1 Bases cientficas de la regeneracin cardiaca Ana Snchez Garca. Unidad de Medicina Regenerativa.

Instituto de Biologa y Gentica Molecular Universidad de Valladolid/CSIC

A pesar de muchos retrocesos y decepciones, naturales durante el establecimiento de cualquier terapia nueva, la cardiologa regenerativa ofrece un enorme potencial teraputico. Las clulas de la mdula sea (CMO) y las clulas madre mesenquimales (CMM) han sido, por ahora, las ms utilizadas en los ensayos clnicos. Las primeras tienen la ventaja de su altamente comprobada seguridad, pero los datos recientes sugieren que las CMM podran ser tener mayor plasticidad. Las clulas del estroma de la mdula sea estn en la interseccin entre estas dos categoras. Los ensayos clnicos con CMO han mostrado resultados teraputicos relativamente modestos y sera conveniente revisar protocolos y diseos para aumentar la eficacia. Es esencial obtener ms informacin acerca de los mecanismos para llevar a cabo modificaciones racionales del diseo, y esto requiere aumentar la investigacin bsica asociada a los ensayos clnicos. La experimentacin en animales grandes, ms prximos al modelo humano, sera de gran ayuda para refinar los protocolos. Por otro lado, los modelos in vitro son muy tiles para probar rpida y simultneamente un gran nmero de modificaciones sistemticas. Las clulas madre residentes cardiacas (CMRC) han despertado grandes expectativas y la puesta a punto de frmacos capaces de activar, movilizar y estimular las CMRC para generar cardiomiocitos in situ, as como la expansin de la CMRC in vitro son dos objetivos claros. Algunas poblaciones de progenitores cardiacos podran tambin rellenarse con CMO circulantes. Las clulas madre embrionarias (CME) necesitarn ms tiempo para entrar en la teraputica, pero la investigacin con CME es igualmente importante y debe servir de fuente de inspiracin para la medicina regenerativa. La produccin de clulas pluripotentes inducidas (iPSC) abre una va completamente nueva, que acerca las clulas madre adultas y embrionarias. La investigacin con distintos tipos de clulas madre no es antittica, sino complementaria.

Es inmortal nuestro corazn?

Es muy importante que reconozcamos la capacidad regenerativa del corazn pues, de lo contrario, tras una lesin destructiva del tejido cardiaco nuestros esfuerzos se limitaran a intentar preservar lo que sobrevivi despus de un accidente isqumico, sin tan siquiera pensar en otras posibilidades teraputicas. Sabemos hoy que en el ratn, el nmero de clulas que entran en el ciclo mittico cada da, medidas con bromodeoxiuridina, es el mismo que el de las clulas que entran en apoptosis: entre el 0,25 y el 1 % de la poblacin total de cardiomiocitos. Esto representa una renovacin total del tejido cardiaco del ratn en menos de un

ao . En el caso del corazn humano, con cifras de recambio en torno al 0.06%, la renovacin total ocurrira en 4-5 aos . Otras estimaciones del recambio cardiaco, oscilan entre 0.0005 y 3% . En cualquier caso estudiando el parenquima cardiaco del ratna lo largo de la vida adulta, se pueden constatar imgenes de miitosis en varias fases, como puede verse en la figura 1, parte superior. Sin embargo, es bien conocido que despus de un infarto agudo de miocardio (IAM) el parnquima cardaco no regenera espontneamente. Durante el denominado remodelado cardiaco la lesin es substituida por una cicatriz de tejido fibroso, sugiriendo que el potencial de las clulas madre residentes cardiacas (CMRC) no es suficiente para una reposicin significativa del tejido lesionado, como puede verse en la Figura.

Reparacin cardiaca por clulas de la medula sea

El inters en la regeneracin cardaca y su aplicacin clnica arranc en 2001 cuando Orlic y colaboradores demostraron que clulas Lin-negativas y ckitpositivas procedentes de mdula sea (MO), eran capaces de reparar infartos agudos de miocardio en ratn, reponiendo de novo tanto el msculo como los vasos, y logrando una notable recuperacin morfolgica y funcional en solo 10 das.

Ckit+ & GFP+

GFP mouse

La novedosa hiptesis en la que se sustentaban tales hallazgos era la generacin de cardiomiocitos, endotelio y msculo liso a partir de progenitores de MO. La plasticidad de clulas madre adultas esta en un momento de intenso debate, que a veces supera el terreno cientfico, por lo que el lector interesado debe examinar revisiones recientes en este campo. Es bien conocido que infartos de miocardio agudos de gran extensin, conducen casi indefectiblemente a la insuficiencia cardiaca en cinco aos. Por otra parte, la eficacia y seguridad de las clulas progenitoras de mdula sea ya ha sido extensamente probada en el tratamiento de enfermedades hematolgicas en los ltimos 50 aos. No es de extraar por tanto que los intentos tratar el IAM en los pacientes con clulas progenitoras de

mdula sea no se hiciesen esperar. Los resultados del primer ensayo clnico fueron publicados un ao despus del artculo de Orlic , y en la actualidad han sido ya tratados ms de 1000 pacientes. Los resultados obtenidos en varios ensayos y metaanlisis se resumen en la Tabla 1 TABLA 1. Ensayos clnicos de regeneracin cardiaca.
Num. ESTUDIO Strauer y col., 2002 Diseo CMO (F) Cels. 1-3x10
7

Num. Patients (Seguimiento) 10 (3 meses) FE NS Otros Resultados Disminucin tamao infarto Mejora volumen/contraccin, volumen sistlico final, contractilidad y movilidad de la pared

TOPCARE-AMI, Assmus y col., 2002

CMO (F) CircPg

2.5x108 8x10
7

9 and 11 (4 meses)

+8%

Mejora viabilidad miocrdica, volumen sistlico final y movilidad de la pared. Resultados similares al ao en (30+29 pacientes) (Schachinger y col, 2004

TECAM, Fernandez Aviles y col., 2004 BOOST, Wollert y col., 2004 (14); Meyer y col., 2006 Janssens y col., 2006 ASTAMI, Lunde y col., 2006 ) REPAIR-AMI, Schachinger y col., 2006)

CMO (F)

8*10

20 (6 meses)

+6%

Mejora volumen sistlico final y funcin regional. Aumento del grosor de la pared infartada

CMO (T) Aleatorizado CMO (F) Aleatorizado, doble ciego BMC (F) Aleatorizado BMC (F) Aleatorizado, doble ciego

2.5x10

30 (6 meses) 30 (18 meses)

+6% NS NS

Recuperacin ms rpida con CMO? Disminucin tamao infarto Mejora de funcin regional

3x108

33(3 meses)

7*107 2.4*10
8

47 (6 meses) 101 (4 meses)

NS 5.5%

No diferencias en el tamao del infarto El placebo aumento la FE 3% Mejores resultados en pacientes con mayor cada de la FE Reduccin de eventos clnicos adversos a los 12 meses

Como puede verse la factibilidad y seguridad de los ensayos esta demostrada, pero la eficacia es modesta. Por ejemplo, en la fraccin de eyeccin algunos autores muestran una mejora del 5-6%, mientras que otros no ven mejora alguna. La misma ligera mejora se puede aplicar a otros parmetros estudiados. Parece claro, por tanto, que existen diferencias con los magnficos resultados previamente obtenidos en roedores. Este punto debera ser tomado en consideracin antes de iniciar nuevos ensayos.

Por otra parte, las diferencias en el diseo, la seleccin, el origen celular, dosis, va y momento de aplicacin hacen que los resultados sean difciles de comparar. Pero el principal problema es que no tenemos una idea clara de la interpretacin a nivel celular de los resultados obtenidos, ya que solamente en algunos casos se han llevado a cabo ensayos celulares bsicos en paralelo. Los resultados iniciales fueron interpretados en trminos de transdiferenciacin de las clulas de la MO a cardiomiocitos y capilares, como en el ratn. Sin embargo, otras hiptesis como la angiognica y la paracrina han cobrado gran fuerza en la actualidad. En el primer caso, los precursores de clulas endoteliales produciran capilares que ayudaran a preservar ms cardiomiocitos en la zona de penumbra. En el segundo, las clulas infundidas produciran factores trficos que evitaran la muerte celular y/o estimularan la proliferacin de las de clulas madre residentes como se muestra en la Figura.
Clulas progenitoras

MECANISMOS

Incorporacin perivascular

Diferenciacin a fenotipo endotelial

Produccin de factores paracrinos

Diferenciacin a fenotipo cardiaco

Fusin

FUNCIONES

Mejora de la neovascularizacin

Regeneracin cardiaca

Clulas Madre Residentes

Otra frontera en el campo de la regeneracin cardaca ha sido la identificacin de clulas madre residentes cardiacas (CMRC). La caracterizacin y clonacin de las CMRC en el corazn adulto son muy recientes. Las CMRC se encuentran en nichos especficos diseminados en el espesor de la pared cardiaca . En muchos casos expresan varios marcadores de clulas madre, como el c-Kit. (El receptor del factor de crecimiento de clulas madre o SCF, de Stem Cell Factor), el antgeno 1 de clula madre (Sca-1) o la glicoprotena P (tambin llamada MDR-1, de Multi-Drug Resistence), o incluso todos ellos. Las CMRC pueden realizar divisin asimtrica, lo que asegura la auto-renovacin. Son clulas multipotenciales, capaces de originar progenitores cardacos (PgC) comprometidos a cada uno de los linajes cardacos, cardiomiocitos, clulas del msculo liso y clulas endoteliales Los progenitores cardacos tienen la capacidad de proliferar y convertirse en precursores (PrC) y, finalmente, en clulas diferenciadas. Se cree que el factor que define la tasa de expansin para las CMRC de ratn ronda el 1000x. La cantidad de cardiomioctos nuevos producidos diariamente en el corazn humano ha sido cuantificada en aproximadamente 5 x 106, pero podra verse incrementado unas 100 veces tras un IAM. Este incremento se debe por un lado al crecimiento en el nmero de CMRC y a un aumento en la frecuencia del ciclo celular. Las CMRC tambin aumentan durante la hipertrofia cardaca inducida por la estenosis artica, como puede verse en la Figura.

NICHO

HIPERTENSION EXPERIMENTAL

1COLONIA

El origen de las Clulas Madre Residentes Cardiacas

El origen de las CMRC no esta resuelto en la actualidad. Podran representar restos de clulas pluripotentes del perodo embrionario o ser la expresin de clulas madre extrnsecas que colonizaron el corazn llegando a travs de la sangre. Esta posibilidad fue apuntada por primera vez tras la observacin de quimerismo en transplantes en los que se utilizaron clulas donantes del sexo opuesto. Por ejemplo, se constat en mujeres que recibieron transplantes de mdula sea donada por hombres, algunos cardiomiocitos mostraban el cromosoma Y . Paralelamente, en varones transplantados con un corazn proveniente de un donante femenino se detecto la presencia de cardiomiocitos, clulas del msculo liso y, ms frecuentemente, las clulas endoteliales que portaban cromosoma Y

CHIMERISM (X,Y) DONNOR

Y CHROMOSOME
CARDIOMYOCYTES

94 %

XX

M IOCITO MIOCITO 103 %

SMOOTH MUSCLE MU SC. LISO

71%

ENDOTHELIUM

XX XY
RECEPTOR

ENDOT ELI O

Estos resultados sugieren que las CMO pueden anidar en el corazn y producir CMRC, PgC, PrC o clulas diferenciadas Por tanto el origen de las nuevas clulas cardacas podra ser doble, intrnseco o extrnseco. El proceso por el cual se produce la transformacin de CMO a clulas cardacas podra transdiferenciacin o desdiferenciacin de una clula madre comprometida o diferenciacin de una clula madre pluripotencial proveniente de la mdula sea.

En cualquier caso, se ha demostrado recientemente que algunas CMO son clonognicas y tienen la capacidad de auto renovarse y de llevar a cabo una diferenciacin hacia tres linajes cardiomiocitos, clulas del msculo liso y endoteliales Por otro lado, algunos estudios independientes sobre clonacin han demostrado que las clulas estromales adultas de mdula pueden dar origen a las llamadas clulas cardiomiognicas (CMG) que se diferencian a cardiomiocitos Entre las clulas de MO, las clulas estromales, generalmente llamadas clulas mesenquimales tienen una mayor plasticidad para producir clulas diferenciadas que otros tipos celulares provenientes de mdula sea. Las clulas madre
mesenquimales (CMM) se pueden obtener de otros tejidos adems de la mdula sea y pueden ser expandidas en un laboratorio de calidad Farmacutica para uso clnico.

Cual es la llamada para las clulas madre?

Debe existir algn mensajero que haga a las clulas residentes dividirse o que promueva el anidamiento de las circulantes hacia el tejido lesionado . En el corazn de ratn las clulas de medula sea inyectadas se acumulan selectivamente en el rea lesionada En el corazn de pollo en desarrollo las CMO inyectadas tambin se dirigen a la lesin., como puede verse en la Figura.
SDF1-INDUCED MIGRATIONOF DiI CD34+ BMCs HOMING
microinjection

LESION
MICROSPHERES SDF1-LOADED

El mensajero debera ser similar en todos los tejidos y ser liberado por las clulas daadas. Citoquinas como el factor estimulador de colonias (G-SCF) o el factor de crecimiento de clulas madre (SCF de Stem Cell Factor), movilizan progenitores de la medula sea, contribuyendo a la reparacin cardaca . El factor estimulador de colonias G-CSF tambin estimula la migracin y diferenciacin a cardiomiocitos de clulas cardiomiognicas derivadas de clulas estromales. Los extractos de clulas embrionarias, ricos en factores de crecimiento, podran ser tambin medios condicionados adecuados, ya que en presencia de clulas embrionarias, las clulas madres adultas ven favorecida su plasticidad

Conclusiones.

A pesar de muchos retrocesos y decepciones, que son naturales durante el establecimiento de una nueva terapia, la cardiologa regenerativa ofrece un enorme potencial teraputico. Las CMO y las CMM han sido las ms frecuentemente utilizadas en los ensayos clnicos en humanos. Las CMO tienen a su favor la experiencia previa de 50 aos de uso teraputico para las enfermedades hematolgicas, que han probado exhaustivamente su bioseguridad. Las CMM parecen tener un mayor potencial plstico, pero su bioseguridad a largo plazo no ha sido probada en detalle. Las clulas estromales de mdula sea estn en la interseccin de los dos tipos celulares escritos. Los resultados de los ensayos clnicos han sido relativamente modestos. Es tiempo quiz de revisar los protocolos y diseos para mejorar los resultados. El conocimiento de los mecanismos de accin sera muy til guiar modificaciones racionales del diseo teraputico, y esto requerira aumentar el componente de investigacin bsica asociada a los ensayos clnicos. La experimentacin animal en modelos ms prximos al ser humano seran muy tiles para refinar los protocolos clnicos. Por otro lado, el uso de modelos in vitro es muy util, ya que permite probar rpidamente modificaciones sistemticas de diferentes variables y posibles mejoras. La combinacin de la informacin obtenida en diferentes modelos, in vitro, animales y humanos, facilitar la traslacin a la clnica. Las clulas madre residentes del corazn, descubiertas recientemente, abren nuevas esperanzas y expectativas. Los frmacos capaces de despertar las clulas madre residentes y de movilizarlas para formar tejido contrctil in situ o la expansin celular in Vitro seguida de la inyeccin en el rea daada son dos de los objetivos ms obvios. Debe recordarse que algunas poblaciones de progenitores cardiacos, como la de clulas colaterales (SPC) o las clulas cardiomiognicas (CMG) pueden rellenarse a partir de clulas circulantes procedentes de la mdula sea . Las clulas embrionarias) humanas requerirn ms tiempo para entrar en el arsenal teraputico, pero esto no quiere decir que sean menos interesantes como objeto de investigacin. Por el contrario, el estudio de la proliferacin y diferenciacin de las CME debe ser la fuente de inspiracin la Medicina Regenerativa. La produccin de clulas pluripotentes inducidas (iPSC) abre una va completamente nueva, que acerca las clulas madre adultas y embrionarias. La investigacin con distintos tipos de clulas madre no es antittica, sino complementaria.