PRODUCTOS DERIVADOS DE PLANTAS EN EL TRATAMIENTO DE

ENFERMEDADES INFECCIOSAS. UNA APROXIMACION A LA BUSQUEDA

RACIONAL DEL EFECTO ANTIMICROBIANO
PLANT PRODUCTS IN TREATMENT OF INFECTION DISEASES. A
RATIONAL APPROACH TO SEARCH OF ANTIMICROBIAL EFFECT
Romn Yesid Ramrez R
Docente Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia

Resumen: Las propiedades Fito teraputicas de las plantas han sido utilizadas
desde tiempos inmemoriales; en contraste, los cientficos hace relativamente
poco estn aplicando el mtodo cientfico para buscar los fundamentos de
estas propiedades. La curva de crecimiento de este tipo de investigaciones
cada vez es ms alta con respecto al tiempo de ejecucin. Para realizar esta
clase de estudios se requiere una base cientfica slida proporcionada por la
acumulacin de experiencias de cientos de investigadores que exploran los
diversos efectos farmacolgicos, entre ellos el efecto antimicrobiano. Hoy se
cuenta con evidencia suficiente para colocar a las plantas en un lugar
privilegiado entre las fuentes de molculas potencialmente activas contra el
efecto de bacterias, virus parsitos y hongos. Los extractos y molculas
derivadas de plantas han probado ser efectivas en cantidades tan pequeas
como lo son los antibiticos usados actualmente y algunas ms efectivas
porque adems actan contra bacterias multiresistentes. En el campo de los
antivirales tambin se ha demostrado que varias de estas sustancias derivadas
de las plantas inhiben la replicacin in vitro de los mismos, hecho que es
plausible tambin en hongos y parsitos aunque en menor proporcin. La
estabilidad y efectividad in vivo de estos derivados es el paso en el cual falta un
mayor desarrollo para que la expectativa que despierta la fitofarmacologa sea
la mquina que eche a andar el nuevo desarrollo de antimicrobianos derivados
de las plantas.
Palabras clave: Extractos vegetales, Productos con accin antimicrobiana,
Fitoterapia, Resistencia a medicamentos.
Abstract: Phytotherapeutic properties of plants have been used since time
immemorial, in contrast, only relatively recently scientists are applying
the scientific method to find fundamentals these properties. The growth
curve of this type of research is becoming increasingly high with respect
to the runtime. To carry out this kind of studies requires a solid scientific
basis provided by the accumulation of experiences of hundreds of
researchers exploring various pharmacological effects, including
antimicrobial effect. Today it has sufficient evidence to place the plants in
a privileged place among the sources of potentially active molecules
against the effect of bacteria, viruses, parasites and fungi. The extracts
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and plant-derived molecules have proven effective in amounts as small
as are currently used antibiotics and also some more effective because
they act against multiresistant bacteria. In the field of antiviral also been
shown that several of these plant-derived substances inhibit the in vitro
viral replication, a fact which is also plausible fungi and parasites
although to a lesser proportion. The in vivo stability and effectiveness of
these derivatives is the step which needed further development to the
expectations aroused by phytopharmacology will be the machine that
have started development of new plant-derived antimicrobials
Keywords: Plant extracts, Products with antimicrobial action, Phytotherapy,
Drug Resistance.

Introduccin
El conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas se ha
transmitido a travs de los siglos, al interior y entre las comunidades
humanas. Los compuestos activos producidos durante el metabolismo
secundario vegetal son generalmente responsables de las propiedades
biolgicas de algunas especies de plantas utilizadas en todo el mundo para
diversos fines, incluyendo el tratamiento de enfermedades
infecciosas. Actualmente, los datos sobre la actividad antimicrobiana de
numerosas plantas (hasta ahora considerado emprico), se han confirmado
cientficamente, y van en paralelo con el nmero creciente de informes sobre
los microorganismos patgenos resistentes a los agentes antimicrobianos
(Silva & Fernades, 2010).
Efectuando una bsqueda en Science Direct DB

de la productividad cientfica
de los ltimos cinco aos del tpico en mencin, se pone de manifiesto el
crecimiento que ha experimentado esta rea del conocimiento. Es as que
cuando se ha consultado las palabras antimicrobial effect plants se han
obtenido ms de 36.000 resultados asociados. Para establecer la actividad en
investigacin desarrollada para cada grupo de microorganismos se efectu una
bsqueda cambiando la palabra antimicrobial por cada uno de los grupos de
microorganismos (bacterias, virus, parsitos y hongos), teniendo los siguientes
resultados: para antibacterial effect plants se obtuvieron ms de 25.000
resultados; para antiviral effect plants se obtuvieron ms de 17.000; para
antiparasitic effect plants se obtuvieron ms de 2.700; y para fungicidal effect
plants se obtuvieron ms de 5.000 resultados. Lo anterior demuestra la
actividad cientfica de investigadores alrededor del mundo que estn trabajando
en la exploracin de las capacidades antimicrobianas de las plantas, esto hace
evidente que la farmacognosia ha dejado de ser una pseudociencia para
convertirse en uno de los campos de investigacin ms promisorios como
alternativa a los medicamentos tradicionales.
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Al hablar de medicina natural nos referimos a aquellos recursos farmacolgicos
sintetizados de forma natural por organismos como las plantas, los animales,
los microorganismos, o inclusive a los recursos minerales con propiedades
farmacuticas, pero es sin duda el reino vegetal el que ofrece mayor variedad
de sustancias potencialmente tiles en el tratamiento de enfermedades,
incluidas las originadas por microorganismos (Cortez-Gallardo et al., 2004). En
este artculo se describir el flujo racional de trabajo sugerido en la bsqueda
del efecto antimicrobiano de las plantas para cada uno de los grupos de
microorganismos mencionados anteriormente.

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano
de plantas

La actividad biolgica o teraputica de una planta medicinal est
estrechamente relacionada con los productos qumicos contenidos en la
misma. Estos productos qumicos se pueden clasificar en grupos principales
tales como: alcaloides, esteroides, cidos, taninos, saponinas, quinonas,
flavonoides, cumarinas, etc (Cowan, 1999). Cada uno de estos grupos
qumicos posee una especificidad en el mtodo que debe aplicarse al recurso
vegetal para extraer tal principio activo.
Se conocen un sinnmero de preparados vegetales que podran tener un
efecto curativo, los cuales no estn estandarizados y varan de acuerdo a la
planta utilizada, algunos de estos mtodos incluyen; infusiones, decocciones,
tinturas, maceraciones, etc. (Thomson, 1978). En el contexto cientfico debe
tenerse en cuenta varios aspectos importantes a la hora de analizar las plantas
como posibles alternativas farmacolgicas o fuentes de compuestos qumicos
tiles en el tratamiento de enfermedades. La va racional para realizar un
anlisis cientfico de las propiedades antimicrobianas de alguna planta
comprende los siguientes procedimientos:

1. Recoleccin: Esta vara segn los propsitos de la investigacin, si se
desea hacer un tamizaje de cierta zona geogrfica, las plantas se recolectarn
al azar, tratando de cubrir la extensin total del sitio; en cambio si se desea
trabajar con una o ms plantas conocidas es importante el apoyo de un bilogo
botnico o conocedor de la taxonoma vegetal para la plena identificacin de
los especmenes a recolectar. Otra modalidad importante es hacer la
recoleccin guiada por la experiencia de curanderos locales, los cuales
sealarn cuales son las plantas usadas por ellos para sus prcticas de
curacin (Fabricant & Farnsworth, 2001). Otro aspecto a tener en cuenta es la
parte de la planta que se va a recolectar o si se va a tomar la totalidad del
espcimen (siempre y cuando sea posible). Esta seleccin est orientada por el
propsito del estudio; es decir si lo que se desea es tamizar, lo recomendado
es (en lo posible) obtener todo el espcimen e inclusive indicar su localizacin
mediante un sistema de posicionamiento global (GPS), pero si la bsqueda de
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la planta es guiada por el conocimiento emprico de sus propiedades, entonces
es prudente seleccionar las partes que el gua (curandero o mdico tradicional)
seale (Clardy & Walsh, 2004). Una vez se hayan recolectado las partes o
plantas completas, es importante detener su metabolismo para que ciertos
componentes no se conviertan en subproductos, por esto, inmediatamente
despus de su colecta, la planta o sus partes deberan introducirse en un
refrigerador porttil a -20 C o -80C. (Kaufman, Cseke, Warber, Duke, &
Brielmann, 1999 ). Existen un buen nmero de variables que podran influir
sobre la calidad y cantidad de metabolitos encontrados en las plantas, por eso
cuando se desconocen las caractersticas de la especie vegetal, a partir de la
cual se buscar obtener el extracto, se han considerado algunas reglas
generales para su recoleccin: i. la corteza debe ser recogida con una
atmosfera de humedad, que facilite su separacin, cortando los segmentos de
forma vertical para que contine el transporte de savia y la planta no muera. ii.
las races, los tubrculos y los bulbos deben ser recogidos preferiblemente
durante el invierno, en el periodo de reposo vegetativo, cuando el contenido de
los principios activos alcanza su grado mximo. iii. las plantas herbceas y las
hojas deben recolectarse cuando se inicia la floracin, durante los periodos
secos, esto permite a la planta regenerarse en el periodo de lluvias. iv. las
flores deben ser cortadas antes de que abran completamente, aunque en
ocasiones son recolectadas las inflorescencias abiertas. v. las frutas se
recolectaran antes de alcanzar su estado maduro. vi. las semillas se
recolectarn cuando los frutos estn maduros (Sharapin, 2000).

2. Secado: Una de las etapas ms importantes durante el proceso de
bsqueda de las propiedades farmacolgicas de las plantas es el secado, este
garantiza la interrupcin de los procesos de degradacin causados por enzimas
y fermentos, impide el desarrollo de microorganismos y de las reacciones de
oxidacin e hidrlisis. Sin embargo el involucrar calor, puede relacionarse con
la perdida de aceites esenciales y compuestos voltiles, acompaado del
riesgo de perder sustancias con caractersticas termolbiles. Para evitar lo
mencionado anteriormente se recomienda secar las plantas a temperaturas
que no excedan los 40C, de ser posible con corrientes de aire caliente para
evitar la acumulacin de humedad, por varios das hasta no evidenciar
humedad alguna en el ejemplar. La eliminacin del agua es directamente
proporcional al rendimiento de los productos a extraer, puesto que si quedan
residuos de agua en el espcimen los metabolitos se disuelven y las
concentraciones efectivas sern mayores (Mukherjee & Houghton, 2009).

3. Extraccin: Independientemente de la estrategia adoptada en la recoleccin
de la planta, un paso crtico para la comprobacin de la actividad
antimicrobiana de las mismas, es la transformacin del material vegetal en las
sustancias (extractos, aceites esenciales, oleoresinas, etc) que tendrn
contacto con los microorganismos de prueba. Se deben tomar las medidas
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necesarias para garantizar que los posibles componentes activos no se
pierdan, se alteren o se destruyan durante la preparacin del extracto. Existen
varios mtodos de extraccin, pero uno de los ms usados por su simplicidad y
economa es la extraccin por solventes, que se basa principalmente en la
mezcla de solventes con material vegetal seco y pulverizado, aplicando o no
una temperatura especfica y agitando continuamente, con el fin de incrementar
la solubilidad de los compuestos intracelulares. Los tamizajes iniciales de las
plantas para hallar su posible actividad antimicrobiana suelen comenzar
utilizando extractos acuosos o alcohlicos y pueden ser seguidos por varios
mtodos de extraccin orgnica. Puesto que casi todos los componentes
activos contra los microorganismos identificados a partir de plantas son
aromticos o compuestos orgnicos saturados, son ms usadas las
extracciones iniciales con etanol o metanol. Es importante considerar la
extraccin tanto de los metabolitos polares como de los no polares, esto se
hace utilizando esquemas de extraccin secuencial en los cuales se obtienen
compuestos de polaridad descendente usando en la primera etapa solventes
alta polaridad y en etapas posteriores solventes cada vez ms apolares
(Vanden & Vlietinck, 1991). As, se pueden obtener n cantidad de extractos
segn la cantidad de solventes usados en la extraccin. Una vez el material
vegetal ha tenido suficiente contacto con los solventes seleccionados, estos
deben ser retirados de la mezcla, para esto usualmente se utiliza la
evaporacin de los mismos, tal evaporacin puede realizar en el rota-
evaporador, el cual permite la separacin del solvente y tras el secado
completo deja como resultado el extracto seco que ser finalmente es el que se
pondr en contacto con los microorganismos en la prueba de actividad
antimicrobiana.

4. Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana: Es en esta seccin del
procedimiento en la que se demostrar qu tanta actividad antimicrobiana tiene
el subproducto de la(s) planta(s) estudiada(s). Existen cuatro grandes grupos
de microorganismos (bacterias, hongos, virus y parsitos) y para cada uno de
ellos existe una abanico de tcnicas por la cuales se puede probar su efecto
inhibitorio, en los siguientes apartados se dar una breve idea de algunas de
las tcnicas usadas para cada uno de los grupos de microorganismos
mencionados.

4.1 Pruebas de susceptibilidad en bacterias: Son las ms numerosas en
cuanto a mtodos se refiere; pero la experiencia ha demostrado que no todas
las tcnicas de tamizaje propuestas poseen igual sensibilidad cuando se trata
de trabajar con subproductos derivados de plantas. Es importante anotar que
no existen mtodos estandarizados para probar la susceptibilidad de
microorganismos a extractos naturales, todas las tcnicas usadas para probar
tal susceptibilidad son adaptadas de las tcnicas aprobadas y estandarizadas
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por organizaciones tales como CLSI o EUCAST. Algunas de las tcnicas ms
utilizadas se describen a continuacin:

4.1.1 Principales Mtodos de difusin: Como su nombre lo indica, en estos
mtodos el antibitico o extracto debe difundir sobre una fase slida (agar),
dejando un halo de inhibicin alrededor del reservorio donde se encuentra. La
ventaja de este tipo de mtodos es la facilidad de ejecucin y el bajo costo, las
desventajas son entre otras la imposibilidad de medir directamente la
concentracin mnima inhibitoria (CMI) y los falsos negativos generados por
posible baja polaridad del extracto a probar. Las principales tcnicas son el
mtodo del disco, el mtodo del agujero en la placa de agar (hole-plate) y el
mtodo del cilindro (Ros, Recio, & Villar, 1988).

Mtodo del disco: La caracterstica esencial de este mtodo es el uso de
discos de papel de filtro de 6 mm de dimetro como reservorio del antibitico o
extracto que se colocar en la superficie del agar <generalmente Mueller
Hinton (MH)>previa siembra masiva de la bacteria que deber estar a una
concentracin equivalente a la escala de La incubacin se har a 35C
por 24 horas y su lectura ser reportada como los milmetros del halo
generado. Esta tcnica se usa actualmente en la prctica clnica para hacer el
tamizaje de la susceptibilidad a los antibiticos y se denomina antibiograma.
Fue estandarizado por primera vez por Bauer y colaboradores en 1966 (Bauer,
Kirby, Sherris, & Turck, 1966) y modificado posteriormente por la Organizacin
Mundial de la Salud para el uso normalizado en los laboratorios clnicos.

Mtodo del agujero en la placa de agar (Hole-plate): En este mtodo 200 L
del antibitico o extracto disuelto, se coloca en un agujero de 12 mm de
dimetro hecho en el agar previamente sembrado de forma masiva y con las
mismas especificaciones tcnicas del mtodo del disco (U.S Pharmacopeial
Convention, 1975).

Mtodo del cilindro: El reservorio de este mtodo es un pequeo cilindro
hueco de porcelana o acero inoxidable en el cul se depositan 100 L del
antibitico o extracto. Una vez se ha incubado, los cilindros son retirados y el
halo de inhibicin es medido y registrado (U.S Pharmacopeial Convention,
1975).

4.1.2 Principales Mtodos de dilucin: Estos mtodos requieren la dilucin
del antibitico o extracto en el medio de cultivo usado. La ventaja principal de
estos mtodos es permitir la medicin directa de la CMI y la desventaja es la
complejidad de su montaje. En general son ms aceptados que los mtodos de
difusin por su grado de estandarizacin y su precisin. Las principales
tcnicas son el mtodo turbidimtrico, la dilucin en caldo (macrodilucin y
microdilucin), y la dilucin en agar.
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Mtodo turbidimtrico: Es basado en la dilucin homognea de la sustancia a
probar (previamente solubilizada) en un medio de cultivo lquido previamente
inoculado que despus de la incubacin es leda (absorbancia) en un
espectrofotmetro a 530 nm (U.S Pharmacopeial Convention, 1975).

Dilucin en caldo: Se basa en una lectura turbidimtrica pero de simple
observacin visual, en la cual se ha sembrado la bacteria en una cantidad
definida de caldo (de preferencia caldo MH). Existen dos tcnicas diferentes
que estn normalizadas por el documento M07-A9 del CLSI (Clinical and
Laboratory Standards Institute, 2012):
Macrodilucin o mtodo en tubo: Consiste en la mezcla de la
sustancia a probar, diluida en 1 mL caldo MH con 1 mL del inculo
bacteriano cuya concentracin debe ser 5 10
5
UFC/mL, haciendo
diluciones seriadas del antibitico o extracto, las cuales se incuban a
35C por 24 horas para leerse de forma directa haciendo un subcultivo
con una gota de la ltima dilucin donde no se observa crecimiento para
determinar la CMI (que ser la concentracin del tubo inmediatamente
anterior al tubo del que no se obtuvo crecimiento en el subcultivo)
Microdilucin o mtodo en placa: Es llamado as porque en su
montaje se usa 0,1 ml de caldo MH mezclado con la sustancia a probar,
adicionando solo 0,01 mL del inculo bacteriano. La mezcla anterior se
deposita en pozos distribuidos en placas estriles de plstico de 96
pozos de fondo cnico o redondo. La MIC corresponde al pozo donde no
se observa crecimiento de la bacteria (botn) tras incubacin de 24
horas.

Dilucin en agar: En esta tcnica la sustancia a probar es disuelta en un
solvente apropiado y mezclado con el agar MH al momento de servirlo en la
placa de Petri. La suspensin bacteriana debe tener una concentracin de 10
4

UFC/mL y se coloca un 1 L de la misma en cada espacio de una cuadrcula
hecha previamente en el exterior de la caja de Petri. Informacin ms detallada
de la tcnica puede encontrarse en el documento M07-A9 del CLSI (Clinical
and Laboratory Standards Institute, 2012).

4.2 Pruebas de susceptibilidad en hongos: Las pruebas de susceptibilidad
para hongos no estn tan desarrolladas, ni son tan variadas como las que
existen para bacterias, esto puede evidenciarse comparando los primeros
documentos de estandarizacin de las pruebas para bacterias que datan de los
aos 70 y los primeros que aparecen para hongos en los aos 90. Esta
diferencia en el avance del desarrollo de los mtodos se debe al
descubrimiento paulatino de nuevos antimicticos y a la aparicin del fracaso
teraputico que empez a aparecer dcadas despus de la resistencia a los
antibiticos. Una condicin especial que debe tenerse en cuenta, es que
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existen hongos levaduriformes y hongos filamentosos y las tcnicas de
susceptibilidad a los antimicticos varan en uno y otro caso. De forma general
las pruebas de susceptibilidad para los hongos consisten en cuantificar la
inhibicin del crecimiento producida por el antifngico comparada con el
crecimiento de la levadura o moho en el mismo medio pero sin antifngico
(Cantn, Martn, & Espinel-Ingroff, 2007). A continuacin se describen muy
brevemente las tcnicas de macrodilucin, microdilucin y difusin en disco
para levaduras y las tcnicas de macrodilucin y microdilucin en caldo para
hongos filamentosos.

4.2.1 Macrodilucin (tubo) y microdilucin (placa) para levaduras: El medio
de cultivo usado tanto para la tcnica micro como para la macro es el RPMI
1640 con glutamina y sin bicarbonato sdico, tamponado con cido morfolino
propano sulfnico, ajustado a pH 7 y con 0,2% de glucosa. Una vez diluido el
antimictico (o sustancia a probar), el volumen final es de 1 mL en la
macrodilucin y de 200 L en la microdilucin; se harn las diluciones seriadas
que se consideren necesarias. Las placas se incuban a 35 C, las inoculadas
con especies del gnero Candida durante 48 h y las inoculadas con C.
neoformans durante 72 h. La lectura puede realizarse de forma visual
(macrodilucin y microdilucin) o por espectrotofometra (microdilucin) y la
CMI es la concentracin ms baja de antifngico que produce una reduccin
aparente del crecimiento de la levadura comparada con el crecimiento del
control despus de 48 h de incubacin. Este mtodo est normalizado por el
documento M27-A3 del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute,
2008b).

4.2.2 Difusin en disco para levaduras: El fundamento de esta tcnica es la
misma que para las bacterias, est basada en el estudio la sensibilidad de las
levaduras a los antifngicos en funcin del halo de inhibicin producido por la
difusin de los mismos en un medio de cultivo slido (MH con 2% de glucosa y
0,5 g/ml de azul de metileno) y est normalizado por el documento M44-A del
CLSI. El inculo de la suspensin fngica debe tener una concentracin
equivalente al tubo 0,5 de la escala de McFarland, la siembra se hace de forma
masiva aplicando los discos impregnados (del antifngico o sustancia a probar)
y la incubacin se realiza por 24 h para Candida spp o 48 para Cryptococcus
spp. La lectura ser equivalente a los mm de dimetro del halo de inhibicin
resultante (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2004).

4.2.3 Macrodilucin y microdilucin en caldo para hongos filamentosos:
Este mtodo est normalizado por el documento M38-A del CLSI. Las
caractersticas del medio de cultivo, pH, preparacin de la solucin madre de
antifngico y diluciones son similares a las del mtodo M27-A3 (para
levaduras). Dependiendo de la especie el tiempo de incubacin vara; desde
tiempos cortos, entre 21-26 h para Rhizopus spp, entre 46-50 h para los
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gneros Aspergillus, Fusarium y S. schenckii y entre 70-74 h para P. boydii
(Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008a).

4.3 Pruebas de susceptibilidad en virus: De manera tradicional se conocen
mtodos fenotpicos que utilizan mayormente el efecto citoptico o el uso de
anticuerpos monoclonales entre otros, como un marcador de eficacia o
ineficacia de un antiviral ante un virus determinado. Por otro lado despus de la
masificacin del uso de la biologa molecular, varios mtodos genotpicos han
sido desarrollados y plenamente validados, dando mayor exactitud a las
determinaciones de este tipo. En este apartado de describirn brevemente
algunos de las tcnicas ms usadas para este tipo de determinaciones.

4.3.1 Pruebas fenotpicas de susceptibilidad en virus: Como ya se ha dicho
las pruebas fenotpicas para evaluar la susceptibilidad a antivirales son
aquellas que se basan en un resultado que refleja la capacidad del virus de
provocar efecto citoptico en un cultivo celular, midiendo este efecto de forma
directa o indirecta. Algunos ejemplos de estas tcnicas son:

Ensayo de reduccin de placas (ERP): El principio del mtodo consiste en la
inhibicin de la formacin de placas virales o focos de efecto citoptico (ECP)
en presencia de un antiviral, debido a la inhibicin del crecimiento del virus. Los
pasos a realizar con este mtodo incluyen: i. cuantificacin del virus y dilucin a
una concentracin determinada de UFP/mL; ii. inoculacin de las placas de 96
pocillos; iii. adicin sobre la monocapa del medio que contiene el agente
antiviral; iv. incubacin; v. observacin de las monocapas para determinar el
nmero de placas; y vi. clculo de la concentracin inhibitoria 50 (CI50).
Se utilizan diferentes medios de cultivo celular para cada tipo de virus debido a
la especificidad que poseen los mismos (Swierkosz & Biron, 1995). Es
importante mencionar que aunque existen tcnicas ms sofisticadas, la ERP es
considerada como el mtodo gold standard por el cual otros mtodos son
evaluados.

Ensayo de absorcin de colorante (Dye uptake): Este mtodo se
fundamenta en la capacidad que poseen algunas clulas como las clulas Vero
que en su estado de viabilidad captan el colorante rojo neutro y su habilidad de
liberarlo en la presencia de un buffer de alcohol cido, lo que permite la
medicin de la reduccin de la muerte celular con la medicin de la
absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. Esta tcnica fue desarrollado
inicialmente por Finter en 1969 (Finter, 1969) y adaptada para el uso de
pruebas de sensibilidad en 1983 por McLaren y colaboradores, (MacLaren,
Ellis, & Hunter, 1983) pero su ltima modificacin fue realizada por Langlois y
su equipo en 1986 (Langlois, Allard, Nugier, & Aymard, 1986).

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4.3.2 Pruebas genotpicas de susceptibilidad en virus: Este tipo de pruebas
se fundamentan en la medicin de carga viral despus de la exposicin de un
cultivo celular a un virus en presencia de un antiviral o sustancia que acte
como tal. Son las pruebas ms aceptadas actualmente por su precisin pero su
costo es elevado. Algunos de estos mtodos son:

Mtodo de hibridacin de ADN: Este mtodo cuantifica el ADN de diversos
virus realizando una hibridacin de las hebras sencillas de ADN que se liberan
despus de la lisis celular de los cultivos que fueron infectados a diferentes
concentraciones del antiviral. Las sondas usadas en la hibridacin son
marcadas con I
125
y la radiacin cuantificada en un contador gamma ser
proporcional a la cantidad de virus que sobreviva a la accin del antiviral. La
concentracin que causa una reduccin del 50% en las lecturas del contador
gamma comparadas con la lectura de los controles de virus sin antiviral es la
CI50 (Swierkosz , Scholl, Brown, J ollick, & Gleaves, 1987).

Mtodo por PCR en tiempo real: Esta tcnica consiste en cuantificar los
niveles de ADN que quedan en el sobrenadante de un cultivo celular
(generalmente clulas Vero) despus de la exposicin a un virus y a cierta
concentracin de antiviral. El ensayo debe contar con primers y una sonda
fluorescente dirigida a un gen especfico para el virus que se est probando. La
CI50 se define como la concentracin del antiviral o extracto que reduce las
copias de DNA viral en un 50% con respecto al control sin antiviral (Stranska,
van Loon, Polman, & Schuurman, 2002). Tambin se han desarrollado mtodos
para cuantificar virus cuyo genoma es de ARN como el virus de la Influenza A
H1N1, usando PCR con transcriptasa reversa es decir RT-PCR (Wong,
Pabbaraju, Wong, Fonseca, & Drews, 2011).

4.4 Pruebas de susceptibilidad en parsitos: Este tipo de pruebas de
susceptibilidad son las que han sido menos desarrolladas debido a que las
tcnicas de cultivo de parsitos son de difcil manejo y mantenimiento. Los
mtodos ms desarrollados son aquellos que determinan la susceptibilidad de
antiparasitarios o molculas candidatas en parsitos de gran importancia en
salud pblica como el Plasmodium (causante de la malaria) o la Leishmania sp
y la E. histolytica. Generalmente los mtodos tradicionales usan el cultivo del
parsito e incorporan la sustancia a probar directamente en el medio de cultivo;
pero otras estrategias han sido empleadas para la estandarizacin y
mejoramiento de las pruebas. A continuacin se describirn dos estrategias
usadas con el objetivo de medir la susceptibilidad de los antiparasitarios o las
posibles alternativas farmacolgicas.

4.4.1 Mtodos tradicionales: Son aquellos en donde la sustancia a probar se
coloca directamente en el cultivo donde estn creciendo los parsitos para
despus de pasado un tiempo de incubacin, medir la viabilidad de los
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parsitos por medio de la incorporacin de indicadores de xido-reduccin
como el MTT (bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazolio) o el INT
(cido difenilamin-4-sulfnico, sal de Bario) que cambian de color al ser
reducidos por los parsito viables. Estas determinaciones se han hecho con
parsitos tales como Leishmania (Arruda, D'Alexandri, Katzin, & Uliana, 2005),
Plasmodium y algunos cestodos como R. echinobothrida en donde el efecto
inhibitorio se observa a simple vista por la cantidad de larvas o adultos muertos
despus de la exposicin al frmaco o sustancia probada (Lalchhandama,
2010).

4.4.2 Mtodos modernos: Con el advenimiento de la biologa molecular,
muchas de las tcnicas tradicionales dieron un giro de 180, el cual implica la
utilizacin de herramientas que aportan a las nuevas tcnicas mayor precisin
y rendimiento, adems de disminuir lo laborioso del procedimiento y el tiempo
de montaje. Una de estas tcnicas fue desarrollada por Franke-Fayard y
colaboradores, los cuales describen un mtodo sencillo para hacer tamizaje de
frmacos antimalricos contra estadios sanguneos de P. berghey, parasito
causante de malaria murina y modelo de prueba en la investigacin de P.
falciparum. En este ensayo se incorpor un gen de luciferasa al Plasmodium
bajo el control de un promotor que expresa la protena ama-1 la cual es una
protena expresada en la fase de esquizonte, estadio siguiente al de trofozoito
que es el estadio en el cual los parsitos son sembrados en RPMI 1640 con
20% FCS e incubados 24 horas en placas de 96 pozos que contienen
diluciones del frmaco. Tras la incubacin la CI50 es inversamente
proporcional a la cantidad de esquizontes que emiten luz con respecto a los del
control sin frmaco (Franke-Fayard et al., 2008). La anterior es solo una
muestra de las modificaciones que se han hecho ltimamente a las tcnicas
tradicionales que aunque son complejas y de baja precisin se siguen
utilizando ampliamente en los estudios de actividad antimicrobiana de extractos
y otros derivados de plantas.

Conclusiones
Tras un breve recorrido por las sendas del mtodo cientfico en la bsqueda del
efecto antimicrobiano de derivados de plantas (extractos vegetales) es notable
el gran desarrollo de esta seccin de la farmacognosia y de la complejidad de
los procedimientos que deben llevarse a cabo para que un compuesto o
molcula de origen vegetal (o de cualquier origen) sea propuesta como nueva
alternativa farmacolgica. Adicionalmente a los procedimientos anteriormente
mencionados no puede desconocerse el valor de la estadstica como tcnica
de validacin de los resultados obtenidos in vitro y el paso a fases posteriores
como las fases in vivo y los ensayos clnicos controlados que son procesos que
toman aos pero que son necesarios para la total validacin del frmaco. Con
todo y esto, son muchos los grupos de investigacin que estn trabajando en el
tema y an mucho mayor es la magnitud de recursos vegetales y naturales que
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faltan por estudiar. La aplicacin de cada uno de los pasos y tcnicas
mencionados a lo largo del escrito debe ser un requisito sine qua non que los
investigadores en este campo deben cumplir en miras a obtener trabajos con la
calidad cientfica suficiente para que confluyan en el descubrimiento de
alternativas farmacolgicas contra las enfermedades causadas por
microorganismos.


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