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Facultad de Medicina Dpto. Ciencias Bsicas Unidad de Biologa

Prof. Viviane de Jourdan R. Segundo semestre 2013

GUA DE LABORATORIO PERMEABILIDAD DE MEMBRANA INTRODUCCIN

La membrana plasmtica es una estructura existente en todos los tipos celulares. Es una envoltura continua que rodea a la clula y la separa del medio externo. La membrana, por las caractersticas qumicas de sus componentes, por la distribucin espacial y organizacin que stos presentan, es una estructura con mltiples e importantes funciones (no solamente limitar), constituye un muy buen ejemplo de relacin morfo-fisiolgica propia de la materia viva. La estructura y composicin qumica de la membrana plasmtica son similares en todos los tipos celulares y tambin a las presentadas por las endomembranas propias de clulas eucariotas. El espesor de las membranas vara entre los 6 y los 10 nm, lo cual indica que no todas las membranas (plasmtica y endomembranas) son exactamente iguales. Est compuesta qumicamente por lpidos (molculas ms pequeas y en mayor nmero), protenas (de gran tamao y menos numerosas) y glcidos, especficamente oligosacridos. Los tipos de lpidos de membrana en las clulas animales son: fosfolpidos (los ms abundantes), esfingolpidos y colesterol. Los fosfolpidos son un tipo de lpidos compuestos por una molcula de glicerol, a la que se unen dos cidos grasos (saturados o insaturados, iguales o diferentes entre s) y un grupo fosfato. El fosfato se une mediante un enlace fosfodister a otro grupo de tomos, pudiendo corresponder a: colina, serina, etanolamina, inositol, entre otros. Generalmente, este grupo de tomos incluye nitrgeno y muchas veces proporciona una carga elctrica al fosfolpido. La distribucin de los componentes qumicos de los fosfolpidos origina una cabeza esfrica polar e hidroflica de la que parten dos colas hidrocarbonadas hidrofbicas que corresponden a las cadenas de los dos cidos grasos. Esto hace que las molculas sean antipticas.

Representacin de una molcula de fosfolpido.

2 Los fosfolpidos ms abundantes son: fosfatidiletanolamina (o cefalina), fosfatidilcolina (o lecitina) fosfatidilserina, fosfatidilinositol.

Fosfolpidos importantes de la membrana. Los esfingolpidos son compuestos derivados de la esfingosina, que es un aminodialcohol (con un grupo amino y dos grupos OH) complejo que contiene una cadena larga insaturada. Los esfingolpidos se dividen en dos grupos: los fosfoesfingolpidos (esfingomielinas) y los glucoesfingolpidos (ganglisidos, cerebrsidos), que incluyen en su composicin qumica a una o ms molculas de glcidos.

Algunos esfingolpidos de membrana.

3 En la membrana, los fosfolpidos y esfingolpidos estn mezclados, forman dos capas de molculas (bicapa) y estn dispuestos de forma asimtrica, ya que no son exactamente los mismos en las dos caras de la membrana. Con criofractura la membrana plasmtica se fractura a nivel de la bicapa de lpidos separndose en 2 caras de fractura, la externa llamada cara E (hoja exterior o hemimembrana exoplsmica) y la interna llamada cara P (cara citoslica, hoja interna o hemimembrana protoplsmica). La externa da al exterior de la clula y la interna es la que da hacia el citoplasma.

Porcentajes de fosfolpidos en las caras E y P de la membrana plasmtica y su distribucin asimtrica. La molcula de colesterol posee una cabeza polar pequea, que corresponde al grupo alcohlico (-OH) que presenta, y una estructura compleja no polar formada por varios anillos. En la bicapa lipdica su grupo polar se sita junto a la cabeza de los fosfolpidos y el anillo inmoviliza parte de las colas de stos, dejando el resto de las colas flexibles.

Molcula de colesterol.

Colesterol en la bicapa lipdica.

Las molculas de lpidos de la membrana no son estticas sino que presentan movilidad permanente dentro de la bicapa. Los movimientos son de varios tipos: a) Difusin lateral: dos lpidos de la misma cara de la bicapa que estn juntos, se intercambian el uno por el otro. b) Flexin: las cadenas de cidos grasos se flexionan. c) Rotacin: el lpido gira sobre si mismo. d) Flip-Flop: el lpido que est en una cara de la bicapa, se intercambia por otro de la otra capa, lo que es poco frecuente. Estos movimientos hacen que la membrana sea fluida. Esta fluidez permite interacciones dentro de la propia membrana e interviene en procesos celulares como, citodiresis, fusin de membranas, sellado de microperforaciones, etc.

Movimientos de las molculas de lpidos. Las protenas no se disponen al azar sino que se orientan de forma particular dentro de la bicapa lipdica. Algunas protenas pueden estar agrupadas constituyendo un complejo proteico.

Protenas conformando un complejo. Al igual que los lpidos, la distribucin de las protenas en las membranas es asimtrica. Segn la posicin que presentan con respecto a los lpidos, se reconocen dos tipos de protenas: a) Integrales: unidas a los lpidos ntimamente, estn unidas a la bicapa lipdica y suelen atravesarla. Dentro de las protenas integrales las hay transmembrana, si la atraviesan de parte a parte una (un solo paso) o varias veces (varios pasos). Son molculas anfipticas. Estn sujetas por interaccin hidrfoba.

5 b) Perifricas: son molculas hidroflicas. Se unen a la membrana por interacciones hidroflicas con las cabezas de los lpidos o con las partes de las protenas integrales que tienen afinidad con el agua.

Protenas de membrana: integrales y perifricas. Las funciones que cumplen las protenas de membrana son muy importantes, mltiples, y variadas: algunas sirven de receptores, participando en procesos de reconocimiento intercelular, adhesin celular, otras permiten la comunicacin intercelular; otras estn relacionadas con el citoesqueleto; otras catalizan reacciones; otras actan participando en el ingreso y/o salida de partculas de la clula; etc.

Protenas de membrana y algunas de sus funciones. Los glcidos son el componente minoritario de la membrana plasmtica. Corresponden a oligosacridos y se encuentran siempre unidos covalentemente a protenas o a lpidos formando glucoprotenas o glucolpidos. Forman una cubierta en la cara E de la membrana: el glicoclix (glucoclix o glucocliz). Nunca existe en la cara P de la membrana, por lo tanto la distribucin de los hidratos de carbono en la membrana, al igual que los lpidos y las protenas, es asimtrica.

Superficie de las microvellosidades de una clula intestinal.

Por la distribucin de los componentes qumicos de la membrana, la observacin transversal, a travs del microscopio electrnico de transmisin (M.E.), proporciona una imagen que presenta 2 bandas oscuras que corresponden a las partes polares hifroflicas de los lpidos y de las protenas y una franja clara entre ellas, la cual corresponde a las cadenas de los cidos grasos y a las regiones apolares hidrofbicas de las protenas. A esto se denomina unidad de membrana de Robertson (U.M.R o U.M.) y es as para todas las membranas celulares.

Microfotografa electrnica de transmisin de una membrana plasmtica. Este aspecto conocido como unidad de membrana es la expresin de como el osmio, usado como fijador - colorante" se une a la membrana.

Modelo de membrana mosaico fluido. Existen regiones de la membrana adaptadas a diferentes funciones, tales como adsorcin, secrecin, transporte de lquidos, adherencia mecnica, interacciones con clulas adyacentes y

7 con la matriz extracelular. Ejemplos de diferenciaciones de membrana: microvellosidades, estereocilios, interdigitaciones, complejos de unin, etc.

Algunas diferenciaciones de la membrana plasmtica.

Otra caracterstica de la membrana plasmtica es su renovacin. Est continuamente aumentando por adicin de las membranas de vesculas provenientes del sistema de Golgi y, por otro lado, se est perdiendo membrana a travs de la endocitosis, lo que mantiene un equilibrio dinmico. Es evidente que la membrana plasmtica constituye la entrada y salida de todo tipo de partcula (iones, molculas), tanto desechos hacia el exterior, como la aportacin de material plstico y energtico a la clula. Este paso a travs de la membrana plasmtica se realiza de dos formas, con prdida energtica (con un trabajo para la clula) o sin gasto de energa. La permeabilidad es fundamental para la fisiologa de la clula y para el mantenimiento de condiciones fisiolgicas intracelulares adecuadas, pues condiciona la entrada de ciertas sustancias, muchas de las cuales son necesarias para mantener los procesos vitales y la sntesis de nuevas sustancias, y regula la salida de agua y de productos de excrecin, que deben ser eliminados de la clula. La presencia de una membrana al ser semipermeable y selectiva, establece una clara diferencia entre el lquido intracelular (LIC) y el extracelular (LEC), en el cual la clula est inmersa. La membrana mantiene un balance entre la presin osmtica del LIC y el LEC. Las soluciones pueden ser iso, hipo o hipertnicas con respecto al LIC: Los lquidos intra y extracelular tienen concentraciones inicas diferentes. En el LEC las concentraciones del Na+ y del Cl- son elevadas, mientras que la del K+ es baja. Dentro de la clula hay mucho K+ y poca cantidad de Na+ y Cl- , pero existe gran cantidad de aniones orgnicos que no atraviesan la membrana. En todas las clulas se detecta un potencial de membrana de 20 a 100 milivoltios. Las membranas celulares normalmente se hallan polarizadas y estn cargadas negativamente por dentro y positivamente por fuera.

Las sustancias pueden atravesar la membrana por diferentes MECANISMOS DE TRANSPORTE, y algunas sustancias lo hacen utilizando ms de uno de estos mecanismos. A.- TRANSPORTE PASIVO. El movimiento de las partculas que atraviesan la membrana, se debe a la energa propia de ellas (energa cintica) y a su tendencia migratoria y ocurre, por lo 7

8 tanto, sin gasto energtico; slo obedece a las leyes de la fsica. El movimiento de las partculas ocurre siempre a favor de gradiente, ya sea ste de concentracin o elctrica. Gradiente de concentracin: las molculas se dirigen del compartimiento de mayor concentracin hacia el de menor concentracin. Gradiente de potencial elctrico: el soluto con carga elctrica, independientemente de su signo, se desplazar de una zona donde la carga sea mayor hacia otra donde la carga sea menor. El transporte de un in es impulsado por el gradiente electroqumico, esto es que un in puede difundir de un lado a otro de la membrana, gracias a la diferencia de concentracin como a la diferencia de carga elctrica a ambos lados de la membrana. El transporte pasivo presenta las siguientes modalidades: 1) Difusin simple: las partculas atraviesan la matriz lipdica de la membrana. Hacen esto las molculas liposolubles (vitaminas A, D, E y K, esteroides, glicridos, etc.), las molculas polares sin carga (urea por ejemplo), gases (O2, CO2, CO, NH3, N2, etc.), solventes orgnicos (benceno, cloroformo, ter, alcoholes, etc.), agua, la que difunde lentamente. La velocidad con que una partcula difunde a travs de la matriz lipdica depende de su tamao, de sus caractersticas qumicas, de la solubilidad que sta tenga en lpidos (coeficiente de particin) y de los gradientes.

Difusin a travs de la matriz lipdica.

2) Difusin facilitada: el paso de partculas a travs de la membrana es facilitada por protenas de membrana, dndose las siguientes formas: a) Difusin a travs de canales (o poros) proteicos, los cuales presentan diferentes grados de selectividad. Algunos de estos canales estn diseados para el paso de un soluto especfico, es el caso de la acuaporina, protena canal que permite el paso solamente de agua. Las molculas de protenas canal presentan una abertura hidroflica y actan en forma similar a un tnel, sin unirse al soluto permiten que ste se mueva libremente a travs de ellas. Muchas protenas canal no permanecen abiertas permanentemente, sino que se abren o cierran en respuesta a estmulos actuando como puertas transitorias. Estos estmulos reguladores pueden ser: la presencia de una sustancia inductora especfica denominada ligando (ejs. Na+, CMPC), a veces el exceso de alguna sustancia (ej. Ca+2), una estimulacin mecnica, una modificacin de la carga elctrica de la membrana (cambio del potencial elctrico). 8

Diferentes tipos de canales proteicos. b) Difusin mediada por protenas transportadoras (permeasas o carriers): las partculas se unen a protenas de membrana especficas las cuales le facilitan el paso. Cuando la protena transportadora se une a la partcula, cambia su conformacin y luego que la partcula atraviesa la membrana, la recupera y queda disponible para facilitar el paso de otra partcula del mismo tipo. B.- TRANSPORTE ACTIVO. La clula debe aportar energa para el traslado de sustancia, el que se efecta en contra de gradientes. Los mecanismos de transporte activo son responsables que el contenido celular sea diferente al del medio. Corresponden a modalidades del mecanismo de transporte activo: a) Sistema de bombeo. Participa una protena especfica del tipo permeasa (transportadora) denominada bombay se requiere aporte energtico que proviene de hidrlisis de ATP o de una reaccin exrgnica. Algunos ejemplos de sustancias que utilizan el sistema de bombeo para pasar a travs de la membrana, son: iones, aminocidos, monosacridos.

Tipos de difusin (sin y con participacin de protenas) y sistema bomba.

10 a) Transporte en cantidad (o en masa): Incluye los procesos de endocitosis y exocitosis, entrada y salida de partculas, respectivamente, involucrando en ambos casos, la participacin de un trozo de membrana, del citoesqueleto y gasto de energa por parte de la clula.

Tipos de endocitosis.

Exocitosis

CUESTIONARIO PREVIO
1.- Compare los siguientes tipos de membrana: a) permeable, b) semipermeable, c) impermeable. D al menos un ejemplo de cada tipo de membrana. 2.- Defina los siguientes trminos: a) soluto, b) solvente, c) electrolito, d) difusin, e) osmosis, f) dilisis, g) gradiente. 3.- Indique a qu corresponde: a) gradiente de concentracin, b) gradiente elctrica, c) potencial de membrana, d) presin osmtica, e) energa cintica. 4.- Caracterice los siguientes tipos de medios: a) isotnico (o iso-osmtico), b) hipotnico (o hipo-osmtico), c) hipertnico (o hiper-osmtico). 5.- Qu concentracin de NaCl debe presentar una solucin para que sea isotnica para clulas humanas? 6.- Defina y caracterice los siguientes trminos: a) crenacin, b) citlisis, c) hemlisis, d) turgencia, e) plasmlisis. 7.- Adems de las clulas vegetales qu otros tipos celulares presentan pared celular? 8.- Cul es la importancia funcional de la pared celular?

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OBJETIVOS
1) Comparar los efectos que ocurren en clulas animales y vegetales, provocados por soluciones de concentraciones diferentes. 2) Adquirir habilidad y destreza en la elaboracin de micropreparados. 3) Reconocer el efecto que produce el comportamiento selectivo (permeabilidad diferencial) de la membrana plasmtica. 4) Utilizar adecuadamente un microscopio ptico compuesto. 5) Completar los diagnsticos de las observaciones realizadas a travs del microscopio ptico compuesto. 6) Seguir las recomendaciones de seguridad para el trabajo de laboratorio.

ACTIVIDADES ACTIVIDAD N1: ACTIVIDAD OSMTICA EN CLULAS VEGETALES.

En el centro de un portaobjeto, que marcar como a, coloque una gota de agua destilada y sobre sta extienda un trocito de epidermis de catfilo de cebolla, no mayor a 0,5 cm. por lado. Agregue otra gota de agua destilada sobre el material y coloque un cubreobjeto. Ubique el micropreparado sobre papel filtro y doble el papel filtro por sobre el cubreobjeto, de manera que el papel filtro pueda absorber el exceso de lquido de los bordes del cubreobjeto. Revise que el microscopio est en posicin inicial, que consiste en: Observe a travs del microscopio ptico compuesto, utilizando el objetivo 40x (aumento total 400x). Complete el diagnstico de la observacin. Coloque el microscopio en posicin inicial y retire el micropreparado desde la platina. Marque otros 2 portaobjetos como b y c, En cada uno de los portaobjetos coloque nuevos trocitos de epidermis de catafilo de cebolla. * REPITA EL PROCEDIMIENTO INDICADO ANTERIORMENTE, CAMBIANDO SLO LO SIGUIENTE: En el portaobjeto b reemplace el agua destilada por solucin de NaCl al 10%. En el portaobjeto c reemplace el agua destilada por solucin de NaCl al 0,9%. .

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DIAGNSTICO DE LAS OBSERVACIONES OBJETIVOS: a) Determinar los eventuales cambios que pueden presentar las clulas
vegetales frente a medios de diferente concentracin osmtica. b) Diferenciar clulas turgentes, plasmolizadas y clulas normales. AUMENTO: 400x D.C.V.: ....

Micropreparado a Medio celular: agua destilada.

Micropreparado b Medio celular: Solucin de NaCl 0,9%.

Micropreparado c Medio celular: Solucin de NaCl 10%.

El micropreparado c, en que utiliz solucin de NaCl al 10%, examnelo tambin con el aumento mayor (1.000x) y dibuje.

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Micropreparado c Medio celular: Solucin de NaCl 10%.

Recuerde que antes de retirar el micropreparado desde la platina del microscopio, debe disponer el microscopio en posicin inicial.

ACTIVIDAD N 2: ACTIVIDAD OSMTICA EN CLULAS ANIMALES.

El material que va a observar a travs del microscopio ptico compuesto, corresponde a sangre humana. Para obtener este material deber desinfectar uno de sus dedos con alcohol yodado y luego pinchar la yema del dedo utilizando una lanceta hematolgica. Con un trocito de papel engomado, marque un portaobjeto como a.Coloque al centro del portaobjeto una gota de sangre. Sobre la gota de sangre ubique un cubreobjeto. Coloque el micropreparado sobre papel filtro y doble el papel sobre el cubre y sin presionar, retire el exceso de lquido. Rpidamente, enfoque a travs del microscopio ptico compuesto. Observe utilizando finalmente el objetivo mayor (100x). Recuerde que debe utilizar aceite de inmersin.. Al no aplicar colorante a la sangre, es difcil diferenciar eritrocitos de leucocitos pero, la mayora de las clulas de la sangre corresponde a eritrocitos y stos se caracterizan por su forma de discos bicncavos. Fije su atencin en ellos. Represente lo observado en el crculo del diagnstico correspondiente. Coloque el microscopio en posicin inicial y retire el micropreparado desde la platina. Con papel engomado, marque otros portaobjetos b, c y d. En el portaobjeto b coloque otra gota de sangre y agregue una gota de solucin de NaCl al 0,9%. Coloque un cubreobjeto. Ubique el micropreparado sobre papel filtro y doble el papel sobre el cubre para retirar el exceso de lquido. Rpidamente, enfoque a travs del microscopio ptico compuesto, utilizando finalmente el objetivo mayor (100x). Represente lo observado en el crculo del diagnstico correspondiente. Coloque el microscopio en posicin inicial y retire el micropreparado desde la platina. En el portaobjeto c coloque otra gota de sangre y agregue una gota de solucin de NaCl al 10%. Coloque un cubreobjeto. Ubique el micropreparado sobre papel filtro y doble el papel sobre el cubre para retirar el exceso de lquido. Rpidamente, enfoque a travs del microscopio ptico compuesto, utilizando finalmente el objetivo mayor (100x). Represente lo observado en el crculo del diagnstico correspondiente. 13

14 Coloque el microscopio en posicin inicial y retire el micropreparado desde la platina. En el portaobjeto d coloque otra gota de sangre y agregue una gota de agua destilada. Coloque un cubreobjeto. Ubique el micropreparado sobre papel filtro y doble el papel sobre el cubre para retirar el exceso de lquido. Rpidamente, enfoque a travs del microscopio ptico compuesto, utilizando finalmente el objetivo mayor (100x). Represente lo observado en el crculo del diagnstico correspondiente. Coloque el microscopio en posicin inicial y retire el micropreparado desde la platina. DIAGNSTICO DE LAS OBSERVACIONES OBJETIVOS: a) Determinar los eventuales cambios que pueden presentar las clulas animales frente a medios de diferente concentracin osmtica. b) Diferenciar clulas crenadas y clulas normales. AUMENTO: 1.000 x D.C.V.: ...

Micropreparado a
Material: Sangre humana.

Micropreparado b
Material: Sangre humana. Medio celular: Solucin de NaCl 0,9%.

Micropreparadoc Material: Sangre humana.

Medio celular: Solucin de NaCl 10%.

Micropreparado d
Material: Sangre humana. Medio celular: Agua destilada.

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ACTIVIDAD 3: SELECTIVIDAD DE MEMBRANA PLASMTICA.

Marque los extremos de un portaobjeto como A y B, como se indica en la siguiente figura:

En las zonas marcadas con crculos en la figura, coloque en A una gota de suspensin de levaduras, una gota de solucin Rojo Congo y un cubreobjeto. Mezcle con un alfiler. Retire el exceso de lquido utilizando papel absorbente. En la zona B coloque una gota de suspensin de levadura que ha sido previamente mezclada con metanol, una gota de sol. Rojo Congo y un cubreobjeto. Mezcle con otro alfiler. Retire el exceso de lquido utilizando papel absorbente. Observe al microscopio ptico compuesto cada zona, utilizando finalmente el objetivo mayor y compare. En cul zona A o B las levaduras estn todas teidas?

DIAGNSTICO DE LAS OBSERVACIONES

OBJETIVO: Reconocer el efecto que produce el comportamiento selectivo (permeabilidad diferencial) de la membrana plasmtica. MATERIAL: Suspensin de levaduras. AUMENTO: 1.000x D.C.V.: ....

Zona A Susp. de levaduras y sol. Rojo Congo.

Zona B Susp. de levaduras con metanol y sol. Rojo Congo.

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16 Para finalizar: Entregue los portas y cubreobjetos que utiliz. Antes de guardar el microscopio, limpie las lentes del microscopio con solvente. Asegrese que el microscopio est en posicin inicial. Guarde el microscopio en el estante y coloque sobre l, la cubierta protectora. Deje el mesn limpio y seco.

CUESTIONARIO FINAL
1) Haga un resumen de los cambios observados en las clulas vegetales y animales , segn aplic agua destilada o soluciones de NaCl 0,9% y 10%. 2) De los lquidos que agreg a las clulas vegetales y animales Cul corresponde a un medio a) isotnico, b) hipotnico y c) hipertnico? 3) Qu factores afectan la velocidad de difusin? 6) Caracterice: a) suero fisiolgico, b) suero glucosado (o glicosado). Cmo los preparara? 4) Qu proceso fue el responsable de los cambios observados en las clulas vegetales y animales? Es un proceso que requiere energa por parte de la clula? 5) Qu se requiere para que se produzca osmosis? 6) Caracterice y compare los procesos de osmosis y dilisis. 7) Cul es la importancia de la osmosis y de la dilisis en los organismos vivos? 8) Complete la siguiente tabla: Clula con pared celular Medio isotnico Medio hipotnico Medio hipertnico 9) Qu tipo celular, animal o vegetal, es ms resistente a las soluciones hipotnicas? Fundamente. 10) Qu tipo celular, animal o vegetal, es ms resistente a las soluciones hipertnicas? Fundamente. 11) Compare en forma general, los mecanismos de transporte de membrana pasivo y activo. 12) Nombre (a los menos 3) sustancias que ingresan o salen de la clula utilizando cada uno de los siguientes mecanismos de transporte: a) Difusin a travs de la matriz lipdica. b) Difusin a travs de poros (o canales proteicos). c) Difusin facilitada por permeasas, d) Sistema de bombeo. e) Transporte en cantidad (o en masa). 13) Cules mecanismos de transporte son causantes de las diferencias de concentracin y de carga existentes en los lquidos intracelular (LIC) etracelular (LEC)? 14) Averige en qu consiste la dilisis renal y cul es su importancia. Clula sin pared celular

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BIBLIOGRAFA
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