EXPRESIN DE LA SUBUNIDAD CIDA DE LA AMARANTINA RECOMBINANTE, CON PROPIEDADES ANTIHIPERTENSIVAS, EN LAS CEPAS DE E.

coli Rosetta(DE3) y BL21(DE3)pLysS Trejo Daz, O. J.; Dvalos Flores, D. E.; Paredes Lpez, O. Faculta de Qumica / Universidad Autnoma de Quertaro Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del IPN Unidad Irapuato RESUMEN Se realiz la transformacin de E. coli TOP10 con los plsmidos pET32b(+), pET32b-Ac1, pET32b-Ac3 y pET32b-Ac3 para su replicacin, aislamiento y caracterizacin con enzimas de restriccin. Se analiz la expresin de la subunidad cida de la amarantina recombinante con propiedades antihipertensivas, que estaba contenida en estos vectores utilizando dos cepas de E. coli: BL21(DE3)pLysS y Rosetta(DE3). Se obtuvo la curva de crecimiento midiendo la DO600 a cada una de las cepas, se indujo la expresin de la protena recombinante cuando las bacterias alcanzaron valores de 0.3-0.4; adicionando 0.3mM de IPTG (Isopropil--D-tiogalactosido). La DO600 se evalu hasta cumplida las 24 horas de la induccin. Posteriormente las muestras se analizaron y se identificaron por SDS-PAGE. INTRODUCCION Dentro de la diversidad de recursos agrcolas que es factible explotar en nuestro pas, el amaranto constituye uno con gran potencial. En las dos ltimas dcadas, el amaranto ha sido objeto de amplios estudios nutrimentales y agronmicos. El grano tiene un contenido de protena cruda de 13 18% en base seca, presentando un buen balance de aminocidos con adecuados niveles de lisina, triptfano y aminocidos azufrados. Actualmente este grano est ganando gran aceptacin entre los consumidores, principalmente por las propiedades nutracuticas que se le atribuyen. La amarantina es la protena ms abundante de las semillas del amaranto, ha demostrado ser un modelo interesante tanto para transformar cultivos de inters como el maz, adicionando un valor nutracutico (Rascn y col, 2004), as como para realizar estudios de ingeniera de protenas (Medina, 2005). Esta protena ha sido analizada y se ha encontrado que est formada por dos subunidades, la cida y la bsica (Barba de la Rosa y col., 1992). La subunidad cida de la amarantina ha sido objeto de modificaciones por ingeniera de protenas, ya que contiene tres regiones hipervariables de las cinco que tiene la amarantina. Dos de esas regiones fueron modificadas con la insercin de dos pptidos bioactivos (pptidos con actividad fisiolgica). Los dos pptidos bioactivos introducidos son IPP y VY que tienen actividad antihipertensiva (Luna-Surez y col., 2008) la evaluacin del comportamiento y actividad de estos pptidos esta en curso. El objetivo de este trabajo es expresar la subunidad cida recombinante de la amarantina que contiene los pptidos bioactivos, en dos cepas de E. coli con caractersticas diferentes y comparar el crecimiento y la expresin de la misma. MATERIALES Y MTODOS Material Biolgico. Cepas. E. coli. Top 10 (Invitrogen) para multiplicacin de plsmidos; E. coli Origami(DE3) (Novagen), E. coli Rosetta (Novagen) y E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen) para expresin de protenas recombinantes. 1

Vectores. Plsmido pET32b(+)(Novagen); pET32b-Ac1(Luna y col. 2008), vector que porta la secuencia gentica que codifica para la subunidad cida de la amarantina; pET32bAc2 (Luna y col., 2008) vector que porta la secuencia gentica que codifica para la subunidad cida de la amarantina modificada con una unidad del pptido antihipertensivo IPP en el extremo carboxilo terminal; pET32b-Ac3 (Luna y col., 2008), vector que porta la secuencia gentica que codifica para la subunidad cida de la amarantina modificada con cuatro unidades del pptido antihipertensivo VY en la regin media de la protena. Isopropil--D-tiogalactosido (IPTG), fue empleado como inductor del promotor T7 para la expresin de la protena. Obtencin de clulas competentes E. coli TOP10, BL21(DE3)pLysS y Rosetta(DE3). Clulas de la cepa TOP10 se cultivaron toda la noche en 5mL de medio LB sin antibitico, las cepas BL21(DE3)pLysS y Rosetta(DE3) se crecieron con cloramfenicol (34g/mL), con agitacin vigorosa. Del cultivo se tom 1mL, se diluy a 100mL con medio LB y se incub hasta una DO600 de 0.3-0.4. Se centrifug el cultivo a 3500 rpm, el sobrenadante se descart y la pastilla se resuspendi con cloruro de magnesio 10mM en hielo. Se centrifug nuevamente y la pastilla se resuspendi con una solucin de cloruro de calcio 50mM y glicerol al 20%. Lo obtenido se crioconserv en alcuotas de 100 l para su posterior uso. Transformacin de las cepas por choque trmico. Se mezclaron las clulas competentes con el DNA plasmdico (pET32b(+), pET32b-Ac1, pET32b-Ac2 y pET32b-Ac3), 1.5L a la cepa TOP10 y 3L a las cepas BL21(DE3)pLysS y Rosetta(DE3). Se enfri la mezcla 30 minutos en hielo; se incub 90 segundos a 42C para el choque trmico e inmediatamente se colocaron en hielo por 2 minutos. Se aadieron 800L de medio LB y se agit vigorosamente a 37C durante una hora. Despus se centrifug a 12000 rpm y se descart el sobrenadante; la pastilla se resuspendi con el medio remanente y se distribuy por extensin en superficie en placas de agar LB con ampicilina (110g/mL) para TOP10, y la adicin de cloramfenicol (34g/mL) para BL21(DE3)pLysS y Rosetta(DE3). El DNA plasmdico se obtuvo a partir de clulas de la cepa TOP10 previamente transformadas. Extraccin de DNA plasmdico. Se realizaron minipreparaciones (Maniatis et al, 1989) para la extraccin del DNA a partir de las cepas TOP10/pET32b-Ac1, TOP10/pET32bAc2, TOP10/pET32b-Ac3 y TOP10/pET32b(+). Se realiz la caracterizacin de los plsmidos con las enzimas de restriccin EcoRI y ScaI mediante electroforesis en gel de agarosa empleando bromuro de etidio para el revelado. Curvas de crecimiento bacterianas. Se inocularon clulas transformadas de BL21(DE3)pLysS y Rosetta(DE3) en 5mL de medio LB con ampicilina (110g/mL) ms cloramfenicol (34g/mL) , y se incubaron en agitacin vigorosa a 37C. Se midi la densidad la DO600 cada hora. A una DO600 de 0.3-0.4, se adicion el inductor IPTG en una concentracin final de 0.3mM y se tomaron muestras hasta cumplidas las 24 horas de la induccin. Las muestras se congelaron a -20C hasta que se utilizaron. Separacin e identificacin de la protena por SDS-PAGE. Las muestras se descongelaron en hielo, se centrifugaron a 12000 rpm, y se elimin el sobrenadante y la pastilla se resuspendi en 20L de agua desionizada y 20L de amortiguador de carga 5X (Tris-HCl 24mM, pH 6.8; glicerol 10%; SDS 0.8%; 2--mercaptoetanol 5.76mM; azul de bromofenol 0.04%). Despus de preparadas las muestras se analizaron en geles de poliacrilamida al 12%. Las protenas se tieron con azul de coomassie (Laemmli, 1970).

RESULTADOS Obtencin de clulas compentes, transformacin de E. coli TOP10, aislamiento y caracterizacin de los plsmidos. Se logr obtener clulas competentes de las cepas de E. coli empleadas en este estudio. Se transformaron correctamente las 3 cepas que portan los plsmidos de inters. Se logr obtener DNA para la transformacin, a partir de las cepas TOP10/pET32b-Ac1, TOP10/pET32b-Ac2, TOP10/pET32b-Ac3 y TOP10/pET32b(+). La caracterizacin se hizo con las enzimas de restriccin EcoRI y ScaI, las cuales cortan en solo un sitio de restriccin del plsmido. Cada plsmido se incub con una y con dos enzimas. Con una enzima la banda mostr un tamao de aproximadamente 6300pb y con las dos enzimas aparecieron dos bandas de aproximadamente 5204 y 1096 pb con respecto al marcador, que corresponden al plsmido linearizado con el inserto y digerido.
Figura 1.- Caracterizacin de los plsmidos. Ac-1 (1 y 2), Ac-2 (3 y 4), Ac3 (5 y 6) y pET32b(+) (7 y 8) mostraron tamaos muy parecidos. Los carriles nones tienen dos enzimas y los carriles pares solo una. En crculo se sealan las bandas ms chicas y tenues que aparecieron por la digestin

6108 5098

2026 1616 1018

Obtencin de clulas competentes y transformacin de E. coli BL21(DE3)pLysS y Rosetta (DE3). La concentracin del DNA plasmdico que se adicion a las cepas fue determinada por espectrofotometra a 260nm y se calcul la eficiencia de transformacin de cada cepa obteniendo que la cepa Rosetta es ms fcil de transformar que BL21. Curvas de crecimiento. Rosetta(DE3) tuvo un desarrollo heterogneo en comparacin con el desarrollo de BL21(DE3)pLysS que fue muy homogneo y parecido al de la cepa nativa (figura 2). Esto puede explicarse por la posible toxicidad que la protena recombinante tiene en la cepa que la est produciendo. Adems BL21 alcanz un mayor nmero de clulas.
BL21(DE3)pL ysS
11 10 9 8 7 x108Clulas/ mL 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 HORAS S ubunidad cida IPP VY pE T32b(+) BL21(DE 3)pLysS (-)

Rosetta(DE3)
11 10 9 8 7 x108Clulas/ mL 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 HORAS Subunidad cida IPP VY Rosetta(DE3)(-) pET32b(+)

Figura 2.- Desarrollo de las cepas Rosetta y BL1 transformadas. Las bacterias se subcultivaron en medio LB, se evalu el crecimiento por densitometria y cuando alcanz niveles de 0.3-04 se indujo la expresin de la subunidad con IPTG 0.3mM

Separacin e identificacin de la protena por SDS-PAGE. Como se muestra en la figura 3, en el SDS-PAGE, la banda del control positivo se encuentra al mismo nivel que las bandas de las muestras. Los controles negativos, cepa con vector vaco y cepa nativa, no mostraron ninguna banda. El peso molecular de la banda del control positivo se encuentra entre 30 y 40kDa.

40kDa 30kDa

Figura 3.- Anlisi SDS-PAGE de las diferentes versiones de la subunidad cida expresadas Roseta Ac2. Carril 1, marcador; 2, cero horas de induccin; 3, una hora; 4, cinco horas; 5, siete horas; 6, veinte horas; 7, veinticuatro horas; 8, cepa con vector vaco; 9, cepa nativa; 10, control positivo. Se observa que los controles negativos no produjeron ninguna protena del tamao del control positivo, mientras que Ac2 s produjo una protena igual que la del control positivo

La presencia de la protena en el control positivo y la ausencia de la misma en los controles negativos, demuestra la presencia de la subunidad cida recombinante de la amarantina. CONCLUSIONES Se aislaron los plsmidos con las diferentes versiones de la amarantina y el patrn de restriccin comprob la identidad de los mismos. Los dos sistemas de expresin fueron susceptibles a la transformacin con la subunidad cida recombinante de la amarantina. Rosetta(DE3) tuvo mayor frecuencia de transformacin y un desarrollo heterogneo, mientras que BL21(DE3)pLysS tuvo un desarrollo homogneo. Se identifico la presencia de la proteina por SDS-PAGE. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Barba de la Rosa, A. P., Gueguen, J., Paredes-Lpez, O., Viroben, G., Fractionation procedures, electrophoretic caracterization, and amino acid composition of amaranth seed protein, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 931-936, 1992 Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Harbor Laboratory Press, 1989 Medina-Godoy, S. Produccin de la Globulina 11S de amaranto en Escherichia coli y Pichia pastoris, y modificacin de la estructura primaria mediante ingeniera de protenas. Tesis de Doctorado en Biotecnologa de plantas, CINVESTAV-Irapuato, Gto. 2005 Luna-Surez, S., Medina-Godoy, S., Cruz-Hernndez, A., Paredes-Lpez, O., Expression anda characterization of the acidic subunit from 11S Amaranth seed protein, Biotechnology Journal, 3, 209-19, 2008 Rascn-Cruz, Q., Sinagawa-Garca, S., Osuna-Castro, J. A., Bohorova, N. et al, Accumulation, assembly and digetibility of amarantin expressed en transgenic tropical maize, Theor. Appl. Genet., 108, 335-342, 2004 4