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MATERIA:
EJEC. TECS. IDENTIF. DE MICROORG. EN B. A NORMAS /
MICROBIOLOGA

ALUMNO:
Antonio de Jess Murga Mnguez




CATEDRTICO: Dr. Norberto Cadena Prez


GRADO Y GRUPO: 3 I



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MINATITLAN, VER. OCTUBRE. 2013

El examen microscpico de microorganismos constituye una de las tcnicas
caractersticas de la microbiologa y aunque es posible observar ciertos microorganismos
sin colorear (Ej. protozoarios), en el caso de las bacterias se hace necesaria la coloracin
de los preparados para aumentar el contraste con el fondo.

Para obtener el mximo aprovechamiento de la observacin microscpica, debe poder
relacionarse el comportamiento tintorial con la estructura y composicin qumica de las
diferentes partes de la anatoma bacteriana.


Los colorantes son sustancias de origen qumico o biolgico, generalmente tintes,
pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la coloracin de tejidos
microorganismos para exmenes microscpicos, debiendo tener al menos, un grupo
cromforo que le proporcione la propiedad de teir.

La presencia de grupos cromforos en una molcula (grupos azo, nitro, etc.) no es
suficiente para que sta acte como colorante, esto es que se fije a las estructuras a
colorear. Para ser colorante debe poseer grupos que sean capaces de disociarse llamados
auxocromos. Por ejemplo el 1,3,5 trinitrobenceno, es un compuesto coloreado pero no es
un colorante. Sin embargo, si se reemplaza un H por un OH en el anillo bencnico, se
obtiene el cido pcrico que tambin es coloreado pero al poseer un grupo disociable
(auxocromo) acta como colorante.

La distincin entre colorantes cidos y bsicos depende de la carga de la parte de la
molcula responsable del color. Si es negativa se trata de un colorante cido y si es positiva
se trata de un colorante bsico. Esta diferencia es importante debido a que, segn sean
cidos o bsicos, los colorantes tendrn afinidad por diferentes zonas de la anatoma
celular.

Algunos colorantes utilizados comnmente en Microbiologa son fucsina bsica, cristal
violeta, safranina, azul de metileno, etc.


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En algunas coloraciones se utilizan sustancias capaces de
formar complejos insolubles con los colorantes y que ayudan al
proceso de coloracin: los mordientes. Ejemplos de
mordientes comnmente usados son el lugol, el cido tnico y
algunas sales.

Lgicamente, es de esperar que el colorante imparta su color a las estructuras celulares,
sin embargo hay un fenmeno llamado metacromacia en el cual se observa un color
diferente. Por ejemplo, pueden visualizarse corpsculos metacromticos rojos en ciertos
preparados teidos con azul de metileno. Una explicacin que da cuenta de este fenmeno
se muestra en la figura. El colorante, al interaccionar con ciertas estructuras polianinicas
como los polifosfatos, se dispone de tal manera que cambia la longitud de onda de
absorcin. Pueden observarse corpsculos metacromticos (grnulos de volutina) en varios
gneros microbianos y en general, su presencia denota algn dficit nutricional en el medio
de cultivo.
Los colorantes se clasifican, teniendo en cuenta si la propiedad tintorial se encuentra en el
anin o el catin de su estructura qumica. Sobre esta base se pueden dividir en tres
grupos: bsicos, cidos y neutros.


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Colorantes bsicos: La accin colorante est a cargo del catin, mientras que el
anin no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+.
Colorante cido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante est a cargo del
anin, mientras que el catin no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+
Colorantes neutros: Estn formados simultneamente por soluciones acuosas de
colorantes cido y bsicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente
en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad tintorial de sus
componentes cidos y bsicos, por ejemplo: la giemsa.


Fuente de obtencin de los colorantes.
Atendiendo a la fuente de obtencin, los colorantes se clasifican en naturales y sintticos.

Colorantes naturales. Los colorantes naturales son bsicamente histolgicos,
encontrndose entre los empleados con mayor frecuencia, los siguientes:

ndigo: Se obtiene de diversas especie de plantas del genero indigfera que contiene
indican, el cual se fermenta para producir el colorante.
Carmn: Se produce, mediante el tratamiento con alumbre y otras sales metlicas a
hembras del insecto cochinilla "Coccus castis".
Orcena y Tornasol: Se obtiene mediante el procesamiento industrial de lquenes de
los gneros: Le canora tinctoria y Rosella tinctoria.
Hematoxilina: Este colorante se extrae con ter de la madera de un rbol oriundo de
Mxico y de algunos paises suramericanos denominados Hematoxilium
campechianum.


Colorantes sintticos. Se obtiene de la anilina, o es ms exactamente del alquitrn de
hulla siendo todos derivados del benceno.



En el proceso de la coloracin, ocurre una
combinacin de reacciones fsicas y qumicas.

Reaccin fsica.
Ocurre un fenmeno de absorcin similar al que
tiene lugar en las materias porosas, considerando

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que el colorante penetra en los intersticios del cuerpo coloreable y se mantiene all por la
cohesin molecular.

Reaccin qumica
Las clulas microbianas son ricas en cidos nucleicos que portan cargas negativas en
formas de grupos fsfato combinndose como colorante bsicos cargados positivamente.
Los colorantes cidos que tienen la accin colorante en el anin no tien la clula,
emplendose como colorante de contraste para colorear su entrono, como por ejemplo: la
tinta china o la eosina que no colorea al microorganismo, pero si el fondo del campo
microscpico.


Los colorantes son sustancias txicas, por lo tanto el proceso de la tincin generalmente
resulta letal para los microorganismos, provocando su inmovilizacin, lo cual puede
significar una ventaja o desventaja para el investigador segn sean los objetivos con la
sustancia colorante. Veamos algunos Ejemplos:

1. Al ocasionar la muerte de los microorganismos sometidos al proceso de tincin se
reducen las posibilidades de contaminacin para el manipulador.
2. Los colorantes pueden ser txicos para el manipulador, algunos incluso han resultado
cancerigenos por lo que ha habido la necesidad de retirarlos del mercado.
3. Algunos colorantes solo tienen afecto letal para determinadas especies o gneros
bacterianos, siendo utilizados como constituyentes de medios de cultivo selectivo
para impedir el desarrollo de microorganismos indeseables y favorecer el desarrollo
de las especies que nos interesa estudiar. Por ejemplo: el verde de malaquita.
4. Otros se emplean como desinfectantes microbianos, mas que para teir, con fines de
microscopia, por sus propiedades bacterianas o bacteriostticas.
5. Algunos tipos de colorantes son empleados no para teir, sino como indicadores de
pH, formando parte de la composicin de los medios de cultivo para indicar los
cambios de basicidad o acidez que se vayan produciendo en el medio como
consecuencia de su actividad metablica. Ejemplo: rojo fenol, azul de bromotimol,
etc.

Atendiendo a los objetivos que se persigan, los mtodos de coloracin se clasifican en:
Tincin simple, tincin compuesta y tincin especial.
Tincin simple: En la tincin simple se utiliza un solo colorante con el que se tie
rpidamente el microorganismo, utilizndose fundamentalmente para observar su
morfologa y tamao. Los colorantes empleados con mayor frecuencia para este tipo
de tincin son los siguientes: azul de metileno, violeta cristal y fuscina fenicada, entre
otros.
Tincin compuesta: En este tipo de tincin, se utiliza ms de una sustancia tintrea.

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Los colorantes se aplican, a la preparacin, separados o juntos, formando parte de
una solucin. En consecuencia se puede determinar algunas caractersticas propias
de diversos gneros que permiten diferenciarlo de los dems, por lo que reciben
tambin el nombre de coloraciones diferenciales. Entre los mtodos mas utilizados se
encuentran: La coloracin de Gram. y la de Ziehl Neelsen.

Coloracin de Gram.
En 1884, el dans Hans Chistian Gram, ide un mtodo de coloracin, que es en la
actualidad, el ms empleado en los laboratorios de bacteriologa, mediante el cual, la
bacteria sometida a esta tincin, en dependencia de la composicin qumica de la especie,
queda teida de color violeta o de color rojo.
Principios. A pesar de que esta tcnica de coloracin se ha venido empleando desde hace
ms de un siglo, an no se ha podido determinar con exactitud la base molecular de la
reaccin, existiendo controversias al respecto. El criterio mas generalizado es que la violeta
y el lugol forman un complejo que reacciona con los componentes bioquimicos de la pared
celular deshidratada, fijndose en esta. Teniendo en cuenta que la composicin qumica de
la pared, no es igual en todos los gneros, la reaccin resultante ser obviamente diferente,
lo que da lugar, que mientras algunos gneros retienen firmemente el colorante al resultar
el complejo impenetrable para el decolorante, en otros gneros la barrera que se produce
es ms permeable, lo que permite al solvente penetrar y extraer el complejo violeta-lugol,
dejando a la bacteria nuevamente incolora.
Fundamento tcnico En el primer paso de la coloracin, cuando los microorganismos
presentes en el frotis son expuestos a la accin colorante de la violeta de genciana, todos
los gneros que se encuentran en el frotis se tien de color violeta. Al adicionar el lugol, no
se produce ningn cambio de color, ya que el lugol no es un colorante, sino un mordiente,
que se adiciona con el objetivo de formar un complejo violeta-lugol, para fijar el color en la
bacteria. Al adicionar el decolorante (alcohol etilicio o alcohol acetona) algunos gneros no
son afectados por estos solventes, reteniendo por consiguiente el color violeta aplicado
inicialmente, en tanto que otros son decolorados quedando la bacteria nuevamente
incolora. Al echar finalmente la solucin de safranina (que es de color rojo ) las especies
que no fueron decoloradas, mantienen la coloracin violeta ya que la safrania es un
colorante mas dbil que la violeta y su adicin no influye significativamente en cambio de
color, en tanto que los gneros que fueron decolorados por el alcohol, se tien con la
safrina, adquiriendo un color de 199.

Coloracin de "Ziehl Neelsen.
Algunos gneros microbianos dentro de los que se incluyen las microbacterias, tienen la
propiedad de retener el colorante con que han sido teidas, aunque sean sometidos a la
accin de solventes tan fuertes como los cidos para su decoloracin, el primer mtodo de
coloracin para este tipo de microorganismo, fue concebido y aplicado por Robert Koch,
descubridor del agente causal de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis o Bacilo de
Koch. Fue modificada y perfeccionada posteriormente por Ziehl y Neelsen. Este mtodo se
utiliza hoy en dia, con alguna que otra modificacin en funcin de las particularidades de la
especie en estudio.
Principio Las microbacterias, como el Mycobaccterium tuberculosis y otras especies
susceptible de ser coloreadas por esta tcnica, se caracterizan por tener una alta
proporcin de cido micolico (lpidos) en su pared celular. La accin del calor, introducido

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en este mtodo, hace que la misma se permeabilice y haga accesible la penetracin de la
fucsina, tindose la pared celular. Al normalizarse la temperatura de la preparacin, el
compuesto lipidico impermeabiliza la pared a la accin del decolorante cido, con lo cual el
microorganismo se mantiene teido. El resto de las especies, as como las clulas
epiteliales y otros artefactos, que no disponen de cido miclico en su pared o membrana,
son decolorados, despus de teidos por la fucsina.
Fundamento tcnico Al someter el frotis a la accin de la Fucsina, todos los
microorganismos, independientemente de que dispongan o no de cido micolico en sus
respectivas paredes celulares sern coloreados de rojo. Al aplicar el decolorante cido, las
especies que posean el cido micolico en la pared, resisten la accin decolorante y se
mantienen teidas de rojo, en tanto que las dems se quedan incoloras. Al aplicar la
coloracin de contraste (azul de metileno) las bacterias que retuvieron el color
proporcionado por la fuscina, no sufren ninguna alteracin permaneciendo de color rojo,
pero las especies que si fueron decoloradas, se tien de azul, al igual que las clulas
epiteliales y otros artefactos presentes en la preparacin.

Coloracin Fragelar de Leifson (modicficacin de Clark)
Los flagelos son estructuras, cuyo dimetro no excede de los 30mm, lo cual esta muy por
debajo del poder de rersoucin del micrososcopico optico. Para hacer visibles a los flagelos
se requiere aumentar su grosor, para lo cual se emplea una suspensin de acido tanico que
al precipitarse sobre su cubierta forman una capa que aumenta aparentemente su dimetro.
Lo que propicia que al ser posteriormente coloreado, tanto los flagelos como su disposicin
con respecto al bacilo se hagan visibles al microscopista.

Coloracin de cpsula.
La cpsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la sintetizan a
partir de polipptidos, polmeros de glucosa u otros aminoazucares que contienen
nitrgeno, que despus de combinarse con el agua es segregada por todo el contorno de la
pared celular como un moco gelatinoso. Cuando la cpsula ha sido producida puede
observarse en los frotis coloreado por el mtodo de Gram como un halo incoloro alrededor
de la bacteria. Cuando se requiere ver la cpsula con ms detalle o inducir su produccin
se recurre a coloraciones especiales.


http://www.ecured.cu/index.php/Colorante
www.biol.unlp.edu.ar/microbiologiagral/materialdidactico01-2011.doc