. En el caso de C. tropicalis se demostr que es ms fcil la induccin de mutantes resistentes en el laboratorio. La anfotericina B es poco fungicida frente a C. parapsilosis y adems esta especie es una causa frecuente de endocarditis.
5-fluorocitosina
La 5-fluorocitosina es una pirimidina que acta como potente inhibidor de la sntesis de macromolculas. Este compuesto es un profrmaco que debe ser metabolizado por las enzimas fngicas para ser activo. Fue comercializado en la dcada de los aos 60 del siglo XX como un antifngico de amplio espectro. Sin embargo, su limitada actividad antifngica fue reduciendo su uso en la prctica clnica y en la actualidad slo se utiliza en terapia combinada.
Mecanismo de accin
Tras su transporte a travs de la membrana celular mediante una citosina-permeasa, la 5fluorocitosina es convertida en 5-fluorouracilo mediante una citosina-desaminasa. La transformacin en 5-fluorouracilo es un paso imprescindible para que la 5-fluorocitosina acte como antifngico. Las clulas de mamfero tienen muy poca o nula actividad citosinadesaminasa lo que explica la selectividad de la 5-fluorocitosina frente a los hongos. Por el contrario, los hongos son incapaces de transportar el 5-fluorouracilo que es txico para las clulas de mamfero (22, 42). El 5-fluorouracilo es convertido por una uridina monofosfato-pirofosforilasa en 5-fluorouridina monofosfato, precursor de la sntesis de RNA aberrante. Por otro lado, es metabolizado a 5fluorodesoxiuridina monofosfato que es un potente inhibidor de la timidilato-sintetasa. La timidilato-sintetasa es necesaria para la sntesis de la timidina, que es necesaria para sintetizar el DNA. En la figura de ms abajo se puede consultar el mecanismo de accin simplificado.
96
Ruta del mecanismo de accin de la 5-fluorocitosina

5-fluorocitosina
Membrana celular
Citosina permeasa
5-fluorocitosina
Citosina-desaminasa
5-fluorouracilo
Uridina monofosfato pirofosforilasa
5-fluorouridina monofosfato
5-fluorouridina difosfato
5-fluorouridina trifosfato
5-fluorodesoxiuridina difosfato
5-fluorodesoxiuridina monofosfato
Timidilato sintetasa Desoxiuridina monofosfato

Desoxitimidin a monofosfato
97
No se conoce con exactitud, cual de las dos rutas de inhibicin del crecimiento es ms importante. En teora, cualquiera de las dos sera suficiente. En C. albicans se ve que los dos mecanismos no estn necesariamente unidos y que su importancia depende de cada cepa (8).

La 5-fluorocitosina se absorbe por va oral. Tras dosis teraputicas se recomienda mantener los niveles plasmticos entre 40-60 g/ml para evitar efectos txicos (15). Con estos datos, y debido a que existen diversos estudios en los que se obtuvieron una buena correlacin in vitro - in vivo, se puede admitir que una cepa con una CIM 32 g/ml puede ser resistente a este antifngico (29). Debido al desarrollo de resistencia secundaria, se suele usar de forma combinada con otros antifngicos, especialmente con la anfotericina B. Las especies sensibles a 5-fluorocitosina pertenecen a los gneros Candida, Cryptococcus y algunos hongos dematiceos responsables de cromoblastomicosis (27). La mayora de las cepas de casi todas las especies de Candida son muy sensibles a la 5fluorocitosina teniendo CIMs entre 0,12-2 g/ml (42), a excepcin de C. krusei cuya CIM suele ser mayor de 8 g/ml. En el caso de Cryptococcus neoformans, las CIMs suelen ser algo ms elevadas y oscilan entre 0,5-8 g/ml.
Uso clnico
La combinacin de anfotericina B y fluorocitosina es el tratamiento de eleccin de la criptococosis en enfermos con SIDA. Adems se utiliza como terapia de rescate en determinadas micosis invasoras. Por otra parte, algunos expertos creen que con otras combinaciones, como azoles y flurocitosina, se pueden lograr resultados favorables en la terapia de las infecciones fngicas. Sin embargo, su uso se ve limitado ya que puede generar resistencias y adems provoca efectos adversos graves. La dosis recomendada es de 150 mg/kg/d. El 80% de la droga se excreta en la orina, por lo que las alteraciones de la funcin urinaria obligan a ajustar su dosis. Una de las caractersticas ms notable de este antifngico es que tiene efectos sinrgicos con anfotericina B frente a levaduras e incluso frente a hongos miceliales. La principal limitacin de esta combinacin viene determinada por la afectacin renal causada por la anfotericina B, que aumenta la concentracin plasmtica de la fluorocitosina.
Efectos adversos
La toxicidad de este antifngico se produce por medio de uno de sus metabolitos, el 5-
98
fluoruracilo. Las bacterias intestinales pueden convertir la fluorocitosina en este compuesto. En ocasiones puede producir alteraciones que se acompaan de diarrea, colitis y afectaciones hepticas. El 5-fluoruracilo se reabsorbe desde el intestino y es una molcula txica para la mdula sea. Los efectos adversos ms frecuentes relacionados con el tratamiento con fluorocitosina son leucopenia y trombocitopenia.
Las cifras de resistencia primaria frente a la 5-fluorocitosina dependen de los estudios consultados. Por ejemplo, un 10% de 8.000 aislamientos de C. albicans procedentes de todo el mundo, eran resistentes. Sin embargo, esta cifra se elevaba al 23,5% cuando se analizaban los procedentes de Estados Unidos (42).
La frecuente aparicin de aislamientos con resistencia secundaria al utilizar este frmaco, as como la deteccin de la existencia de sinergismo con anfotericina B, condujo a su utilizacin combinada, principalmente en el tratamiento de infecciones por Candida y Cryptococcus (15). Tambin se demostr in vitro y en modelos experimentales de candidosis sistmica y criptococosis que la administracin de ketoconazol y fluconazol con 5-fluorocitosina es sinrgica (15).
La resistencia a la 5-fluorocitosina puede ser debida a la deficiencia o carencia de una de las enzimas implicadas en su accin como por ejemplo la citosina-permeasa, la citosinadesaminasa o la uridina monofosfato pirofosforilasa. Tambin se puede deber a un aumento en la produccin de pirimidinas debidos a diversos efectos en la regulacin de su biosntesis. Este aumento de pirimidinas compite con los metabolitos fluorinados que se derivan de la 5-fluorocitosina. Se cree que todos estos mecanismos ocurren, en algn grado, en los aislamientos resistentes. En las especies intrnsecamente resistentes el mecanismo predominante es el defecto en la citosina-permeasa (23). En C. albicans la causa ms frecuente de la resistencia es la alteracin de la uridina monofosfato pirofosforilasa (23, 50). Las cepas con resistencia parcial a la 5-fluorocitosina son heterocigticas en el locus de esta enzima que es necesaria para la sntesis de 5-fluoro uridina monofosfato y 5- fluoro desoxiuridina monofosfato. La resistencia a la 5-fluorocitosina se puede originar, tericamente, por diferentes mecanismos en los que estn implicadas enzimas que no son esenciales para el crecimiento
99
o la patogenicidad, pero, en la prctica, la resistencia debida a la prdida de la citosinapermeasa o citosina-desaminasa es poco frecuente. En C. glabrata la resistencia a 5-fluorocitosina, inducida por luz ultravioleta, se debe en el 55% de los casos a la prdida de la uridina monofosfato pirofosforilasa, en un 35% a la de la citosina-desaminasa, y tan solo en el 10% a la de la citosina-permeasa. En C. albicans los resultados son similares (23).
Importancia clnica de la resistencia a 5-fluorocitosina

La aparicin de cepas resistentes a 5-fluorocitosina condujo a limitar su uso. Cualquier especie sensible puede desarrollar resistencia, originando el fracaso del tratamiento (25). Como ya se coment, el desarrollo de resistencia unido al sinergismo que se observa tanto in vitro como in vivo cuando se combina con la anfotericina B y los azoles llev a su utilizacin exclusiva en unin de otro antifngico (38). A excepcin de C. krusei, el resto de las especies (C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata y C. guilliermondii) son mayoritariamente sensibles a este compuesto. En resumen, teniendo en cuenta las excepciones comentadas ms arriba, la 5-fluorocitosina en combinacin con otros antifngicos se puede utilizar, con bastante tranquilidad, frente a la mayora de los aislamientos de Candida spp., si bien es necesario que se compruebe la sensibilidad del aislado.
Azoles
El descubrimiento y comercializacin de los azoles constituyen uno de los principales hitos de la Micologa mdica. Su espectro de actividad y sus limitados efectos adversos, particularmente en el caso de los triazoles, permiten tratar eficazmente muchas infecciones fngicas, reduciendo la toxicidad que invariablemente se asocia a otros antifngicos. No obstante, estos frmacos muestran algunos inconvenientes, como el desarrollo de resistencia secundaria y la escasa utilidad que hasta la fecha demostraron en las infecciones invasoras graves por hongos miceliales.
Derivados del imidazol y del triazol

Los antifngicos sintticos derivados del imidazol y del triazol son el avance ms importante de los ltimos aos en el tratamiento de las micosis sistmicas oportunistas (9). Los imidazoles y triazoles comparten, a grandes rasgos, los mecanismos de accin y de resistencia, y por ello se suelen agrupar como derivados azlicos o azoles. No obstante, tambin existen numerosas diferencias entre los dos grupos de antifngicos. Los imidazoles, miconazol y ketoconazol, y los triazoles, fluconazol, itraconazol y voriconazol, se utilizan por va oral o parenteral. El resto de los imidazoles, mucho ms numerosos, y algn triazol, como el terconazol, se administran slo tpicamente.
100
Mecanismos de accin
Los azoles son molculas sintticas con un anillo de cinco carbonos unido a una cadena aliftica que cuenta con un grupo fenilo. Cada miembro de esta clase incorpora otros elementos qumicos a esta estructura comn, lo que origina una gran diversidad de propiedades bioqumicas (ver figura 1). Existen dos familias de azoles que se distinguen por las molculas de nitrgeno que contiene el anillo azlico, dos en el caso de los imidazoles y tres en el de los triazoles. Los azoles tienen la capacidad de unirse con el grupo hemo que forma parte de enzimas y otras protenas. En esta capacidad reside su actividad antifngica, ya que varias de las enzimas que participan en la sntesis del ergosterol presentan un grupo hemo, por lo que los azoles tienen capacidad para unirse a ellas e interferir su funcin. La enzima que ms se afecta es la 14- demetilasa, de esta forma el tratamiento con azoles bloquea la sntesis de ergosterol, acumulndose esteroles 14- metilo. El bloqueo inhibe el crecimiento de la clula fngica, pero no la mata. Slo algunos azoles y a dosis muy elevadas, inalcanzables in vivo, muestran actividad fungicida. Los azoles actan inhibiendo la biosntesis del ergosterol, concretamente el paso de desmetilacin del lanosterol en el carbono 14. La diana de los azoles es, por tanto, la enzima lanosterol-14-alfa-desmetilasa, que es una de las especies del citocromo P450 (P45014DM) localizado en el retculo endoplsmico (51). La disminucin del ergosterol y la acumulacin de esteroles metilados alteran la estructura y funciones de la membrana celular, que se vuelve ms permeable y vulnerable a daos posteriores. De esta forma se alteran diferentes sistemas enzimticos unidos a la membrana, como los que participan en el transporte de nutrientes y en la sntesis de quitina (51). El resultado es la inhibicin del crecimiento y, por tanto, los imidazoles y triazoles son primariamente fungistticos, lo que limita su utilidad. A pesar de ello, el ketoconazol, fluconazol, itraconazol y voriconazol se utilizan como tratamiento de micosis sistmicas, incluso en pacientes inmunodeprimidos. Este carcter fungisttico de los azoles, que implica en muchos casos largas terapias de mantenimiento, est directamente relacionado con el desarrollo de resistencia secundaria. Aunque la toxicidad de los triazoles es menor que la de los imidazoles, tambin pueden inhibir sistemas enzimticos de los mamferos que son dependientes del citocromo P450, como los implicados en la sntesis de hormonas esteroides. Los efectos, no obstante, son menos pronunciados en el caso de los triazoles: por ejemplo, el ketoconazol inhibe la sntesis de testosterona a concentraciones 100 veces ms bajas que el fluconazol (17).
101
En determinadas condiciones, los imidazoles ms txicos, como el clotrimazol y miconazol, a altas concentraciones, pueden tener un efecto fungicida sobre las levaduras, debido a que ejercen un dao directo fisicoqumico sobre la membrana celular que es irreversible. Sin embargo, el ketoconazol, no muestra esta accin letal. Los estudios sobre el mecanismo de accin de los imidazoles tambin apuntan a la posible existencia de otras dianas. Adems de la sntesis del ergosterol y de la propia membrana celular, el efecto antifngico de los imidazoles se relaciona con enzimas mitocondriales como la ATPasa y la citocromo-oxidasa (34). Su efecto sobre la fosforilacin oxidativa en mitocondrias hepticas de mamfero y su actividad inhibitoria sobre bacterias Gram positivas muestran su limitada selectividad (26). La importancia relativa de cada una de estas dianas potenciales podra depender de la especie fngica, de las condiciones ambientales y del azol en particular de que se trate. Desde el punto de vista clnico, la mayora de los imidazoles y triazoles deberan ser considerados como fungistticos, aunque la actividad fungicida demostrada in vitro para algunos podra darse con concentraciones ms altas alcanzadas.
102
Figura 1. Frmulas qumicas de los principales azoles de uso clnico y de los nuevos triazoles sistmicos
Fluconazol
Voriconazol
Posaconazol
Ketoconazol
Ravuconazol
Itraconazol
103
Ruta de la biosntesis del ergosterol, enzimas y genes implicados. Zonas de accin de los antifngicos
Gen Enzima Esterol Escualeno ERG1 Escualeno epoxidasa 2,3oxidoescualeno ERG7 Lanosterol sintetasa Lanosterol ERG11 ERG24 ERG25 ERGX ERGY Enzimas C-4 esterol desmetilasas Lanosterol (C-14) desmetilasa C14 esterol reductasa Zymosterol ERG6 C-24 esterol metiltransfersa Fecosterol ERG2 C-8 esterol isomerasa Episterol ERG3 ERG5 ERG4 C-5 esterol desaturasa C-22 esterol desaturasa C-24 esterol reductasa Ergosterol Azoles (?) Morfolinas Azoles Morfolinas Alilaminas Tiocarbamatos Inhibidor

Los azoles son antifngicos de amplio espectro aunque deben hacerse algunas distinciones. Los imidazoles muestran una magnfica actividad frente a levaduras, dermatofitos, hongos patgenos primarios y algunos hongos miceliales. Sin embargo, su toxicidad hace que casi hayan desaparecido de la prctica clnica, perviviendo presentaciones para uso tpico y el ketoconazol oral, que se utilizan en algunos pases. Respecto a los triazoles, el fluconazol tiene actividad frente a levaduras y hongos patgenos primarios, aunque es inactivo frente a hongos miceliales (Aspergillus, Fusarium...) y algunas especies de levaduras muestran resistencia intrnseca (C. krusei); adems es frecuente que aparezcan resistencias
104
secundarias cuando las cepas contactan prolongadamente con el antifngico. El itraconazol tiene un espectro de actividad ms amplio ya que es activo frente a levaduras y muchos hongos miceliales. Debe destacarse que la resistencia secundaria al fluconazol suele acompaarse de resistencia al itraconazol o al menos de ascensos en su CIM, lo que pueden determinar fallos teraputicos (38).
Uso clnico
La utilizacin clnica de los azoles depende de los efectos adversos y de las propiedades bioqumicas de cada una de las molculas. La mayora de los imidazoles son txicos o insolubles en agua por lo que no pueden administrarse ni oral ni parenteral, aunque algunos de ello se utilizan en presentaciones tpicas. Otros imidazoles, como el ketoconazol pueden emplearse en formulaciones orales en casos de tias, pitiriasis, onicomicosis, infecciones de las mucosas por levaduras, micosis subcutneas y otras infecciones. El miconazol es un imidazol soluble que podra indicarse como frmaco parenteral en el tratamiento de infecciones invasoras, no obstante, produce reacciones anafilcticas, toxicidad renal y genera resistencias con facilidad, por lo que prcticamente no tiene aplicacin en la prctica clnica. Con respecto a los triazoles, su disponibilidad y relativa falta de toxicidad generan prcticas teraputicas abusivas que para algunos expertos, constituyen la causa de la aparicin de especies y de cepas multirresistentes. El fluconazol es un antifngico soluble en agua con un perfil farmacocintico excepcional lo que permite que pueda administrarse oral y parenteral. Se elimina en la orina y penetra en el lquido cefalorraqudeo y otros lquidos orgnicos. La popularizacin del fluconazol se produjo a finales de los aos 80, gracias a que se us en el tratamiento de las candidosis orofarngeas que afectaban a los enfermos HIV+, antes de la aparicin de la triple terapia antirretroviral. Actualmente, se emplea en el tratamiento de las infecciones causadas por levaduras y en algunos tipos de micosis primarias. La existencia de una presentacin parenteral lo convierten en un frmaco de primera lnea en el tratamiento de las fungemias e infecciones invasoras por levaduras, aunque debe destacarse que existen especies resistentes al fluconazol, por lo que es recomendable identificar a nivel de especie y si es C. krusei o C. glabrata, tratar la micosis con otro antifngico. La dosis depende del tipo de infeccin, as en las infecciones mucosas o superficiales suelen emplearse 200-400 mg/d por va oral. En las infecciones profundas se recomiendan 400-800 mg/d e incluso 1600 mg/d en enfermos neutropnicos con micosis graves.
105
El itraconazol no presenta un perfil farmacocintico tan bueno como el fluconazol. Es una molcula derivada del ketoconazol, por lo que no es soluble en agua, se absorbe irregularmente en el tracto digestivo, se une a protenas plasmticas, no se elimina por orina y no penetra en el lquido cefalorraqudeo. Debido a estas caractersticas, slo exista una presentacin en tabletas orales de este antifngico, lo que impeda que pudiera emplearse como terapia en las micosis invasoras graves. No obstante, su espectro de actividad incluye muchos hongos miceliales, por lo que se ha utilizado en profilaxis y en terapias de refuerzo o de mantenimiento en la aspergilosis y en otras infecciones por hongos miceliales en enfermos inmunodeprimidos. A finales de los aos 90 se comercializaron dos nuevas presentaciones de itraconazol, una solucin oral y otra parenteral. Estos compuestos incluyen ciclodextrina que permite obtener una suspensin estable del antifngico, lo que mejora sus parmetros farmacocinticos. El itraconazol se utiliza a dosis de 200 mg/d, aunque puede administrarse 600 mg/d. Para los tratamientos orales se recomienda aplicar una dosis de carga de 300 mg cada 12 h, durante tres das. El itraconazol oral es eficaz en infecciones superficiales y profundas leves por levaduras y hongos, en micosis primarias y en algunos casos como tratamiento de refuerzo o de mantenimiento en micosis invasoras.
Efectos adversos
Los imidazoles no muestran una afinidad elevada por las enzimas fngicas, por ello inhiben enzimas humanas como las del citocromo P450 heptico, lo que puede causar graves efectos secundarios, motivo por el cual, muchos imidazoles slo pueden usarse en presentaciones tpicas. El ketoconazol sigue emplendose en algunos pases en su formulacin oral, aunque debe destacarse que se ha descrito hepatotoxicidad en el 5% de los enfermos tratados con este antifngico y multitud de interacciones medicamentosas. Tambin origina la supresin de la sntesis de testosterona y a dosis altas de la de cortisol. Por tanto es preferible emplear triazoles en los tratamientos sistmicos. El fluconazol tiene escasos efectos adversos incluso a dosis tan elevadas como 2 g/d. En algunos enfermos provoca nuseas, reacciones cutneas y en tratamientos prolongados, arritmias cardacas. Muestra interacciones con otros frmacos, pero de baja intensidad. El itraconazol causa molestias intestinales en un 10% de los enfermos en tratamiento, aunque rara vez obligan a abandonar la terapia. Tambin se reportaron alteraciones electrolticas y reacciones cutneas. El itraconazol tiene interacciones medicamentosas similares a la del ketoconazol. En la tabla se resumen las interacciones de ketoconazol, fluconazol e itraconazol con otros frmacos.
106
Interacciones medicamentosas de los azoles (Graybill, 1998). La tabla muestra el nivel de alteracin que se produce en cada tipo de interaccin. Nivel de interaccin Tipo de Interaccin Fluconazol Itraconazol Ketoconazol
Frmacos que disminuyen la concentracin del azol: Rifampicina Medio Rifabutina Bajo Isoniazida Sin interaccin Fenitona Sin interaccin
Alto Alto Alto Sin interaccin
Alto Alto Alto Alto
Frmacos que aumentan la concentracin del azol Bajo Claritromicina Bajo Otros macrlidos Frmacos cuya concentracin aumenta por los azoles: Fenitona Carbamacepina Warfarina Ciclosporinas Terfenadina Astemizol Sulfonureas Digoxina
Sin interaccin Sin interaccin
Sin interaccin Sin interaccin
Bajo Bajo Bajo Bajo Bajo Bajo Bajo Desconocido
Medio Medio Medio Alto Medio Medio Bajo Bajo
Medio Medio Medio Alto Alto Medio Bajo Bajo
Tanto los imidazoles como los triazoles son considerados, en trminos generales, antifngicos de amplio espectro, ya que son activos in vitro sobre levaduras, dermatofitos, Aspergillus y otros hongos filamentosos. La nica excepcin la constituye el fluconazol que carece de actividad sobre algunas levaduras como C. krusei (36) y sobre Aspergillus, Sporothrix, Rhizopus y otros hongos filamentosos (13). Sin embargo, existen especies como Scedosporium prolificans en las que todos los resultados obtenidos tanto in vitro como in vivo por diferentes autores indican una total insensibilidad o resistencia intrnseca a todos los antifngicos, incluidos los imidazoles y los triazoles, lo que diferencia a S. prolificans de S. apiospermum (Pseudallescheria boydii) que es relativamente sensible a todos los azoles, incluido el fluconazol (4).
107
Un caso especial es el de Pneumocystis jirovecci que carece de ergosterol en la membrana celular y, por lo tanto, es insensible a los imidazoles y triazoles (3).
El uso generalizado de algunos azoles, especialmente de forma oral o tpica, hace muy difcil asegurar que un hongo posea una resistencia natural (primaria) a los imidazoles o triazoles, y que sta no haya sido adquirida durante un tratamiento previo (secundaria). Desde un punto de vista prctico, es ms importante la distincin entre insensibilidad (intrnseca) y resistencia (primaria o secundaria), ya que en el primer caso no estara indicado el uso del antifngico, pero en el segundo caso su utilizacin dependera del resultado de las pruebas de sensibilidad in vitro. Como ya se mencion, en el caso del fluconazol, C. krusei es insensible, pero tanto C. glabrata como C. albicans pertenecen al segundo grupo (resistencia primaria o secundaria). Aunque se sigue incluyendo a C. glabrata junto con C. krusei como ejemplo de levaduras resistentes al fluconazol, es preciso insistir en que: Las cepas de C. glabrata aisladas de hemocultivo, de enfermos posiblemente no tratados con antifngicos derivados del imidazol o del triazol, pueden tener CIM de fluconazol tan bajas como C. albicans, mientras que las de C. krusei son siempre elevadas independientemente de su origen. Se describen casos de resistencia secundaria en C. glabrata tras el tratamiento con fluconazol, y con el aislamiento previo de la cepa sensible del mismo enfermo. El hecho de que C. glabrata y otras levaduras como C. guilliermondii sean especies haploides (47), a diferencia de C. albicans que es diploide, permite suponer que las mutaciones puntuales que pudieran conferir resistencia a los imidazoles o triazoles se expresan ms fcilmente en las primeras. De hecho, el comportamiento de C. guilliermondii frente al fluconazol es similar al de C. glabrata. C. glabrata es una especie sensible al fluconazol que desarrolla fcilmente resistencia al mismo. Incluso puede ocurrir que, al estudiar la sensibilidad in vitro, si el tamao del inculo es grande y el tiempo de incubacin largo, una cepa sensible de C. glabrata aparezca como resistente in vitro por poseer una alta frecuencia de mutacin hacia la resistencia. Por ello, las CIM de fluconazol para la cepa de referencia de C. glabrata en el mtodo del CLSI son excesivamente altas debido a que la incubacin es de 48 horas (31). Para otras combinaciones de especie fngica - antifngico (imidazol o triazol) resulta ms difcil delimitar el tipo de resistencia que poseen, pero, en cualquier caso, antes de considerar que una resistencia es intrnseca es conveniente estar seguro de que en esa especie no existen cepas sensibles aunque sean poco frecuentes.
108
Hasta principios de los aos 90, la resistencia secundaria a los antifngicos derivados del imidazol o del triazol era muy poco frecuente. La primera descripcin de resistencia adquirida a los imidazoles en C. albicans data de 1978 y corresponde a una infeccin urinaria tratada durante largo tiempo con miconazol (20). En la dcada de los 80 los tratamientos prolongados con ketoconazol de algunos pacientes con candidosis mucocutnea crnica dieron lugar a fracasos teraputicos o recadas debidos al desarrollo de resistencia en C. albicans. La primera cepa de C. albicans con resistencia secundaria al ketoconazol se obtuvo de un paciente norteamericano en 1980 (39). Estas cepas fueron estudiadas en numerosos laboratorios que confirmaron su resistencia y analizaron los mecanismos implicados, y alguna de ellas se suele emplear como control en los estudios de resistencia a los imidazoles y triazoles, tanto in vitro (25 a) como in vivo (38). En 1986 se describi el primer caso de resistencia secundaria al ketoconazol en C. albicans procedente de un paciente con SIDA y esofagitis (45). A finales de la dcada de los 80 se extendi el uso del fluconazol, en especial en los pacientes infectados por el HIV, pero no pasaron muchos aos antes de que se comenzaran a describir casos de candidosis orofarngea o esofgica que no responda al tratamiento y que estaban causados por cepas de C. albicans con resistencia secundaria a dicho antifngico (2, 5, 10, 12, 35, 40, 46, 51). Al igual que en el caso del ketoconazol, la resistencia secundaria al fluconazol en C. albicans aparece despus de tratamientos prolongados de infecciones superficiales en pacientes inmunodeprimidos. En el caso de C. glabrata, por el contrario, la resistencia secundaria al fluconazol puede ocurrir tras tratamientos cortos y en pacientes inmunocompetentes (19).
En los ltimos aos se avanz en el conocimiento de los mecanismos de resistencia para los azoles., no obstante, todava existe mucha controversia y si bien debera hacerse un anlisis ms detenido sobre el tema, escapa de los objetivos de este manual. En la tabla siguiente se retoman los principales mecanismos de resistencia identificados en las clulas eucariotas.
109
Mecanismos de resistencia en las clulas eucariotas

Alteraciones en la entrada del frmaco Alteraciones en el procesamiento intracelular Modificacin Degradacin Alteraciones de la diana Mutaciones puntuales Aumento en la expresin Amplificacin gnica Reconversin genmica o recombinacin mittica Alteraciones en otras enzimas en el proceso de biosntesis del ergosterol Alteraciones en las bombas de eliminacin
Antes de comenzar es importante conocer la nomenclatura que se utiliza. En la tabla se describe la misma
Nomenclatura de los genes

Gen
CAD CAP CDR CFTR CYHR ELF ERG FCY FLR HST6 MDR MRP PDR STE6 THR YAP YCF YEF
Nombre ingls
Cadmiun resistance Candida activation protein (transcription factor) Candida drug resistance Cystic fibrosis transmembrane conductance receptor Cyclohexymide resistance Elongation Factor Ergosterol biosynthesis enzimes Flucytosine resistance Fluconazole resistance Homolog of STE6 Multidrug resistance MDR-related protein Pleomorphic drug resistance Sterile 6 (gene involving in mating a factor export Threonine biosynthetic enzyme Yeast activation protein Yeast cadmium factor Yeast elongation factor
Microorganismo
Saccharomyces Candida Candida Muchos sistemas Candida Candida Saccharomyces y Candida Candida Saccharomyces Candida Muchos sistemas Muchos sistemas Saccharomyces Saccharomyces Saccharomyces y Candida Saccharomyces Saccharomyces y Candida Saccharomyces Candida y
110
En una clula sensible, el azol alcanza el interior de la misma, para encontrarse con la diana la lanosterol desmetilasa, que es el producto del gen ERG11. Los primeros mecanismos implicados en la resistencia son aquellos referidos a la incapacidad del frmaco de alcanzar el interior celular (51). El segundo mecanismo implicado en la resistencia es la modificacin de la diana, en este caso la lanosterol desmetilasa. Cuando se altera esta enzima se acumulan esteroles 14 metilados. Las alteraciones genticas relacionadas con la sntesis de la lanosterol desmetilasa estn asociadas con el gen ERG11. Se logr identificar las siguientes alteraciones genticas (51). 1. 2. 3. 4. Mutaciones puntuales en la regin que codifica. Aumento de la expresin del gen. Amplificacin del gen, es decir aumento en el nmero de copias del mismo. Conversin o recombinacin mittica en microorganismos diploides.
Tambin se identificaron alteraciones de otras enzimas involucradas en la sntesis del ergosterol. En tercer lugar aparecen las bombas de expulsin de azoles que de forma general siempre estn expresadas pero a un nivel bajo. Existen 2 tipos de bombas de expulsin que contribuyen a la resistencia a los antifngicos: 1. Transportadores de la casete de unin del ATP (ATP binding cassette transporters, ABCT). 2. Facilitadores mayores (Major Facilitators, MF). Estas bombas usan como energa el gradiente de protones de la membrana. Estas bombas se ocupan de la expulsin activa de molculas (hidrofbicas o lipoflicas) que son txicas para las clulas y entre ellas estn los azoles. Se identificaron en Saccharomyces cerevisiae el nmero total de genes ABCT y MF y respectivamente son 30 y 28 (51).
Transportadores ABCT en Candida

Basndose en la similitud de la secuencia, los 30 ABCT de Saccharomyces cerevisiae se han agrupado en 6 familias. De estas 6 familias 3, denominadas PDR5, MRP/CFTR y MDR, contienen ABCT implicados en la resistencia a frmacos en diversos sistemas. En Candida se identificaron 13 bombas de expulsin. En la familia PDR5 se describieron 10 miembros, asociadas a la resistencia azoles, que se conocen con el nombre de CDR. El gen HST6 de Candida es un miembro de la familia MDR. Tambin se identificaron en Candida segmentos del gen YCF1 de la familia MRP/CFTR. EL gen de Candida ELF1 es un miembro de familia YEF de los ABCT. Este gen tiene homologa con los factores de elongacin y es poco
111
probable que se asocie con la resistencia. Los genes YCF1 y ELF1 no se los asocia con resistencia a frmacos. Los genes ABCT que se han correlacionado con la resistencia a los azoles son los genes CDR. Se identificaron 10 genes CDR, de los cuales solo se ya estudiaron con cierta profundidad el CDR1 y el CDR2.
Facilitadores mayores en Candida

Se logr clonar el gen MDR1 (tambin conocido como Ben-R) en C. albicans. Este gen fue clonado por su habilidad para conferir resistencia al benomilo y al metrotexate cuando se transformaba Saccharomyces cerevisiae. C. albicans es intrnsecamente resistente a ambos frmacos. En resumen, la intervencin de las bombas de expulsin (CDR y MDR1) en la resistencia a los azoles de aislamientos clnicos se demostr mediante la deteccin de concentraciones aumentadas de mRNA y no se determin la causa real del aumento. El aumento de las concentraciones del mRNA puede ser el resultado de al menos 3 mecanismos: 1. Amplificacin gnica: cada uno de los genes implicados se transcribe de forma normal con lo que la cantidad final de mRNA aumenta. 2. Aumento en la transcripcin: esto puede ser el resultado de una mutacin en el promotor del gen o alteraciones en la actividad de los factores de transcripcin que interactan con el promotor del gen. 3. Aumento en la vida media del mRNA debido a una degradacin ms lenta. Este suceso es, en general, el resultado de una mutacin en la regin 3 del mRNA. No hay muchos datos para determinar cual de estos 3 mecanismos es el que se produce de forma ms comn en los aislamientos clnicos. En resumen, en los aislamientos clnicos la resistencia es poco probable que se deba a una simple mutacin. Esta aparece tras largos periodos de presencia del frmaco y en unas condiciones que sean favorables para un desarrollo gradual de la misma. Lo ms probable es que la resistencia se desarrolle durante periodos prolongados y debido a diversas alteraciones como consecuencia de la presin selectiva del antifngico.
Importancia clnica de la resistencia a los imidazoles y triazoles

La dificultad que existe para interpretar y comparar los datos obtenidos in vitro sobre la resistencia o sensibilidad a los azoles impide llegar a conclusiones definitivas sobre la influencia que estos antifngicos ejercen sobre el desplazamiento de especies sensibles por especies menos sensibles o resistentes.
112
En el caso de las candidosis vaginales, algunos autores consideran que se est produciendo un cambio y que cada vez es ms frecuente la implicacin de especies menos sensibles a los imidazoles como Candida tropicalis o que desarrollan fcilmente resistencia como C. glabrata. Para otros autores C. albicans sigue siendo la especie predominante con mucha diferencia sobre las dems y los azoles solo produciran su desplazamiento. Hasta el momento no se demostr ninguna relacin causa-efecto entre la resistencia secundaria a los azoles en las cepas de C. albicans procedentes de mujeres inmunocompetentes y la recidivas de las vaginitis fngicas, aunque s puede existir adquisicin de cepas de C. albicans que desarrollaron resistencia secundaria al fluconazol procedentes de una pareja sexual con SIDA (14, 41, 43, 44). En pacientes neutropnicos el empleo profilctico de fluconazol se ha relacionado con un aumento notable de infecciones debidas a C. krusei, que no responden al tratamiento con fluconazol (52). Se observaron fenmenos similares debidos a otras especies resistentes al fluconazol como A. fumigatus (32). El tratamiento de las diferentes formas de candidosis superficiales con derivados azlicos suele ser de corta duracin. En los pacientes inmunodeprimidos que requieren tratamientos ms prolongados se dan las circunstancias que permiten el desarrollo de la resistencia secundaria en C. albicans. Los pacientes con candidosis mucocutnea crnica que tras recibir tratamientos prolongados con ketoconazol desarrollan resistencia secundaria a ste, probablemente representen una pequea muestra de un fenmeno ms general que podra haber ocurrido tambin en otras poblaciones de pacientes inmunodeprimidos, pero del que se desconoce la verdadera extensin (26). No obstante, la resistencia al ketoconazol no parece desarrollarse con facilidad dado el escaso nmero de fracasos teraputicos descriptos tras muchos aos de utilizacin. La situacin es diferente en la poblacin de pacientes infectados por el HIV En especial, cuando se desarrolla el SIDA totalmente, la infeccin oral causada por C. albicans es un cuadro recidivante que suele precisar tratamientos con azoles, bien de larga duracin, bien de numerosos ciclos para conseguir su remisin. El crecimiento de la poblacin con SIDA multitratada con azoles ha dado lugar a un aumento notable de las descripciones de casos de candidosis oral o esofgica que no responden al tratamiento con fluconazol. Ello no impide que las cepas resistentes puedan aparecer en otros contextos, por ejemplo, causando infecciones diseminadas en pacientes inmunodeprimidos, o, incluso, en individuos inmunocompetentes (18). El aislamiento de C. albicans con resistencia a fluconazol en pacientes no infectados por el HIV y que no han recibido azoles es especialmente
113
preocupante y plantea nuevos interrogantes sobre el origen y diseminacin de esta resistencia (16). Los datos de actividad comparada de los diferentes azoles sobre las cepas sensibles y resistentes de C. albicans son muy escasos, y la resistencia cruzada entre azoles es un tema sujeto a discusin. En el caso de las cepas resistentes al ketoconazol que fueron estudiadas, se demostr la resistencia cruzada a otros imidazoles y a los triazoles, tanto in vitro como in vivo en modelos experimentales de infeccin. Frente a esta primera idea de resistencia cruzada a los azoles, se vio que pacientes con SIDA que haban desarrollado resistencia al fluconazol podan responder en algunos casos al ketoconazol o al itraconazol (24). Estos casos pueden deberse a cepas de C. albicans resistentes slo al fluconazol, aunque no est claro si se tratara de una resistencia independiente y especfica a fluconazol o bien si la resistencia a los azoles es un fenmeno que afecta a todos los antifngicos de esta familia, aunque las CIM de cada uno aumenten de forma diferente segn el antifngico, la cepa y la situacin clnica de que se trate. Las infecciones causadas por estas cepas resistentes nicamente al fluconazol pueden responder no slo al ketoconazol o itraconazol, sino tambin a dosis elevadas del propio fluconazol, aunque la mayora de estos pacientes acaban sufriendo recadas causadas por cepas altamente resistentes a todos los azoles (24).
Nuevas molculas antifngicas de uso sistmico

En los ltimos aos aparecieron varios antifngicos cuyas caractersticas farmacocinticas y perfil de toxicidad permitieron disear formulaciones de uso sistmico. Algunos de estos nuevos antifngicos ya se estn utilizando en tratamientos clnicos y otros estn en etapa de evaluacin en ensayos clnicos en humanos y empezarn a difundirse en breve en los centros sanitarios de todo el Mundo.
Caspofungina
La caspofungina (Merk & Co, MK-0991) es el primer frmaco que se comercializa de una nueva clase de antifngicos, las candinas. La principal novedad de estos antifngicos es su mecanismo de accin, ya que actan sobre la 1,3-beta-glucano sintetasa, enzima necesaria para la formacin de 1,3-beta-glucano, uno de los principales componentes de la pared fngica. La caspofungina se licenci a finales de 2001 para uso en enfermos con aspergilosis, en EUA y otros pases, por lo que es el primer antifngico comercial cuya diana se encuentra en la pared fngica. Este mecanismo de accin le confiere ciertas ventajas, ya que no muestra resistencia
114
cruzada con los antifngicos que actan sobre la membrana y como demuestran algunos datos in vitro, podra ser un magnfico candidato para la terapia combinada con azoles o anfotericina B. Su espectro de accin incluye Candida spp. Aspergillus spp., Pneumocystis jirovecii y los hongos dimrficos, pero no es activa frente a aquellas especies que tienen 1,6beta glucano en su pared como Cryptococcus spp. y Fusarium spp. No se absorbe por va oral por lo que slo existe una formulacin parenteral. Se administra en dosis de 50-70 mg/d, se une en un 97% a protenas plasmticas, se metaboliza en el hgado y se excreta en heces y orina. Segn varios estudios preliminares, ha demostrado eficacia en el tratamiento de la candidosis orofarngea y sobre todo en el tratamiento de rescate de la aspergilosis invasora. No parece tener efectos adversos graves, aunque su infusin puede producir fiebre. Muestra interacciones medicamentosas con las ciclosporinas y la rifampicina.
Nuevos triazoles
Existen otros nuevos antifngicos sistmicos, los derivados triazlicos, entre ellos, se encuentran voriconazol (Pfizer, UK-109,496) posaconazol (Schering-Plough, SCH-56592) y ravuconazol (Bristol-Myers Squibb, BMS-207147). Estos tres triazoles son ms liposolubles que el fluconazol y muestran actividad frente a cepas de levaduras resistentes al fluconazol. No obstante, las CIMs de voriconazol, posaconazol y ravuconazol en las cepas resistentes al fluconazol son ms altas que en las cepas sensibles al fluconazol, lo que hace suponer que es posible el desarrollo de resistencia cruzada. Respecto a los hongos filamentosos, los nuevos triazoles muestran un espectro de actividad similar al de itraconazol, por lo que se han puesto esperanzas en su utilizacin en el tratamiento de la aspergilosis invasora. Voriconazol tiene una presentacin oral y otra parenteral. Se administra a dosis de 200-400 mg/12h, se une a protenas plasmticas en un 60%, se metaboliza en el hgado y se elimina por orina. Muestra eficacia en el tratamiento de la candidosis oral y en la aspergilosis invasora. En este ltimo caso, los resultados de un anlisis multicntrico demuestran que el voriconazol tiene una eficacia superior que la anfotericina B convencional en el tratamiento inicial de la aspergilosis. Presenta algunos efectos adversos como visin borrosa, fotosensibilidad y alteraciones hepticas, adems de interacciones medicamentosas parecidas a las de itraconazol que pueden limitar su uso. Respecto al posaconazol y el ravuconazol parecen tener la misma eficacia que el voriconazol, por lo que se esperan los resultados de ms ensayos clnicos.
115
Referencias
1. Alvarez M., Lopez Ponga B., Rayon C., et al. (1995) Nosocomial outbreak caused by Scedosporium prolificans (inflatum): four fatal cases in leukemic patients. J Clin Microbiol. 33:3290-3295. 2. Baily GG., Perry FM., Denning DW., et al (1994). Fluconazole-resistant candidosis in an HIV cohort [see comments]. Aids. 8(6):787-92. 3. Bartlett MS., Queener SF., Shaw MM., et al. (1994). Pneumocystis carinii is resistant to imidazole antifungal agents. Antimicrob Agents Chemother. 38(8):1859-1861. 4. Berenguer J., Rodriguez-Tudela JL., Richard C., et al. (1997). Deep infections caused by Scedosporium prolificans. A report on 16 cases in Spain and a review of the literature. Scedosporium Prolificans Spanish Study Group. Medicine (Baltimore). 76(4):256-65. 5. Boken DJ., Swindells S., Rinaldi MG. (1993). Fluconazole-resistant Candida albicans. Clin Infect Dis. 17(6):1018-21. 6. Como JA., Dismukes WE. (1994). Oral azole drugs as systemic antifungal therapy. New Engl J Med. 330(4):263-272. 7. Crdoba S., Rodero L., Vivot W, et al. (2008). In vitro interactions of antifungal agents against Fusarium spp. clinical isolates. Int J Antimicrob Agents. 31(2):171-4. 8. Cuenca- Estrella M., Daz-Guerra TM., Mellado E., et al. (2001) Flucytosine primary resistance in Candida species and Cryptococcus neoformans. Eur J Clin Microbiol Infect Dis;20(4):276-9. 9. Cuenca-Estrella M., Rodriguez-Tudela JL., Mellado ME., et al. (1998). Comparison of the in vitro activity of voriconazole (UK-109-246), itraconazole and amphotericin B against clinical isolates of Aspergillus fumigatus. J Antimicrob Chemother 42:531-533. 10. Denning DW., Baily GG., Hood SV. (1997). Azole resistance in Candida. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 16(4):261-80. 11. Dick, JD., Merz WG., Saral R. (1980). Incidence of polyene-resistant yeasts recovered form clinical speCMIens. Antimicrob Agents Chemother. 18:158-163. 12. Dronda F., Alonso Sanz M., Laguna F., et al. (1996). Mixed oropharyngeal candidiasis due to Candida albicans and non-albicans Candida Eur J Clin Microbiol Infect Dis.;15(6):446-52. 13. Espinel Ingroff A., Dawson K., Pfaller M., et al. (1995). Comparative and collaborative evaluation of standardization of antifungal susceptibility testing for filamentous fungi. Antimicrob Agents Chemother. 39(2):314-9. 14. Fong IW., Bannatyne RM., Wong P. (1993). Lack of in vitro resistance of Candida albicans to ketoconazole, itraconazole and clotrimazole in women treated for recurrent vaginal candidiasis. Genitourin Med. 69(1):44-6.
116
15. Francis P., Walsh TJ. (1992). Evolving role of flucytosine in immunocompromised patients: new insights into safety, pharmacokinetics, and antifungal therapy. Clin Infect Dis. 15(6):1003-18. 16. Goff DA., Koletar SL., Buesching WJ., et al. (1995). Isolation of fluconazole-resistant Candida albicans from human immunodeficiency virus-negative patients never treated with azoles. Clin Infect Dis. 20(1):77-83. 17. Hanger DP., Jevons S., Shaw JTB. (1988). Fluconazole and testosterone: in vivo and in vitro studies. Antimicrob Agents Chemother. 32:646-648. 18. Hennequin C., Labenne M., Benkerrou M., et al. (1994). Fluconazole-resistant Candida albicans in an immunocompetent child [letter]. Clin Infect Dis. 19(6):1179-80. 19. Hitchcock CA., Pye GW., Troke PF., et al. (1993). Fluconazole resistance in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 37(9):1962-5. 20. Holtz RJ., Azmi A. (1978). Miconazole-resistant Candida. Lancet. i:50-51. 21. Hope WW., Tabernero L., Denning DW., et al. (2004) Molecular mechanisms of primary resistance to flucytosine in Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother 48(11):437786. 22. Kerridge D. (1986). Mode of action of clinically important antifungal drugs. Adv Microbial Physiol. 27:1-72. 23. Kerridge D., Fasoli M., Wayman FJ. (1988). Drug resistance in Candida albicans and Candida glabrata. Ann New York Acad Sci. 544:245-259. 24. Laguna F., Rodrguez-Tudela JL., Martnez-Suarez JV., et al. (1997). Patterns of fluconazole susceptibility in isolates from human immunodeficiency virus-infected patients with oropharyngeal candidiasis due to Candida albicans. Clin Infect Dis. 24:12430. 25 (a). Martinez Suarez JV., Rodriguez Tudela JL. (1995). Patterns of in vitro activity of itraconazole and imidazole antifungal agents against Candida albicans with decreased susceptibility to fluconazole from Spain. Antimicrob Agents Chemother. 39(7):1512-6. 25. Martinez Suarez J., Rodriguez Tudela J. (1996). Resistencia a antifngicos en los hongos patgenos oportunistas (I). Polienos y fluorocitosina. Enferm Infecc Microbiol Clin. 14:384-389. 26. Martinez Suarez JV., Rodriguez Tudela JL. (1996). La resistencia a los antifngicos en los hongos patgenos oportunistas (II). Imidazoles y triazoles. Enferm Infecc Microbiol Clin. 14(8):490-8. 27. Mc Ginnins MR., Rinaldi MG. (1996). Antifungal drugs: mechanisms of action, drug resistance, susceptibility testing, and assays of activity in body fluids, p. 176-211. In V.
117
Lorian (ed.), Antibiotics in Laboratory Medicine, Fourth Edition ed. Williams & Wilkins, Baltimore. 28. Merz, WG., Sandford GR. (1979). Isolation and characterization of a polyene-resistant variation of Candida tropicalis. J Clin Microbiol. 9:677-680. 29. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard. (2002); Document M27-A2. Villanova, Pa, USA. 30. Odds FC. (1993). Resistance of yeasts to azole-derivative antifungals. J Antimicrob Chemother. 31(4):463-71. 31. Pfaller MA., Bale M., Buschelman B., et al. (1994). Selection of candidate quality control isolates and tentative quality control ranges for in vitro susceptibility testing of yeast isolates by National Committee for Clinical Laboratory Standards proposed standard methods. J Clin Microbiol. 32(7):1650-3. 32. Philpott Howard JN., Wade JJ., Mufti GJ., et al. (1993). Randomized comparison of oral fluconazole versus oral polyenes for the prevention of fungal infection in patients at risk of neutropenia. Multicentre Study Group. J Antimicrob Chemother. 31(6):973-84. 33. Pierce AM., Pierce HJJ., Unrau AM., et al. (1978). Lipid composition and polyene antibiotic resistance of Candida albicans mutants. Can J Biochem. 56:135-142. 34. Portillo F., Gancedo C. (1985). Mitochondrial resistance to miconazole in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 199:495-499. 35. Redding S., Smith J., Farinacci G., et al. (1994). Resistance of Candida albicans to fluconazole during treatment of oropharyngeal candidiasis in a patient with AIDS: Documentation by in vitro susceptibility testing and DNA subtype analysis. Clin Infect Dis. 18(2):240-242. 36. Rex JH., Pfaller MA., Galgiani JN., et al. (1997). Development of interpretive breakpoints for antifungal susceptibility testing: conceptual framework and analysis of in vitro-in vivo correlation data for fluconazole, itraconazole, and Candida infections. Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing of the National Committee for Clinical Laboratory Standards [see comments]. Clin Infect Dis. 24(2):235-47. 37. Rodero L, Cuenca-Estrella M., Crdoba S, et al. (2002) Transient Fungemia Caused by an Amphotericin B-Resistant Isolate of Candida haemulonii. J Clin Microbiol.; 40(6): 22662269. 38. Rodriguez Tudela J. (1997). Resistencia de los hongos patgenos oportunistas a los antifngicos. Rev Clin Esp. 197 (Mon. 1):67-74. 39. Rosenblatt HM., Byrne W., Ament ME., et al. (1980). Successful treatment of chronic mucocutaneous candidiasis with ketoconazole. J Pediatr. 97(657-660).
118
40. Ruhnke M., Eigler A., Tennagen I., et al. (1994). Emergence of fluconazole-resistant strains of Candida albicans in patients with recurrent oropharyngeal candidosis and human immunodeficiency virus infection. J Clin Microbiol. 32(9):2092-2098. 41. Sangeorzan JA., Bradley SF., He X., et al. (1994). Epidemiology of oral candidiasis in HIV-infected patients: colonization, infection, treatment, and emergence of fluconazole resistance. Am J Med. 97(4):339-46. 42. Scholer HJ., Polak A. (1984). Resistance to systemic antifungal agents, p. 393-460. In B. LE (ed.), Antimicrobial drug resistance. Academic Press, Orlando. 43. Sobel JD. (1994). Controversial aspects in the management of vulvovaginal candidiasis. J Am Acad Dermatol. 31(3 Pt 2):S10-3. 44. Sobel JD., Vazquez JA. (1996). Symptomatic vulvovaginitis due to fluconazole-resistant Candida albicans in a female who was not infected with human immunodeficiency virus. Clin Infect Dis. 22(4):726-7. 45. Tavitian A., Raufman JP., Rosenthal LE., et al. (1986). Ketoconazole-resistant Candida esophagitis in patients with acquired immunodeficiency syndrome. Gastroenterology. 90(2):443-5. 46. Troillet N., Durussel C., Bille J., et al. (1993). Correlation between in vitro susceptibility of Candida albicans and fluconazole-resistant oropharyngeal candidiasis in HIV-infected patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 12(12):911-5. 47. Vazquez JA., Lundstrom T., Dembry L., et al. (1995). Invasive Candida guilliermondii infection: in vitro susceptibility studies an molecular analysis. Bone Marrow Transplantation. 16:849-853. 48. Walsh TJ., Melcher GP., Rinaldi MG., et al. (1990). Trichosporon beigelii, an emerging pathogen resistant to amphotericin B. J Clin Microbiol. 28(7):1616-22. 49. Whelan WL., Beneke ES., Rogers AL., et al. (1981). Segregation of 5-Fluorocytosineresistant variants in Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 19:1078-1081. 50. Whelan WL., Kerridge D. (1984). Decreased activity of UMP pyrophosphorilase associated with resistance to 5-fluorocytosine in Candida albicans. Antimicrob Agentes Chemother. 26:570-574. 51. White TC., Marr KA., Bowden RA. (1998). Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 11:382-402. 52. Wingard JR. (1992). The use of fluconazole prophylaxis in patients with chemotherapyinduced neutropenia. Leuk Lymphoma. 8(4-5):353-9
119
Apndice
120
Curso a Distancia y Taller: Identificacin presuntiva de Levaduras de inters mdico. Determinacin de la susceptibilidad por difusin Departamento Micologa INEI. Dr. C. G. Malbrn
Tabla 1. Disolucin de los antimicrobianos solubles en agua Solucin del antimicrobiano Paso 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Concentracin Origen (g/ml) 5120 640 640 160 160 160 20 20 20 2,5 2,5 2,5 Almacn Paso 1 Paso 1 Paso 3 Paso 3 Paso 3 Paso 6 Paso 6 Paso 6 Paso 9 Paso 9 Paso 9 Volumen Medio (ml) (ml) = + 1 1 1 1 0,5 0,5 1 0,5 0,5 1 0,5 0,5 7 1 3 1 1,5 3,5 1 1,5 3,5 1 1,5 3,5 Conc. Conc. final intermedia 1:10 (g/ml) (g/ml) = 640 320 160 80 40 20 10 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 64 g/ml 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,03125 Log 2 6 5 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5
121
Tabla 2. Disolucin de los antimicrobianos insolubles en agua Solucin del antimicrobiano Paso 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Conc. (g/ml) 1600 1600 1600 1600 200 200 200 25 25 25 Origen Almacn Almacn Almacn Almacn Paso 4 Paso 4 Paso 4 Paso 7 Paso 7 Paso 7 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,5 3,5 0,5 1,5 3,5 0,5 1,5 3,5 Volumen (ml)+ Solvente (ml) = Conc. intermedia (g/ml) = 1600 ug/ml 800 400 200 100 50 25 12,5 6,25 3,13 Conc. final 1:10 Log 2 (g/ml) 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,0313 4 3 2 1 0 -1 -2 -3 -4 -5
122
Tabla 3. Composicin del medio RPMI 1640 (los componentes estn registrados en ingls en el original) Componente L-arginine (base libre) L-aspargine (anhidra) L-aspartic acid L-cystine 2HCL L-glutamic acid L-glutamine Glycine L-histidina (base libre) L-hydroxiproline L-isoleucine L-leucine L-lysine HCL L-methionine L-phenylalanine L-proline L-serine L-threonine L-tryptophan L-tyrosine 2Na L-valine g/l de agua 0,2 0,05 0,02 0,02 0,3 0,01 0,015 0.02 0,05 0,05 0,04 0,015 0,015 0,02 0,03 0,02 Componente Biotin D-pantothenic Choline chloride Myo-inositol Niacinamide PABA Pyridoxine HCL Riboflavin Thiamine HCL Vitamina B12 Calcium nitrate H20 Potassium chloride Magnesium sulfate (anhidro) Sodium chloride Sodium phosphate, (anhidro) D-glucose dibasic g/l de agua 0,0002 0,00025 0,003 0,001 0,035 0,001 0,001 0,001 0,0002 0,001 0,000005 0,1 0,4 0,04884 6 0,8 2 0,001 0,053
0,0652 Folic acid
0,005 Glutathione, reduced 0,0288 Phenol red, Na 3 0,02
123

Curso Levaduras Médico Difusión

Загружено:

Сведения о документе

Исходное описание:

Оригинальное название

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

Curso Levaduras Médico Difusión

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

CURSO A DISTANCIA Y TALLER: MDULO: Determinacin de la susceptibilidad por difusin

Agosto- Noviembre, 2012

Departamento Micolog a INEI. Dr. C. G. Malbr Malbrn

CURSO A DISTANCIA Y TALLER:

13 de Agosto al 23 de Noviembre, 2012

MDULO Determinacin de la susceptibilidad por difusin

Programa del taller presencial 20 al 23 de noviembre, 2012

Mtodos por microdilucin para levaduras

Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos Concepto

Pruebas en medio lquido y medio slido

Difusin en agar con disco

Caractersticas comparables entre los mtodos de difusin y dilucin

Factores que influyen en los resultados de las pruebas de sensibilidad

Pruebas de sensibilidad a los antifngicos. Proceso de estandarizacin Introduccin

Procedimiento para pesar del polvo base de los antifngicos

Preparacin de las soluciones madre

Utilizacin de solventes diferentes del agua

Solventes recomendados para algunos antifngicos

Intervalo de concentraciones recomendadas para cada antifngico

Seleccin de los antifngicos para analizar e informar de forma rutinaria

En ningn caso, se deben de utilizar nombres comerciales.

Nmero de antifngicos a ensayar

Directrices genricas para realizar las pruebas de sensibilidad

Procedimientos Medio de cultivo

Preparacin de las diluciones de los antifngicos

Solucin madre Esquema de diluciones

1600 g/ml 1:10

0,9 ml RPMI 160 g/ml 0,31 g/ml

Preparacin del inculo

1. Todos los microorganismos se deben de subcultivar en agar Sabouraud. Hay que

2. El inculo se debe preparar tocando 5 colonias de 1 mm de dimetro de cultivos

3. La suspensin resultante se debe de agitar vigorosamente durante 15 segundos. La

UFC/ml. Esta suspensin se diluye 1:2000 con RPMI 1640 lo

Preparacin del inculo

3-5 colonias 1 mm en 5 ml de agua destilada estril

1-5 x 106 UFC/ml

Ajustar a la DO del 0,5 McFarland a 530 nm

Inoculacin del Medio de cultivo (RPMI 1640)

Inoculacin del medio de cultivo

Lectura de los resultados

Sensible Sensible dependiente (S) de la dosis (S-DD) a 8 0,125 4 1

Intermedio (I)b --------8-16 -----------------

16-32 0,25-0,5 ----2 -------------

Anidulafungina Caspofungina Micafungina

>2 >2 >2

Candinas (Anidulafungina, Caspofungina, Micafungina)

Modificaciones realizadas para el mtodo en microdilucin

G H 16 8 4 2 1 0, 0,2 0,1 0,06 0,03 CC CE

Rango de concentraciones en mg/l

Modificaciones del mtodo para circunstancias especiales

Todos los antifngicos

Todos los antifngicos

Todos los microorganismos

Impacto del tiempo de lectura: 24 versus 48 h

Rangos de CIM a 24 y 48 h de dos cepas control de calidad

Control de calidad Propsito

Responsabilidades del Control de Calidad Fabricantes

Seleccin de las cepas de referencia

Coleccin de las Cepas de Referencia

Origen de las cepas de referencia

Preparacin de las cepas para su almacenamiento

Uso rutinario de las cepas de referencia