ANTEPROYECTO DE MICROBIOLOGIA

I. GENERALIDADES 1.1 Ttulo: Obtencin de Hidrogeno a partir de Escherichia coli y Klebsiella sp. 1.2 Personal Investigador 1.2.1 Autores: Acedo Lazo, Steve Vladimir Ipanaqu Ballesteros, Jonathan Jurez Lpez, Luis Enrique Maldonado Cunyarache, William 1.3 Tipo De Investigacin 1.3.1 De acuerdo al objetivo: Bsico 1.3.2 de acuerdo a la tcnica: Experimental 1.4 rea del Proyecto Curso : Microbiologa

Facultad: Ciencias Escuela : Escuela Profesional de Biologa 1.5 Ubicacin e Institucin donde se desarrollar el proyecto 1.5.1 Ubicacin: Piura. 1.5.2 Institucin: Laboratorio de la escuela profesional de Biologa de la facultad de ciencias de la UNP.

1.6 Tiempo que durar el proyecto: 02 meses 1.7 Fecha de inicio y trmino: 1.7.1 Inicio 1.7.2 Trmino : 09 de diciembre del 2010 : 09 de febrero del 2011

1.8 Horas dedicadas al proyecto: 10 horas semanales 1.8 Cronograma del trabajo PROYECTO FECHA Diciembre S2 X X X X X X X X X X X X X X X X S3 X S4 X S1 X Enero S2 X S3 X S4 X Febrero S1 X S2 X

PROCEDIMIENTO Revisin bibliogrfica Entrega de anteproyecto Toma de muestras Anlisis de muestras Anlisis de los resultados Informes parciales Presentacin del informe final Sustentacin del TEA

1.10 Presupuesto: 1.10.1 Recursos Disponibles: 1.10.1.1 Personal Autores Asesor

1.10.1.2 Equipos y Materiales Computadora Pentium IV Samsung Cmara Digital USB Kingston Impresora Hp Microscopio Autoclave Horno microbiolgico Equipo de bao mara Cocina elctrica Licuadora Estufa Matraz erlenmeyer Pipetas Asas de koll Mechero Tubos de ensayo Placas petri Cooller

1.10.2 Recursos no disponibles 1.10.2.1 Equipos y materiales: 100 hojas Dina A-4 01 marcador indeleble 01 CD para la sustentacin 02 Flder Manila 01 alcohol 01 algodn 06 litros de agua destilada 01cojin de leja 01 detergente 04 frascos de vidrio 06 viales s/. 3.00 s/. 2.00 s/. 1.00 s/. 1.20 s/. 6.00 s/. 1.00 s/.12.00 s/. 1.00 s/. 1.00 s/. 4.00 s/. 2.00

1.10.3 Otros servicios de terceros

Fotosttica Impresiones Tipeo Alquiler de Can Multimedia

s/. 5.00 s/. 10.00 s/. 10.00 s/. 10.00

Resumen Recursos no disponibles : Servicios de terceros : s/. 87.20 s/. 35.00

TOTAL

s/. 159.20

II. Plan de investigacin 2.1.- Antecedentes

Para que sea posible tener en el futuro una economa basada en el hidrgeno necesitaremos un modo de producirlo en cantidades abundantes y de manera segura y rentable. Hacer viable el uso del hidrgeno como una futura fuente de combustible resulta apremiante dada la disminucin de los suministros de petrleo y gas natural, as como la escalada en sus costos y el hecho de que al quemar combustibles fsiles se liberan en la atmsfera grandes cantidades de dixido de carbono, un gas de efecto invernadero. ( Por el contrario, al quemar hidrgeno gaseoso (por ejemplo, en una clula de combustible) no se produce contaminacin. El hidrgeno, uno de los componentes del agua, es muy abundante. Sin embargo, encontrar mtodos simples y baratos de extraer ese elemento abundante y producirlo en su forma gaseosa pura, un paso crucial para hacer realidad esa "economa del hidrgeno", ha constituido un desafo tecnolgico. ( En montajes experimentales utilizando bacterias Thermatoga neapolitana, con alimentacin con glucosa simple como materia prima, y stas generaron copiosas cantidades de gas hidrgeno a temperaturas entre 70 y 85 grados Celsius, y a presin atmosfrica normal o ms elevada. Un hallazgo significativo fue que la Thermatoga neapolitana produce el hidrgeno con plena eficacia en un ambiente moderadamente bajo de oxgeno. Con anterioridad, la produccin de hidrgeno utilizando bacterias slo se haba conocido bajo condiciones anaerobias, o sea, libres de oxgeno. (

El oxgeno normalmente mata a los microbios anaerobios como la Thermatoga neapolitana. Esto sera un problema para cualquier medio de produccin prctica fuera del laboratorio, pues resultara muy caro eliminar todo el oxgeno de las lneas de produccin. Esta investigacin proporciona la primera evidencia de que las bacterias pueden producir eficazmente el gas hidrgeno estando presente el oxgeno.(Jaramillo, 2004)

El hidrgeno es un combustible muy prometedor ya que su combustin es limpia (genera agua), tiene alto contenido energtico y su utilizacin es muy verstil, por lo cual es considerado el combustible del futuro. A diferencia de otros combustibles, el H2 no esta disponible como tal en la naturaleza, por lo tanto hay que sintetizarlo a partir de compuestos con hidrgeno como el agua o la materia orgnica. (Hawkes et al, 2002) La produccin de hidrgeno puede ser llevada a cabo a partir de combustibles fsiles, de biomasa y del agua ya sea por procesos qumicos,

fsicos o biolgicos. Los procesos biolgicos tienen la ventaja de ser energticamente menos costosos ya que no es necesario agregar energa para su obtencin. (Schreder; Scholz, 2003). La produccin biolgica de hidrgeno se debe principalmente a la presencia en las clulas de enzimas como la hidrogenasa y la nitrogenasa. La Hidrogenasa est ampliamente distribuida en los microorganismos anaerbicos. Esta tiene diversos orgenes filogenticos y produce el hidrgeno tanto irreversible como reversiblemente, dependiendo de las condiciones medio ambientales en las que se encuentre (Bedoya et al, 2008). Se han realizado numerosos estudios a nivel molecular con estas enzimas para el mejoramiento de la produccin de hidrgeno. Adems, se han llevado a cabo estudios estequiomtricos en diversos microorganismos, con el fin de aclarar las vas metablicas utilizadas en la produccin de hidrgeno. Es comn el estudio en especies del gnero Clostridium para determinar los rendimientos mximos tericos de la conversin de glucosa en hidrgeno en condiciones anaerobias (Bedoya et al, 2008). Tambin se han hecho estudios sobre Klebsiella pneumoniae, un microorganismo anaerobio facultativo capaz de producir hidrgeno en cantidades significativas involucrando en su metabolismo tanto la hidrogenasa como la nitrogenasa. En las posibles rutas metablicas para la produccin de hidrgeno en Klebsiella pneumoniae a partir de glucosa el rompimiento del acetil-CoA es catalizado por dos enzimas llamadas piruvato-formiato-liasa y piruvato-deshidrogenasa (Bedoya et al, 2008). Con Escherichia coli se ha demostrado la produccin de hidrgeno a partir de formiato en anaerobiosis debido a su actividad formiatohidrogeno-liasa (Bedoya et al, 2008). Los distintos parmetros y condiciones de operacin (principalmente pH, HRT, presin parcial de hidrgeno y CO2, subproductos, temperatura, concentracin inicial de sustrato, edad y volumen del inoculo, etc.) deben ser controlados durante el proceso de fermentacin oscura, pues estos pueden afectar directamente la eficiencia de produccin, el contenido del biogs, el tipo de cidos producidos y la rata especfica de produccin de hidrgeno (Bedoya et al, 2008). As como el nitrgeno y el fosforo son muy importantes en la produccin de hidrgeno, el azufre y el hierro son componentes esenciales en la produccin de las hidrogenasas, las cuales son las encargadas de

generar el hidrgeno. Se ha visto tambin que la limitacin de hierro en el medio promueve la formacin de metabolitos no asociados al metabolismo del hidrgeno, obtenindose menor produccin de hidrgeno. Segn esto, se deben determinar las cantidades necesarias de nutrientes inorgnicos y de otros elementos traza para lograr una eficiente produccin de hidrgeno a diferente condiciones (Bedoya et al, 2008).

2.2 Justificacin: El presente trabajo se basa en el aprovechamiento de Escherichia coli y Klebsiella sp para produccin de hidrogeno como biocombustible a partir de la fermentacin acido mixta de carbohidratos; utilizando un medio sinttico enriquecido con fuentes de glucosa y compuestos tales como Fe+2, PO-4, S, etc. La produccin de este biocombustible contribuye enormemente a la conservacin ambiental ya que es un gas no contaminante; a diferencia de los combustibles fsiles. 2.3 Problema Cmo se obtiene el hidrogeno a partir de un cultivo de Escherichia coli y Klebsiella sp?

2.4 Hiptesis Escherichia coli y Klebsiella sp producen hidrogeno a partir de medios selectivos. 2.5 Objetivos Demostrar la obtencin de Hidrogeno a partir de Escherichia coli y Klebsiella sp. 2.6 Metodologa 1. Obtencin de la Cepa

Las cepas

que se utilizaran: Escherichia coli y Klebsiella sp sern laboratorio de microbiologa, las cuales se

proporcionadas por el

caracterizan por producir gran cantidad de gas en medio TSI. 2. Reactivacin de la Cepa Cada cepa ser reactivada en 6 ml de caldo nutritivo (Anexo 01), e incubada por 24 48 horas a 35.5C. Posteriormente se comparar cada cultivo bacteriano reactivado con tubos de Mc Farland, para ver la densidad microbiana. 3. Produccin de gas Para saber que tan eficientes son los dos tipos de bacterias para producir gas, se elaboraran dos sistemas. Primero: En dos botellas pequeas de vidrio se colocaran 45 ml. de caldo Mc Conkey (Anexo 02); una vez estriles en la autoclave por 15min a 120C con 151b de presin, se inocular 5ml. de cada bacteria (E. coli y Klebsiella sp) a cada botella por separado, se homogenizarn y se extraer 1 ml de cada

preparado para medir el pH y Temperatura. Posteriormente se colocar un globo en el pico de la botella y se sellar los bordes con cinta de empaque. Se incubar por 10 das a temperatura ambiente. Segundo: En dos botellas pequeas de vidrio se colocaran 45 ml. de un medio sinttico (Anexo 03); una vez estriles en la autoclave por 15min a 120C con 151b de presin, se inocular 5ml. de cada bacteria (E. coli y Klebsiella sp) a cada botella por separado, se homogenizarn y se extraer 1 ml de cada

preparado para medir el pH y Temperatura. Posteriormente se colocar un globo en el pico de la botella y se sellar los bordes

con cinta de empaque. Se incubar por 10 das temperatura ambiente. Referencias Bibliogrficas

Jaramillo, J. 2004. Biologia para el aceso a ciclos superiors formatives. Edit. Mad. S.L. Mexico Hawkes F., Dinsdale R., Hawkes D., Hussy I. (2002) Sustainable fermentative hydrogen production: challenges for process optimization. Int Journal of Hydrogen Energy 27:1339-1347.

Schrder U, Scholz F. (2003) Bacterial batteries. Nature Biotechnology.; 21(10): 1151-1152.

Bedoya, A; Castrilln, J; Ramirez, J; Vsquez, J y Mario, Z. 2008. Produccin Biolgica de Hidrgeno: Una Aproximacin al Estado del Arte. Universidad Nacional de Colombia Medelln. Disponible en URL:

http://redalyc.uaemex.mx.

http://www.solociencia.com/biologia/06102301.htm

ANEXOS

Anexo 01

Composicin de CALDO NUTRITIVO Peptona.

5.00 g

Extracto de Carne. 1.00 g Extracto de Levadura... 2.00 g Cloruro de Sodio. Agua destilada 5.00 g 1000 ml

Anexo 02

Composicin de AGAR Mc CONKEY Peptona. 20.00 g Lactosa. 10.00 g Sales Biliares.... Cloruro de Sodio. Rojo Neutro. Cristal Violeta. Agar Agar Agua destilada 1.50 g 5.00 g 0.050 g 0.001 g 15.00 g 1000 ml

Anexo 03

Composicin del MEDIO SINTTICO Glucosa NH4HPO-4... NH4H2PO4 ..... KH2PO4.. MgSO4.7H2O MgSO4.4H2O.. FeCl2... NaCl K2HPO-4.. Agua destilada

10.000 g 5.000 g 2.000 g 5.000 g 0.200 g 0.020 g 0.005 g 5.000 g 0.200 g 1000 ml