IBCM GUIA DE PROBLEMAS DE ACIDOS NUCLEICOS 1- Qu uniones relacionan: a) dos deoxirribosas entre si; b) 2 bases enfrentadas?

2- Un segmento de AD de cadena sim!le tiene la siguiente com!osici"n de bases: A #1$% & ' 2#$( & ) 1($1 & * 2($( & 'u+l ser,a la com!osici"n de bases de la cadena com!lementaria? 'u+l ser,a la com!osici"n de bases de la forma de doble cadena de dic-o segmento?

#- .x!li/ue !or /u a ma0or concentraci"n salina en el medio$ la -ibridi1aci"n entre dos -ebras de AD es menos rigurosa 0 2ice2ersa3 Qu utilidad tiene esto en las tcnicas de 4out-ern 0 ort-ern blot? '"mo influ0e la tem!eratura en el grado de -ibridi1aci"n? 5undamente3 '"mo se !uede lograr la -ibridi1aci"n entre dos cadenas con com!lementariedad !arcial? 6- 7a) Qu es una en1ima de restricci"n$ de d"nde se obtienen 0 !ara /u se usan como -erramienta de 8ngenier,a *entica? 7d)Qu ti!os de extremos !ueden de9ar en el AD de cadena doble? Qu es una secuencia !alindr"mica? 'om!letar las siguientes secuencias !ara /ue corres!ondan a !osibles !alindromes: i- A*) ii'AA iii''' i2A)' %- .xiste un solo gen !ara la !irulasa en cada clula de mam,fero 7en realidad dos co!ias dado /ue -a0 dos alelos$ !or/ue en -umanos los cromosomas se encuentran de a !ares)3 .l gen tiene (: ;b de longitud3 4in embargo$ se -an encontrado en el cito!lasma de diferentes ti!os de clulas de un mismo organismo dos m< A de ($( 0 = ;b de longitud3 .l de ($( es idntico en secuencia al de = ;b$ exce!to !or el -ec-o de /ue carece de un segmento interno de :$# ;b3 a)-'"mo ex!lica la gran diferencia de tama>o entre el gen 7(: ;b) 0 sus mensa9eros? b)-'"mo ex!lica la existencia de dos ti!os de m< A diferentes de !irulasa? c)-Usted su!one /ue algunos te9idos ex!resan el mensa9ero de ($( ;b$ mientras /ue otros solo ex!resan el de = ;b3 ?ara demostrarlo decide anali1ar los extractos de m< A total de los diferentes te9idos mediante la tcnica de nort-ern-blot$ utili1ando la -ibridaci"n de sondas es!ec,ficas de cD A radioacti2as3 'u+l de las dos es!ecies de mensa9ero detecta en un ort-ern blot con cada una de las siguientes tres sondas? .s/uematice 0 ex!li/ue !or /u -un cD A del m< A de !irulasa de ($( ;b -un cD A del m< A de !irulasa de = ;b -un cD A del m< A del segmento diferencial de :$# ;b @- Usted !osee un !l+smido de # ;b A!8B'CD 0 una secuencia de D A !ro2eniente de una ?'< de 1 Eb AD AxD3 .l !8B'C tiene una secuencia de corte con .co<8 7extremo co-esi2o) 0 con .co<F 7extremo romo) ambos se!arados !or (:: !b3 .l D Ax !osee un sitio de corte con BamG1 a 2:: !b del extremo %H3 )ambin cuenta con un ladder de I:::$ (:::$ %:::$ 6:::$ 2:::$ 1::: 0 %:: !b3

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a) '"mo efectuar,a el clonado de D Ax en !8B'C? b) Utili1ando digesti"n con .< c"mo c-e/uear,a /ue su 2ector incor!or" el inserto3 *rafi/ue lo obtenido en la electroforesis de agarosa3 c) '"mo c-e/uear,a la orientaci"n del inserto? *rafi/ue lo obtenido en la electroforesis de agarosa3 (- Usted !osee la siguiente secuencia de AD :
%H-A)A)'''A*)*''AA))*')***)A)AA)A')*)''A*)')')')'**A*')*')*'*AAA*-#H

4u idea es am!lificar la secuencia !or ?'< 0 tiene /ue com!rar los !rimers de 1: !b3 '"mo escribir,a la secuencia de los primers al -acer el !edido? =- 4e /uiere determinar la !resencia de secuencias corres!ondientes al 2irus del G8F en AD de linfocitos ) de un !aciente3 Jos linfocitos son un ti!o de clulas de la sangre !ertenecientes al con9unto de los gl"bulos blancos3 .n un tubo de ensa0o agregaron los siguientes com!onentes !ara una reacci"n de am!lificaci"n de AD !or ?'<: i3 AD molde: AD total de linfocitos de un !aciente /ue tiene anticuer!os anti-G8F circulantes en sangre ii3 ?rimer a de 2: nucle"tidos cu0a secuencia es com!lementaria de la -ebra inferior en la regi"n AaD 7figura 1) iii3 ?rimer b$ de 22 nucle"tidos cu0a secuencia es com!lementaria de la -ebra su!erior en la regi"n AbD 7figura 1) i23 d )?s 0 Buffer con CgK2 23 )a/ !olimerasa: AD !olimerasa de una bacteria term"fila Regin a 5 278 pb 3 5 Regin b 3

4e reali1aron #: ciclos de am!lificaci"n en un termociclador autom+tico com!utari1ado3 'ada ciclo consiste en: 7a) 8ndicar lo /ue est+ ocurriendo en cada una de las siguientes eta!as de un mismo ciclo: 1-.ta!a 1: #: seg a I6L'3 2- .ta!a 2: @: seg a %2L'3 #- .ta!a #: #: seg a (2L'3 7b) 'u+l es la longitud 7en !ares de bases) del !roducto de la ?'<? 7c) 'u+l es el !eso molecular del !roducto de la ?'<? DATO ! pa" #e ba$e$ % &5' Da 7d) 'u+l ser,a el !roducto de ?'< si se omitiera: i- uno de los !rimers ii- los 2 !rimers iii- el AD molde 7e) Dado /ue la ?'< es extremadamente sensible$ /ue controles reali1ar,a !ara descartar una e2entual contaminaci"n3

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I- Usted cuenta con el !l+smido !*J#-basic /ue es un 2ector re!ortero /ue se utili1a !ara ex!resar la !rote,na Juciferasa$ cu0o ma!a de restricci"n es el /ue se muestra en la 5ig3 23 .ste ti!o de !l+smido se utili1a !ara medir la acti2idad de !romotores frente a distintos est,mulos$ estas secuencias son en general mu0 acotadas 71::-1::: !b) 5igura 2
PvuI 3523

PvuI 4569

a) Diga !ara /ue sir2en las secuencias /ue est+n indicadas en el ma!a del !l+smido 7Am!r$ lucK$ ori 0 4F6: !ol0A) b) Usted am!lifica el !l+smido 2ac,o 7sin ningMn !romotor r,o arriba del gen de luciferasa) en bacterias 0 reali1a una mini!re! !ara !urificarlo3 Qu .< utili1a !ara c-e/uear /ue el !roducto obtenido es el deseado? Gaga un diagrama del gel 0 /ue bandas es!erar,a obtener si usted no trato con < Asas: calle 1: Jadder calle 2: !l+smido sin digerir calle #: !l+smido digerido con la en1ima de su elecci"n3 Utilice el diagrama 5ig3 # A c) 4i usted utili1a la .< PvuI 'u+ntas bandas obtiene 0 de /ue tama>o? .s/uemat,celos en la 5ig3 #B3 d) .l !romotor /ue usted desea clonar fue le2antado !or la <eacci"n en 'adena de la ?olimerasa 7?'<) desde AD gen"mico utili1ando !rimers dise>ados de tal manera /ue en sus extremos de9an sitios de restricci"n !ara las siguienteNs en1imaNs: i- 4ma8 '''*** ii- 4al8 0 BamG8 *)'*A' 0 **A)'' iii- O-o8 ')'*A* i2- 4ac8 0 O-o8 *A*'A' 'u+l cree /ue ser,a la me9or estrategia de clonado? '"mo c-e/uear,a /ue la inserci"n -a sido exitosa? DATOS S(aI e)*"e(+$ "+(+$ Ba(,I 5- p"+*./en*e Sa0I 3- p"+*./en*e Sa1I 5- p"+*./en*e 23+I 5- p"+*./en*e

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e) Desgraciadamente cuando c-e/uea si !osee los reacti2os necesarios !ara reali1ar el ex!erimento descubre /ue solo !osee .< /ue de9an extremos romos3 Qu cambios 2a a tener /ue -acer en su estrategia de clonado? 4abiendo /ue la secuencia de su inserto es la siguiente$ donde la secuencia en negrita 0 subra0ada corres!onde a la reconocida !or ci8 0 /ue esta en1ima no corta en el !l+smido Qu estrategia sugiere !ara c-e/uear /ue el clonado -a sido exitoso 0 /ue el inserto se incor!oro en la direcci"n correcta? ! )''A))'A*A**)*)*)))')CCCGG))AAA))*''**'A'***AA***A*****)*'A &' *))****A'''''*'AA**A''*A')**)'AA**)A**AA**'A*'''*AA*A*)')'' !!4 A**')A*AA**A'AA*A)*AA**AAA)*')**''A''A)'))***')*')*')**AA)) !77 ))'***'A))A))))A))))A))))))*A*'*A*'*'A)*')AA*')*AA 5ig #3 A B

1:- 4e dis!one de una ce!a de ratones gentilmente cedida a su laboratorio !or el Dr3 Cenguelito3 .stos ratones tienen un llamati2o !ela9e en tono !Mr!ura casi fluo !or obra 0 gracia del Dr3 Cenguelito$ /uien$ en alguna o!ortunidad$ en medio de sus misteriosos ex!erimentos obtu2o mutantes /ue luego mantu2o !or endocr,a 7cru1amiento entre !arientes con las mismas caracter,sticas$ lo /ue lle2a a tener una ce!a: todos genticamente iguales)3 Ptros in2estigadores estudiaron esta ce!a de ratones 0 determinaron /ue el color !Mr!ura se debe a la ex!resi"n en la dermis del gen /ue se indica en la 58*U<A 6 el cual se encuentra ba9o el control del factor de transcri!ci"n 5T 0 en co!ia Mnica en el genoma 7no -a0 otro alelo en el cromosoma -om"logo)3

IBCM a) .s/uematice el m< A maduro de la !ur!urina 0 determine su longitud3 QU4)858QU.3

b) .s/uematice el !atr"n de bandas es!erado en un S+.*3e"n b1+* 0 en un N+"*3e"n b1+* reali1ado a !artir de muestras de te9ido 3ep6*i0+7 #8"(i0+ / #e "i9n si se utili1" como sonda un fragmento de D A marcado radioacti2amente com!lementario a una de las cadenas en el E2ON 23
FIGURA 1 : esquema de DNA genmico de ratn que muestra la regin correspondiente al gen de la protenaprpura que solo se expresa en la dermis de ratn bajo el control de FT.

FT
ATG E1

BamH1

BamH1 TGA

//

E2

//

E3

//

E4

+1
DATOS E1=160 pb E2= 300 pb E3= 130 pb E4= 260 pb 5 no codificante= 50 pb 3 no codificante= 80 pb Distancia entre los sitios BamH1= 810 pb Intrn 1= 300 pb Intrn 2= 500 pb Intrn 3= 350 pb

.9ercicio adicional la cual, el cDNA de FT se ha colocado bajo el control de un promotor que responde a
factores de transcripcin de expresin constitutiva en todos los tejidos del ratn.

FIGURA 2 : esquema de la construccin con la cual se preparan ratones transgnicos en

Usted encontr" 0 aisl" en la Ant+rtica una bacteria cri"fila$ cu0a m+xima acti2idad metab"lica la .n regin a amplificar por PCR esJ a Es 6L '3 !rinci!io su idea es lograr comerciali1ar alguna de las !roteasas de esta bacteria$ en la industria alimenticia$ como un !roducto ablandador de carnes en fr,o3 ?ara ello decide -acer P FTm+s adelante !odr,a identificar otros genes de una biblioteca gen"mica de la bacteria 0a /ue im!ortancia comercial3 7a) Describa como reali1ar,a la biblioteca gen"mica J !laca de ?etri de la biblioteca usted !osee a!rox3 1:: 7b) 4u!oniendo /ue en cada colonias 0 /ue el genoma de su bacteria criofila es de 136::3:::3::: !b3 'u+ntas !lacas de ?etri tiene la biblioteca? 7c) ?ara el screening del gen usted cuenta con una sonda de 1:: !b marcada radioacti2amente$ donde la secuencia de la sonda fue dise>ada a !artir de regiones altamente conser2adas de !roteasas de otras bacterias no cri"filas3 '"mo ser,a la rigurosidad de -ibridi1aci"n? '"mo la controlar,a?