Fundamentos de La Filogenia Molecular

Arturo Sez Seplveda, 2000.

Estudio bibliogrfico para la asignatura Prehistoria de Amrica I, a cargo del Prof. Francisco Mena L.

Introduccin Los estudios recientes sobre poblamiento americano son una muestra de la tendencia a la prctica de un mayor nmero de investigaciones interdisciplinarias percibida durante los ltimos aos. Esto esta representando un cambio a gran escala dentro de la ciencia en respuesta a la alta especializacin de disciplinas durante la primera parte del siglo pasado. La antropologa es un caso especial donde tambin pueden observarse las consecuencias de esta tendencia a eliminar los lmites entre disciplinas. La antropologa ha visto como sus ramas se han separado peligrosamente excusadas en la exclusividad de sus temas de estudio. Este trabajo es un intento ms por integrar a las diversas ramas de la antropologa y reunir fuerzas en pro de responder al problema del poblamiento de Amrica. Aunque este es un problema que concierne a principalmente a la arqueologa, la antropologa social ha aportado tambin con datos que han permitido formular hiptesis acerca de los patrones de comportamiento de los grupos humanos que en algn momento poblaron el nuevo continente. Por otra parte la antropologa fsica tambin ha contribuido a la solucin de este problema con datos basados en craneometra, morfologa dental, inmunologa, grupos sanguneos, etc. Por otro lado la lingstica tambin ha hecho lo suyo a partir de datos obtenidos por glotocronologa. Aportes de otras ciencias como la ecologa, y la geologa, entre otras, tambin han sido importantes (Meltzer, 1993; Turner, 1983; Greenberg et al, 1986). Podemos ver como este cuadro nos muestra a un cuerpo bastante numeroso de disciplinas que se ha reunido para solucionar un problema propio de la arqueologa. Es el objetivo de este trabajo interiorizar a los estudiantes de arqueologa de los mtodos, tcnicas y modelos que permiten realizar estudios basados en la gentica de las poblaciones humanas, especficamente de los anlisis realizados basndose en el DNA mitocondrial, ya que, debido a la ya citada especializacin que se sufre desde la enseanza media, la mayora de los estudiantes del rea de las Ciencias Sociales poseen muy poca o carecen absolutamente de alguna formacin en biologa. A pesar de este problema, existen elementos tericos en estos estudios que al ser dominados facilitan la compresin de los resultados obtenidos sin necesidad de poseer un conocimiento acabado de biologa celular y gentica de poblaciones. Previamente, deseo advertir que los mitos acerca de la dureza relativa de las ciencias en cuanto a sus teoras y metodologas, no son ms que eso: mitos. Veremos ms adelante que los estudios de gentica de poblaciones adolecen de los mismos problemas (tanto en nmero y/o en calidad) que los realizados por arqueologa. Por lo tanto carece de todo sentido y validez considerar a los estudios sobre DNA como la piedra rosetta del poblamiento americano, y en ningn caso se debe pretender coronar a estos estudios como nica fuente de certeza al respecto. Es ms, la responsabilidad final sobre la evaluacin de los datos provenientes de otras disciplinas recae exclusivamente sobre los arquelogos, quienes deben tener conocimiento de estos datos y formular hiptesis a partir de stos que puedan ser

contrastadas finalmente con el registro arqueolgico 1. Con esto quiero decir que la antropologa fsica no es, en el fondo, ms que una fuente, entre otras, de datos para la resolucin de los problemas antropolgicos y que su objetivo final es el mismo que el de sus disciplinas hermanas. Cada cual posee ciertas caractersticas propias que la hacen nica e indispensable para abordar de la manera ms completa el estudio del ser humano. En general, la antropologa utiliza ciertos rasgos como e l lenguaje, el parentesco, tabes y las costumbres sociales para reconocer distancias relativas y grados de relacin entre las diversas culturas. En arqueologa se utilizan los restos materiales para reconocer estas relaciones. Por otro lado, la antropologa fsica hace lo suyo a travs de los rasgos biolgicos de los grupos humanos. En este mismo sentido, los genes (o como veremos mas adelante, determinadas secuencias de nucletidos) tambin sirven como marcadores de la gran variabilidad que presenta la especie humana y que nos permiten conocer sus orgenes ancestrales. Como ya se dijo, este trabajo se propone interiorizar al lector de aquellas teoras, supuestos, metodologas y tcnicas relacionadas a los estudios de las migraciones humanas basados en el DNA mitocondrial. Se expondrn, por tanto, los elementos necesarios para comprenderlos. La primera parte del trabajo consistir en una introduccin a ciertos conceptos en los que se basan estos estudios, tomados de la gentica molecular y poblacional. Luego se describirn las tcnicas con que se consiguen los datos y por ltimo, se presentarn de manera general, los resultados que se han obtenido durante aproximadamente veinte aos de investigacin. Estructura del DNA El DNA (cido desoxirribonucleico) es una molcula (Figura 1) formada por dos cadenas complementarias de polinucletidos que estn unidas y son paralelas entre s (Watson and Crick, 1953)2. Los nucletidos son las subunidades o eslabones de la doble cadena y estn formados por una base nitrogenada, un grupo fosfato y un azcar. Las bases nitrogenadas del DNA son cuatro: adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). Los nucletidos estn dispuestos en la molcula de DNA de manera yuxtapuesta, por lo que pueden reconocerse secuencias de las bases que miran hacia el interior de la cadena (Figura 2) (Por ejemplo, una determinada cadena AAGGCTCGT es paralela a su complementaria TTCCGAGCA.).

La Arqueologa lleva la batuta, es decir, tiene a su cargo la direccin de una orquesta compuesta por aquellas disciplinas que buscan resolver el problema del poblamiento de Amrica. 2 James D. Watson y Francis H.C. Crick (1953) determinaron la estructura del DNA. A partir de este momento, comienza en biologa un fenmeno histrico llamado revolucin molecular, revolucin que lleva ya 50 aos y que a esta fecha cuenta con el logro de secuenciar completamente el genoma humano.

Figura 1. Esquema que representa los diferentes niveles de organizacin desde el DNA hasta el cromosoma (tomado de: Cummings, 1995).

Mutaciones A escala molecular, las mutaciones pueden consistir en sustituciones, inserciones o deleciones de una o ms bases de la molcula de DNA (Cummings, 1995). Estos cambios en el material hereditario deben propagarse a travs de las sucesivas generaciones, tanto en clulas aisladas como en organismos complejos (Pincheira, 1993). Las mutaciones que consisten en un cambio de la secuencia pero no del nmero de nucletidos de un gen se llaman sustituciones de nucletidos. Generalmente, estas sustituciones afectan a uno o a unos pocos nucletidos. Una segunda clase de mutaciones es la debida a inserciones o deleciones de una o ms bases, lo que afecta al nmero total de nucletidos (Cummings, 1995). En la molcula de DNA encontramos genes y reas no codificantes. Esta distincin tiene importancia ya que un gen se define como una cadena o secuencia lineal de nucletidos del DNA que especfica la secuencia lineal de los aminocidos que forman un polipptido (que junto a otros polipptidos forman una protena o enzima). De esto se infiere que no es correcto hablar de genes no codificantes ya que stos, por definicin, no existen. Una mutacin producida en un gen, puede provocar efectos en el

Figura 2. Esquema de dos cadenas de polinucletidos orientados en direccin opuesta con su columna vertebral de azcar-fosfato a lo largo del borde exterior y con las bases en el interior. Las bases estn unidad a las de la cadena opuesta por enlaces de hidrogeno (tomado de: Cummings, 1995).

fenotipo, es decir, en la manifestacin de la informacin contenida en ese gen 3. Esto lo hace susceptible de ser sometido a seleccin pudiendo ser favorecido o eliminado, afectando de la misma manera a la caracterstica surgida por la mutacin. Por otra parte, una mutacin producida en un rea no codificante no se manifestar en un fenotipo ni menos ser sometida a la seleccin, por lo tanto, esta mutacin se conservara en el tiempo generando una mayor variedad en los individuos de una poblacin (polimorfismo) (Wallace, 1994). DNA mitocondrial Las mitocondrias son organelos pequeos, del tamao de una bacteria, que se encuentran presentes en el citoplasma de la mayora de las clulas animales y cuya funcin principal es la produccin de la mayor parte de la energa celular en forma de ATP, molcula en cuyos enlaces se almacena esta energa. En las primeras etapas evolutivas de la vida, hace miles de millones de aos, los precursores de las actuales mitocondrias fueron probablemente organismos procariontes (con su DNA distribuido en el citoplasma) de vida independiente, parecidos a las bacterias. Se cree que posteriormente estos organismos establecieron una relacin simbionte con clulas eucariontes primitivas. El DNA mitocondrial (mtDNA) es una reliquia evolutiva de esta anterior etapa independiente. La mayora de las mitocondrias poseen entre 2 y 10 copias de l cromosoma mitocondrial (figura 3), encontrando cientos de mitocondrias por clula, por lo que existen entre 1.000 y 10.000 copias de mtDNA por clula. En los extremos tenemos a los glbulos rojos, que no contienen ninguna mitocondria y al vulo, cuyas copias de mtDNA llegan a las 200.000.

El mtDNA humano es una molcula circular constituida por 16.569 pares de bases 4. Este mtDNA contiene la informacin para 37 genes que participan en los procesos de produccin de la energa necesaria para el funcionamiento de la clula. Las nicas zonas que no codifican ningn gen son la regin del bucle de desplazamiento (D-loop), tambin llamada regin control, y unas secuencias de pocos nucletidos ubicadas entre los genes (figura 4). El mtDNA se hereda exclusivamente por va materna; la madre transmite el genoma mitocondrial a todos sus hijos, y solamente las hijas los transmitirn de nuevo a todos los miembros de la siguiente generacin (Ohno, 1997). Durante la fecundacin, las mitocondrias presentes en el espermatozoide no penetran en el vulo, y cuando lo hacen, son eliminadas. Por su mecanismo de herencia, el mtDNA no esta sujeto a recombinacin, por lo que representa la historia de solo un linaje, sin mezclarse con la historia de otros linajes. La tasa de mutacin espontnea del mtDNA es unas 10 veces superior a la del DNA nuclear. Esto se debe en parte a que la molcula de mtDNA carece de protenas protectoras (llamadas histonas), posee un sistema de reparacin de errores muy poco eficiente y adems esta continuamente expuesta a los efectos mutgenos de los radicales de oxigeno producidos durante la respiracin celular (Wallace, 1994). Como consecuencia de esto, hay una gran variacin de secuencias entre especies e incluso entre individuos de una misma especie. En el hombre se ha calculado que dos individuos escogidos al azar tienen como promedio unos 50-70 nt de diferencia en su secuencia (nt, nucletidos).

Figura 4. Mapa del mtDNA humano que muestra la localizacin de los genes y reas no codificantes (modificado de: Wallace, 1994). Figura 3. Fotografa electrnica del cromosoma mitocondrial (tomado de: Cummings, 1995).
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Una excepcin es la sustitucin de la tercera base de un triplete o codn. Este tipo de mutacin no tiene consecuencias ya que el nuevo triplete formado es sinnimo del triplete que exista antes de la mutacin (Triplete o codn: conjunto de tres bases adyacentes que codifican para un aminocido determinado)

A diferencia del DNA nuclear, que contiene aproximadamente 3.000.000.000 de pares de bases. Esta diferencia permiti que ya en 1981, S. Anderson pudiera secuenciar la totalidad de las bases del mtDNA. Esta secuencia (llamada secuencia de Anderson) es utilizada como referencia para determinar cambios en la secuencia de nucletidos de la muestra de DNA a analizar (Anderson et al, 1981).

Reloj Molecular En 1962, los qumicos Zuckerkandl y Pauling analizaron la secuencia de aminocidos de la hemoglobina. Asumiendo una tasa constante de cambio, estimaron que si los humanos y caballos diferan en dieciocho aminocidos, y compartan un ancestro comn hacia los 100-160 millones de aos, entonces los humanos y gorilas deban divergir hacia unos 11 millones de aos. Una justificacin emprica de este supuesto fue dada el siguiente ao por el bioqumico Emanuel Margoliash para la enzima citocromo c. Observando aproximadamente el mismo numero de diferencias de aminocidos entre un ave y cuatro especies de mamferos, un pez y cinco especies de amniotas, o entre una levadura y seis especies de vertebrados, Margoliash concluy que las tasas de cambio en diferentes linajes eran aproximadamente idnticas. Al surgir las tcnicas del DNA, se ha dispuesto de los medios necesarios para explorar la historia evolutiva de la especie humana. Comparando la secuencia de los nucletidos de un gen de origen humano con el de otros animales, o con los de las plantas e, incluso, de los fsiles, se puede reconstruir la historia evolutiva de un determinado gen y calcular cuanto tiempo ha transcurrido desde que las especies afines se separaron a partir de un antepasado comn. Algunos genes han evolucionado y se han separado mucho, mientras que otros, aunque se han dispersado en numerosas especies distintas, se han mantenido relativamente invariables durante millones de aos. Uno de los principales supuestos de los estudios de filogenia basados en mtDNA postula que los cambios de las bases (mutaciones) se acumulan a una velocidad constante, proporcionando un reloj molecular que puede ser calibrado mediante otros datos como el registro fsil, la glotocronologa o el registro arqueolgico. Si esta presuncin es correcta, entonces el grado de parentesco entre dos individuos se puede medir por el nmero de diferencias existentes entre sus mtDNA. Estas diferencias se utilizan para construir un esquema conocido como rbol filogentico, que indica el parentesco. En el siguiente grafico, se ilustra el principio en el cual se sostiene la idea del Reloj molecular. Utilizaremos como ejemplo a tres hominoides: Simbolizaremos con las letras A, B y C al hombre, chimpanc y gorila, respectivamente. De acuerdo a la data paleontolgica, el hombre y el chimpanc estn ms emparentados entre s que cada uno de ellos con el gorila, por lo que consideraremos a este ltimo como grupo externo. Supongamos que luego de comparar las secuencias de nucletidos del mtDNA de cada grupo, las diferencias nucleotdicas entre A y B suman 24 (los valores y resultados utilizados en este ejemplo no son reales). An sin reconocer que efectivamente se cumpla el principio del reloj molecular, ya podemos predecir que las diferencias nucleotdicas entre A y C, y entre B y C sern mayores que entre A y B debido a que la separacin entre las estirpes que originaron a C, A y B es mas temprana que la separacin que origino a las estirpes A y B. Luego, las diferencias entre A y C suman 45, mientras que las diferencias entre B y C suman 46 . Estos resultados muestran que la velocidad con que han ocurrido los cambios en el linaje C es aproximadamente la misma que en los linajes A y B, lo que valida la idea de un Reloj Molecular. Utilizando este principio, podemos ahora establecer el momento en que las diferencias nucleotdicas comenzaron a producirse independientemente en cada linaje, lo que indica el momento de su separacin. Para esto se necesitan fechas de referencia, en este caso, la paleontologa indica que la separacin entre el linaje que origino a los gorilas y el linaje que luego origino a hombres y chimpancs ocurri hace unos 10 millones de aos. Entonces hacemos el siguiente razonamiento: si

consideramos que 45 diferencias ocurrieron durante 10 millones de aos, y que estas diferencias se acumularon de manera constante, entonces 24 diferencias significan un tiempo de separacin de 5,3 millones de aos entre el hombre y el chimpanc.

La cuestin del reloj molecular del mtDNA no est exento de problemas (Chakraborty and Weiss, 1991; Huelsenbeck,2000). Estos pasan principalmente por el grado de constancia en la acumulacin de mutaciones en relacin a la resolucin temporal del problema que se quiera resolver, ya que como vimos en el ejemplo anterior pueden obtenerse resultados bastante gruesos sin que esto conlleve problemas. Sin embargo, cuando se aplica este principio a fenmenos poblaciones mas recientes, se debe tener en consideracin que ciertas porciones del mtDNA mutan a velocidades bastante diferentes (Horai et al, 1995). Se ha determinado que los cambios en las bases de la totalidad del mtDNA se acumulan a una tasa de 2-3% por milln de aos. Torroni et al (1994) ha estimado, segn sus estudios en tribus de habla Chibcha, que para las poblaciones de Amrica, esta tasa es de 0.022-0.029% por 10.000 aos. Por otra parte la regin del DLoop posee una tasa de mutacin de un 30% por milln de aos (Horai et al, 1995) Deriva gnica (Drift). La composicin gentica de una poblacin puede verse afectada por una serie de factores. Estos son la seleccin, la mutacin, el flujo gnico (migraciones)(Ayala, 1984; Valenzuela, 1993) y la deriva gnica. Este ltimo factor consiste en la prdida de la variabilidad gentica de una poblacin. La deriva gnica cobra importancia cuando se trata con poblaciones de tamao reducido como es el caso de los primeros pobladores de Amrica. Para mostrar los efectos de la deriva gnica daremos el siguiente ejemplo: si se arroja una moneda 1.000 veces, el numero de caras que se espera es de 500 y el numero de sellos tambin de 500. Sin embargo, no nos sorprenderamos si los resultados fuesen 507 caras y 493 sellos, pero s entraramos en sospechas sobre la moneda (o sobre quien la arroja) si los resultados fuesen 700 caras y 300 sellos. Por otra parte, si la moneda slo se arroja 10 veces y el resultado fuese 7 caras y 3 sellos no nos asombrara; en una muestra tan pequea diramos que tal desviacin de lo esperado (5 caras y 5 sellos) no es sorprendente. Ahora, si lanzamos la moneda slo 5 veces, un resultado posible puede ser perfectamente solo 5 caras y 0 sellos. El mismo principio es aplicable al muestreo gentico, lo cual implica que la deriva gentica depende del tamao de la poblacin. Cuando una poblacin pequea se divide, es probable que los miembros de la nueva poblacin lleven en su acervo gnico ciertos genes que se encontraban en muy escasa proporcin en la poblacin original. Lo que suceder con el pasar

del tiempo es que estas variedades de genes sern las ms representativas de la nueva poblacin. A este fenmeno se le denomina efecto fundador. La deriva gnica puede aparecer tambin de otra forma en poblaciones estables que sufren por diversos motivos (guerras, hambrunas, cambios ambientales) una disminucin brusca de su nmero de integrantes. En este caso puede producirse la eliminacin de algunas variedades genticas. Al volver a expandirse, el resto de la poblacin solo poseer en su acervo gentico las variedades de los individuos que lograron sobrevivir. A este fenmeno se le denomina poblacin en cuello de botella. Estos dos fenmenos tienen como consecuencia la reduccin de la variabilidad gentica producto del azar y deben tenerse en cuenta al estudiar procesos de migracin y colonizacin por parte de poblaciones con un escaso numero de individuos. Estos factores estadsticos tambin poseen importancia al tomar una muestra determinada; mientras mayor sea la muestra de individuos, mejor ser la resolucin y representatividad de la poblacin total. Tcnicas Los clones son molculas, clulas o individuos que tienen un antepasado comn. Los mtodos para obtener organismos clonados no son nuevos; las tcnicas de horticultura que producen clones de arboles frutales han sido utilizadas desde la antigedad. Las tcnicas para obtener clulas clonadas, organismos de una sola clula y algunos animales se remontan, todas ellas, hacia los ltimos 100 aos, Mas recientemente, se ha conseguido la clonacin de molculas del DNA o de porciones del mismo. La obtencin de las molculas de DNA en grandes cantidades ha tenido una repercusin profunda en la investigacin gentica y ha hecho que surjan aplicaciones de esta tcnica en muchas disciplinas, desde la arqueologa hasta la conservacin del medio. La clonacin de molculas o de porciones de las mismas permite obtener un gran nmero de molculas idnticas de DNA, todas las cuales tienen un antepasado comn. Los mtodos para clonar molculas de DNA solo sirven para el DNA, y son diferentes a los utilizados para la clonacin de plantas o animales. Estos mtodos son producto de los descubrimientos genticos y bioqumicos realizados a finales de los aos sesenta y comienzos de los aos setenta. En conjunto, estas tcnicas suelen denominarse tcnicas de DNA recombinante o de ingeniera gentica. El termino DNA recombinante tal y como se le utiliza corrientemente, puede referirse a la reunin artificial de molculas de DNA o de parte de esas molculas que no se encuentran juntas en la naturaleza. Enzimas de restriccin A mediados de los aos setenta, Hamilton Smith y Danie l Nathans descubrieron una serie de enzimas llamadas enzimas de restriccin que se unen a las molculas de DNA y separan las dos cadenas del DNA cortndolas por un determinado sitio de la secuencia de sus bases. Este descubrimiento fue producto de la investigacin destinada a averiguar cmo ciertas bacterias del suelo son capaces de resistir las invasiones por virus. En la figura 5 se observa como se produce reconocimiento del DNA y el sitio donde se produce el corte del mismo mediante una enzima aislada de una bacteria que vive en nuestro intestino grueso (escherichia coli), y denominada EcoRI. En el cuadro 1 se presentan los sitios de corte donde actan otras enzimas de restriccin.

Figura 5. Sitio especifico del DNA donde la endonucleasa de restriccin EcoRI efecta el reconocimiento y el corte del DNA (tomado de: Cummings, 1995).

Secuencia separada GAATTC Escherichia coli EcoR I CTTAAG Bacillus GGATCC BamH I amyloliquefaciens CCTAGG AAGCTT Hemophilus influenzae Hind III TTCGAA Brevibacterium TGGCCA Bal I albidum ACCGGT TCGA Thermus aquaticus Taq I AGCT AGCT Arthobacter luteus Alu I TCGA Cuadro 1. Algunas enzimas de restriccin comunes y los sitios donde cortan (tomado de: Cummings, 1995).

Origen

Enzima

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa, ideada en 1986, tiene como ventaja producir grandes cantidades de secuencias de DNA para distintas aplicaciones. La PCR utiliza DNA monocatenario como molde para sintetizar la cadena complementaria por medio de la enzima DNApolimerasa, de manera similar a como acta esta enzima durante la replicacin del DNA en el ncleo celular. En la tcnica de PCR (figura 6), el DNA que se va a amplificar se calienta para romper los enlaces de hidrogeno que mantienen unidas a las bases complementarias de cada cadena de DNA, con lo que se obtienen dos cadenas separadas, proceso conocido como denaturacin. A continuacin se aaden secuencias cortas de nucletidos que actan como cebadores de la replicacin de DNA (paso denominado annelling), y estos cebadores hibridan las regiones complementarias del DNA monocatenario. Los cebadores o primers pueden sintetizarse computacionalmente y suelen tener 20 a 30 nucletidos de largo. En el tercer paso (extensin), la DNApolimerasa comienza a actuar en los cebadores y sintetiza una cadena de DNA complementaria del DNA monocatenario. El

conjunto de estos tres pasos se conoce como ciclo. El ciclo completo puede repetirse calentando la mezcla y separando el DNA bicatenario en dos cadenas de una sola hebra, cada una de las cuales sirve como molde. El resultado final es que la cantidad existente de DNA se duplica en cada ciclo. Despus de n ciclos, hay un aumento de 2n en la cantidad de DNA bicatenario (Cuadro 2). La ventaja de la tcnica de PCR reside en la capacidad de amplificar el DNA a partir de cantidades pequesimas de DNA,

incluso sin que este se encuentre purificado. Se ha utilizado DNA de muchos orgenes para iniciar la tcnica de PCR, como sangre seca, pellejo de animales extintos, pelos aislados, restos momificados y fsiles. El DNA ms antiguo que se ha utilizado en la tcnica de PCR hasta la fecha ha sido extrado de las abejas y termitas conservadas en mbar de hace unos 30 millones de aos. La preservacin del DNA antiguo depende de principalmente tres factores: Ausencia de masas de agua, condiciones anaerbicas, y bajas temperaturas.

Figura 6. Proceso de amplificacin con el PCR. En el paso 1, el DNA que va amplificarse se calienta para separar las dos cadenas de la mo lcula. En el paso 2, los cebadores monocatenarios cortos se aparean con los nucletidos adyacentes a la regin que va a ser amplificada. Estos cebadores se obtienen por sntesis y son complementarios de la secuencia de nucletidos colindantes de la regin que va a ser amplificada. En el paso 3, se aaden las enzimas y los nucletidos necesarios para sintetizar el DNA, y se produce esa sntesis, comenzando en los cebadores y usando las regiones monocatenarias como plant illas. Esta serie de tres pasos se denomina ciclo. Los ciclos se repitan las veces que se desee hasta que se obtiene o amplifica una cantidad suficiente de DNA (tomado de: Cummings, 1995).

Numero de copias 0 1 1 2 5 3 10 1024 15 32768 20 1048576 25 33544432 30 1073741820 Cuadro 2. Amplificacin de secuencias del DNA mediante la PCR (tomado de: Cummings, 1995). Ciclo

La calidad del DNA se ve afectada por la degradacin producida por putrefaccin (nucleasas de las bacterias). As tambin, existen elementos contaminantes del DNA que inhiben o provocan problemas durante la reaccin de la PCR. El cido hmico, el azul ndigo (colorantes) y las hemoglobinas (protomorfinas) son unos de estos contaminantes. El DNA amplificado de estas muestras se utilizara para estudiar la evolucin de estos insectos. La tcnica de PCR se utiliza tambin en el diagnostico clnico de ciertas enfermedades y en aplicaciones forenses.

Anlisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) Recordemos que las enzimas de restriccin actan reconociendo ciertas secuencias especficas de las bases de DNA y cortando las dos cadenas del DNA por los sitios de esas secuencias. En las poblaciones, la secuencia de nucletidos en largos tramos del DNA esta sujeta a variaciones ms o menos notorias. En algunos casos, esa variacin en la secuencia de las bases puede crear o destruir algn sitio donde la enzima de restriccin efecta el reconocimiento y corte de la cadena, y eso altera el patrn de los cortes que se realizan en el DNA. Esto, a su vez, da lugar a variaciones que se detectan determinando la longitud de los fragmentos del DNA, lo que se conoce como polimorfismo de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP). Estos polimorfismos son hereditarios. Para efectuar el anlisis de los RFLP, se extrae una pequea muestra de sangre (10 a 20 mL), y se separan los leucocitos a los cuales se les extrae el DNA. En este momento se expone la muestra de DNA a enzimas de restriccin. Como resultado de ello, el DNA queda cortado en varias porciones llamadas fragmentos de restriccin del DNA. Estos fragmentos se colocan en un gel de agarosa y son expuestos a una corriente elctrica (tcnica llamada electroforesis). Las molculas del DNA llevan cargas negativas y, cuando emigran a travs del gel hacia el polo positivo, se separan por su tamao (los fragmentos ms pequeos emigran ms rpidamente). Luego, los fragmentos separados se someten a una tcnica conocida como anlisis de transferencia de Southern, con el que se puede identificar radiogrficamente a un subgrupo de los fragmentos de restriccin. En el caso de que un fenmeno de mutacin hubiera suprimido o creado un sitio de corte para la enzima de restriccin, esto podra detectarse por el cambio experimentado en la longitud del fragmento de DNA, que se volvera ms largo o ms corto (figura 7). Esta variacin en el modelo de corte se conoce como un RFLP. A partir de los cortes realizados por las enzimas de restriccin en una muestra determinada, se obtiene un haplotipo, el cual esta definido por la presencia o ausencia de una serie de sitios de corte. Al conjunto de haplotipos que comparten una serie de cortes se le denomina haplogrupo. Una poblacin posee un conjunto de haplogrupos que la caracteriza, por lo tanto, las poblaciones se pueden comparar por la presencia o ausencia de estos haplogrupos y la frecuencia en que stos se encuentran. Secuenciacin de las zonas Hipervariables. La zona del D-Loop del mtDNA (tambin llamada regin control, o displacement loop) puede dividirse en dos reas: La regin hipervariable 1 (HVSI) de unos 360 nucletidos de largo y la regin hipervariable 2 (HVSII) formada por mas o menos 740 nucletidos. Estas zonas del mtDNA no codifican para ningn gen (su funcin es regular los procesos de replicacin y transcripcin del mtDNA), por lo tanto tienden a acumular mutaciones en su secuencia con una mayor rapidez (motivo por el que se es llama hipervariables) (Horai, 1995; Meyer et al, 1999). En las poblaciones podemos encontrar cierta variedad de secuencias, lo que se denomina polimorfismo de secuencia. La regin hipervariable 1 acumula cambios a una velocidad algo mayor que la regin hipervariable 2, por lo que la HVSI es ms polimrfica. Al realizar los anlisis de secuenciacin, el mtDNA muestreado de la poblacin es comparado con la secuencia

referencia (Secuencia de Anderson (1981)) por medio de programas computacionales, los que arrojan resultados acerca de las diferencias nucleotdicas, grados de parsimonia y regularidades dentro del mtDNA de distintas poblaciones e individuos.

Figura 7. Anlisis de los RFLP. A y B corresponden a dos muestras obtenidas de dos individuos. Las reas gruesas y sombreadas representan una regin que puede formar estructuras bicatenarias con una sonda de DNA clonado. Las flechas vert icales indican la localizacin de los sitios de reconocimiento y corte por las enzimas de restriccin. En la muestra A hay tres sitios de corte que producen dos fragmentos (de 3 y 5 kilobases). Una kilobase (kb) contiene 1000 pares de bases de la molcula de DNA. En la muestra B hay dos sitios de corte. La digestin por la enzima de restriccin produce un fragmento de 8 kb de largo (modificado de: Cummings, 1995).

Estudios sobre la diversidad de haplogrupos del mtDNA. El mtDNA ha sido ampliamente usado con el objetivo de realizar filogenias que relacionen a las distintas poblaciones de todo el mundo. De este modo es como se ha propuesto un origen africano y de unos 200.000 aos para la especie humana actual, tesis conocida como la Eva mitocondrial. Tambin se ha utilizado el mtDNA para relacionar a la especie humana con otros primates. Los resultados de estas investigaciones podran tener importantes aplicaciones en paleoantropologa. Investigadores de todo el mundo han buscado reconstruir la historia demogrfica de las poblaciones locales a travs del mtDNA debido a las caractersticas mencionadas con anterioridad. A travs de la cuantificacin de la diversidad gentica de la poblacin mundial, junto con las tasas de mutacin reveladas por diversos estudios, se han estimado las fechas en que los grupos humanos migraron desde frica, pasando a Eurasia, Europa, Asia oriental, Australia y por ultimo, Amrica. Como es el ltimo caso el que en esta oportunidad revisare, har un breve recuento y visualizacin del estado actual en que se encuentran las investigaciones realizadas mediante los anlisis de mtDNA en pro de la resolucin de la cuestin del poblamiento americano. Las preguntas que se buscan responder son acerca de los orgenes de las poblaciones, la fecha de la primera colonizacin del continente, el numero de las migraciones, as como el tamao de las poblaciones migratorias, y la historia demogrfica local. La regin codificante del mtDNA, es estudiada por anlisis de RFLP. Vimos que las enzimas de restriccin cortan la molcula de mtDNA en secuencias nucleotdicas especificas para cada una. Los cambios mutacionales de estas secuencias producen variantes genticas, o haplotipos, que son reveladas en el anlisis de RFLP como cadenas de mtDNA de diferente longitud. La suma total de estos RFLP constituye un haplotipo individual, y aquellos haplotipos que comparten RFLP especficos pertenecen a un mismo haplogrupo, o linaje de mtDNA.

Las interrelaciones entre los haplotipos son determinadas por generacin de filogenias de secuencias mutacionales a travs de anlisis de parsimonia y calculando distancias genticas interhaplotipo e interpoblaciones. Por lo general, para estos estudios se utilizan 14 enzimas de restriccin: Alu I, Ava II, BamH I, Dde I, Hae II, Hae III, Hha I, Inf I, Hinc II, Hpa I, Hpa II/Msp I, Mbo I, Rsa I y Taq I (Torroni et al, 1994). Los resultados obtenidos a travs de los anlisis de los RFLP han revelado que los grupos que poblaron el continente pueden ser agrupados en cuatro o cinco haplogrupos, cada uno de ellos, identificado por determinados sitios en los cuales las enzimas de restriccin actan (Wallace, 1994; Wallace et al, 1998): Haplogrupo A, definido por la presencia de sitio HaeIII en np 663. Haplogrupo B, definido por la ausencia de 9np entre np 8271 y np 8281 (COII-tRNALys) y la presencia de sitio HaeIII en np 16517. Haplogrupo C, definido por la ausencia de sitio HincII en np 13259 y presencia del sitio AluI en np 13262. Haplogrupo D, definido por la ausencia de sitio AluI en np 5176. Estos haplogrupos estn presentes en Asia, juntos a otros haplogrupos asiticos (F y H, definidos por otras enzimas) los que se agrupan en dos macro haplogrupos: El primero, formado por los haplogrupos C y D, definidos por la presencia del sitio DdeI en el np 10394 y AluI en el np 10397; y el segundo, constituido por los haplogrupos A, B, F y H, definidos por la ausencia de estos sitios. As se puede establecer que los individuos que colonizaron Amrica, llegaron al continente solo por la va Siberia-BeringiaAlaska. Al tratar de responder a la pregunta acerca de las poblaciones especificas que cruzaron Beringia, se debe seguir y comparar los haplogrupos que contienen las poblaciones de ambos continentes. Las poblaciones de Siberia cercanas a Beringia poseen los haplogrupos A, C y D y carecen del haplogrupo B. Esto llevo a que Torroni et al (1993) postularan una primera migracin conformada por estas poblaciones. Una segunda migracin que habra llevado el haplogrupo B se habra originado en poblaciones ubicadas al sureste de Siberia para luego dispersarse entre las poblaciones originadas a partir de la primera migracin (Starikovskaya, 1998). Otra explicacin nos dan Bonatto y Salzano (1997a, 1997b) quienes plantean que solo ocurri una nica migracin originada en Mongolia y el rea adyacente de Manchuria, constituida por poblaciones portadoras de los cuatro haplotipos. Esta idea esta sustentada adems por estudios virolgicos que postulan la presencia del virus HTLV-II (Human T-cell Lymphotrophic Virus type II) en poblaciones de Amrica, Mongolia, Manchuria y la regin sudeste de Siberia (Neel et al, 1994). Existe un quinto haplogrupo denominado X encontrado en algunos grupos de Norteamrica (Brown et al, 1998), definido por la ausencia del sitio Dde I en el np 1715 y la presencia del sitio Hae III en el sitio 16517. Este haplogrupo no se encuentra en Asia, pero s en Europa, lo que sugiere la posibilidad de que algunas de las poblaciones que colonizaron Amrica tengan un ancestro caucsico. La regin no codificante o D-Loop otorga una mayor resolucin para definir haplogrupos y subgrupos (haplotipos) que

son equivalentes a los obtenidos por las enzimas de restriccin. El primer estudio que utiliz este tipo de anlisis fue realizado por el grupo de Ryk Ward (1991). Los haplotipos se definen por la presencia de determinadas transiciones 5 en sitios especficos de la regin control (Foster et al, 1996): A1: 16.223, 16.290, 16.319 y 16.362. A2: 16.111, 16.223, 16.290, 16.319 y 16.362 B: 16.189 y 16.217. C: 16.223, 16.298, 16.325 y 16.327 D1: 16.223, 16.325 y 16.362 X: 16.223 y 16.278. A partir de estos anlisis se ha podido realizar un estudio ms acucioso de los posibles linajes fundadores que pasaron desde Siberia a Amrica, y, con ayuda de simuladores computacionales, llevar a cabo estimaciones acerca del nmero de migraciones, las fechas en que ocurrieron y las condiciones demogrficas de las poblaciones colonizadoras. Los primeros trabajos realizados por Torroni y Wallace dieron un gran apoyo a los estudios de Greenberg y Turner. Puede observarse cierta correlacin entre la presencia de estos cuatro haplotipos y la lengua que hablan las poblaciones. Los grupos de habla amerindia presentan por lo general, los cuatro haplogrupos descritos, los grupos Na-Dene, presentan solo el haplogrupo A, mientras que los Eskimo-Aleutianos muestran tanto el haplotipo A como el D. Las investigaciones llevadas a cabo por Greenberg et al (1886) y Christy Turner (1983) sugirieron que el poblamiento de Amrica habra ocurrido a travs de tres oleadas migratorias, cada una de ellas compuesta por uno de estos grupos lingsticos, en algn momento anterior a los 14.000 A.P. La diversidad de secuencias en los cuatro haplogrupos observadas por Torroni y Wallace fue la siguiente: A, C y D = 0,053 0,096% B = 0,024% Utilizando una tasa de mutacin de 2,2 2,9% por milln de aos obtenida de estudios realizados en poblaciones de habla Chibcha, Torroni y Wallace llegaron a la conclusin de que una primera poblacin cruz Beringia con los haplogrupos A, C y D hace unos 22.000 29.000 aos A.P. Luego lleg a Amrica una poblacin con el haplogrupo B, posiblemente por la ruta costera hace unos 8.000 a 11.000 aos A.P. Los descendientes de este grupo se dispersaron luego entre las poblaciones previas que posean los haplogupos A, C y D de todo el continente. Los ltimos inmigrantes de Asia son los Na-Dene y Eskimo Aleutianos. Los Na-Dene contienen solamente el haplogrupo A, cuya diversidad es de 0,021, lo que sugiere que llegaron al continente poco despus de la llegada del haplogrupo B entre unos 7.000 a 9.000 aos A.P. Un punto de vista contrario al anterior lo entregan Bonatto y Salzano (1997a, 1997b), quienes utilizaron 720 secuencias de la regin control de mtDNA amerindio para la regin hipervariable I (HVSI) y 217 para la HVSI y HVSII. Para obtener un rango de resultados utilizaron una taza de mutacin alta y otra baja: HVSI: 10,3%/MY y 15%/MY HVSII: 8,85%/MY y 11,5%/MY (MY, milln de aos).

Las transiciones son aquellas mutaciones, es decir, cambios en los nucletidos en los una purina es sustituida por otra purina o una pirimidina es reemplazada por otra pirimidina (TC o AG o viceversa).

Las dos tasas mas bajas fueron tomadas de Horai et al (1995), mientras que la taza de mutacin alta para la HVSI fue tomada de Ward (1991), y para la HVSI y HVSII fue utilizada la tasa de Stoneking (1992, cit por Bonatto y Salzano, [1997b]). Los valores para la diversidad nucleotdica fueron bastante similares en los cuatro haplogrupos, a diferencia de los resultados obtenidos por Torroni et al (1994), segn los cuales el haplogrupo B posea una diversidad considerablemente mas baja que los otros tres en estudios basados en RFLP. Esta diferencia seria producto de que las poblaciones muestreadas y/o la regin del mtDNA estudiada son diferentes, o bien, la definicin de haplogrupos no se corresponde. Los valores de divergencia entre haplogrupos son mucho mayores que aquellos valores de diversidad dentro de los haplogrupos. Esto lleva a pensar que el proceso de divergencia (no diversificacin) comenz antes de su entrada a Amrica. Bonatto y Salzano concluyen que habra ocurrido un cuello de botella para cada haplogrupo seguido de una gran expansin. De acuerdo a esto, la diversidad de secuencia dentro de los haplogrupos puede usarse como un estimador del tiempo transcurrido desde que ocurri tal cuello de botella. Los valores de diversidad encontrados para cada haplogrupo son muy similares, lo que sugiere que todos los haplogrupos se expandieron aproximadamente al mismo tiempo y que, por lo tanto, lo ms probable es que tengan su origen en una misma poblacin lo que concuerda con el modelo de una nica migracin. Todos los nativos americanos se originaron de un nico evento de colonizacin que ocurri en Beringia hace por lo menos 22.000 aos A.P., posiblemente hace 30.000 a 40.000 aos A.P. Sugieren que la poblacin ancestral se asent en Beringia durante algn tiempo antes de expandirse. Eventualmente cruzaron el corredor de Alberta y colonizaron el resto del continente. El colapso del corredor (25.000 14.000 aos A.P. / 30.000 11.000 aos A.P.) separ a las poblaciones que continuaron en Beringia, de los cuales se originaron los NaDene y Eskimo (cuya diversidad original se redujo debido a las condiciones climticas), de aquellos habitantes ubicados al sur de los glaciares que dieron origen a los pueblos de habla amerindia. La idea de que la diferenciacin en las secuencias de los haplogrupos comenz durante el asentamiento en Beringia y no en Asia, se sustenta en que si la expansin hubiera ocurrido en algn lugar de Asia, entonces se podra esperar estas secuencias, con todos los marcadores para cada haplogrupo, en un alto nmero y frecuencia, similar al 90% encontrado en americanos; sin embargo, solo las secuencias fundadoras para cada haplogrupo han sido encontradas en Asia, y en una muy baja frecuencia (Bonatto and Salzano, 1997a). Estos resultados no concuerdan con la idea de una migracin independiente de los grupos NaDene, ni tampoco con una migracin del haplogrupo B mas reciente como ha sido propuesto por Torroni et al (1994). Por otro lado, si hay acuerdo con las fechas probables para la primera (o nica) migracin la que habra ocurrido entre los 30.000 y 40.000 aos A.P. Foster et al. (1996) se encuentran en la misma lnea de una nica migracin. Al igual que Bonatto y Salzano, obtienen fechas similares para los haplogrupos A1, A2, B, C, D1 y X. Postulan que las secuencias fundadoras arribaron a Amrica hace unos 20.000 a 25.000 aos atrs, en una oleada. Un subgrupo de D1 ubicado en Sudamrica arroja una fecha cercana a los 13.000 aos A.P. lo que esta en completo acuerdo con la evidencia arqueolgica del sitio Monte Verde entregada por Dillehay (1989). La reduccin de la

variabilidad gentica de los grupos circumpolares estara explicada por las duras condiciones climticas surgidas por la fase Younger Dryas. Una vez terminadas estas condiciones glaciales hacia los 11.300 atrs las poblaciones de Beringia se reexpandieron demogrfica y geogrficamente para evolucionar en los pueblos Na-Dene y Eskimo del presente a quienes identifica como los fabricantes de las puntas Clovis. La fecha de 11.300 aos coincide con el valor obtenido de la divergencia gentica del haplogrupo A2 de 0,56 y con el trmino del silencio del registro arqueolgico presente en Alaska. Los estudios realizados en muestras antiguas han sido muy escasos por las dificultades tcnicas y elevados costos que conlleva la extraccin de mtDNA desde restos seos. Anne Stone y Mark Stoneking (1998) sometieron a comparacin el mtDNA de 108 individuos de un cementerio precolombino de Illinois. Analizaron la secuencia de la HVSI, encontrando que aparte de los haplogrupos A, B, C y D, existan otros linajes no tan comunes pero que tambin haban sido trados desde Asia. La considerable diversidad contenida en el mtDNA les llevo a fechar la expansin de los grupos en Amrica entre los 23.000 a 37.000 aos A.P. adems de entregar mas evidencia que contradice a la hiptesis de las tres migraciones de Wallace. El grupo de Yelena Starikovskaya (1998), por el contrario, asume la postura de Torroni y Wallace que sugiere que fueron al menos dos y quizs tres las migraciones que poblaron sucesivamente el continente. A partir del anlisis de 145 individuos pertenecientes a poblaciones de Chukotka (Esquimales de Chukchi y Siberia), observo que estas poblaciones slo posean tres (A, C y D) de los cuatro haplogrupos principales (A, B, C y D). Segn estos investigadores, los habitantes de Beringia posean un set limitado de haplotipos fundadores. La divergencia en la secuencia estimada para los haplogrupos A, C y D del mtDNA de las poblaciones siberianas y de nativos americanos indicara que los primeros habitantes del Nuevo Mundo se expandieron hace aproximadamente 34.000 aos A.P. Una segunda migracin producida hacia los 16.000-13.000 aos A.P. aparentemente habra triado el haplogrupo B al continente. Termino esta revisin con la postura del el grupo de Graciela et al. (1994) por cuanto contradice tanto a Torroni y Wallace como al grupo de Foster. De los primeros difieren por la cuestin del nmero de migraciones ya que consideran que la visin de tres oleadas migratorias y cuatro linajes fundadores es reduccionista. Sus estudios han confirmado la presencia de los cuatro haplogrupos, pero afirman que no son solo cuatro, sino que son 13 los linajes que participaron en la colonizacin del continente. Esto ultimo los pone en desacuerdo con Foster et al, ya que niegan la posibilidad de que haya ocurrido un cuello de botella como los ltimos plantean. Conclusin A travs de estas pginas he mostrado como los estudios filogenticos se apoyan en supuestos que aun son discutidos por los genetistas de poblaciones. Las diferencias que existen en torno a la posibilidad de calibrar un reloj molecular se ven reflejadas en cada uno de los trabajos a que he pasado revista. Ya han pasado cerca de unos 15 aos desde que se realizaron las primeras investigaciones orientadas a resolver desde el punto de vista gentico las preguntas acerca de los orgenes de hombre y su historia demogrfica. Durante ese periodo las tcnicas han avanzado mucho, como tambin se ha complejizado la discusin

sobre los mecanismos de la evolucin y los alcances que tienen este tipo de estudios. La variedad en los resultados surgidos del anlisis del mtDN A ha provocando que algunos investigadores los ignoren por un tiempo hasta que existan mayores acuerdos (Gibbons, 1996). Sin embargo, la calibracin del reloj molecular esta hacindose cada vez ms fina, y el banco de datos que contienen la informacin se las secuencias nucleotdicas de diferentes poblaciones va aumentado, conforme aumentan los estudios realizados en nuevas poblaciones. A modo personal considero que estas diferencias no tienen, a largo plazo, un efecto negativo. Mas bien, contribuyen a enriquecer las visiones que se pueden tener acerca del problema del poblamiento, prestando orientacin e integracin entre las distintas disciplinas que se entrelazan en estos estudios. Esta claro que los distintos investigadores del tema estn aun lejos de alcanzar grandes acuerdos. Quizs el nico punto en comn que poseen se encuentra en el ultimo prrafo de sus artculos en donde manifiestan la esperanza en que las nuevas investigaciones den luz de nuevos datos y modelos demogrficos para explicar de mejor manera la variedad gentica de las poblaciones actuales y a partir de ellas reconstruir los eventos pasados de movimientos de los pueblos. La sntesis de los diversos resultados arrojados por estas investigaciones confirman que aun queda mucho tiempo y esfuerzo para poder resolver definitivamente las preguntas acerca de cuando y en cuantas oleadas se pobl el continente americano. Los consensos apuntan principalmente a que la primera entrada de los grupos humanos no preceden al evento de colonizacin de Siberia ocurrido, segn las investigaciones arqueolgicas y genticas, aproximadamente hace 40.000 aos A.P. Por una parte estn los investigadores de la lnea de Torroni y Wallace quienes respaldan la relacin entre los haplogrupos y los grupos lingsticos, afirmando que la colonizacin del continente se realiz a travs de tres oleadas migratorias. El otro extremo esta representado por las investigaciones de Bonatto y Salzano, Peter Foster y otros, quienes alegan por la ocurrencia de solamente un evento migratorio y caracterizado por la reduccin en algn momento de este de la diversidad gentica de los grupos colonizadores. Sin embargo, estn dadas las condiciones para una fructfera produccin en las investigaciones del futuro. Al revisar la bibliografa, se notara que grupos aparentemente dispares en sus posiciones estn conformados por investigadores que se alternan para defender distintos puntos de vista. Aunque una revisin exhaustiva de los estudios en este campo no es un objetivo principal de este trabajo, espero haber clarificado un poco el panorama dado por la gentica al problema del poblamiento de Amrica, panorama que debe ser complementado con los datos entregados por el registro arqueolgico. La complejidad que puede apreciarse al reconocer los movimientos poblacionales que subyacen a la presencia y frecuencia de ciertos haplotipos en distintas poblaciones pueden ilustrar la tambin compleja diversidad de sitios paleoindios a lo largo del continente y especialmente en Sudamrica. A nivel local es importantsimo es que se establezca una comunicacin entre las distintas facultades y departamentos de la universidad, a fin de enriquecer la discusin en torno a temas pertinentes a las Ciencias Sociales en los que otras disciplinas como la Biologa tengan algo que aportar para abarcar de una forma mucho mas global el fenmeno humano. Es en esa discusin donde una disciplina joven como la nuestra tiene mucho ms que ganar.

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