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CURSO DE CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS HPLC

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS HPLC


1.- INTRODUCCIN La cromatografa se utiliza para separar los diferentes analitos de inters a partir de mezclas con otros analitos que interfieren. Los mtodos cromatogrficos se pueden dividir en dos principales categoras: cromatografa de gases (GC) y cromatografa de lquidos de alto desempeo (HPLC). La cromatografa de lquidos de alto desempeo (HPLC) es una tcnica de separacin muy usual para semivoltiles y no voltiles o para analitos que se descompongan por calentamiento. El xito de la separacin de cromatografa de lquidos requiere que los analitos de inters sean solubles en el disolvente seleccionado como fase mvil. Debido a que los disolventes se trabajan a alta presin, la tcnica originalmente se le llam cromatografa de alta presin, pero ahora se le refiere como cromatografa de lquidos de alto desempeo, (High Performance Liquid Chromatography). Todos los procesos alcanzan una separacin por el paso de una fase mvil sobre una fase estacionaria. Los constituyentes de una mezcla son separados debidos a sus diferentes coeficientes de particin entre la fase mvil y la fase estacionaria teniendo as diferentes tiempos de
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retencin. Los compuestos que interaccionan fuertemente con la fase estacionaria eluyen lentamente (tiempo de retencin grande), los compuestos que permanecen en la fase mvil o que su interaccin con la fase estacionaria es dbil, eluyen rpidamente (tiempo de retencin corto). 2.0 DEFINICIONES 2.1 Tiempo de retencin total ( tR1 o tR2 ) es el tiempo, que es necesario para que el componente de una muestra migre desde la entrada de la columna (inyeccin de la muestra) al final de la columna(detector). Tiempo muerto t0 (tiempo sin adsorcin) es el tiempo requerido por un compuesto inerte para que migre de la entrada de la columna al final de la columna sin ninguna interaccin por la fase estacionaria. 2.2 Tiempo de retencin neto o corregido (tR1 o tR2) es la diferencia entre el tiempo de retencin total y el tiempo muerto t0 . Que es el tiempo que permanece el analito en la fase estacionaria. tR1 = tR1 t0 tR2 = tR2 - t0 2.3 Factor de capacidad kes una medida de la separacin de la muestra en el cromatograma. Este es especfico para una sustancia dada, k depende de la fase estacionaria, la fase mvil, la temperatura, caractersticas del empaque, etc. k1= tR1 t0 = tR1 k1= tR1 t0 = tR1 t0 t0 t0 t0
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2.4 Retencin relativa , tambin conocido como factor de separacin , es la relacin entre dos factores de capacidad, colocndose en denominador el compuesto de referencia. = k2 k1 2.5 Velocidad lineal del disolvente (cm/seg). La velocidad lineal es independiente de la seccin transversal de la columna y proporcional a la cada de presin de la columna. La velocidad lineal puede ser calculada por medio del tiempo muerto, en donde L es la longitud de la columna en cm y t0 es el tiempo de retencin de un compuesto no retenido. U=L t0 2.6 Nmero de platos tericos n caracteriza la calidad del empaque de una columna y su transferencia de masa, nmeros grandes de n significa que se pueden separar mezclas complejas de analitos. N = 16 ( tR1 / w )
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= 5.54 (tR1 / w1 )2
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2.7 Altura equivalente de un plato terico h (HETP), es la longitud (o altura) de un plato terico, cuando una columna tiene un nmero grande de platos tericos, h , la altura deber ser muy pequea. El valor de h es un criterio para la calidad de una columna, el valor de h depende del tamao de partcula, velocidad de flujo y de la fase mvil. h=L/n 3.0 CLASIFICACIN DE LA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS 3.1 En HPLC fase Normal, donde la fase estacionaria es de elevada polaridad tal como el trietilenglicol colocada sobre partculas de slice o almina, y la fase mvil de menor polaridad que la fase estacionaria (columna polar, fase mvil no polar). En HPLC fase Reversa, se refiere a que la fase mvil es relativamente polar y la fase estacionaria no polar (columna no polar, fase mvil polar). La fase estacionaria con frecuencia se trata de un hidrocarburo y la fase mvil puede ser como por ejemplo el agua, el metanol o el acetonitrilo. La fase Reversa de HPLC es la tcnica seleccionada para analizar residuos y analitos orgnicos no voltiles. En cromatografa en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente
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es el ms soluble en la fase mvil y un aumento de la polaridad de la fase mvil aumenta el tiempo de elucin. En cromatografa fase reversa: Las partculas slidas de partculas no tratadas son polares y no son muy usuales para separar compuestos no polares, por la poca afinidad que se tiene. Para resolver este problema la superficie reactiva (polar) se le somete a un proceso qumico para cambiar sta superficie a no polar, tenindose as diversas superficies no polares (fase reversa). Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento unido qumicamente tiene un carcter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Por lo general, el grupo R del siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (n-octadecilo). En estas preparaciones, los grupos de hidrocarburo de cadena larga se alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partcula, dando una estructura semejante a una brocha o un cepillo. Las cadenas ms largas originan rellenos o empaques que proporcionan una mayor retencin. Adems, una mayor longitud de la cadena permite una mayor cantidad de muestra. En la mayora de las aplicaciones de la cromatografa en fase inversa (o reversa) , la elucin se lleve a cabo con una fase mvil de elevada polaridad como es el caso de
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una solucin acuosa conteniendo concentraciones diversas de disolventes como el metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. Se debe procurar que el pH sea menor de, aproximadamente a 7,5 porque si no puede tener lugar la hidrlisis del siloxano, lo que originara la degradacin o destruccin del empaque. Con empaques de fase enlazada en fase normal, R en la estructura del siloxano es un grupo funcional polar como es el caso de los grupos ciano ( -C2H4CN ), diol ( _C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (-C3H6NH2 ) Y Los Dimetilamino ( -C3H6n(CH3)2. 4.0 COMPONENTES BSICOS CROMATOGRAFO DE LQUIDOS DE UN

4.1 Componentes de HPLC Los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin son comnmente los siguientes: Bomba Inyector/Automuestreador Columna Detector Recipientes de disolventes Disolventes Desgasificador Filtro (frit)
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Precolumna Vlvula de drenado Sistema de datos/Integrador Todas estas partes pueden presentar problemas y requieren diagnosticarlos. 4.1.1 Un aparato de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio para contener los disolventes a utilizar como fase mvil. El desgasificador que puede consistir en un difusor de un gas inerte como helio que arrastra los gases disueltos como el aire. Estos sistemas pueden tener un dispositivo ( filtro) para la eliminacin de partculas slidas en suspensin de los disolventes. Por otro lado, conviene que todos los disolventes que se vayan a utilizar, sean filtrados a vaco a travs de una membrana de 0.45 micras. 4.1.2 Disolventes El rango de disolventes que pueden ser usados en cromatografa de lquidos es muy amplio. El agua y las disoluciones acuosas buffer (reguladora) son de uso comn, as como los disolventes no acuosos de baja viscosidad. Los disolventes no acuosos poseen diferentes polaridades (ver tabla).

Tabla 1.Disolventes grado cromatografa de lquidos en orden de ndice de polaridad. Disolvente Polaridad Disolvente polaridad Pentano 0.0 Metil terbutil ter 2.5 Heptano 0.1 o-Xileno 2.5 Hexano 0.1 Benceno 2.7 Eter petrleo 0.1 Clorobenceno 2.7 Isooctano 0.1 o-Diclorobenceno 2.7 Ciclohexano 0.2 Eter etlico 2.8 Hexadecano 0.5 Cloruro de metileno 3.1 Tricloroetileno 1.0 Dicloro etileno 3.5 Tetracloruro de carbono 1.6 Isopropanol 3.9 Tolueno 2.4 2- butanol 4.0 Disolvente Alcohol isobutlico Tetrahidrofurano Cloroformo Metil isobutil cetona Acetato de etilo Metil n-propil cetona Metil etil cetona 2- Etoxietanol Fenetilamina Acetona Polaridad 4.0 4.0 4.1 4.2 4.4 4.5 4.7 5.0 5.0 5.1 Disolvente Metanol Piridina Carbonato de dietilo 2- Metoxi etanol Acetonitrilo Propilen carbonato Dimetil formamida Dimetil acetamida Dimetil sulfxido Agua Polaridad 5.1 5.3 5.5 5.5 5.8 6.1 6.4 6.5 7.2 10.2

4.1.3 Filtros Los disolventes que se usen en cromatografa de lquidos, deben de estar libres de partculas y de aire disuelto, para ello se deben filtrar y desgasificar, de lo contrario pueden causar problemas. Las partculas pueden bloquear el
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empaque de la columna y el aire disuelto puede formar burbujas en el sistema que provocan ruido en el detector. Para eliminar las partculas es necesario filtrar haciendo pasar el disolvente a travs de una membrana de 20 micras, colocada en un sistema filtrante Millipore accionada con vaco. Para desgasificar se introduce al reservorio del disolvente un tubing con un filtro de metal sinterizado mediante el cual se le burbujea helio, con un flujo pequeo (5 -10 psi). Otra opcin para desgasificar los disolventes consiste en colocar el reservorio dentro de un bao de ultrasonido durante 10 15 min. La muestra puede ser tambin un problema, para asegurarse que no tenga partculas, deber ser filtrada mediante una membrana de 0.45 micras utilizando una jeringa que en su extremo tenga colocado un filtro con esta membrana (swinny). 4.1.4 Bombas La bomba es una de las partes ms importantes de un cromatgrafo de lquidos. Para obtener las mejores separaciones, la columna deber empacarse con partculas muy pequeas, pero como se puede observar que esto afecta grandemente a la presin requerida. Esto significa que entre menor sea el tamao de partcula mayor ser la presin desarrollada por la bomba.
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Se utilizan tres tipos de bombas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante. Las bombas recprocas, son las que se usan en su mayora, consisten, en una pequea cmara en la que el disolvente es impedido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor. Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia fuera de un cilindro. 4.1.5 Inyectores El inyector de un HPLC comnmente consiste de una vlvula de inyector y un loop de muestra. La muestra se disuelve en la fase mvil antes de ser inyectada en el loop de la muestra. La muestra se carga con una jeringa y se inyecta en el loop a travs de la vlvula de inyeccin. Con un giro al rotor de la vlvula, se cierra la vlvula y se abre el loop para inyectar la muestra en la corriente de la fase mvil. Los volmenes del loop pueden ser desde 10 l hasta 500 l. Las inyecciones pueden ser automatizadas. 4.1.6 Precolumnas

En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca por delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes. La composicin del empaque de la precolumna debe de ser semejante al de la columna

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analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la cada de presin. Las columnas pueden bloquearse con partculas que se van reteniendo sobre la superficie del empaque al paso de la disolucin de las muestras inyectadas o de la propia fase mvil (disolvente) provocando un aumento en la presin de trabajo, para minimizar este problema se tienen 2 formas de proteccin de la columna. Una forma es utilizar una precolumna (o guarda columna) y la otra es instalar un filtro en lnea entre el inyector y la columna. La precolumna consiste en una seccin corta de columna, alrededor de 5 cm de longitud, empacada con el mismo material que la columna e instalada inmediatamente antes de la columna. Esta columna acta como un filtro, s sta, empieza a bloquearse (la presin aumentar, para mantener la misma velocidad de flujo, de ser necesario la precolumna puede ser removida, limpiarla y reempacarla. Las precolumnas eliminan materia en suspensin y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Las precolumnas debern ser de composicin similar a la columna analtica, ayudando al buen funcionamiento de la columna analtica, reemplazando la precolumna cuando se contamine. 4.1.7 Columnas

Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de acero inoxidable, con una resistencia de
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presin de hasta 10000 psi. Estas son de una longitud de 10 a 30 cm de longitud, con un dimetro interno de 4 a 10 mm, tamao de partcula del empaque de 5 a 10 micras. Normalmente los nmeros de platos se pueden situar en 100 000 platos/ metro. Las columnas son rectas, de 10 a 30 cm de longitud, que de acuerdo a necesidades es posible hacer extensiones mediante acoples y as tener longitudes ms largas. Las columnas normalmente no requieren control de temperatura trabajando a temperatura ambiente, sin embargo la aplicacin de temperatura puede mejorar los cromatogramas. De manera comn las columnas son de 25 cm de longitud, 4.6 mm de dimetro, y tamao de partcula de 5 micras y con un nmero de platos de 10,000 platos. Generalmente las columnas se trabajan en condiciones isotrmicas, a temperatura ambiente. Los instrumentos modernos tienen control de temperatura, desde la ambiente a 100 o 150 o C. El empaque de la columna consiste en micropartculas de 3 a 10 micras de dimetro, de silica , que estn recubiertas con pelculas de sustancias orgnicas unidas fisicamente o qumicamente a la superficie.

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4.1.7

Detectores

Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolucin, responden a una propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por otro lado se tienen los detectores basados en una propiedad del soluto, que responden a alguna propiedad del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil. 4.1.8.1 Detectores de absorbancia

Los mtodos HPLC requieren del uso de detectores, de tal forma que un flujo de la columna pasa a travs de una celda montada el extremo final de la columna. Un haz de radiacin ultravioleta pasa a travs del flujo de la celda en el detector. A medida que los compuestos eluyen de la columna, pasan a travs de la celda y absorben la radiacin, resultando en una energa medible.

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5.0 5.1

CROMATOGRAFA Inyeccin de muestra

A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean deben de ser pequeos, de unas cuantas dcimas de microlitro hasta tal vez 500 microlitros. Adems, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. Normalmente los volmenes con que se trabaja van de 5 a 50 microlitros ( L). Una forma de inyectar consiste en introducir la jeringa (que debe de ser de punta roma) al inyector del cromatgrafo de lquidos, que tiene instalado un loop o rizo, en el cual se descarga la muestra, para posteriormente se accione el dispositivo de inyectar muestra. Este tipo de inyector permite que la muestra se introduzca sin interrumpir el flujo de la fase mvil. Con estos loops o rizos se puede introducir la muestra hasta presiones de 7000 psi (libras por pulgada cuadrada), con una precisin de unas dcimas de por ciento. Nunca se debe de utilizar una microjeringa propia para cromatografa de gases, ya que estas jeringas pueden rayar las superficies del inyector y provocar fugas.
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El loop es un tubing de acero inoxidable en forma de rizo o aro. Estos loops o rizos son intercambiables de acuerdo al volumen en microlitros con el que se quiere trabajar. Es decir que el volumen de muestra se determina por el tamao del loop, lo comn es de 10, 20 o 50 L. 5.1.1 Cromatografa fase normal y fase reversa. Se distinguen dos tipos de cromatografa de reparto: fase normal y fase inversa o reversa. En la fase normal, la fase estacionaria es polar (grupos ciano, amino, diol) y la fase mvil no polar (hexano). En la fase inversa o reversa, la fase estacionaria es no polar y la fase mvil es polar (agua, metanol, acetonitrilo). En fase normal, el componente menos polar es el que eluye primero y en la fase inversa o reversa el componente ms polar es el primero en eluir. 5.1.2 Fases mviles ( Eluyentes)

Las fases estacionarias en base a la silica son compatibles con todos los disolventes orgnicos dentro del rango de pH mencionado. Es recomendable utilizar disolventes de la ms alta pureza (grado HPLC). Adems de que todas las disoluciones preparadas se deben de filtrar a travs de un membrana de 0.5 micras antes de utilizarse en el sistema de HPLC.

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El uso de disolventes HPLC no puros provocan adsorcin irreversibles de impurezas sobre la entrada de la columna. Estas impurezas bloquean los sitios de adsorcin, cambian la selectividad de la columna y provocan que haya divisin de picos. En gradiente de elucin, las impurezas causan los llamados picos fantasmas. Los picos fantasmas pueden aparecer siempre en la misma posicin en el cromatograma. Generalmente estos picos son causados por las impurezas de los disolventes o aditivos. Por la que es recomendable correr un gradiente sin inyeccin al iniciar cada mtodo para eliminar los picos fantasmas. Para impedir la adsorcin irreversible en la entrada de la columna, es recomendable utilizar una precolumna. Al utilizar la precolumna aumenta notablemente la vida media. Como alternativa de precolumna es instalar un filtro en lnea. Estos filtros retienen slidos del eluyente pero no impiden la adsorcin irreversible de impurezas orgnicas. ilRestricte17 July 2008Month ##, 200X Page 10 5.1.3 Fase estacionaria reversa La fase mvil es polar y consiste de disoluciones acuosas conteniendo concentraciones diversas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. El pH no debe de ser mayor que 7.5 porque esto generara la hidrlisis del siloxano y la destruccin del empaque de la columna.

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Si OH + Cl Si R3

Si O Si R3

En donde R puede ser radicales metilo o C8 H17 o C18 H37 (metilo, octilo o octadecilo). Los eluyentes se clasifican en orden creciente de polaridades de la siguiente forma: Hidrocarburos; teres; steres; cetonas; aldehdos; amidas; aminas; alcoholes; y agua. La polaridad de la fase estacionaria deber ser bastante similar a la de los analitos y para la elucin se utiliza una fase mvil de polaridad considerablemente distinta. El tiempo de elucin puede ser modificado con la polaridad del eluyente, los factores de selectividad pueden controlarse variando la naturaleza de la fase mvil o la fase estacionaria. El eluyente puede estar formado por una mezcla de disolventes, tales como metanol (49%) con agua (51%), proporciones que en su momento pueden cambiarse. 5.1.4 Gradiente de elucin

Si la composicin del disolvente se mantiene constante a travs de toda la corrida analtica, se tiene un proceso llamado elucin isocrtica. S la composicin del disolvente se cambia de alguna forma (pH, fuerza reguladora, mezcla con otros disolventes), entonces se
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tendr un proceso llamado elucin por gradiente . El gradiente de elucin es muy usual cuando se tienen mezclas de analitos con diversas caractersticas. Las caractersticas del disolvente se cambian progresivamente, que a su vez cambian el comportamiento de los analitos. S se realiza apropiadamente, mezclas complicadas en su separacin pueden ser separadas eficientemente. Generalmente para realizar este tipo de mezclas se requiere de una segunda bomba, sin embargo es posible con una sola bomba pero con una vlvula de control y una cmara mezcladora. 6.0 SELECCIN DE COLUMNAS DE HPLC 6.1 Parmetros de seleccin de columna

Fase estacionaria Tamao de poro Tamao de partcula Longitud Dimetro interno 6.1.1 Seleccin de la fase

Para esta seleccin se debe considerar el tipo de analitos de inters y el pH.

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Las fases C18 y C8 son las mejores para iniciar el desarrollo de mtodos con muestras tpicas. Tener en cuenta que el pH juega un papel crtico en la separacin y puede ser agresivo para la columna; buscar la columna adecuada. Elegir la fase estacionaria ms adecuada para la muestra en particular. Usar fases especiales como la SB-Aq para muestras polares, difciles de retener para disminuir los tiempos de desarrollo. Buscar la columna que nos d resultados con el mnimo de problemas C18 ofrece la mayor retencin, puede ser ms de lo deseado para algunas muestras; recomendada para analitos moderadamente polares. C8 tiene menor retencin que C18, pero su selectividad es parecida en la mayora de los casos; recomendada para analitos polares, moderadamente polares y no polares. Fenil tiene una retencin significativamente menor para compuestos no polares, pero retiene los compuestos polares, por lo que reduce el tiempo de anlisis para mezclas de compuestos polares y no polares. CN es la de menor retencin, muestra cambios en la selectividad, buena para reducir los tiempos de anlisis de los compuestos que tardan en eluir lo cual evita el uso de gradientes. Buena para separaciones de compuestos polares y moderadamente polares. E- July
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6.1.2 Seleccin del Tamao de Poro Tamao de las molculas que sern analizadas. Las molculas pequeas (PM menor a 2000) pueden distribuirse fcilmente en poros de 80-120 Las molculas mas grandes (PM mayores a 2000)por ej. protenas y pptidos, requieren un tamao de poro mayor 300

E-Semi17 July 2008Month ##, 200X Page 4

6.1.2.1 Seleccin del tamao de poro de la columna. Las molculas deben entrar al poro para interactuar con la fase. La molculas deben entrar y salir del poro libremente para maximizar la eficiencia. 5 El tamao de la molcula en disolucin determina el tamao de poro de la columna. Un pico estrecho indica acceso libre a los poros. /Presentation TitleAgilent Restrictedonth ##, 200X Page 6 6.1.3 Tamao de partcula Para anlisis convencionales de molculas grandes y pequeas, el tamao de partcula ms usado es de 5 micras. Mientras ms pequeo sea el tamao de partcula, mayor es la eficiencia y la resolucin. Tamaos de partcula disponibles (en micras): 1.8, 3, 3.5, 5, 10. E-SeminarGroup/Presentation Titl17 July##, 200X Page 7 6.1.4 Seleccin de longitud de la columna El tiempo de anlisis es proporcional a la longitud de la columna.
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Columnas de 250mm tienen tiempos de corrida ms largos Preferir columnas cortas de tamao de partcula pequeo para disminuir el tiempo de anlisis. E-Semin arGr17 July 2008Month ##, 200X Page 8 6.1.4.1 Disminucin del tiempo de anlisis Disminuir la longitud de columna y disminucin del tamao de partcula: disminucin proporcional en el tiempo de anlisis (tiemp~long, L) disminucin proporcional en el uso de disolventes (~L) disminucin de N, platos~ L y as N mantiene la resolucin, R. Agilent Restricted17 July 2008Month ##, 200X Page 9 6.1.5 Seleccin del dimetro interno El dimetro interno define cunto del analito se puede inyectar en la columna. Las columnas de i.d. pequeo, incrementan la sensibilidad, por lo que son muy usadas en tcnicas como LC/MSD Mientras menor sea el i.d., requiere de menor cantidad de disolvente E-

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7.0

DESARROLLOS DE MTODOS pH Un parmetro importante

7.1

La retencin de los compuestos ionizables es fuertemente influenciada por el pH. Los compuestos ionizables (cidos y bases) pueden ser analitos o compuestos de matriz. Un control preciso del pH mejora la reproducibilidad del mtodo. El intervalo de pH de 1 12 provee la mxima flexibilidad para el desarrollo de mtodos pH 2.5, pH 6.5, pH 8, pH 11.5. 2A/Presentation Title17 July 2008Month ##, 200X Page 18 7.1.1 pH medio Los compuestos de inters son inestables a bajos pH Se mejora la solubilidad de los analitos a pH medios. Incrementar la retencin de los compuestos bsicos. Puede existir una mejor selectividad en el intervalo de pH de 3 a 8.E-SeminarGroup/Presentation TitleAgilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 20 7.1.2 pH alto Los compuestos de inters pueden no ser solubles a pH bajos. Los compuestos de inters pueden no ser estables a pH bajos. Obtener un incremento en la retencin de compuestos bsicos analizndolos en su forma no cargada. Mejorar la selectividad.
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E-Se 8.0 CUIDADOS GENERALES PARA COLUMNAS DE HPLC La silica es el soporte ideal para las columnas HPLC . Esta ofrece una gran estabilidad mecnica, excelentes propiedades fisicoqumicas, un amplio rango de enlaces qumicos y es compatible con un amplio rango de disolventes qumicos. Los siguientes puntos son importantes: 8.1 Estabilidad con el pH

En general, las columnas de HPLC son estables dentro de un rango de pH de 2 a 8. 8.2 Estabilidad mecnica

Las fases estacionarias basadas en la silica, mecnicamente son muy estables. Las columnas pueden utilizarse hasta 6000 psi sin tener problemas. Sin embargo se deben evitar golpes o shocks de presin sobre las columnas. Los golpes de presin en las columnas provocan canalizaciones en la columna, lo cul resulta en divisiones de picos en los cromatogramas.

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8.3 Fases mviles ( Eluyentes) Las fases estacionarias en base a la silica son compatibles con todos los disolventes orgnicos dentro del rango de pH mencionado. Es recomendable utilizar disolventes de la ms alta pureza (grado HPLC). Adems de que todas las disoluciones preparadas se deben de filtrar a travs de un membrana de 0.5 micras antes de utilizarse en el sistema de HPLC. El uso de disolventes HPLC no puros provocan adsorcin irreversibles de impurezas sobre la entrada de la columna. Estas impurezas bloquean los sitios de adsorcin, cambian la selectividad de la columna y provocan que haya divisin de picos. En gradiente de elucin, las impurezas causan los llamados picos fantasmas. Los picos fantasmas pueden aparecer siempre en la misma posicin en el cromatograma. Generalmente estos picos son causados por las impurezas de los disolventes o aditivos. Por la que es recomendable correr un gradiente sin inyeccin al iniciar cada mtodo para eliminar los picos fantasmas. Para impedir la adsorcin irreversible en la entrada de la columna, es recomendable utilizar una precolumna. Al utilizar la precolumna aumenta notablemente la vida media. Como alternativa de precolumna es instalar un filtro en lnea. Estos filtros retienen slidos del eluyente pero no impiden la adsorcin irreversible de impurezas orgnicas.

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8.4

Regeneracin de columnas

La adsorcin irreversible provocada por impurezas que puede causar cambios en la selectividad o divisin de picos. Frecuentemente estas columnas sucias pueden ser regeneradas con los siguientes procedimientos: 8.4.1 Columnas fase reversa de de de de de de de

Empaques tales como C18, C8, C4, C1, C30, CN o fases fenilos. - Fluir la columna con 20 volmenes* (de columna) agua. - Fluir la columna con 20 volmenes (de columna) acetonitrilo. - Fluir la columna con 5 volmenes (de columna) isopropanol. - Fluir la columna con 20 volmenes (de columna) heptano. - Fluir la columna con 5 volmenes (de columna) isopropanol. - Fluir la columna con 20 volmenes (de columna) acetonitrilo. 8.4.2 Columnas fase normal

Empaques tales como Silica, Diol, Nitro, y fases amino. - Fluir la columna con 20 volmenes (de columna) de heptano.
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- Fluir la columna con 5 isopropanol. - Fluir la columna con 20 acetonitrilo. - Fluir la columna con 20 agua. - Fluir la columna con 20 acetonitrilo. - Fluir la columna con 5 isopropanol. - Fluir la columna con 20 heptano. * V= r2 h

volmenes (de columna) de volmenes (de columna) de volmenes (de columna) de volmenes (de columna) de volmenes (de columna) de volmenes (de columna) de

9.0 PROBLEMAS y SOLUCIONES EN LOS SISTEMAS DE HPLC.2008Mon Tipos de problemas en columna 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 R Lnea base Presin Forma de pico Retencin Resolucin

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9.1.1 Variaciones de la lnea base - Posible causa: Burbujas de aire atrapado en la celda del detector debido a una mala desgasificacin de los disolventes de la fase mvil. - Solucin: Asegrese de que todas las fases mviles estn debidamente desgasificadas. 9.1.1.1 Presin con fluctuaciones. - Posible causa: Burbujas en la bomba. - Solucin: Desgasifique el disolvente; Burbujee el disolvente con helio. - Posible causa: Fuga en la vlvula check o sellos. - Solucin: Reemplace o limpie las vlvulas check; reemplace sellos de la bomba. 9.1.2 Lnea base con mucho ruido

- Posible causa: Aire atrapado en la celda del detector o en la bomba. - Solucin: Enjuague el sistema y purgue la bomba de HPLC. Utilice disolventes desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo de la fase mvil del sistema. - Posible causa : problema de la lmpara del detector o celda de flujo sucia.

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- Solucin: Reemplace la lmpara UV (cada una tiene un tiempo de vida de 2000h aprox.); limpie y fluya la celda. - Posible causa: Falla en el mezclado del disolvente, en gradiente o isocrtico. - Solucin: Use un equipo apropiado de mezclado; compruebe la precisin de proporciones de disolventes adicionando un compuesto que absorba al UV y monitoreando la lectura en el detector. - Posible causa: ocasionales spikes de interferencias elctricas. - Solucin: Usar estabilizador de voltaje para el sistema. - Posible causa: Contaminacin acumulada. - Solucin: Fluya la columna con un disolvente fuerte; limpie las muestras; utilice disolvente grado HPLC. - Posible causa: spikes por burbujas en el detector. - Solucin : Desgasifique el gas. 9.1.3 Spikes

- Posible causa: Burbujas en fase mvil. - Solucin: Desgasifique la fase mvil; Use restrictor de presin a la salida del detector; Asegrese que todas la conexiones estn apretadas. - Posible causa: Columna almacenada sin tapones. - Solucin: Almacene la columna con sus tapones apretados; fluya la columna invertida con metanol desgasificado.

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9.2.1

Presin alta

Posibles causas: Frit de la columna tapado Empaque tapado Contaminacin de la columna Columna incorrecta, por error (d.i. menor) Soluciones: Verificar la presin con y sin columna, muchos de esto problemas pueden ser causados por obstrucciones en el sistema. Lavar la columna: Elimina la contaminacin de columna y desbloquea el empaque Compuestos de alto peso molecular o adsorbidos Precipitados de la muestra o del buffer Voltear la columna Desbloquea el frit Cambio de frit Elimina el frit tapado E-SeminarGroup/Presentation Ti200X Page 33 9.2.2 Lavado de la columna: Use al menos 26 ml de cada disolvente para columnas analticas (4.6 mm)

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Purgar la columna con disolventes ms fuertes que la fase mvil. Opciones de disolventes para columnas de fase reversa (en orden de incremento de fuerza): 1. Fase mvil sin las sales del buffer 2. 100% Metanol 3. 100% Acetonitrilo 4. 75% Acetonitrilo: 25 % Isopropanol 5. 100% Isopropanol 6. 100% Cloruro de metileno* 7. 100% Hexano* *Despus de usar hexano o cloruro de metileno la columna debe ser purgada con Isopropanol antes de regresar a la fase reversa. 34 9.2.3 Lavado de la columna: Opciones de disolvente para la fase normal (En orden de incremento de fuerza) Use al menos 50 ml de cada disolvente 1. 50% Metanol: 50 % Cloroformo 2. 100% Acetato de etilo Es posible usar pequeas cantidades de cido, para eliminar compuestos fuertemente retenidos, la reequilibracin es muy larga. Es ms fcil comenzar con columnas ciano y diol que con

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columnas de slica cuando se va a comenzar a usar LC de fase normal. E-SeminarGroup/Presentation Tit17 July 2008Month ##, 200X Page 35 9.2.4 Prevencin de la presin alta: Instalar accesorios en lnea: Fase mvil filtrada Pre-Columna Inyector Filtro Guarda Columna: Columna Analtica Detector Tanto el filtro como el guarda-columna actan sobre la muestra, mientras que la pre-columna lo hace sobre la fase mvil. Proteger la columna - Pre columnas - Filtros en lnea Preparacin de la muestra Purga apropiada de la columna Filtrar los buffers Cambiar frecuentemente los buffers y el agua (cada 12 das max.)

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Usar frascos mbar o forrados con papel aluminio para minimizar la exposicin a la luz de las fases acuosas. E-SeminarGroup/Presentation Title Agilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X PaPage 37 9.3.1 Forma de Pico: Picos divididos Coleo Ensanchamiento Baja eficiencia Muchos problemas de la forma de pico, son una combinacin de problemas, esto es, ensanchamiento con coleo o coleo con incremento en el tiempo de retencin. E-SAgilent Restrict17 July 2008Month ##, 200X Page 38 9.3.1.1 Picos divididos Pueden ser causados por: Contaminacin de la columna Frit parcialmente obstruido Volmen muerto en la columna Efectos del solvente de inyeccin Columna contaminada Lavar la columna con 100 % ACN. La respuesta mejora notablemente despus de lavar la columna con 100 % ACN. E-SAgilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 40 Picos divididos Efectos del disolvente de inyeccin
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La forma del pico mejora completamente si se utiliza como disolvente de la muestra, a la fase mvil. a) Disolvente de inyeccin 100 % Acetonitrilo b) Disolv. de inyeccin, Fase mvil. /Presentation Title Agilent Restrict17 July 2008Month ##, 200X Page 41 9.3.1.2 Coleo del pico Posible causa: interacciones secundarias El coleo se elimina agregando un modificador a la fase mvil. Reduciendo el pH de la fase mvil, se reducen las interacciones con los silanoles que causan el coleo. E-SAgilent Restricte17 July 2008Month ##, 200X Page 43 Coleo del pico: Posible causa: contaminacin en la columna Solucin: invertir la columna y lavarla con un volumen de alcohol isoproplico. Ensanchamiento: Posible causa: Volmen muerto en la columna Multiples cambios en la forma del pico pueden ser causados por el mismo problema. Un caso, cuando el elevado pH disuelve a la slica y forma un volumen en la columna. El no ajustar el pH de la fase mvil, ocasiona disolucin de la slica.
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Solucin: invertir la columna y lavarla con un volumen de alcohol isoproplico. 9.4.1 Cambios en la retencin: Posible causa: Cambios en la fase mvil Variacin del modificador de la fase mvil. Solucin: Corregir la fase mvil, resuelve el problema. Posible causa: Cambios en las condiciones, pueden causar cambios en la retencin. Solucin: Restaurar las condiciones iniciales. Posible causa: Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase mvil. Solucin: Purgar el flujo de la fase mvil, para eliminar burbujas de aire. Prevencin: asegrese de que la fase mvil sea apropiadamente desgasificada, ya sea burbujeando helio o por sonificacin. 9.4.1.1 Aumento del tiempo de retencin. - Posible causa: Disminucin de velocidad de flujo. - Solucin: Comprobar velocidad de flujo en la bomba, comprobar fugas en los sellos y en el sistema. - Posible causa: Composicin variable de la fase mvil

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- Solucin: Cubra las reservas de disolvente; asegrese de que el sistema desarrolla la composicin correcta. - Posible causa: Prdida de fase enlazada - Solucin: Usar fase mvil con pH entre 2 y 8. 9.4.1.2 Disminucin de tiempos de retencin. - Posible causa: Sitios activos en el empaque de la columna. - Solucin: Use modificador de fase mvil, (compuestos bsicos), o aumentar la fuerza del buffer; utilizar columnas con mayor desactivacin (end capping). - Posible causa: Columna sobrecargada con muestra. - Solucin: disminuya la cantidad de muestra o utilice columna con dimetro mayor. - Posible causa: Aumento de velocidad de flujo. - Solucin: Comprobar la velocidad de flujo en la bomba. - Posible causa: Prdida de fase estacionaria enlazada o slica base. - Solucin: Usar fase mvil con pH entre 2 y 8. - Posible causa: Variacin de la temperatura de columna. - Solucin: Equilibre la temperatura de columna o aslela; asegrese que la temperatura del laboratorio sea constante.

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9.5.1 Prdida de resolucin - Posible causa: Obstruccin de la columna de HPLC o del Guarda columna por partculas. - Solucin: Seguir las indicaciones de la presin alta. - Prevencin: Filtrar todo antes de que se introduzcan las fases mviles en el sistema de HPLC. 9.6 Sensibilidad baja

-Posible causa: Bloqueo en las lneas del automuestreador. - Solucin: Compruebe el flujo y limpie cualquier obstruccin. - Posible causa: Atenuacin demasiado alta. - Solucin: Reducir la atenuacin del detector. - Posible causa: El loop del inyector no se esta llenando. - Solucin: Sobrellene el loop con muestra. - Posible causa: No se esta inyectando suficiente muestra. - Solucin: Aumente la cantidad de muestra inyectada. - Posible causa: Los picos se salen del rango del detector. - Solucin: Diluya o concentre la muestra para que los picos estn dentro del rango lineal del detector. - Posible causa: Prdida de muestra durante su preparacin. - Solucin: Utilice estndar interno durante su preparacin; optimice el mtodo de preparacin de
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muestra. 9.6.1 Fuga en la columna o conexiones.

Posible causa: Conexiones flojas. Solucin: Apriete o reemplace conexiones. Fuga en el detector Posible causa: Falla en el sello del detector. el sello del detector o

9.6.2 -

- Solucin: empaque. 9.6.3

Reemplace

Fuga en la vlvula del inyector

- Posible causa: Rotor de la vlvula daada. - Solucin: Reemplazar la vlvula del rotor. 9.6.4 Fuga en la bomba

-Posible causa: Falla en el sello de la bomba. -Solucin: Reemplace el sello de la bomba; revisar el pistn y si tiene rayaduras, reemplazar. 9.6.5 Picos negativos

- Posible causa: En detector de I.R., el ndice de refraccin del soluto es menor que el de la fase mvil. - Solucin: Invierta la polaridad para hacer positivo al pico.
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- Posible causa: en detector UV, la absorbancia del soluto es menor que el de la fase lquida. - Solucin: Utilizar fase mvil con menor absorbancia UV; s se recicla el disolvente, detener el reciclado cuando el reciclado afecte a la deteccin. - Solucin: Fluya la columna con un disolvente fuerte; limpie las muestras; utilice disolvente grado HPLC. - Posible causa: spikes(lneas verticales) por burbujas en el detector. - Solucin: Desgasifique el gas. ##, 200Pa 10.0 CONCLUSIONES Los problemas en columnas de HPLC son: Presin alta Forma de pico indeseable Cambios en la retencin/selectividad La mayora de estos problemas se resuelven lavando la columna. Frecuentemente estos problemas no estn asociados con la columna y pueden ser causados por el instrumento y condiciones experimentales. La columna se comporta de acuerdo a cmo la tratemos.

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