PRÁCTICA # 2 “MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO” INTRODUCCIÓN:

El microscopio es, sin lugar a dudas, el instrumento más importante en el

laboratorio microbiológico. Se usa para aumentar el tamaño de la imagen aparente
de los objetos, lo cuál hace posible ver los detalles estructurales de los
microorganismos. Sus antecedentes más notables se remontan al s. XVII cuando
Anthony Van Leewenhoek (Delft, Holanda, 1632 – 1723), reporta lo siguiente en una
de las cartas que dirigió a la “British Royal Society” : “ En el año de 1675,
descubrí criaturas vivientes en agua de lluvia que había permoneado sólo unos días
en un recipiente… esto me invitó a observar más atentamente el agua, especialmente
los pequeños animalejos que me parecían diez mil veces más pequeños que aquellos
que pueden percibirse en el agua a simple vista”. Leewenhoek observó, entre otras
cosas, bacterias y protozoarios en el agua de la lluvia, en infusiones diversas y
en su sarro dental. Sus descripciones son, hasta la fecha excelentes y fácilmente
reconocibles. El estudio microscópico de los organismos proporciona datos
fundamentales para su identificación, como forma, tamaño, reacción a diferentes
colorantes y estructuras celulares; orienta al microbiólogo cuando trata de aislar
microorganismos y permite establecer características como pureza, presencia de
contaminantes, variedad o edad de una población entre otras cosas. Por ello es tan
importante saber utilizar este instrumento y desde luego, cuidarlo adecuadamente.
Para ello, en esta practica se incluye la descripción de los componentes de un
microscopio compuesto y las funciones de cada uno de ellos; asimismo. Se describen
las características de las lentes amplificadoras y las condiciones en las que se
puede utilizar cada objetivo, así como los pasos que se deben seguir para
establecer una iluminación adecuada, el enfoque correcto y la forma precisa de
manejar el microscopio.

OBJETIVOS:
Mediante esta practica, el alumno lograra: ℘ ℘ ℘ ℘ ℘ identificar cada una de las
partes de el microscopio iluminar correctamente el microscopio óptico de campo
claro enfocar adecuadamente el microscopio en todos sus aumentos reportar
correctamente las observaciones microscópicas cuidar esmeradamente el microscopio
en todo momento, sobre todo, cuando lo utilice.

GENERALIDADES:

En la actualidad existen dos tipos de microscopia, según la forma en que se

amplifica la imagen: La microscopia óptica: en esta la imagen se amplifica
sucesivamente por una seria de lentes. Este sistema permite obtener aumentos de
100 a 1000 diámetros y en algunos casos, hasta 2000 según el tipo de luz que se
utilice y la forma de iluminar el objeto en estudio o preparación. Los
microscopios ópticos pueden ser de campo claro, de campo oscuro, de contraste de
fases, de fluorescencia y de ultravioleta. El de campo claro es el mas utilizado
para el estudio microbiológico en general. La microscopia electrónica: es aquella
en la cual la amplificación de la imagen se obtiene mediante un haz de electrones
(que sustituye la luz) y un campo magnético (que hace las veces de lentes) produce
imágenes con aumentos de 200000 a 400000 diámetros.

MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO: En la microscopia de campo claro, el campo

microscópico o área observada esta brillantemente iluminada y los objetos en
estudio aparecen más oscuros al fondo. Un microscopio óptico de fondo claro esta
integrado por un sistema óptico que permite iluminar el objeto en estudio y
amplificar su imagen, y un sistema mecánico que da soporte y movimiento a los
componentes ópticos, explicado de manera muy concisa, el fundamento de su
funcionamiento es el siguiente: la luz procedente de la lámpara y del condensador
atraviesa la preparación (en la cual se encuentra el objeto en estudio) y permite
que la primera lente (objetivo) forme una imagen aumentada de lo que hay en ella;
antes de ser vista, esta imagen es amplificada nuevamente por otra lente (ocular).
A continuación se describen brevemente las funciones de los componentes
fundamentales del microscopio:

1
°Base, °Tubo

soporte y cuerpo del tubo, sirven para mantener en posición a todos los
componentes del microscopio y son gruesos y fuertes, para disminuir la vibración.
intercambiable del microscopio: Se encuentra insertado en la parte superior del
cuerpo del tubo, soporta el ocular y permite alinearlo con el objetivo
seleccionado para una observación. sujetar la preparación y dos tornillos 3.1,
para desplazarla en sentido vertical y horizontal, lo que facilita la localización
del objeto y la revisión de la preparación.

°Platina: En ella se coloca la preparación o portaobjetos de estudio, la platina

esta equipada con pinzas para °Revólver: Es el disco que soporta a los objetivos y
se gira para colocar el objetivo requerido bajo el tubo. °Tornillo micrométrico o
de enfoque preciso: Con este se puede desplazar el tubo en forma más lenta, lo que
permite hacer los movimientos finos que se requieren para obtener el enfoque
exacto y preciso.

°Tornillo

macrométrico o de enfoque aproximado: Este permite desplazar el tubo del

microscopio (o ala platina en algunos modelos) acercando el objetivo a la
preparación, lo que permite localizar la imagen y lograr un enfoque aproximado.

Sistema óptico: Esta integrado por una fuente luminosa, una lente condensadora de
luz que la dirige hacia el espécimen y dos juegos de lentes que ayudan a la
amplificación de imagen. ° Interruptor

°Fuente de luz : Es una lámpara que se encuentra colocada debajo de el objeto y

emite la luz que pasa por el
condensador, para después iluminar la preparación, para regular la intensidad de
la luz algunos microscopios tienen integrado a la lámpara, un diafragma, el que se
abre o se cierra, en otros únicamente regula el voltaje. ° Diafragma de campo

°Condensador: Esta interpuesto entre la fuente de luz y la muestra, el condensador

recibe la luz de la lámpara,
rectifica los rayos de luz y los concentra o enfoca en un cono de luz sobre el
campo donde se sitúa la muestra, de tal manera que los rayos después de atravesar
la preparación, penetra a la lente de el objetivo con el mejor ángulo posible,
para ello el condensador se baja o se sube hasta alcanzar una posición que origine
un foco preciso. del diafragma iris, es posible controlar la cantidad de luz que
entra al condensador y regular el paso de la luz para dar nitidez a la imagen, el
propósito de el diafragma no es controlar la intensidad de la luz que llega al
objeto, sino asegurar que la que sale del condensador llene exactamente la lente
de el objetivo, si el diafragma es demasiado grande, parte de la luz pasara
alrededor del objeto y originara brillo reduciendo la claridad de la imagen. Son
las lentes que amplifican la imagen del campo del microscopio y por lo tanto, del
objeto en estudio, la mayoría de los microscopios tiene tres objetivos que
proporcionan diferentes aumentos, siendo los mas comunes el 10x, 40x, 90x y 100x ,
la lente de bajo poder de aumento abarca un campo microscópico con una superficie
mayor, se utiliza para localizar los objetos de interés y para seleccionar al
espécimen a observar, la lente de 40x permite la visualización detallada de
microorganismos grandes, como algas, protozoarios y hongos, la lente de 90x 0 100x
( que se emplea con aceite de inmersión ) se utiliza para observar bacterias o
microorganismos eucariontes pequeños. Cuando el microscopio es par focal, las
distintas lentes están ajustadas de tal manera que, al enfocar el espécimen con
una lente, así permanece al cambiar a otros objetivos, de esta manera se puede
enfocar con el objetivo de poco aumento y cambiar a los objetivos de mayos aumento
sin volver a enfocar o realizando ajustes menores. Esta lente amplifica aun más la
imagen procedente del objetivo y permite que el ojo la perciba, el ocular se
encuentra insertado en el tubo intercambiable.

°Diafragma Iris: Controla el diámetro del circulo de luz que sale de el sistema
condensador, al mover la palanca

°Objetivos:

°Ocular:

La función de los sistemas de lentes amplificadoras interpuestas entre la muestra

y el ojo (objetivo y ocular) consiste, en gran parte, en aumentar el ángulo
aparente que forman con el ojo los objetos que estas dentro del campo
microscópico. Para hacer una buena observación es muy importante que la imagen
aumentada no se encuentre distorsionada, de manera que retenga los detalles
esenciales del espécimen, en la microcopia óptica, especialmente en la de pequeño
aumento existen varios tipos de distorsiones que resultan de las propiedades de
las lentes por lo que, en los microscopios modernos, cada sistema de lentes
(condensador objetivo y ocular) consiste en un juego de varias lentes de diversas
formas y dimensiones, cuyo diseño permite corregir las distintas distorsiones, de
este modo la amplificación y la calidad de la imagen quedan determinadas por : ∼
las características y calidad de las lentes ∼ la longitud de onda de luz empleada
∼ el medio que atraviesa la luz antes de llegar al objetivo (aire, agua, aceité de
inmersión).

2
Estas a su vez determinan la capacidad amplificadora y el poder de resolución del
microscopio. En el ocular se indica su coeficiente de aumento individual, por
ejemplo 10x, que significa que su poder de aumento es 10 veces o 10 diámetros. En
el objetivo hay cuatro datos: 40 X = Coeficiente de aumento 0.65 = Apertura
numérico 160 = (Mm.) la longitud mecánica del tubo (medida desde la superficie de
la rosca del objetivo hasta la base del ocular) 0.17 = Requiere cubre ojos de
0.17mm. de espesor (cubreobjetos num. 1) En lugar de 0.l7 puede estar marcado: //0
/0.11 = Acepta cubreobjetos desde 0.17 (num. 1) a 0.22 (num. 2) de espesor = No
requiere cubreobjetos = 0.27 (Korr) es ajustable a los diferentes espesores de los
cubreobjetos (desde 0.11 hasta 0.27 mm. ).

Características del ocular y los objetivos: Los coeficientes de aumento de los

oculares y de los objetivos, permiten calcular el aumento total o capacidad
amplificadora de un microscopio, que es igual a: producto de los coeficientes de
aumento del ocular y del objetivo que se utilizan; por ejemplo: en un microscopio
con un ocular de 6x y objetivos de 10x y 40x y 100x, la imagen se amplifica 60,
240 y 600 veces respectivamente. Mediante la utilización de oculares con mayores
coeficientes de aumento, es posible obtener mayores amplificaciones de la imagen,
aunque esta tiene un límite al que se conoce como aumento útil de un microscopio.
El aumento útil del microscopio esta dado por las propiedades físicas de la luz
(que establecen el limite fijo de la amplificación efectiva) y una característica
del sistema de lentes, conocida como apertura numérica, las que en conjunto dan
lugar a una propiedad conocida como poder de resolución. Apoca resolución, las
estructuras se ven juntas, entre mayor es la resolución, mayor es el detalle con
que se observan. Resolución de dos puntos: El poder o límite de resolución de una
lente, corresponde a su capacidad para presentar distintos y separados dos puntos
adyacentes, determinando la máxima amplificación útil que se puede obtener con un
microscopio óptico. El poder de resolución (δ) se expresa mediante la siguiente
ecuación: δ = longitud de onda / Apertura numérica De acuerdo con la teoría
óptica, la resolución mas alta posible en un microscopio de luz compuesto
permitirá ver con claridad objetos cuyo diámetro sea de casi 0.2 mm. Lo anterior
significa el poder de resolución es igual al diámetro de la estructura visible mas
pequeña, de este modo en un microscopio óptico compuesto los objetos de
dimensiones menores alas señaladas, al ser amplificados, darán lugar a imágenes
difusas. La amplificación que aumenta el tamaño, pero no su detalle, se denomina
amplificación o aumento vacío. Efecto de la longitud de onda sobre el poder de
resolución, cuanto mas corta sea la longitud de onda empleada, mas pequeña será la
estructura visible (mayor poder de resolución), en este sentido, la luz aportara
mayor poder de resolución que la luz roja, sin embargo puesto que el espectro de
luz visible es relativamente estrecho el aumento de la resolución disminuyendo la
longitud de onda de la luz empleada, tiene un valor limitado. El mayor aumento de
la resolución de un microscopio se consigue aumentado la apertura numérica La
apertura numérica de la lente es función del diámetro real del objetivo en
relación con su distancia focal, lo que determina el Angulo (u) de los rayos de
luz más oblicuos que pueden entrar al objetivo y el poder de desviar el rayo
luminoso, índice de refracción (N) del medio que hay entre la muestra y el
objetivo. Existe correspondencia entre la amplificación del objetivo y su apertura
numérica, las lentes con mayor coeficiente de aumento, por lo general, tienen
mayor apertura numérica, pero como se indica en la formula el medio por el que
pasa la luz también influye en la apertura numérica; de este modo, cuando el
objetivo esta separado del objeto por aire, su apertura nunca puede ser mayor de
1.0 debido a que el índice de refracción del aire es menor que el de el vidrio,
los rayos luminosos se refractan o desvían cuando pasan por el portaobjetos al
aire, por lo que se pierde la mayor parte de los rayos luminosos, para alcanzar
valores mayores el objetivo debe estar inmerso en un medio con un índice de
refracción mayor que el del aire y similar al del

3
vidrio, de esta manera se disminuye la desviación y un porcentaje mayor de rayos
luminosos procedentes de la muestra pasan directamente al objetivo, proporcionando
una mayor resolución y una imagen mas clara. El aceite de inmersión aumenta la
cantidad de luz que pasa a la lente del objetivo La apertura numérica (AN) permite
calcular los límites de aumento útil multiplicándola por 500 y por 1000. Ej. Si el
objetivo tiene una apertura numérica de 0.65 por lo que pueden usarse aumentos
totales de 325 a 650 diámetros, fuera de esos limites se obtienen “aumentos vacíos
“en forma comparable a lo que suceda cuando se observan un mosaico tan lejos que
solo se ven colores pero no figuras delimitadas, o tan cerca que se ve cada
piedrecilla pero se pierde el conjunto Otros factores relacionados con el sistema
de la lente utilizada son la profundidad de campo y el área de campo, la primera
es el espesor del espécimen en foco de cualquier momento y es mayor con menor
poder de aumento, con la inmersión en aceite, la profundidad de campo es muy
superficial, por lo común menor de 1mm, el área de campo es mayor con el menor
aumento y es por esta razón que las lentes de bajo coeficiente de aumentos son
útiles para localizar objetos. Datos ópticos sobre las lentes objetivos de uso
común: Hay que insistir en que el sistema de iluminación es de suma importancia,
en especial cuando se emplean objetivos de alto poder de amplificación, la
cantidad de luz que entra en el sistema debe enfocarse en el espécimen y para este
propósito, se usa el sistema de lentes del condensador y el diafragmas, el primero
permite obtener un foco preciso en tanto que, el segundo, controla el circulo de
luz que sale de el condensador. Relación entre la distancia de trabajo de las
lentes y el ajuste del diafragma Iris: Cuanto mas corta es la distancia de
trabajo, más abierto esta el diafragma. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES: Aun
cuando los objetos biológicos no absorben diferencialmente la luz visible, sus
distancias estructurales tienen correlación en forma inversa con la velocidad de
propagación de luz, cuando mayor sea el índice de refracción, menos será dicha
velocidad, esta propiedad, aplica en la microscopia de contraste de fases,
permitiendo hacer visibles estructuras que de otra manera no lo serian o
resultarían poco visibles. Suponiendo un haz de luz que incide sobre dos
estructuras transparentes A y B las cuales poseen índices de refracción (N)
distintos y espesores iguales NA y NB , la onda que atraviesa la capa B se retrasa
en relación con la que atraviesa la capa A , el ojo no percibe este retraso y los
dos medios parecen igualmente transparentes. En el microscopio de contrastes de
fases, se introducen elementos ópticos para aprovechar la diferencia de retardos,
que esta dada por las diferencias en los índices de refracción del objeto. Para
ello se separa la radiación dirección directa difractada, y se produce en esta
ultima, un retraso de fase respecto a la primera para formar una imagen con la
suma de los dos. Los pequeños cambios de fase que se producen en el objeto se
amplían y se producen en cambios de intensidad de la imagen viéndose en estas
partes más o menos oscuras. La microscopia de fase se usa como un método de rutina
en la observación de células vivas. En la práctica, el contraste de fase (PH) se
integra de la siguiente forma: dentro del condensador se monta un diafragma anular
(PH) cuya imagen se forma en el plano focal del objetivo, donde se encuentra otro
PH (este diafragma es otro filtro neutro en forma de anillo). La radiación
difractada procedente del objeto atraviesa el anillo PH en la zona
semitransparente, en donde se produce un retrazo de aproximadamente ¼ de longitud
de onda. Los elementos ópticos para el contraste de fases son los siguientes: A.-
Condensador especial PH o condensador revolver con PH B.- Objetivo 10/0.25 PH 1
Con anillo de fase 1 Objetivo 40/0.65 PH 2 con anillo de fase 2 Objetivo 100/1.25
oil PH 3 con anillo de fase 3 C.- Ocular auxiliar Ajuste del microscopio para el
contraste de fases 1) Iniciar la técnica de iluminación según Kohler en la
posición J del condensador revolver (campo claro) 2) Ajustar el condensador
revolver en la posición PH correspondiente al objetivo PH (PH 1 con 1, PH 2 con 2
etc.) 3) Sustituir el ocular normal por el auxiliar y hacer el enfoque de los dos
anillos de fases (negro el del objetivo y blanco el del condensador)

4
4) Con la ayuda de los botones de ajuste situado en el condensador, hacer
coincidir el anillo de fases blanco con el negro. 5) Retirar el ocular auxiliar y
colocar nuevamente el ocular normal, insertar un filtro verde para aumentar el
contraste de los grises. 6) Al cambiar el objetivo, solo adaptar el diafragma de
campo luminoso al tamaño del campo visual y cambiar la posición del condensador al
que corresponde, según el nuevo objetivo, ejemplo PH 2 con 2 y PH 3 con 3.
MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO La microscopia del campo oscuro se consigue situando
una pantalla circular opaca en la entrada del condensador de ABBE, de manera que
se oscurezca la parte central, o bien, empleando tipos especiales de condensadores
(paraboide o cardioide), la preparación se ilumina con un haz de luz
suficientemente fino, bajo un ángulo agudo, de forma que no incida en la lente
frontal del objetivo. ej. Se muestra como el haz de luz ilumina oblicuamente al
espécimen y alcance el objetivo, el campo aparecerá uniformemente oscuro y cada
partícula se vera como un punto luminoso por efecto de difusión de la luz que
incide sobre ella. Dirección del haz de luz en un microscopio de fondo oscuro La
apertura numérica del objetivo debe ser suficientemente baja para excluir la luz
directa del condensador, para el trabajo con aceite de inmersión, se usa un
objetivo con un diafragma de iris incorporado, por medio de la cual la apertura
numérica puede reducirse. Esta técnica se emplea para observar preparaciones
biológicas sin colorear y entre otras cosas, permite observar el movimiento
browniano y los flagelos, así como estudiar células en acción y los movimientos
implicados en procesos tales como la mitosis y la migración celular. Elementos
ópticos para campo oscuro: 1.- Posición D de condensador revolver 1.4 AN, o ultra
condensador 1.2/1.4 AN oil Además existen condensadores para campo oscuro sin
aceite con los que se obtienen aumentos menores. AN 0.8/0.9 para objetivos con
apertura numérica de 0.6- 0.7, y condensadores 0.7/0.85 para objetivos con AN de
0.4-0.6 2.- Objetivos con diafragma de iris 100/1.25 oil iris 40/1.0 oil iris 3.-
Sin filtro 4.- Doble inmersión de aceite (sobre la preparación y el condensador),
solamente en condensadores con 1.4 AN o 1.2/1.4 AN MICROSCOPIA DE FLUORESENCIA La
fluorescencia la propiedad que tienen algunas sustancias para emitir luz después
de haber sido expuestas a una radiación del longitud de onda corta a la que se
denomina radiación excitadota (UV). La luz fluorescente emitida tiene una longitud
de onda mas larga que la radiación con la cual se irradia la sustancia
fluorescente (ley de Stokes). La radiación emitida por la sustancia fluorescente
tiene menor energía que la radiación inicial o de excitación. Consecuentemente,
una sustancia fluorescente puede ser excitada por una radiación invisible como la
luz ultravioleta, para ser vista en el especto visible, o bien, puede excitarse
con radiación cuya longitud de onda corresponde a la azul o al verde y la luz que
se emite tendrá una longitud de onda mas larga que corresponde a la fluorescencia
verde, amarilla o roja. La microscopia de fluorescencia es particularmente útil en
la búsqueda de agentes etiológicos como bacterias y virus que no florecen, por lo
tanto, hay que ponerlos en condiciones de emitir radiación fluorescente útil para
su observación. Existen algunas sustancias que poseen fluorescencia propia, ala
que se denomina fluorescencia primaria, Por ejemplo de estas que tienen: la
clorofila, las porfirinas, algunas vitaminas, ceras y aceites de inmersión (solo
que contengan di felino policromado BCB). La fluorescencia de microorganismos o de
estructuras biológicas que no fluorecen por si mismas se consiguen por medio de
los fluorocromos, los que en principio son considerados como colorantes (chorna =
color). Dependiendo de la composición química y de las características de la
tinción, los fluorocromos se depositan en zonas específicas del espécimen y dejan
otras si teñir. Este proceso se conoce como fluorocromacion y la fluorescencia que
genera se denomina Fluorescencia secundaria. Actualmente se conoce una gran
variedad de fluorocromos y, entre los mas usados se encuentran: la auramina, la
rodamina, el isotiocianato, fluoresceína, la criflavina y el naranja de acridina.
Elementos importantes de n microscopio de florescencia:

5
°Fuente de luz, la luz emitida por la fuente debe tener la suficiente radiación de
aquellas longitudes de onda
requeridas para la excitación de los fluorocromos. Generalmente se usa una fuente
de mercurio a alta presión (HBO50). Cuando se quiere excitar con la luz azul, se
usa una lámpara incandescente potente de alógeno (ejemplo Hal 100w).

°Filtro de excitación. El filtro de excitación debe permitir el paso de la

radiación necesaria o útil para el método °Filtro supresor selectivo o filtro
barrera. Este retiene la luz de excitación de longitud de onda corta (UV)
no es absorbida por el espécimen y que podría llegar a los ojos del observador y
ocasionarle daño. Cuidado y limpieza del microscopio Como todo instrumento de
precisión, el microscopio debe cuidarse con esmero. Lo principal desde luego, es
manejarlo con precaución, solo debe moverse lo indispensable, sujetándolo
firmemente con ambas manos y depositándolo con suavidad. Forma correcta de
transportar el microscopio: Todos los componentes del microscopio deben embonar
perfectamente y moverse con suavidad y facilidad; nunca debe forzarse la
colocación de la pieza en su movimiento .Debe evitarse el polvo, ya que tiene a
depositarse en las cremalleras y en las lentes. También debe resguardarse de la
humedad y el calor excesivos. Las lentes deben conservarse lo mas limpias
posibles, evitando que se ensucien con las preparaciones y con la grasa de las
manos y pestañas. Para limpiar las lentes se utiliza un pincel suave, libre de
grasa. Si es necesario exhale sobre la superficie antes de la lente de usar el
pincel. Si no basta el agua de vaho puede usarse una pequeñísima cantidad de éter
muy puro, pero nunca alcohol ni otros disolventes, porque pueden disolver el
pegamento de las lentes. El pincel para limpiar las lentes se lava de vez en
cuando con éter puro. El sistema mecánico se limpia con un paño que no suelte
pelusa, perfectamente limpio y humedecido con agua destilada; después de limpiar
el sistema mecánico, se seca perfectamente. usado y retener todas aquellas
longitudes de onda de la emisión de la fuente de luz, que son útiles para la
excitación. que

REPORTE: Historia del microscopio:

El microscopio se invento, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por
Jansen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por
primera vez por los componentes de la "Academia dei Lincei" una sociedad
científica a la que pertenecía Galileo y que publicaron un trabajo sobre la
observación microscópica del aspecto de una abeja. Sin embargo las primeras
publicaciones importantes en el campo de la microscopia aparecen en 1660 y 1665
cuando Malpighi prueba la teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea al
observar al microscopio los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra
Micrografía. A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Leenwenhoek,
utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez
protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. Durante el siglo XVIII el
microscopio sufrió diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su
facilidad de uso aunque no se desarrollaron mejoras ópticas. Las mejoras mas
importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del
microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de inmersión
sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000A
principios de los años 30 se había alcanzado el limite teórico para los
microscopios ópticos no consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin
embargo existía un deseo científico de observar los detalles de estructuras
celulares ( núcleo, mitocondria... etc.). El microscopio electrónico de
transmisión (T.E.M.) fue el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado
este utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra
consiguiendo aumentos de 100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska
en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio
electrónico de barrido (SEM).
Tipos de microscopio: • •
Microscopio binocular: el que tiene dos oculares. Microscopio compuesto: el que
consta de varias lentes o sistemas de ellas, unas situadas cerca del objeto
(objetivo) y otras cerca del ojo del observador (ocular). La primera da una imagen
real e invertida del objeto y la segunda una imagen virtual ampliada de la real.
se utiliza mayormente para el estudio de objetos de aproximadamente uno a 2000
micrómetros, aunque se pueden ver cosas aun más pequeñas con el empleo de técnicas
especiales.

6
• • • • • • • • • •

Microscopio corneal: un microscopio especialmente adaptado a una lámpara de

hendidura para examinar la córnea in vivo e in situ. Microscopio de barrido:
microscopio electrónico en el cual las radiaciones realizan un rastreo o barrido
de la superficie de la muestra lo que ofrece una imagen en relieve de la misma.
Microscopio de contraste de fases: microscopio óptico que, por las modificaciones
de la fase de luz, debidas a la diferencia del índice de refracción, permite
distinguir las estructuras de objetos incoloros o poco contrastados. Microscopio
de rayos X: el que utiliza rayos x. Microscopio electrónico: un microscopio que
utiliza haces de electrones y proporciona aumentos de 200.000 diámetros y en el
cual un campo magnético permite enfocar los rayos catódicos (electrones) y obtener
una imagen en la pantalla fluorescente o placa radiográfica. Microscopio
fluorescente: el provisto de filtros que permiten observar, con luz ultravioleta,
sustancias teñidas con colorantes fluorescentes. Microscopio operatorio:
microscopio binocular que se utiliza en técnicas de microcirugía. Microscopio
simple: el formado por un solo sistema de lentes. Microscopio ultrasónico: el que
utiliza la reflexión de ondas ultrasónicas para observar detalles estructurales de
lo observado Microscopio ultravioleta: el que utiliza ondas.

Partes del microscopio:

     

base : sostén del instrumento columna o brazo: sostiene los oculares y objetivos
platina: superficie para colocar la laminilla ajuste mecánico de la platina: para
mover la laminilla revólver: contiene los objetivos objetivos: lentes principales
del microscopio; son parafocales, pues al cambiar de un objetivo a otro, la imagen
queda casi en foco y sólo es necesario un leve ajuste; objetivos: a) rastreo:
cuatro magnificaciones o 4x

b) c)  

Baja potencia : 10x Alta potencia: 40x

cabezal: contiene los oculares oculares: el microscopio es binocular, pues hay dos
lentes oculares; son de diez magnificaciones o 10x; para determinar la
magnificación de la imagen que observas a través del microscopio, multiplica la
magnificación de los oculares por la del objetivo en uso; con nuestros
microscopios la magnificación de la imagen puede ser de 40x, de 100x o de 400x

       

anillo de enfoque del ocular izquierdo: se usa para compensar la diferencia de

visión que existe entre los dos ojos  ajuste de distancia interpupilar tornillo
macrométrico o ajuste grueso: para subir y bajar la platina rápidamente; se usa
solamente con los objetivos de 4x y 10x tornillo micrométrico o ajuste fino: para
subir y bajar la platina muy lentamente; se usa con todos los objetivos para
perfeccionar el enfoque de la imagen

iluminador: provee iluminación con intensidad variable  interruptor  indicador

de encendido ajuste de iluminación: se usa para controlar la intensidad de
iluminación condensador: enfoca la luz en el plano de la laminilla ajuste del
condensador: para subir y bajar el condensador; para nuestro uso el condensador
debe estar un poco por debajo de su posición más alta diafragma: para controlar el
diámetro del cono de luz que llega al objetivo, no para controlar la intensidad de
iluminación; al disminuir la apertura del diafragma se aumenta el contraste y la
profundidad de foco, pero se disminuye la resolución; para lograr la mejor imagen
posible es necesario cambiar la apertura del diafragma al cambiar el objetivo
filtro azul: absorbe el exceso de luz roja y amarilla del iluminador para que la
iluminación sea más similar a la luz natural

7


cordón eléctrico: al guardar el microscopio se debe evitar la posibilidad de

tropezar, doblando el cordón alrededor de la base del microscopio o enrollándolo y
colocándolo alrededor de uno de los oculares

Uso y cuidado del microscopio: Al usar el microscopio es importante no solamente

observar cuidadosamente la imagen sino también interpretar correctamente lo que se
ve con este instrumento. Con el microscopio compuesto, la imagen de un objeto se
ve muchas veces más grande y de manera invertida. La profundidad de foco es
limitada, especialmente con los objetivos de mayor magnificación; por esto es
esencialmente bidimensional o en un solo plano. Sin embargo, los organismos
biológicos son tridimensionales. Para apreciar la estructura tridimensional se
puede estudiar una serie de laminillas que representan cortes sucesivos o cortes
perpendiculares; además, en una misma laminilla se puede enfocar ligeramente hacia
arriba y hacia abajo. El uso correcto del microscopio requiere varios tipos de
ajuste, los cuales son necesarios para que se vea con claridad y en todo su
detalle cada objeto que se estudie. Es imprescindible saber cómo usar
correctamente este instrumento: Es responsabilidad individual y colectiva de todos
los instructores y estudiantes mantener estos instrumentos en óptimas condiciones.
Al llevar el microscopio de un lugar a otro es importante sostenerlo siempre con
ambas manos, una colocada debajo de la base y la otra agarrando la columna o el
brazo del instrumento. Cuando se deposita el microscopio sobre la mesa debe
hacerse con suavidad, sin que haga ruido. Tampoco debe arrastrarse sobre la mesa o
dentro del gabinete, pues esto produce vibraciones que con el tiempo sacan de
alineamiento la delicada óptica del instrumento. Antes de usar el microscopio se
verifica que los lentes oculares y objetivos estén limpios. Si es necesario
limpiar los lentes u otras partes del microscopio (como el condensador o el filtro
azul) se debe usar papel de lente seco; la única humedad que puede emplearse es la
del aliento para empañar el lente y luego frotarlo suavemente. Si la laminilla
está sucia o si está mojada por debajo, se puede usar un «Kimwipe» para limpiarla.
Una de las principales causas de una imagen borrosa y poco definida es la
presencia de sucio en los lentes o en la laminilla, especialmente polvo y huellas
digitales en los oculares. No se debe tocar los lentes o la parte central de la
laminilla con los dedos. Se pueden localizar «sucios» de la siguiente manera: ∼si
el sucio se mueve al mover la laminilla, está en la laminilla ∼si el sucio se
mueve al mover los oculares, está en los oculares ∼si el sucio desaparece al
cambiar el objetivo, está en el objetivo anterior ∼si el sucio entra y sale de
foco al subir y bajar el condensador, está en el condensador

∼si el sucio no se mueve y no está en ninguno de los lugares anteriores, puede

estar dentro del microscopio; se
debe notificar al instructor de laboratorio; no remover ninguna parte del
microscopio Uso correcto del microscopio: Enchufar el microscopio. Prender el
iluminador; la luz roja debe indicar que está encendido, aunque puede ser que no
se vea iluminado. Ajustar la intensidad de luz a un nivel cómodo. Hay que volver a
ajustar la intensidad de luz al cambiar el objetivo o la laminilla. Si la luz no
funciona, avisar al instructor de laboratorio para que se cambie la bombilla.
Ajustar la distancia interocular para adaptar la distancia entre los oculares a la
distancia entre los ojos, moviendo lateralmente la base de los oculares hasta que
se vea claramente una sola imagen. El propósito principal de los dos oculares es
el de minimizar la interferencia de luz ambiental y de otras imágenes y,
consecuentemente, la fatiga visual. Los dos oculares no proporcionan una imagen
estereoscópica, porque hay un solo objetivo. La distancia interpupilar varía para
cada persona; por lo tanto, hay que hacer este ajuste al principio de cada
laboratorio. Enfocar el microscopio. Mirando por fuera el objetivo para que no
toque la laminilla, usa el tornillo macrométrico para subir la platina a la
posición más alta (no hagas esto con el objetivo de 40x en la posición vertical).
Mirando entonces por los oculares (los estudiantes con espejuelos pueden
removerlos para facilitar el uso del microscopio), usa el tornillo macrométrico
para bajar la platina hasta que el objeto esté en foco. Cerrando el ojo izquierdo,
usa el tornillo micrométrico para lograr una imagen en perfecto foco. Cerrando el
ojo derecho, usa el ajuste en el ocular izquierdo para corregir el foco. Este
ajuste es necesario al principio de cada laboratorio.

MATERIAL
    Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Pipeta pasteur

8
 Preparaciones proporcionadas por el profesor  Pincel fino para limpiar el
microscopio


   

Paño limpio de lino o de otro material que no suelte pelusa Pañuelos desechables
Agua del lago de chapultepec Pulque Yakult

METODOLOGÍA:

1.

Cuidado del microscopio e identificación de sus componentes: 1.1. Recibir el

microscopio, sujetándolo firmemente con ambas manos y depositarlo sobre la mesa
con suavidad. 1.2. Revisar los componentes del microscopio y verificar que todos
embonen perfectamente, para ello, mediante movimientos suaves, desplazar el tubo
del microscopio y la platina; girar el tubo intercambiable y el revolver. 1.3.
Identificar cada uno de los componentes del microscopio. 1.4. Observar los datos
del microscopio e identificar. °En el ocular, el coeficiente de aumento. °En el
objetivo: °El coeficiente de aumento °La apertura numérica °La longitud mecánica
del tubo °El espesor del portaobjeto a emplear 1.5. Calcular el total de
amplificación que se puede obtener con los diferentes objetivos 1.6. Calcular el
aumento útil de los diferentes objetivos 1.7. Limpiar las lentes con un pincel
libre de grasa 1.8. Exhalar sobre la superficie de cada una de las lentes y
limpiar con una hoja de papel seda 1.9. Alinear el objetivo de menor aumento con
el tubo del microscopio 1.10.Con el tornillo micrométrico, acercar al máximo la
platina al objetivo, observando lateralmente para que no lleguen a chocar. 2.
Iluminación (Técnica según Kohler): 2.2.Encender la lámpara (luz amarilla o bajo
voltaje) 2.3.Abrir diafragmas (de campo y de iris) 2.4.Subir el condensador
2.5.Seleccionar el objetivo de 10 x o 40 x o 100 x 2.6.Enfocar con el macrométrico
y micrométrico ° Ajustar la distancia interpupilar (distancia entre ojos) °
Ajustar la misma cifra de distancia interpupilar a cada uno de los porta oculares
(para tubos binoculares, se ajusta desplazándose horizontalmente) ° Ajustar
dioptrías (agudeza visual) en el porta ocular izquierdo, o bien el ocular
enfocable izquierdo. 2.7.Cerrar el diafragma de campo. 2.8.Descender ligeramente
el condensador, hasta ver nítido el borde del diafragma de campo 2.9.De ser
necesario, centrar el condensador con la ayuda de sus dos tornillos laterales
(anteriores o posteriores), una vez centrado el condensador, abrir el diafragma de
campo, agregar el filtro azul (algunos modelos de microscopio carecen del sistema
de filtros) e intensificar un poco mas la luz 3. Enfoque de la preparación: 3.1
Colocar la preparación en la platina. 3.2 Con el tornillo macrométrico llevar la
platina lo mas cercano posible al objetivo (observando lateralmente) 3.3 Observar
por el ocular, mover lentamente el tornillo macrométrico para separar el objetivo
de la preparación hasta que aparezca la imagen del objeto. Como la profundidad de
campo es poca y se reduce aun mas con aumentos mayores, el enfoque se logra solo
en una pequeña zona, si se mueve mas el tornillo de enfoque, la imagen desaparece
3.4 Para mejorar la nitidez de la imagen (dependiendo del modelo de microscopio) *
Disminuir la intensidad de la luz, cerrando el diafragma de la lámpara o bajando
ligeramente el voltaje de la misma. * Regular el contraste de la imagen con ayuda
del diafragma de iris del condensador. 3.5 Colocar el objeto de interés (que debe
estar perfectamente enfocado) en el centro del campo microscópico, moviendo
ligeramente la platina. 3.6 Girar el revolver, y alinear el objetivo de 40X con el
tubo del microscopio 3.7 Observar por el ocular y verificar que la imagen
permanece enfocada y que solo es necesario mover el tornillo micrométrico o de
precisión 3.8 Girar el revolver colocar sobre la preparación una gota de aceite de
inmersión y continuar girando hasta alinear el objetivo de 100X
9
3.9 Observar por el ocular y verificar que la imagen permanece enfocada y solo es
necesario mover el tornillo micrométrico en la mayoría de los casos aumentar la
intensidad de la luz NOTA: El microscopio tiene la propiedad de ser parfocar por
lo que al enfocar uno de los objetivos, los demás quedan en foco 3.10 Iluminar el
microscopio varias veces y enfocar tantas preparaciones como sea posible 3.11
Observar primero las letras, después del colorante seco y luego las preparaciones
de microorganismos proporcionadas por el profesor 3.12 Después de retirar la
preparación, limpiar el aceite que queda en el objetivo con un pañuelo desechable,
separando sus dos hojas y usando las partes interiores que no sueltan pelusa, no
utilizar algodón por que deja fragmentos que ensucian las lentes 3.13 Dejar el
microscopio con el objetivo de menor aumento alineado con el tubo y lo mas cercano
posible a la platina GUIA DE OBSERVACION Procedimiento: ℘ ℘ ℘ ℘ ℘ ℘ Identificar
las partes del microscopio compuesto Enfocar, iluminar y observar las
preparaciones proporcionadas; hacer esquemas. A partir de la muestra del agua del
lago realizar preparaciones en fresco y observar a 10x a 40x Tratar de localizar
protozoarios y algas microscópicas y esquematizar. A partir de la muestra de
pulque, realizar una preparación en fresco y observar a 40x y 100x a inmersión.
Diluir una gota de yakult en 9 gotas de agua y realizar la preparación en fresco.
Observar lactobacilos.

RESULTADOS:

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

ocular revólver objetivo mecanismo de enfoque tornillo de enfoque fino platina

espejo condensador

1) Partes del Microscopio:

10
ANÁLISIS DE RESULTADOS:
 Primero en el laboratorio se identificaron cada una de las partes que componían
al microscopio utilizado en laboratorio, para su uso correcto.  Una vez
identificadas las partes, se prosiguió a colocar muestras previamente preparadas
para su observación en el microscopio; para esto se tuvo que enfocar primero las
imágenes en el microscopio, iniciando por el menor aumento (en este caso los
aumentos eran de 5x, 10x, 40x y 100x) y hacia el objetivo con mayor aumento. Se
observaron las muestras y se dibujaron.

Se observó en el agua del lago algunos protozoarios que se movían constantemente

(5x), en el 10x, se observaron protozoarios y una euglena que se movía
constantemente sobre sí misma. En el 40x, se observó un paramesium, los
protozoarios y algunas algas más cerca, se observaba su pared celular muy definida
y algunos flagelos. En el 100x, se observaron mejor las algas marinas, y como los
protozoarios se movían en sí mismos circularmente, se observaba su pared celular y
en el paramesium se logró observar mejor su pared celular, los flagelos y como se
había comido algunos protozoarios y otras bacterias; esta especie a comparación de
las demás observadas, fue la de tamaño más grande.  En el pulque se lograron
observar cocos (solos), diplococos, cocos en cadena, protozoarios y bacilos de
leumococo.  Por último en el yakult se observaron los lactobacilos, aunque nos
costo mucho trabajo encontrarlos ya que aún con el aumento de 100x , fueron
demasiado pequeñas las especies.

CUESTIONARIO:

1) ¿Qué es el movimiento browniano? 2)

El movimiento que lleva a cabo una partícula muy pequeña que está inmersa en un
fluido, se llama movimiento browniano. Este movimiento se caracteriza por ser
continuo y muy irregular. La trayectoria que sigue la partícula es en zigzag.
¿Cómo funciona el microscopio de campo oscuro? La microscopia del campo oscuro se
consigue situando una pantalla circular opaca en la entrada del condensador de
ABBE, de manera que se oscurezca la parte central, o bien, empleando tipos
especiales de condensadores (paraboide o cardioide), la preparación se ilumina con
un haz de luz suficientemente fino, bajo un ángulo agudo, de forma que no incida
en la lente frontal del objetivo. ej. Se muestra como el haz de luz ilumina
oblicuamente al espécimen y alcance el objetivo, el campo aparecerá uniformemente
oscuro y cada partícula se vera como un punto luminoso por efecto de difusión de
la luz que incide sobre ella.

11
3) ¿En qué consiste el microscopio de contraste de fases?
4) Principales aportaciones a la ciencia gracias al microscopio:

microscopio óptico que, por las modificaciones de la fase de luz, debidas a la

diferencia del índice de refracción, permite distinguir las estructuras de objetos
incoloros o poco contrastados

Algunos descubrimientos en la historia de la microscopía óptica 1611 1655 1674

1833 1838 1857 1876 1879 1881 Kepler sugirió la manera de construir un microscopio
compuesto Hooke utilizó un microscopio compuesto para describir unas pequeñas
celdillas en los cortes de corcho a las que denominó "células". Leeuwenhoek
informó sobre su descubrimiento de protozoos. Nueve años más tarde observó por
primera vez bacterias. Brown publicó sus observaciones microscópicas de las
orquídeas, y describió claramente el núcleo celular. Schleiden y Schwann
propusieron la teoría celular, afirmando que la célula nucleada es la unidad
estructural y funcional de las plantas y los animales. Kolliker describió las
mitocondrias de las células musculares. Abbé analizó los efectos de la difracción
en la formación de la imagen en el microscopio y mostró la manera de optimizar el
diseño de los microscopios. Flemming describió con gran claridad el comportamiento
de los cromosomas durante la mitosis de las células animales Retzius describió
muchos tejidos animales con una precisión que aún no ha sido superada por ningún
especialista en microscopía óptica. En las dos décadas siguientes, tanto él como
Cajal y otros histólogos, diseñaron métodos de tinción y establecieron las bases
de la anatomía microscópica. Koch utilizó colorantes de anilina para teñir
microorganismos e identificó las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera.
En las dos décadas siguientes, otros bacteriólogos, como Klebs y Pasteur,
identificaron los agentes causantes de otras muchas enfermedades examinando al
microscopio preparaciones teñidas. Zeiss hizo una serie de lentes, siguiendo las
leyes de Abbé, que permitieron a los especialistas en microscopía la resolución de
estructuras situadas en los límites teóricos de la luz visible. Golgi observó por
primera vez el aparato llamado "de Golgi", impregnando células con nitrato de
plata. Lacassagne y sus colaboradores desarrollaron la primera técnica
autorradiográfica para localizar el polonio radiactivo en las muestras biológicas.
Lebedeff diseñó y construyó el primer microscopio de contraste interferencial. En
1932, Zernicke inventó el microscopio de contraste de fases. Estos dos adelantos
permitieron observar por primera vez células células vivas no teñidas en detalle.
Coons utilizó anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para detectar
antígenos celulares. Nomarski ideó y patentó el sistema de contraste
interferencial para el microscopio óptico., que aún lleva su nombre. Allen e Inoué
perfeccionaron la microscopía óptica de contraste video-amplificada.

1882

1886

1898 1924 1930

1941 1952 1981

N.T. Generalmente se considera que el primer microscopio compuesto fue construido

por los holandeses H. Jansen y Z. Jansen en 1590.

CONCLUSIONES:
Por medio de esta práctica se identificaron cada una de las partes del
microscopio, para después lograr una buena iluminación y enfoque del mismo al
realizar algunas pruebas para este fin con algunas muestras preparadas y otras
preparadas por nosotros mismos para observar algunos microorganismos y lograr
enfocarlos correctamente, para su posterior estudio. Esta es una práctica
indispensable y muy importante ya que uno de los elementos indispensables en
microbiología es el microscopio, debido a que en esta materia su principal
objetivo de estudio son los

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organismos microscópicos, para los que se requiere este aparato y si no se sabe
utilizar correctamente, será muy difícil lograr una buena práctica en laboratorio.

REFERENCIAS:
° http://personales.mundivia.es/mggalvez/micro2.htm

TablaAlberts, Bruce, Biología Molecular de la Célula (2da. Edición, Ediciones

Omega, Barcelona, 1994) ° Atlas, R.M. (1990) Microbiología, fundamentos y
aplicaciones. CECSA: México *Manual de microbiología general: ° Departamento de
Microscopia de Carl Zeiss (1980) La microscopia desde el principio. México

Madigan, M. T.; Martinko, J.M. Y Parker, J. (1997) Block. Biología de los

microorganismos. 8ª ed. Prentice Hall. Iberia, España.

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