Universidade Estadual de Campinas Unicamp

Faculdade de Engenharia de Alimentos FEA

TA514 Bioqumica
Prof. Dr. Hlia Harumi Sato

Efeito do pH na Estabilidade das Enzimas

Turma C Grupo 3 Beatriz Momesso Paulino Enos Itiro Suga

042158 043189

1. Introduo Os fatores que influenciam a estabilidade de um enzima so aqueles que afetam as estruturas secundrias, terciria e quaternria da pretena. A determinao da faixa de pH de estabilidade de uma enzima til para a manuteno da enzima na forma ativa durante a reao enzimtica ou para a inativao da mesma quando necessrio. Muitas enzimas se desnaturam irreversivelmente em solues muito cidas ou muito alcalinas. O pH de estabilidade de uma enzima freqentemente influenciado pela presena ou aunsncia de cofatores ou outras molculas de baixo peso molecular. A temperatura um parmetro extremamente crtico na determinao da estabilidade de enzima. O efeito do pH na estabilidade de uma enzima modificado por outros fatores como tipo e concentrao do tampo, presena ou ausncia de substrato, fora inica, constante dieltrica do meio (modulada pela adio de solventes orgnicos como etanol) e efeito do pH na estabilidade de cofatores e ativadores. A invertase ou b-frutofuranosidase catalisa a hidrlise da sacarose em glicose ou frutose. A invertase utilizada na produo de acar invertido. Este ltimo apresenta menor capacidade de cristalizao que a sacarose e utilizado em compotas, doces e produtos de panificao. A invertase comercial pode ser obtida de leveduras como Sacharomyces cerevisiae e de fungos como Aspergillus niger.

2. Objetivos Determinar a faixa de pH de estabilidade da invertase comercial de Sacharomyces cervisiae.

3. Reviso bibliogrfica O efeito do pH na estabilidade das enzimas pode ser claramente distinguida do efeito do pH na atividade cataltica. Todas as enzimas so protenas, portanto fatores que influenciam a estabilidade de uma enzima so aquelas que afetam as etruturas secundrias, tercirias e/ou quaternrias. Por exemplo, a maioria das enzimas sofrem desnaturao irreversvel em solues muito cidas ou muito alkalinas. O pH em que isso ocorre varia com a enzima. A pesina, enzima proteoltica do entmago, rapidamente inativada no pH 7, uma vez que bastante estvel em pH 2. A fosfatase alcalina do leite muito estvel entre as regies de pH 7 a 9, mas acima de pH 9,5 rapidamente inativada. (WHITAKER, 1994) A estabilidade de uma enzima modificada por um nmero de fatores. Considerando o efeito do pH na estabilidade da tripsina. A forma da curva de estabilidade funco das condies de incudao. Aps 24 horas de incubao a 30 C, o pH de estabilidade mxima est em pH 2,5, enquanto a quantidade de atividade em pH 1 e 8 so bastate baixas. (WHITAKER, 1994) As foras que mantm a cadeia de protena na sua particular forma resulta de um nmero de interaes envolvendo a estrutura peptidica (a-hlice)

e os gupos R do aminocido que formam a protena. Os grupos R do aminocido podem ser carregados positivamente ou negativamente dependendo do pH da soluo. Em um pH neutro, a maioria das protenas possuem cargas positivas e negativas disponveis ao longo da cadeira de aminocido. Cargas opostas atraem umas as outras enquanto cargas iguais se repelem. Contudo as foras no to intensas essas repulses/atraes so importantes para manter a estrutura tridimensional (terciria) da protena o qual muito importante para sua funcionalidade. (MATHEWSON, 1998)

4. Materiais e mtodos 4.1. Materiais - Oito tubos de ensaio contendo 0,1mL de invertase previamente incubado em diferentes valores de pH (pH 2,6 a 10) durante 1 hora a 50 C. (Para o estudo fdo efeito do pH na estabilidade da invertase, misturas de 5mL de soluo de invertase (50mg/100mL) + 10mL de solues tampo 0,1M de diferentes valores de pH foram previamente incubadas durante 1 hora a 50 C.) - Soluo Tampo Acetato 0,1M pH 4,5. - Soluo 1% de sacarose em Tamo Acetato 0,1M pH 4,5. - Reagente de Somogyi-Nelson I (SNI) - Reagente de Somogyi-Nelson II (SNII) - 18 tubos de ensaio - Pipetas - Espectrofotmetro - gua destilada 4.2. Mtodos 4.2.1. Ajuste das solues enzimticas pr-incubadas em diferentes valores de pH a 50 C durante 1 hora, para pH 4,5 Adicionaram-se 14,9mL de soluo Tampo Acetato 0,1M pH 4,5 nos oito tubos de ensaio contendo 0,1mL de soluo de invertase pr-incubada em diferentes valores de pH a 50 C durante 1 hora. Determinou-se a atividade de invertase residual em cada tubo de ensaio como descrito a seguir. 4.2.2 Determinao da atividade residual de invertase aps incubao em solues tampo de diferentes valores de pH Distribuiram-se 4mL de soluo 1% de sacarose em Tampo Acetato 0,1M pH 4,5 em 9 tubos de ensaio previamente numerados pH 2,6 a 10 (Tabela 1) e um Branco e incubou-se por 10 minutos a 40 C para equilibrar a temperatura. Adicionou-se 1mL de soluo enzimtica diluida (4.2.1) nos respectivos tubos de ensaio contendo substrato e incubaram-se durante 20 minutos a 40 C. No tubo Branco adicionou-se 1mL de gua destilada no lugar da enzima e incubou-se tambm por 20 minutos a 40 C.

Aps a incubao retiraram-se os tubos de ensaio do banho-maria, colocaramse os tubos em banho de gelo para paralizar a reao enzimtica e determinar os acares redutores formados pelo mtodo de Somogyi-Nelson. 4.2.3 Determinao de acares redutores pelo mtodo de Somogyi-Nelson Pipetou-se 0,5mL de amostra + 1mL de reagente SNI em 9 tubos de ensaio numerados conforme a Tabela 1. Agitaram-se os tubos colocando-os em banho maria em ebulio por 6 minutos. Retiraram-se os tubos e colocaram-se em banho de gelo at resfriar a temperatura ambiente. Retiraram-se os tubos do banho de gelo e adicionou-se 1mL de reagente SNII em cada tubo. Agitou-se os tubos deixando-os repousar por 5 minutos. Adicionaram-se 10mL de gua destilada misturando-os por inverso. Calibrou-se o espectrofotmetro com a soluo Branco, medindo ento a absorbncia a 540nm contra tubo Branco.

5. Resultados e discuo 5.1 Resultados Aps a utilizao do espectrofotmetro e da realizao dos clculos dos valores de atividade relativa obteve-se os dados mostrados na Tabela 1. Com esses dados foi traado o Grfico 1.
Tabela 1 - Efeito do pH na Estabilidade da Invertase

Efeito do pH na Estabilidade da Invertase Unidade de Atividade Solues Tampo Abs 540nm de Invertase (U/mL) pH 2,6 (T. Citrato Fosfato) 0 0 pH 3,6 (T. Acetato) 0,252 5,04 pH 4,5 (T. Acetato) 0,523 10,46 pH 5,0 (T. Acetato) 0,447 8,94 pH 6,0 (T. Fosfato) 0,061 1,22 pH 7,0 (T. Fosfato) 0 0 pH 8,0 (T. Fosfato) 0 0 pH 10 (T. Borato-NaOH) 0 0

% Atividade Relativa 0 48,18 100 85,46 11,66 0 0 0

Grfico 1 - % Atividade Relativa

% Atividade Relativa 120 100 80 60 40 20 0 -20 0 2 4 6 8 10 12

A tabela 2 mostra diferentes concentraes de gicose pela absorbncia e o grfico 2 a concentrao de glicose pela Abs 540nm Femto III e a curva ajustada. Podemos ento utilizar a quarta coluna desta tabela para calcular a concentrao de glicose no pH timo.
Tabela 2 - Curva padro de glicose

Concentrao de glicose mg/mL 0,025 0,05 0,1 0,15 0,25 0,3 0,4

Curva padro de glicose Abs Abs 540nm 540nm Femto I Femto II 0,044 0,047 0,116 0,115 0,211 0,21 0,321 0,321 0,502 0,5 0,644 0,642 0,848 0,842

Abs 540nm Femto III 0,043 0,108 0,195 0,305 0,479 0,618 0,81

Grfico 2 - Concentrao de glicose mg/mL - Abs - 540nm Femto III

0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

A curva ajustada tem equao y = 0,000834075 + 0,494849562 * x Conclui-se que a concentrao de glicose em pH 4,5 de 0,25964mg/mL

5.2. Discues De acordo com (WANG, 1996), ao contrrio da maioria das enzimas, a invertase exibe relativamente alta atividade por uma ampla srie de pH (3,50 5,5), com o timo perto de pH 4,5. A atividade da enzima atinge um mximo em torno de 55 C. Os valores de Michaelis-Menten de um variedade grande de enzimas, mas para a maioria das enzimas o Km entre 2mM e 5mM. O valor de Michaelis-Menten para enzimas livres normalmente prximo de 30mM. A anlise do grfico obtido demonstra que a estabilidade mxima para as condies do experimento condizem com os resultados descritos na literatura. A invertase uma enzima muito utilizada na indstria alimentcia e utilizada para a fabricao de acar invertido, que tambm chamado de acar lquido. Este tipo de acar utilizado, principalmente, na indstria de refrigerantes e alimentos congelados, pois tem maior poder adoante e no cristaliza em baixas temperaturas. Tambm pode substituir o mel natural, sendo utilizado como xarope. Estes xaropes tambm so usados na fabricao de medicamentos. A invertase uma enzima de baixo custo, encontrada na levedura Saccharomyces cerevisiae, mais conhecida como fermento de po ou fermento biolgico. A invertase capaz de transformar o acar de cana-deacar em acares mais simples, ou seja, a sacarose em dextrose e levulose.

6. Concluso Este mtodo demosntrou que o pH um dos fatores que influenciam drsticamente a estabilidade das enzimas. O conhecimento dos valores de pH timo tanto para atividade como para a estabilidade de suma importncia para

o controle de processos na indstria de alimentos, pois est diretamente relacionada a rendimentos em uma linha de produo.

7. Referncias Bibliogrficas MATHEWSON, P. R. Enzymes: Practical Guide For The Food Industry, Minnesota, 1998, p. 8-9 WHITAKER, J. R. Principles of Enzimology for the Food Sciences, New York, ed. 2, p. 276-277 WANG, N. S. Experiment no 14 Enzyme Kinetics of Invertase via initial rate determination, department of Chemical & Biomolecular Engineering, Maryland, 1996