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Abordagens protemicas e suas aplicaes no campo da hematologia

Weber, Simone Schneider
Farmacutica-Bioqumica, Doutora em Medicina Tropical e Sade Pblica e aluna do curso de Ps-graduao em Hematologia Laboratorial da Academia de Cincia e Tecnologia. E-mail: swbiotecnologia@yahoo.com.br

Resumo Tcnicas protemicas esto cada vez mais sendo empregadas na descoberta de biomarcadores, para a definio e caracterizao de ambos os processos, normal e o patolgico. Os recentes progressos das metodologias empregadas nas abordagens protemicas tm aberto novas oportunidades de aplicao mdica, inclusive no campo das doenas hematolgicas e medicina transfusional. No presente artigo feita uma reviso das aplicaes das protemica no campo da hematologia, incluindo os resultados obtidos nas reas da protemica clnica, medicina transfusional e farmacoprotemica. Palavras-chaves: protemica; hematologia; medicina transfusional e farmacoprotemica

Abstract Proteomic techniques are increasingly being employed for biomarker discovery, to the definition and characterization of both, physiological normal and the pathological processes. Recent progresses of methodology used in proteomic approaches have been open new opportunities for medical application, including in the field of hematological diseases and transfusion medicine. In the current report, the clinical application of proteomics in the field of hematology is reviewed, including the results obtained in the clinical proteomics, transfusion medicine and farmacoproteomic. Keywords: proteomic; hematology; transfusion medicine and farmacoproteomic

INTRODUO O termo proteoma foi descrito pela primeira vez por Marc Wilkins em 1994 (WILKINS et al., 1994) e refere-se ao conjunto de todas as protenas que intervm nos processos biolgicos, as quais so produzidas com base no genoma. Enquanto o genoma essencialmente esttico e no muda de uma clula para outra de um mesmo organismo, o proteoma altamente dinmico e dependente do estado da clula (GODOVAC-ZIMMERMANN; BROWN, 2001). Entretanto, a complexidade do proteoma no se explica apenas pelo nmero de

protenas, mas tambm, devido s inmeras possibilidades de interaes protena-protena e modificaes ps-traducionais (PTMs), as quais apresentam um papel importante na funo das protenas (JENSEN et al., 2002). Tal

complexidade, fez necessria a introduo de outros processos, como sub-fracionamento da amostra ou imunoprecipitao de protenas, dando origem ao termo - subproteoma - (SEM, 2007), o qual descreve um grupo especfico de protenas de um proteoma total, por exemplo: fosfoproteoma (conjunto de protena fosforiladas); glicoproteoma

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(protenas glicosiladas), ou ainda o proteoma de organelas celulares de interesse, tais como: ncleo, membrana, mitocndria e outros. Atualmente, denominaes com o sufixo mica - tm proliferado para designar a descrio em larga escala de um grupo de diferentes molculas, tais como: metaboloma, usado para uma coleo de metablitos produzidos em um determinado momento fisiolgico (PSYCHOGIOS et al., 2011); interactoma, que descreve as interaes de uma protena com as demais (CUSICK et al., 2005) e secretoma, para protenas secretadas (WEBER et al., 2012). Muitas tcnicas empregadas em protemica tm como foco a identificao de biomarcadores, outras tm potencial para automao e utilizao na rotina clnica com propsito diagnstico e permitem a anlise de inmeros tipos de amostras e de alteraes no perfil de expresso proteica associada a uma doena. De maneira geral, as metodologias empregadas em protemica (Figura 1) envolvem a extrao das protenas da amostra, separao por eletroforese uni (SDS-PAGE) ou bidimensional (2D-PAGE) e/ou cromatografia liquida (LC), seguida de anlise por espectrometria de massas (MS). A MS uma tcnica analtica que permite separar partculas de diferente relao massa-carga (m/z) em uma mistura complexa, muito utilizada em abordagens protemicas, aplicadas em larga escala, para identificar

2012). Assim, a aplicao das tcnicas protemicas representa uma importante etapa na expanso do conhecimento sobre a fisiopatologia das alteraes hematolgicas (LIUMBRUNO et al., 2010), bem como dos processos e vias metablicas

(COLLAND et al., 2004; MAY et al., 2011). No presente artigo feita uma reviso das aplicaes da protemica no campo da

hematologia, incluindo os resultados obtidos nas reas da protemica clnica, medicina transfusional e farmacoprotemica.

protenas expressas por um genoma, clula, tecido ou organismo (SCHUBERT et al., 2006). Nos ltimos anos, muitas questes importantes, referentes aos processos biolgicos e mecanismos bioqumicos, tm sido respondidas com auxlio da protemica e centenas de biomarcadores

candidatos j foram descritos (CHEN et al., 2012; KRUGER et al., 2013; LEE et al., 2012; PENNO; ERNST; HOFFMANN, 2012; WHEELOCK et

Figura 1- Viso geral das metodologias empregadas em protemica. A separao das protenas de uma amostra complexa pode ser realizada por diferentes tcnicas acopladas espectrometria de massas (MS). As tcnicas mais comumente utilizadas envolvem separao eletrofortica unidimensional (SDS-PAGE) ou bidimensional (2D-PAGE), bem como a cromatografia lquida (LC). A identificao das protenas pode ser realizada pelo software Mascot, atravs de dois mtodos: o PMF (do ingls: peptide mass fingerprint) ou o MS/MS. No PMF, o Mascot compara o padro de digesto ou PMF da protena que queremos identificar com os gerados teoricamente para todas as sequncias de protenas depositadas nos bancos de dados disponveis on line. Enquanto que, o MS/MS realiza o sequenciamento e identificao dos aminocidos que compem pequenas regies dos peptdeos detectados. O conjunto de todas as protenas identificadas constitui o Proteoma da amostra analisada.

Protemica Clnica A busca por marcadores moleculares que auxiliem no diagnstico e tratamento de doenas

al., 2013; ZHANG et al., 2012; ZHENG et al.,

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humanas, incluindo as neoplasias hematolgicas, tem focado na anlise protemica de amostras biolgicas, objetivando identificar alteraes no padro proteico associado a uma doena. Esse novo ramo da medicina foi recentemente

mltiplos marcadores foi sugerido como um mtodo eficiente e sensvel de aplicao da protemica clnica para o diagnstico

hematolgico. Recentemente, foi publicada uma reviso mostrando um grupo de 21 protenas candidatas a biomarcadores da DECH,

denominado de Protemica Clnica (KAMPER et al., 2011; LION; TISSOT, 2008;

identificadas por metodologias protemicas ou imunooensaios (PACZESNY, 2013), chamando a

YUDITSKAYA; SUFFREDINI; KATO, 2010). Biomarcador ou marcador biolgico foi

ateno para a importncia das pesquisas nessa rea. Outro exemplo importante, foi a descrio de um biomarcador para o diagnstico diferencial do Linfoma de Hodgkin Clssico dos demais

definido como uma caracterstica que pode ser medida experimentalmente e indica a ocorrncia de uma determinada funo normal ou patolgica de um organismo ou uma resposta a um agente farmacolgico 2001). Em (FOLLEN; suma, tipo SCHOTTENFELD, trs tipos de de

linfomas, a protena ligadora de galactina 1 (Gal-1) (KAMPER et al., 2011). Os autores descrevem que a superexpresso da Gal-1 est tambm associada ao mal prognstico, bem como na refratariedade ao tratamento, nessa doena. Os eritrcitos (do ingls: RBC, red blood cells) circulam no sangue, durante 120 dias, em contato com uma variedade de outras clulas e substncias. Portanto, muitas alteraes nos RBCs podem resultar da interao dos mesmos com protenas plasmticas, drogas ou substncias secretadas por clulas ativadas. A membrana eritrocitria contm protenas do citoesqueleto e protenas integrais, imersas na bicamada lipdica, todas importantes para a manuteno da integridade e forma celular. Defeitos nas protenas do citoesqueleto levam a alteraes na forma e fragilidade osmtica dos RBCs (DELAUNAY, 2004;2007; PERRIN et al., 2006). O primeiro estudo envolvendo proteoma dos eritrcitos foi realizado por Low et al (LOW; SEOW; CHUNG, 2002) e descreveram 84 diferentes protenas de membrana dos RBCs por MALDI TOF MS/MS (do ingls: matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry). Atualmente, o proteoma das clulas vermelhas do sangue 750 humano protenas apresenta descritas

existem zero,

biomarcadores:

biomarcadores

doenas, que indicam determinadas patologias; tipo 1, biomarcadores usados pra detectar o efeito de uma droga; e o tipo 2, com aplicao em ensaios clnicos (PACZESNY, 2013). Dentre as abordagens protemicas utilizadas na busca de biomarcadores, podemos citar um trabalho

realizado por Bassim et al (BASSIM et al., 2012), o qual utilizando LC-MS/MS, os autores avaliaram amostras de saliva de pacientes com Doena do Enxerto Contra o Hospedeiro, tambm conhecida como DECH ou GVHD (do ingls: graft-versushost disease), uma complicao comum aps o transplante de medula ssea (TMO) alognico. Esse estudo permitiu a identificao de um padro proteico na DECH, caracterizado pela reduo na expresso de duas protenas, a lactotransferrina e a lactoperoxidase. Os autores sugerem que essa metodologia pode ser aplicada como um teste no invasivo para deteco precoce, rastreamento e acompanhemento da DEHC, em larga escala, nos pacientes aps TMO alognico. Uma abordagem semelhante j havia sido descrita para deteco de DEHC em amostras de urinas (WEISSINGER et al., 2005), onde um modelo de painel com

aproximadamente

(GOODMAN et al., 2007). A partir da descrio

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do proteoma dos eritrcitos normais, possvel avaliar as alteraes que ocorrem nas protenas de membrana dos eritrcitos nas doenas

dissulfetos a glicoprotena GPIb, um componente central do complexo GPIb-IX-V, receptor do Fator de von Willebrand (FVW) que medeia a ativao e adeso plaquetria. Embora, sabe-se que GPI regulada negativamente por quinases A e G (PKA e PKG), no havia sido descrito que GPI pudesse ser alvo de fosforilao. O processo de inibio da GPI no regulado pelas PKA e PKG, assim os autores supem que outro tipo de quinase possa desempenhar um papel importante no processo de regulao da adeso plaquetria. Vrios autores tm dispensado esforos no sentido de entender como os mecanismos de modificaes pstraducionais (PTMs) tais como fosforilaes (ZAHEDI et al., 2008) e glicosilaes

hematolgicas, como por exemplo, na anemia falciforme (YUDITSKAYA et al., 2010) ou na esferocitose hereditria (POLPRASERT;

CHIANGJONG; THONGBOONKERD, 2012). Um reviso dos artigos publicados sobre

protemica envolvendo os eritrcitos e plasma de paciente com doena falciforme, descreve a ativao de protenas antioxidantes, aumento dos defeitos nas protenas do citoesqueleto, bem como aumento das protenas do reparo e desregulao das apolipoprotenas, como achados importantes e associados aos portadores de hemoglobina S (HbS) (YUDITSKAYA et al., 2010). Um estudo

(LEWANDROWSKI et al., 2007) podem modular as funes das protenas et eritrocitrias al., e

realizado por Yuditskaya et al (YUDITSKAYA et al., 2009) mostrou evidncias que a deficincia nos nveis de ApoA-1 predispe o desenvolvimento da hipertenso pulmonar arterial (HPA) em pacientes com doena falciforme. Esse achado representa um possvel alvo teraputico, onde o aumento nos nveis de ApoA-1 poderiam prevenir complicaes e aumentar a qualidade de vida desses pacientes. Os autores sugerem ainda, que os nveis baixos de ApoA-1 possam predispor outras complicaes vasculares comuns na doena falciforme, como o priapismo e a lcera cutnea de perna. Com

plaquetrias

(DITTRICH

2005;

GOODMAN et al., 2007). A prpura trombocitopnica idioptica (PTI) uma patologia adquirida que leva reduo da contagem de plaquetas, mediada por mecanismo imunolgico. O tratamento inicial a

corticoterapia e, se caracterizada a falncia ou dependncia desta, a esplenectomia a segunda opo. Zheng et al (ZHENG et al., 2012) analisaram amostras de soro de pacientes com PTI, os resultados indicaram que o nvel de

relao esferocitose hereditria, o defeito mais comum observado num grupo de 300 pacientes, foi a deficincia de uma protena transmembrana, denominada de protena banda-3 (POLPRASERT et al., 2012). Atualmente, j existe descrio de 1.200 protenas plaquetrias (COPPINGER et al., 2004; GEVAERT et al., 2003; MCREDMOND et al., 2004; MOEBIUS et al., 2005). Zahedi et al.

haptoglobina srica pode ser utilizado como um indicador da eficcia da esplenectomia nesses pacientes.

Medicina Protemica

Transfusional

na

era

da

Esse tpico descreve como as abordagens protemicas tm contribudo na questo do controle de qualidade dos processos de obteno e estocagem de hemocomponentes e hemoderivados. O concentrado de hemcias (CH) o

(2008) recentemente identificaram um novo stio de fosforilao na GPI (24), a qual juntamente com GPI so covalentemente ligadas por pontes

hemocomponente

mundialmente

mais

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transfundido, seguido do concentrado de plaquetas (CP) e plasma fresco congelado (PFC)

(22C). Atualmente, a qualidade dos concentrados de plaquetas determinada in vitro pela anlise da morfologia plaquetria, pH e pelo teste de

(D'ALESSANDRO; ZOLLA, 2010). Alguns protemicas trabalhos no aplicando de metodologias qualidade de

agregao plaquetria ou citometria de fluxo para avaliar a funo 2005). (CARDIGAN; Embora TURNER; existam

controle

hemocomponentes tm sido publicados, incluindo plasma (ISSAQ; XIAO; VEENSTRA, 2007), hemcias (PASINI et al., 2006) e plaquetas (PERROTTA; BAHOU, 2004; THIELE et al.,

HARRISON,

ainda

limitaes com relao s anlises de morfologia e funo das plaquetas mantidas sob estocagem (THIELE et al., 2007). Wurtz et al (WURTZ et al., 2007) e Glenister et al (GLENISTER; PAYNE; SPARROW, 2008) comparam os efeitos da estocagem em concentrados de plaquetas

2010). Um estudo coordenado por Springer et al (2009) mostrou uma diferena marcante no perfil protemico das plaquetas de pacientes com Diabetes tipo II em relao s plaquetas de doadores de sangue saudveis, bem como

randomizados e obtidos por afrese. O primeiro grupo descobriu que os nveis de fator plaquetrio 4 (PF4) e -tromboglobulina (-TG) so maiores nos concentrados de plaquetas obtidos por afrese. Essas protenas so encontradas nos -grnulos secretados aps ativao plaquetria (BLAIR; FLAUMENHAFT, 2009). Portanto, os autores sugerem que o mtodo de coleta por afrese, o qual apresentou maior quantidade das protenas plasmticas PF4 e -TG, possa produzir uma maior ativao das plaquetas durante a estocagem. No mesmo trabalho, Wurtz et al (WURTZ et al., 2007) descrevem a utilizao de um teste que combina esferas magnticas (ClinProt, Bruker Daltonik, Daltonik, plaquetrias Germany) Germany) causadas e LC-MS/MS detectar Bruker leses Os

diferentes efeitos da estocagem. Foram descritas 122 protenas diferencialmente expressas (do total de 844 analisadas) no grupo de pacientes diabticos. Os autores sugerem que os achados indicam a necessidade de aprofundar as anlises de adequabilidade da doao de plaquetas pelos diabticos, uma vez que essas plaquetas

envelhecem e ativam mais rapidamente durante a estocagem (SPRINGER et al., 2009). A deteco da ativao plaquetria pode avaliar precocemente as alteraes que iro influir na viabilidade das plaquetas durante o perodo de estocagem

(TYNNGARD, 2009). Resultados semelhantes tm sido descritos para plaquetas doadas por

para pela

voluntrios hipertensos tratados com antagonista do receptor de angiotensina II (SACRISTAN et al., 2008). Esses achados so de extrema importncia, uma vez que esses pacientes, diabticos e hipertensos, quando oportunamente tratados so aceitos como doadores de plaquetas, embora a funo hemosttica possa estar comprometida (D'ALESSANDRO; ZOLLA, 2010). Comparado com os demais hemocomponentes, os CPs apresentam um risco maior de

estocagem.

sobrenadantes de plaquetas estocadas foram submetidos ao teste, o qual foi capaz de identificar picos em 7807 e 9347 m/z, correspondentes s protenas plasmticas PF4 e a -TG,

respectivamente (WURTZ et al., 2007). Uma vez coletados, os concentrados de plaquetas podem ser submetidos leucorreduo com a finalidade de amenizar a ocorrncia de complicaes transfusionais, tais como: reao transfusional aloimunizao febril no-hemoltica antgenos (RTFNH), leucocitrios

contaminao bacteriana durante a estocagem, uma vez que so mantidos a temperatura ambiente

contra

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humanos (HLA), refratariedade plaquetria e preveno de infeces transmitidas por leuccitos (CMV, HTLV e Creutzfeldt Jacob) (SHARMA; MARWAHA, 2010). Nesse sentido, Ryu et al

so exemplos que ilustram a necessidade de implantao de medidas de controle que previnam a transmisso de patgenos via transfuso de hemocomponentes (KLEIN, 2005). As tcnicas disponveis para inativao de patgenos so: azul de metileno (SOLHEIM, 2008), solventes

analisou o filtrado de concentrados de plaquetas aps 24 e 120 horas de estocagem. Os resultados mostraram que o nmero de spots/protenas, no sobrenadante, aumentou com a estocagem e diminuiu com a filtrao. Em particular, a quimiocina CXCL2 (protena inflamatria de macrfago), fator estimulador e de IL-22, colnias foram

(SOLHEIM, 2008), irradiao (pra preveno de TRALI) (SELTSAM; MULLER, 2011), incluindo o Intercept blood system (INFANTI et al., 2011), e mais recentemente o tratamento com vitamina B12 (riboflavina) (MARSCHNER; GOODRICH,

megacarioctico protenas que

(Meg-CSF) exibiram

2011). Porm, esses mtodos alm da reduo de agentes patognicos podem resultar na reduo de atividade dos factores da coagulao (SOLHEIM, 2008). Em Medicina Transfusional,

maiores

alteraes,

corroborando com a importncia da utilizao do procedimento de leucorreduo. A leucorreduo no um procedimento valioso apenas para concentrados de plaquetas, mas tambm durante a preparao de concentrados de hemcias.

incompatibilidades entre doadores e receptores, com relao aos antgenos plaquetrios humanos (HPAs), podem causar refratariedade plaquetria e prpura ps-transfuso (ROSENBERG; DARDIK, 2006). Em 2009, Garritsen et al (GARRITSEN et al., 2009) utilizando metodologia MALDI-TOFMS (SAUER et al., 2002; SAUER; GUT, 2002) validaram uma tcnica de genotipagem de

Resultados similares foram observados por Annis et al (ANNISS et al., 2005), onde os autores demonstraram que o sobrenadante de CH no leucorreduzido apresentou um acmulo de

protenas com atividade imunognicas e prinflamatrias, entre elas um promotor da adeso de neutrfilos e uma protena de fase aguda. As condies de estocagem de CHs, sob condies de aerobiose e anaerobiose, foram avaliados por D'Amici et al (D'AMICI;

antgenos plaquetrios humanos (HPAs), a qual se mostrou vantajosa em comparao com os mtodos convencionais, tais como rapidez,

acmulo de grande quantidade de dados, anlise combinada de seis lcus (HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4, HPA-5, e HPA-15) em uma nica reao e alta preciso, permitindo o uso desta tcnica em larga escala.

TIMPERIO; ZOLLA, 2008). O estresse oxidativo foi a principal causa das alteraes nas protenas das hemcias estocadas. Os achados sugerem que a deprivao de oxignio durante a estocagem protege as protenas eritrocitrias contra a

degradao. Outra aplicao da protemica no

Farmacoprotemica O termo farmacoprotemica utilizadas engloba para a

monitoramento dos efeitos da inativao de patgenos sobre a integridade das protenas plasmticas, presentes nos Plasmas Frescos

ferramentas

protemicas

descoberta e o desenvolvimento de novas drogas e seus mecanismos de ao (HESS, 2013; JAIN, 2004), bem como para avaliar a resposta celular a

Congelados (PFCs). Os prons causadores da variante da Doena de Creutzfeldt-Jakob (vCJD)

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uma

determinada

droga

ou

frmaco

A protemica tem sido usada para estudar os mecanismos de resistncia em pacientes

(SAMINATHAN et al., 2010). Um estudo combinando tcnicas genmicas e protemicas avaliou alteraes no perfil de protenas plasmticas em pacientes tratados com anticoagulante oral (SAMINATHAN et al., 2010). Os autores identificaram altos nveis de

intolerantes aos inibidores da tirosino-quinase (imatinibe) (PIZZATTI et al., 2012). A

identificao de protenas expressas no plasma obtido da medula ssea de pacientes no

responsivos ao imatinibe, revelou a existncia de regulao da via de sinalizao WNT, com ativao de Wnt1 e Wnt5a. A ativao constitutiva da sinalizao WNT considerada um evento inicial necessrio na gnese da maioria das neoplasias (KATOH, 2005). Portanto, os autores sugerem que esses achados possam estar

transtirretina (TTR) no soro dos pacientes que receberam dosagens baixas de warfarina, mas no aqueles tratados com doses elevadas do

anticoagulante. Na anemia falciforme (AF), as hemcias falciformes, ou drepancitos, aderem ao endotlio via fosfatidil-serina (PS), aspecto clinicamente relevante, o qual est associado s crises de vasooclusivas. Sabemos que os nveis de PS na superfcie celular dos drepancitos so cerca de cinco vezes maior que nos eritrcitos normais, efeito induzido pela liberao de leucotrienos seguido pela ativao da 5-lipoxigenase

contribuindo para a resistncia ao tratamento com os inibidores da tirosina-quinase no grupo de pacientes avaliados (PIZZATTI et al., 2012). Recentemente, a protemica foi tambm descrita como uma metodologia eficiente para a caracterizao inibidores da do mecanismo de os ao quais dos se

tirosina-quinase,

(HAYNES et al., 2006).

A hidroxiuria, um

mostraram capazes de induzir a apoptose das clulas BCR-ABL positivas (BALABANOV et al., 2013).

medicamento utilizado na preveno das crises vaso-oclusivas da AF, e que induz um aumento nos nveis de Hemoglobina F (HbF), parece atenuar a expresso de PS na superfcie das hemcias falcizadas e diminui a adeso ao endotlio vascular (HAYNES et al., 2008). Hidroxiuria, evidentemente induz outros efeitos, independente do aumento da HbF, tais como aumento da expresso de protenas envolvidas na proteo contra estresse oxidativo (GHATPANDE et al., 2008;2010) e protenas da via glicoltica, como GAPDH e aldolase (HRYNIEWICZ-

CONSIDERAES FINAIS A protemica tem provado ser uma ferramenta poderosa para anlise de hemocomponentes e derivados do sangue. Portanto, abordagens

protemicas esto cada vez mais sendo aplicadas na medicina transfusional. Os resultados podem fornecer dados clnicos relevantes para o aumento da segurana e eficcia transfusional, bem como, para aprimorar os mtodos de estocagem desses produtos. A rea da medicina transfusional descata-se como uma das reas mais promissoras para aplicao da protemica. Nesse sentido, a protemica e medicina transfusional aparecem como disciplinas complementares, e uma aliana entre os pesquisadores de ambas as reas se faz

JANKOWSKA et al., 2009). Enzimas da via glicoltica so conhecidas por serem reguladas pelo fator 1 induzvel por hipxia (HIF-1)(KALUZ; KALUZOVA; STANBRIDGE, 2008), o qual um regulador central da resposta mudanas na concentrao de oxignio.

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necessrio, objetivando aprimorar os mtodos de obteno e manuteno dos hemocomponentes. Ao passo que, a protemica clnica introduz uma nova perspectiva na gerao de

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diferencialmente expressas nos tecidos doentes possa representar importantes indicadores

moleculares, existem vrios desafios tcnicos para o desenvolvimento de testes clnicos. Portanto, dificilmente um marcador isolado ter

sensibilidade e especificidade suficientes para a predio ou diagnstico, e provavelmente, sero necessrios painis de protenas associadas a condies especficas. Sendo assim, as pesquisas com objetivo de buscar biomarcadores, ainda precisam percorrer um longo caminho at que possam efetivamente apresentar aplicaes

clnicas. Entretanto, estudos tm dispensado esforos nesse sentido, e esperamos que no futuro breve, a protemica possa contribuir para a melhoria do diagnstico e tratamento dos pacientes hematolgicos.

AGRADECIMENTOS A autora agradece aos colegas farmacuticos bioqumicos, Cludio Brando e Janaina Lauxen Negri pelas valiosas sugestes na leitura da verso final do artigo.

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