Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola.

Captulo 2

2. Vida y muerte de los microorganismos

2.1. Crecimiento
Es el incremento ordenado de todos los componentes de la clula viva, arribando a la duplicacin de todas las estructuras, orgnulos y componentes celulares, as como la biognesis de mitocondrias y cromoplastos cuando ciertos microorganismos se ven sbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgnulos son esenciales. En la mayora de los organismos unicelulares, la reproduccin es consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el nmero de individuos de la poblacin, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamao del organismo (1). La figura 1 muestra una curva general del crecimiento de un microorganismo unicelular . Despus de la inoculacin d e una porcin de medio con unas pocas clulas, transcurre un perodo de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metablica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanz una velocidad constante de crecimiento se dice que est en la fase exponencial debido a que el nmero de clulas se puede expresar como funcin de 2n, donde n es el nmero de ciclos d e duplicacin experimentado por la poblacin (3). Una bacteria originar cuatro clulas (2 2 ) despus de dos ciclos, dieciseis (24 ) despus de cuatro ciclos, etc. Cada clula de bacteria o levadura da, por escisin o gemacin, dos clulas y el nmero inicial X o de clulas (en el instante to=0) se convierte, despus de n generaciones en un tiempo t, en X = X o. 2n Como n representa el nmero de divisiones celulares durante el intervalo de tiempo t, el tiempo de generacin g = t/n, y X = Xo.2t/g o sea ln X = ln X o + t.ln 2/g * El trmino ln 2/g es la velocidad especfica de crecimiento () de la poblacin o sea = 0,69/g y dX/dt = X En el curso de la fase exponencial la velocidad especfica de crecimiento alcanza su valor ms elevado (mx). La ecuacin * puede escribirse bajo la forma lnX

- lnX o = .t por lo tanto X = X o.et

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 En condiciones ideales el tiempo de generacin de las bacterias puede ser de 20 minutos, de esta forma una nica clula producir 2.097.152 bacterias al cabo de 7 horas. Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que permanece constante el nmero de clulas. Esta fase puede durar mucho tiempo, por ejemplo dcadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre ser seguida, ms temprano o ms tarde, por la fase de muerte (3). En los estudios de la cintica del crecimiento individual de los microorganismos pluricelulares, tales como actinomicetos y mohos, se observ que: a) la velocidad de extensin de las hifas cortas es proporcional a la longitud de las mismas y a la velocidad especfica de crecimiento, es decir que estas hifas pueden crecer exponencialmente; b) cada pice hifal puede extenderse a una velocidad independiente de la velocidad de aumento de la biomasa; c) cuando la capacidad de la hifa para extenderse supera las posibilidades brindadas por los puntos de crecimiento existentes, se generan otros nuevos (ramificacin) (4).

2.2. Tipos de nutricin

Los organismos fotosintticos y los que obtienen energa por oxidacin de compuestos inorgnicos suelen usar generalmente CO2 como fuente nica o principal de carbono (auttrofos). Pero, la mayora de los microorganismos del laboratorio son heterotrficos, es decir necesitan fuentes de carbono orgnico y nitrgeno asimilables, as como sales minerales y en ciertos casos vitaminas. Pueden sintetizar todos sus constituyentes celulares a partir de un nico compuesto orgnico que sirve tanto de fuente de carbono y de energa, y de una fuente inorgnica u orgnica de nitrgeno (1). Metabolismo energtico de los microorganismos (1) tipo de organismos dependientes de fottrofos radiacin solar fotolittrofos= auttrofos dadores de electrones inorgnicos fotoorgantrofos dadores de electrones orgnicos quimitrofos compuestos qumicos quimiolittrofos= auttrofos oxidacin de compuestos inorgnicos quimioorgantrofos= hetertrofos oxidacin o fermentacin de compuestos . orgnicos Algunas bacterias, por ejemplo Azotobacter que vive libre en el suelo, y Rhizobium que crece como simbionte en los ndulos de la raz de leguminosas, as como cianobacterias, pueden fijar el nitrgeno gaseoso de la atmsfera, es decir reducirlo convirtindolo en nitrgeno orgnico. Por otra parte, las formas parsitas obligadas obtienen del hospedador los complejos constituyentes de su materia viva (5). En tanto que los sulfatos pueden ser utilizados por casi todas las bacterias y hongos, los nitratos son a menudo menos adecuados como nutrientes. Sin embargo, la mayora de los microorganismos hace uso del amonio como fuente nica o principal de nitrgeno. Sin embargo, algunas bacterias requieren fuentes de azufre reducido, tal como sulfuro o tiosulfato. Los organismos vivos necesitan tambin muchos otros elementos, como fsforo, potasio, magnesio, manganeso, calcio, hierro, cobalto, cobre, cinc y molibdeno (1)

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2.3. Factores de crecimiento

Son los compuestos, necesarios en pequea cantidad, que debe suministrar el medio para que tenga lugar el crecimiento de algunos microorganismos. Los organismos que requieren un determinado factor de crecimiento son auxotrficos para ese compuesto. Por ejemplo, Lactobacillus arabinosus crece normalmente en presencia de 10 -4 g/mL de biotina, pero no en ausencia de esta vitamina (6).

2.3.1. Factores orgnicos

Algunos microorganismos carecen de la capacidad de sintetizar ciertos aminocidos, nucletidos o vitaminas. stos son generalmente aportados por los extractos de levadura y carne, agregados al medio (3). A veces son adicionados en cantidades demasiado elevadas interfiriendo en el metabolismo microbiano, por ejemplo, las clulas de Corynebacterium glutamicum cultivadas en un medio rico en biotina no excretan cido glutmico, mientras que si son suspendidas en un medio pobre en biotina ocurre lo inverso. Generalmente los microorganismos requieren L-aminocidos, por ejemplo Leuconostoc mesenteroides , pero algunas bacterias necesitan D-alanina (6). Vitaminas del grupo B cido nicotnico (niacina) cido pantotnico riboflavina (B2 ) cido flico biotina cobalamina (B12 ) piridoxal- piridoxina (B6 ) tiamina (B1 ) Funcin (1) precursor de piridn-nucletidos (NAD y NADP) coenzima A flavn-nucletidos (FMN, FAD) participa en transferencia de grupos metilo biosntesis de cidos grasos, fijacin de CO2 sntesis de desoxirribosa y transferencia de restos monocarbonados transformaciones de aminocidos y cetocidos -descarboxilaciones

2.3.2. Factores minerales

La ausencia total de metales comporta la muerte o enfermedades carenciales en todos los seres vivos, pero todo es cuestin de dosis pues, el efecto es beneficioso hasta un cierto nivel, traspasado el cual se observan trastornos fisiolgicos. Algunos elementos esenciales, por ejemplo cinc, cobre, cobalto, hierro, molibdeno, son necesarios para la actividad de enzimas especficas (1). Adems, algunos seres vivos tienen requerimientos minerales especiales, como el silicio que es parte esencial de la pared celular de las diatomeas (7).

2. 4. Transporte de solutos
El transporte de nutrientes a travs de la membrana citoplasmtica es especfico porque son captados por la clula solamente aqullos para los cuales existe un sistema transportador. Existen dos tipos principales de transporte. El primario comprende los procesos que conducen a la transferencia de iones (H +, Na+, K +) produciendo alteraciones en el potencial electroqumico. Las fuerzas que intervienen son el transporte de electrones respiratorio o fotosinttico, o las bombas inicas dependientes del ATP o de la descarboxilacin de metabolitos. El transporte secundario est guiado por gradientes en el potencial electroqumico (9). La difusin pasiva o simple est gobernada por el tamao molecular y las propiedades lipoflicas del material, permitiendo la entrada de agua, toxinas no-polares y ciertos inhibidores. La difusin facilitada se lleva cabo debido a la presencia de una

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 permeasa especfica para el substrato y depende de la concentracin de substrato en el medio. El nutriente no puede ser acumulado dentro de la clula. El transporte activo y la trasladacin del grupo se parecen a la anterior en que participan protenas especficas y difieren en que necesitan la provisin de energa. El nutriente puede ser acumulado dentro de la clula. En el transporte activo la molcula liberada en el interior de la clula es idntica a la del exterior, mientras que en la trasladacin del grupo l a molcula fue modificada durante el transporte, por ejemplo por fosforilacin en el caso de un azcar (9). Se distinguen diferentes procesos de transporte activo segn la va por la cual se dispone de la energa necesaria: potencial protn, ATP o fosfoenolpiruvato. El transporte de muchas substancias (azcares, iones inorgnicos y orgnicos) es empujado por el potencial protn, La clula bacteriana mantiene dicho potencial por bombeo constante de protones y otros iones (Na+) al exterior, en el cual intervienen protenas de transporte localizadas en la membrana (9). Cada una de estas protenas tiene una funcin especfica. Por ejemplo, una protena cataliza el transporte simultneo de una molcula de azcar (lactosa, melibiosa o glucosa) y un protn en la misma direccin, lo que se conoce como un simporte de dos (a veces ms) substancias. Otras protenas catalizan el transporte simultneo de dos substancias en direcciones opuestas, por ejemplo un protn y otro in (Na+ o un cido orgnico), lo que se llama antiporte, como se muestra en la figura 2. En las clulas procariticas la entrada de azcares a la clula es favorecida por un simporte acoplado a H +, mientras que en las eucariticas est casi siempre acoplado a Na+. Adems de los sistemas de transporte que dependen del potencial de la bomba de protones hay otros que dependen del ATP, donde intervienen las protenas del espacio periplsmico en las proteobacterias (8) . Cuando el transporte ocurre mediante trasladacin de grupos, la molcula transportada es modificada qumicamente. Por ejemplo, la glucosa (manosa, fructosa u otro azcar) es captada por el sistema fosfotransferasa dependiente del fosfoenolpiruvato y se libera en el interior glucosa-6-fosfato (ver figura 2). En condiciones aerobias y a pH 7,0 la concentracin del Fe+++ es a lo sumo 10 -18 moles/L pues se forma el hidrxido frrico casi insoluble, por lo que algunas bacterias excretan substancias que tienden a solubilizar al hierro formando complejos con Fe+++ que permitan transportado. Tales substancias se denominan siderforos y son compuestos fenlicos e hidroxamatos (9). La levadura de cerveza posee distintos sistemas especficos para la captacin de cada in metlico (Cu++, Fe+++, Mn+, Zn++). En el caso del hierro primero es reducido a

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Fe++ por las reductasas de la membrana citoplasmtica, luego interviene un sistema de baja afinidad para su incorporacin a las clulas con hierro, pero cuando hay una deficiencia limitante del crecimiento acta otro sistema de captacin de alta afinidad. La levadura tambin tiene dos sistemas de captacin para la incorporacin de manganeso. Por otra parte, en algunas bacterias patgenas la virulencia depende de la capacidad del microorganismo para obtener iones metlicos del hospedador. El conocimiento de los genes que generan los sistemas de captacin de iones metlicos de los microorganismos permite obtener vegetales transgnicos que aprovechan mejor los nutrientes del suelo o secuestran metales txicos como, por ejemplo unas plantas donde se haba expresado un gen que les posibilit convertir el Hg++ en Hgo (11).

2.5. Factores ambientales

El suelo, o material de la superficie terrestre en el que se sustenta la vida vegetal, es uno de los sitios ms dinmicos en interacciones biolgicas de la naturaleza. Comprende organismos vivos, minerales disgregados, agua, aire y materia orgnica muerta. El agua y el aire representan aproximadamente la mitad del volumen del suelo
(12).

2.5.1. Agua y presin osmtica

La disponibilidad de agua en el ambien te se expresa indirectamente en trminos de

actividad del agua (aw), la que se define como la razn entre la presin de vapor de temperatura, es decir, aw = p/p o Este concepto se asocia al de humedad relativa de la atmsfera en equilibrio con el

agua del substrato o solucin (p ) y la presin de vapor del agua pura (po) a la misma

sistema, de la siguiente manera HRE = aw . 100 La mayor parte de las bacterias no crecen a una a w por debajo de 0,91 mientras que los mohos pueden desarrollarse con cifras de 0,80. Los valores ms bajos obtenidos para arqueobacterias halfilas son del orden de 0,75 mientras que los mohos xerfilos (amantes de la sequedad) y las levaduras osmfilas (que prefieren presiones osmticas elevadas) se multiplican muy lentamente an con valores de 0,65 y 0,60 respectivamente. Los lmites de a w dentro de los cuales hay crecimiento, son ms amplios a la temperatura ptima de multiplicacin. La capacidad de los organismos para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce a l aw . La presencia de ciertos elementos nutritivos ampla los lmites de aw dentro de los cuales los organismos pueden sobrevivir (3). La presin osmtica () est relacionada con la actividad del agua a travs una expresin

temperatura absoluta (T), el logaritmo natural de la actividad del agua (aw) y el volumen molar parcial del agua (v ) (3). El potencial agua de un suelo es la suma de los potenciales osmtico, matricial (o capilar) y gravitacional. La humedad relativa de la fase vapor en equilibrio con el suelo es tambin una medida indirecta del potencial agua.

= -RT.ln aw/v que comprende a la constante de los gases (R ), la

= -RT m /109 donde es la densidad del agua, los iones por molcula de soluto, m la molalidad, el coeficiente osmtico a la molalidad m y la temperatura TK. El potencial matricial () est dado por la ecuacin = (RT ln p/p o) /106 M donde M es el peso molecular del agua.
ecuacin

El potencial osmtico de la solucin del suelo ( ) puede expresarse mediante la

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 El trmino capacidad de campo se refiere al contenido en agua de un suelo, drenado despus de la saturacin, cuando la velocidad de la prdida de agua debida a la gravedad es pequea. No es una medida precisa (12). Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio, y estn protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presin osmtica interna (1). En contraposicin a la diversidad de concentraciones de potasio y sodio en los distintos ambientes, los organismos vivos contienen potasio a una concentracin ms elevada que la del medio externo. Adems de neutralizar las cargas negativas de la clula y de regular la funcin enzimtica, el potasio acta como un soluto implicado en la regulacin osmtica de algunos organismos Algunos organismos halfilos que viven en ambientes de alta salinidad sdica, por ejemplo Halobacterium, son la excepcin a esta regla (10). Los organismos que son capaces de crecer a elevadas concentraciones de azcar se denominan osmfilos. Basados en sus respuestas, o tolerancia, a la sequedad los microorganismos se pueden distribuir entre tres grupos definidos por el potencial agua () ptimo y mnimo para el crecimiento: grupo 1. ptimo 0.1 MPa, mnimo alrededor de 2MPa; contiene algunos hongos y una variedad de bacterias Gram-negativas; grupo 2. ptimo alrededor de 1 MPa, mnimo alrededor 5MPa; contiene principalmente zigomicetos, bacterias Gram-negativas y actinomicetos; grupo 3. ptimo alrededor de 1MPa, mnimo 10 a 15 MPa; contiene una variedad de ascomicetos y basidiomicetos y bacterias Gram -positivas (12).

2.5.2. Tensin superficial

La tensin superficial de los medios de cultivo afecta al desarrollo de un microorganismo. Por ejemplo BaciIIus subtilis tiende a crecer en la superficie a modo de pelcula o velo en los medios corrientes con una tensin superficial entre 57 y 63 dinas, pero si se disminuye a menos de 40 dinas por el agregado de un detergente crece en forma difusa (13). La humectabilidad es funcin de la tensin superficial. Las soluciones de detergentes pueden penetrar en grietas y espacios muy pequeos e incluso hasta el centro de los agregados de bacterias, donde el agua quedara por encima sin mostrar penetracin alguna.

2.5.3. pH

El pH del medio puede influir sobre la expresin de genes y regular el transporte de protones, la degradacin de los aminocidos, la adaptacin a condiciones acdicas o bsicas y an la virulencia. Las clulas perciben los cambios del pH ambiente a travs de diferentes mecanismos. La protonacn y desprotonacin de los aminocidos inducida por el pH, puede alterar la estructura protenica secundaria y por lo tanto la funcin que seala el cambio. La clula puede responder slo a una de las formas de las molculas de seal. Por ejemplo, los cidos orgnicos atraviesan la membrana citoplasmtica solamente en la forma protonada y un aumento de la concentracin intracelular indicara un incremento en la acidez ambiental. El gradiente de protones a travs de la membrana puede servir, por s mismo, como un sensor para ajustar los procesos dependientes de la energa (8). El pH intracelular puede ser mantenido sobre un valor crtico en el cual las protenas internas se desnaturalizan irreversiblemente. En Salmonella typhimurium hay tres mecanismos para mantener el pH interno compatible con la vida: la respuesta homeosttica, la respuesta de tolerancia al cido y la sntesis de protenas de shock acdico (14). A pH ambiental mayor que 6,0 las clulas bacterianas ajustan su pH interno a travs de la respuesta homeosttica modulando la actividad de las bombas de protones,

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antiportes y simportes, para aumentar la velocidad a la cual los protones son expelidos del citoplasma. El mecanismo homeosttico es constitutivo y funciona en presencia de inhibidores de la sntesis proteica. La respuesta de tolerancia al cido es iniciada por un pH externo de 5,5 a 6,0. Este mecanismo es sensible a los inhibidores de la sntesis proteica y puede mantener el pH interno por sobre 5,0 teniendo el pH externo valores tan bajos como 4,0. La prdida de la actividad ATPasa, causada por las mutaciones que desorganizan genes o los inhibidores metablicos, anula la respuesta de tolerancia al cido pero no el mecanismo homeosttico. Esta respuesta tambin puede conferir proteccin cruzada frente a otros agentes ambientales de estrs. La sntesis de protenas de shock acdico es la tercera va por la que la clula regula el pH interno. Esta sntesis es generada por un pH ambiental de 3,0 a 5,0 proveyendo un conjunto de protenas reguladoras distintas de las protenas de la respuesta de tolerancia al cido. Rango de pH para el crecimiento (2) lmite inferior ptimo 0,5 2,0-3,5 5,5 7,0-7,5 5,6 7,1 6,0 6,8 6,0 7,5-7,8 6,6 7,6-8,6 1,6 1,8 1,9 2,5 <2,8 2,8

Bacterias Thiobacillus thiooxidans Azotobacter sp. Erwinia carotovora Clorobium limicola Thermus aquaticus Nitrobacter spp. Hongos Aspergillus oryzae Fusarium oxysporum Penicillium italicum Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Aspergillus niger

lmite superior 6,0 8,5 9,3 7,0 9,5 10,0 9,3 11,1 9,3 8,5 7,4 8,8

Aunque para la mayora de las bacterias el pH ptimo para el crecimiento se encuentra entre 8,5 y 7,5; pocas especies son acidfilas (Thiobacillus), algunas son cidotolerantes (lactobacilos), pero muchas crecen en condiciones alcalinas (nitriificadores, rizobios, actinomicetos y bacterias ureolticas). Por su parte, los hongos prefieren valores bajos de pH, y predominan cuando se siembra una muestra de suelo en un medio de pH 5, pero no a pH 8 (15). Algunos organismos productores de cidos no son cido-tolerantes y si el medio no posee un regulador de pH se autoenvenenan, por ejemplo ciertas enterobacterias (2).

2.5.4. Oxgeno

El metabolismo de los microorganismos est fuertemente infludo por el oxgeno molecular. Los organismos que dependen de la respiracin aerbica, para los cuales el oxgeno es el aceptor final de electrones, se conocen como aerbicos estrictos. Un ejemplo de stos es la actinobacteria Streptomyces. Por el contrario para los organismos anaerbicos estrictos el oxgeno es generalmente txico. Las clulas somticas de las bacterias del gnero Clostridium son muy sensibles al oxgeno mientras que los endosporos estn protegidos de su efecto letal. Un grupo intermedio de organismos, los anaerbicos facultativos, pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno molecular, por ejemplo la levadura Saccharomyces cerevisiae que puede obtener su energa tanto de la fermentacin como de la respiracin. Por otro lado estn los organismos que nicamente toleran al oxgeno, como algunas bacterias lcticas que

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 obtienen su energa exclusivamente de la fermentacin sin ser daadas por el oxgeno. Ciertas bacterias aerbicas se cultivan mejor en ambientes donde la concentracin de oxgeno es reducida y se las denomina microaeroflicas (14).

2.5.5 Potencial de reduccin

El potencial de reduccin de un substrato es aquel en que dicho substrato gana electrones con mayor facilidad. Cuando pasan electrones de un compuesto a otro, se crea una diferencia de potencial entre ambos, la que se expresa en milivoltios (mV). Cuanto ms oxidada est una substancia ms positivo ser su potencial elctrico, y cuanto ms reducida el potencial ser ms negativo. El potencial de reduccin de un sistema se expresa con el smbolo Eo. Los microorganismos aerobios crecen en ambientes con valores E o positivos mientras que los anaerbicos necesitan para su desarrollo un medio con Eo negativo. Entre las substancias que ayudan a mantener condiciones reductoras en el medio de cultivo se encuentran los aminocidos con un grupo tiol ( -SH) y los azcares con un grupo aldehdo libre (15).

2.5.6. Temperatura
En muestras de agua recogidas en las proximidades inmediatas a las surgencias termales se han hallado hasta 108 - 109 clulas bacterianas por mL. Las bacterias adaptadas a elevadas presiones hidrostticas (250260 bares o sea 25-26 MPa) muestran adems una notable adaptacin a las altas temperaturas, por ejemplo unas bacterias metanognicas tenan tiempos de duplicacin entre 37 y 65 minutos a 100C bajo tales presiones (16). Temperaturas cardinales en C para microorganismos procariticos (17) grupo mnima ptima mxima termfilos 40-45 55-75 60-90 mesfilos 5-15 30-45 35-47 psicrotrofos -5-+5 25-30 30-35 psicrfilos -5-+5 12-15 15-20 Los valores de las temperaturas cardinales (mnima, ptima, mxima) varan ampliamente entre las bacterias como se muestra en el cuadro siguiente, pero algunas tienen una amplitud mayor, como por ejemplo Clostridium perfringens que crece entre 12 y 50C. Los organismos aislados de ambientes fros crecen a temperaturas por debajo de 0C si las altas concentraciones de solutos impiden la congelacin del medio (1). Temperaturas en C para el crecimiento de bacterias (1) especie mnima ptima mxima Listeria monocytogenes 1 30-37 Pseudomonas maltophila 4 35 Escherichia coli 10 37 Clostridium kluyveri 19 35 Bacillus flavothermus 30 60 Thermus aquaticus 40 70-72 Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 Pyrobacterium brockii 80 102-105

45 41 45 37 72 79 90 115

Los mohos psicrotrofos pertenecen a los gneros Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Trichothecium y las levaduras a Candida, Cryptococcus, Torulopsis, Rhodotorula (18).

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Temperaturas cardinales de algunos hongos (18,19) temperatura C grupo mnima ptima Alternaria solani 2 27 Aspergillus fumigatus 12 35 Botrytis cinerea 0 20 Fusarium moniliforme <5 25 Rhizoctonia solani 2 25-30 Trichothecium roseum <10 30

mxima 45 55 30 35 35 35

La velocidad de crecimiento se ve afectada por los cambios de temperatura y en los rangos inferiores el tiempo de generacin puede sobrepasar las cien horas. Los microorganismos eucariticos, por ejemplo protozoos, son ms sensibles a las bajas temperaturas que los procariticos, y entre estos ltimos los gram negativos son ms afectados que los gram positivos (17).

2.6. Medios de cultivo

El medio sirve de reservorio para los nutrientes. El componente dominante es casi siempre el agua. Tambin en el caso en el que los microorganismos se hallen sobre un substrato slido, por ejemplo cereales o forrajes, ste debe estar hmedo para permitir la accin microbiana o enzimtica. Medios complejos para el enriquecimiento de bacterias hetertrofas (21) base : extracto de levadura 1%, KH 2PO4 0,1%, MgSO4 0,02% incubacin : 30C, en la obscuridad fuente condiciones agregado organismos suelo pH 7,0 - aerobiosis --oxidantes de aminocidos " pH 3,0 - anaerobiosis glucosa 2% Sarcina sp. suelo pasterizado pH 7,0 - aerobiosis --Bacillus spp. " pH 7,0 - anaerobiosis --Clostridium fermentadores de aminocidos " pH 8,0 - aerobiosis urea 5% Bacillus pasteurii " pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%, Clostridium fermentadores CaCO3 2% de azcares vegetales, leche, pH 6,5 - anaerobiosis glucosa 2% bacterias lcticas frutas, cerveza pH 6,0 - aerobiosis etanol 4% bacterias acticas suelo, agua pH 7,0 - anaerobiosis glucosa 2%, bacterias coliformes residual CaCO3 2% queso suizo pH 7,0 - anaerobiosis lactato Na 2% bacterias propinicas Los microorganismos heterotrficos pueden utilizar azcares, alcoholes y aminocidos como fuente de energa. Algunos son capaces de emplear polisacridos, como almidn y celulosa, al tener la posibilidad de hidrolizar estos compuestos hasta azcares sencillos. Loa aminocidos y nucletidos suelen constituir la fuente primaria de nitrgeno y para obtenerlos, algunos organismos son capaces de degradar pptidos, protenas y polinucletidos. Tambin las grasas son utilizadas como fuente de energa, aunque slo un nmero relativamente pequeo de microorganismos las atacan (20). Adems del carbono, los nutrientes primordiales son nitrgeno y fsforo que se incorporan como amonio o nitrato, y fosfato. Otros nutrientes, tales como vitaminas e iones metlicos, se requieren en pequea cantidad (micronutrientes) y suelen estar, como contaminantes, en los componentes principales de los medios de cultivo e incluso

10

Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 en los recipientes de vidrio que los contienen. Cuando el oxgeno es necesario para el metabolismo, la fuente usual de suministro es el aire filtrado (5). La mayora de los mohos, as como unas pocas bacterias y levaduras, cuando crecen sin alteraciones, forman una pelcula fuerte y contnua en la superficie del medio. En cambio, si crecen bajo el efecto de una agitacin vigorosa, originan bolitas de una pulpa fibrosa dispersadas por todo el medio fludo (20). Los requerimientos nutritivos de los mohos son muy parecidos a los de las levaduras, salvo que los mohos presentan ms diversidad en los tipos de substratos orgnicos que pueden asimilar (5). En el laboratorio un medio corriente es el extracto de malta, con o sin extracto de levadura y agar. Para el crecimiento de algunos mohos se utiliza un medio definido constitudo por sacarosa y sales minerales conocido como agar Czapek, a veces adicionado de extracto de levadura. Cuando se desea aislar hongos osmfilos se le agrega 20 a 50% de sacarosa (18). Un medio con cloruro de amonio y otras sales, sin ninguna fuente de carbono, cuando se incuba aerbicamente tendr disuelto CO2 atmosfrico y en presencia de luz permitir el crecimiento de algas y cianobacterias. Pero si se incuba en la obscuridad facilitar el desarrollo de bacterias que obtienen energa por oxidacin del amonio (20). Medios para el enriquecimiento de bacterias fotosntetizantes (21) base : NH 4 Cl 0,1%; K 2 HPO 4 0,1%; MgSO4 0,02%; FeSO4 0,005%; CaCl2 0,002%; MnCl2 0,0002%; NaMoO4 0,0001% incubacin : 25 - 30C, iluminacin constante, sin aire agregado pH organismos Na2S 0,2% + NaHCO3 0,5% 7,5 bacterias verdes del azufre Na2S 0,2% + NaHCO3 0,5% 8,0 - 8,5 bacterias purpreas del azufre Na malato 0,5% + ext de levadura 0,05% 7,0 - 7,5 bacterias purpreas no del azufre Medios sintticos para el enriquecimiento de bacterias autotrficas (21) base: K2 HPO4 0,1%; MgSO4 0,02%; FeSO4 0,005%; CaCl2 0,002%; MnCl2 0,0002%; NaMoO4 0,0001% incubacin: 25 - 30C, en la obscuridad agregado pH atmsfera organismos NH4 Cl 0,15% + CaCO3 0,5% 8,5 aire Nitrosomonas NaNO2 0,3% 8,5 aire Nitrobacter NH4 Cl 0,1% + Na2 S2 O3 0,7% 7,0 aire Thiobacillus NH4 NO3 0,3% + Na 2 S 2 O3 0,7% + NaHCO3 0,5% 7,0 sin aire T. denitrificans NH4 Cl 0,1% 7,0 H 2 85%, O2 10%, bacterias . CO2 5% del hidrgeno Sea cual fuere la composicin qumica del medio, es necesario que todos los componentes estn perfectamente mezclados, de modo que el microorganismo tenga acceso a todos los nutrientes. La mayora de las bacterias y algunas levaduras crecen comnmente como clulas individuales o como agregados de varias de ellas, y permanecen suspendidas en el medio. Cuando se trata de una poblacin densa o las clulas secretan polmeros, el medio fludo se vuelve viscoso y adems, pueden formar grandes agregados o crecer como una pelcula mucosa sobre la superficie.

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2. 7 Esterilizacin
2.7.1. Accin del calor
Con el fin de evitar el crecimiento de microorganismos extraos introducidos por la contaminacin, se esterilizan con vapor de agua a presin todos los materiales que integran el medio de cultivo. El vapor tambin se suele emplear para esterilizar recipientes y otras superficies con las que el medio est en contacto (20). Tiempo de destruccin de algunos endosporos bacterianos (2) calor hmedo minutos a organismo 100 105 110 bact. termfilas ... 400 100-300 Bacillus anthracis 2-15 5-10 ... B. subtilis horas ... Clostridium tetani 5-90 5-25 C. perfringens 5-45 5-27 10-15 C. botulinum 300-530 40-120 32-90 C.sporogenes 150 45 12 calor seco minutos a organismo 120 130 bacilos termfilos ... ... B. anthracis ... ... C. botulinum 120 60 C.pefringens 50 15-35 C. tetani 20-40 115 40-110 ... 40 4 10-40 ... 140 ... >180 15-60 5 5-15 120 11-35 ... 1 4-20 ... 150 180 60-120 25 30 125 4-8 ... ... ... 160 30-90 9-90 20-25 12 130 3,5 ... ... ... 170 15-60 10-15 5 1340 C 1 ... ... ... ... 1800 C 15 3 5-10 1

Los factores que afectan a la termodestruccin pertenecen a tres tipos generales: (a) factores intrnsecos, por ejemplo diferencias entre cepas y especies, entre endosporos y clulas somticas; (b) factores ambientales que ejercen su influencia durante el crecimiento y la formacin de las clulas o los endosporos, como edad, temperatura y medio de cultivo; (c) factores ambientales que actan durante el tratamiento trmico de las clulas o los endosporos, por ejemplo pH, aw , medio de suspensin, tipo de substrato, sales y otros compuestos org nicos o inorgnicos. Los endosporos bacterianos son muy resistentes a la temperatura, algunos pueden incluso sobrevivir tratamientos de varios minutos a 120C en ambiente hmedo. Cuando se utiliza el calor para destruir los microorganismos presentes en una pelcula lquida es posible utilizar tratamientos muy cortos, pero la esterilizacin de algunos slidos exige horas debido a las dificultades impuestas por la penetracin del calor (17). El autoclave es un aparato cuyo funcionamiento se basa en que la temperatura de ebullicin del agua aumenta con la presin. Por consiguiente si la presin absoluta del vapor en el recipiente cerrado se eleva a 2,02 kg/cm2 la temperatura subir hasta 1200 C. La presin absoluta es la suma de la presin atmosfrica y la presin manomtrica del autoclave. La temperatura de una mezcla de vapor y aire a determinada presin es inferior a la del vapor solo, por lo que debe evacuarse todo el aire de la cmara de esterilizacin (1). Otra precaucin importante es la de que el vapor se introduzca bien en los materiales sometidos a esterilizacin. El tiempo de funcionamiento depende de la naturaleza y volumen del material que se esteriliza, as como del tipo de envase.

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 El orden de la termodestruccin microbiana es logartmico, lo que permite desarrollar combinaciones de tiempo y temperatura que aseguren un efecto destructivo. La figura 3 muestra una recta tpica de supervivencia microbiana obtenida representando, en funcin del tiempo, el logaritmo del nmero de los supervivientes a la exposicin a una determinada temperatura. A partir de este grfico se puede determinar el tiempo de reduccin, decimal (D) que es el nmero de minutos precisos para destruir el 90% de una poblacin. La lnea recta se extiende tericamente hasta la zona de logaritmos negativos, por ejemplo log 10-3 = 1 clula por cada 1000 g (14). La muerte de los microbios por una fuente de calor, u otro agente letal, se expresan mediante la ecuacin cintica de primer

N = No .e-kt donde N es el nmero de clulas (UFC/g), No el nmero inicial de clulas, t el tiempo, k la constante de velocidad, luego 2,3 log(N/No) = - (k t) y entonces t = - [2,3 log(N/N o)] / k
orden El tiempo de reduccin decimal es la constante cintica usada con ms frecuencia en la industria de conservas vegetales e igual a D = 2,3 / k estando D y k definidos para una temperatura dada.

k y T est relacionada con la energa de activacin Ea mediante la ecuacin de Arrhenius k=s -Ea/RT donde s es la constante de frecuencia, R la constante de los gases ideales, T temperatura en grados
La interrelacin entre Kelvin.

D y T est dada por el valor z y est relacionado con E a por la ecuacin E a = [2,3 R. T 1. T 2 / z]. 9/ 5 siendo T 1 la temperatura de referencia y T2 la
La interrelacin entre del ensayo, en grados Kelvin (14).

2.7.2. Accin de las radiaciones

La irradiacin consiste en proyectar una cierta cantidad de energa sobre un cuerpo para expulsar los electrones perifricos fuera de los tomos y producir de esta manera iones. Estos ion es, as como los electrones expulsados, reaccionan a su vez con otros tomos. El resultado es la rotura de enlaces entre los tomos y las molculas que constituyen la substancia tratada. En las clulas, la radiacin afecta en primer lugar a los cidos nucleicos y las protenas, sin que se produzca un calentamiento apreciable. Algunas de las alteraciones que una radiacin ionizante puede producir en un cido nucleico son reparables por el microorganismo, por ejemplo la hidratacin de la citosina. Otras alteraciones son ms perjudiciales, como la formacin de puentes entre ambas cadenas del ADN impidiendo la duplicacin del mismo y por tanto de la bacteria. Se emplean tres formas de radiacin: los rayos gamma, los electrones acelerados y los rayos X. Los irradiadores de rayos gamma funcionan con cobalto 60, emitiendo estos rayos con gran poder de penetracin, de hasta varias decenas de centmetros, lo que permite tratar productos a granel. La irradiacin tambin inhibe la germinacin de las papas y las cebollas, prolongando el tiempo de almacenamiento, as como afecta a las larvas y huevos de insectos en los cereales.

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El gray es la cantidad de energa absorbida correspondiente a un joule por kg de substancia ionizada y reemplaza al rad (1 Gy = 100 rad) en el sistema internacional (22).

2.7.3. Accin de la luz ultravioleta

El rango de la radiacin UV que ms afecta a los microorganismos est entre 240 y 280 nm, y se utiliza para el tratamiento de superficies contaminadas pues tienen poco poder de penetracin. La radiacin germicida (254 nm) es absorbido por el material celular pero de manera ms significativa por los cidos nucleicos, a los que causa el mayor dao. Los endosporos bacterianos son 7 a 50 veces ms resistentes a la radiacin UV de 254 nm que las clulas vegetativas (23). El principal efecto de la luz UV es causar la formacin de dmeros, mediante enlaces transversales, entre pirimidinas adyacentes, especialmente residuos de timina del ADN. Estos residuos unidos por enlaces transversales, alteran el proceso normal de replicacin dando como resultado mutaciones. Muchas bacterias poseen un eficiente mecanismo de fotorreactivacin para reparar el dao causado por la radiacin UV cuando se exponen inmediatamente despus a la luz visible (2).

2.7.4. Accin de las microondas

Las microondas son una parte del espectro de ondas electromagnticas cuya banda se extiende desde los 500 megahertz hasta los 10 gigahertz, es decir incluye ondas cuyas frecuencias de oscilacin van desde los 500 millones a los 10.000 millones de ciclos por segundo, y se usan para generar calor interno en diversos productos (24). Las molculas de agua son dipolos elctricos y cuando se aplica un campo de microondas, se reorientan con cada cambio en la direccin del campo produciendo calor por la friccin intermolecular. Las caractersticas fsicas, trmicas, dielctricas del tejido biolgico, su masa y la frecuencia de la radiacin, causan un calentamiento diferencial de los distintos constituyentes. Esta falta de uniformidad trmica ha limitado el uso de las microondas para la inactivacin microbiana, pues el calentamiento heterogneo puede dejar puntos donde sobrevivan microorganismos, aunque tericamente estas clulas son calentadas especficamente dentro de la matriz del producto que las contiene. La frecuencia comnmente usada, por distintas razones, es 2,45 GHz y no parece ser la ms conveniente (23).

2.7.5. Accin del ultrasonido

Las ondas sonoras de alta frecuencia (ultrasonido) tambin se usan para desintegrar clulas microbianas y eliminar microorganismos de un equipo (2). Se ha usado para productos lquidos un proceso combinado de inactivacin microbiana que incluye calor (112C) y ultrasonido (20kHz) bajo una presin de 300 kPa (23).

2.7.6. Separacin por filtracin

Las preparaciones que contienen productos sensibles al calor se esterilizan mejor por filtracin. El material filtrante se prepara con un ster de celulosa u otros polmeros con poros de tamao preciso y uniforme. Es muy delgado, con un espesor de unos 150 m y por eso se le denomina membrana filtrante. Los filtros ms usados tienen un dimetro de poro de 0,2 m de 0,45 m. Para su uso se suele colocar la membrana preesterilizada sobre el disco que la soporta en la unidad de filtracin estril. Los filtros de aire de elevada eficiencia (HEPA) permiten suministrar aire libre de polvo y microorganismos a una cmara de siembra, y estn acoplados a un sistema de flujo laminar (2).

2. 8. Desinfeccin
Los desinfectantes son substancias qumicas que matan a las clulas somticas adheridas a las superficies inanimadas, pero no necesariamente a las formas

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 esporuladas. Los antispticos destruyen o inhiben el crecimiento y la actividad de los microorganismos que estn sobre los tejidos vivos (1). Se llama bactericida a la substancia que mata las clulas bacterianas y bacteriosttico a la que impide el crecimiento y multiplicacin de las mismas. Un agente antimicrobiano interfiere con el crecimiento y metabolismo de los microorganismos y cuando se refiere a grupos especficos se usan los trminos antibacteriano o antifngico (2). Varios factores influyen sobre la velocidad con que son inhibidos o destrudos los microorganismos. A medida que aumenta la concentracin del agente las clulas mueren ms rpido, por ejemplo 4,25 g de fenol/L requieren unas 10 horas para obtener el mismo resultado que una concentracin de 6,04 g/L en 1,5 horas. Un ligero aumento de la temperatura permite aumentar grandemente la efectividad de un desinfectante por ejemplo, para una solucin de fenol de 4,62 g/L, un incremento de 30 a 42C permite obtener el mismo resultado en un tiempo diez veces menor (2). Las especies de microorganismos difieren en la sensibilidad a los diversos agentes antimicrobianos. Los endosporos bacterianos son las clulas ms resistentes por su capacidad de sobrevivir a las condiciones qumicas adversas. La presencia de materia orgnica puede reducir significativamente la efectividad de un antimicrobiano, inactivndolo por combinacin con el mismo o protegiendo al microorganismo al dificultar el contacto con el desinfectante. Cuando estn en un ambiente con un pH cido los microorganismos son destrudos a temperatura ms baja y en menor tiempo que en un medio ligeramente alcalino (1). Los compuestos fenlicos pueden ser bactericidas o bacteriostticos segn la concentracin usada, pero algunos son fungicidas. La actividad es reducida por un pH alcalino o la presencia de materia orgnica. El alcohol etlico en concentraciones de 50 a 70% v/v es efectivo contra clulas somticas. Los productos que contienen 5 a 7% de hipoclorito de sodio se usan para higienizar diversos equipos, pero es muy afectado por la presencia de materia orgnica. Los detergentes disminuyen la tensin superficial y no son afectados por las aguas duras. Los agentes que al ionizarse tienen la propiedad detergente en el anin son conocidos como detergentes aninicos, por ejemplo el lauril sulfato sdico o los jabones. Producen la eliminacin mecnica de los microorganismos al atraparlos en la espuma. Los que tienen la propiedad detergente en el catin son llamados catinicos, por ejemplo los cloruros de amonio cuaternario. Son bactericidas frente a las grampositivas pero tienen poca accin contra las gramnegativas (2). El formaldehdo es un gas que se comercializa como una solucin acuosa (formol o formalina) que contiene entre 37 y 40 % de formaldehdo. Se emplea en soluciones del 3 al 8%. Tiene una alta actividad microbicida. Se lo suele usar para esterilizar ambientes cerrados bajo c ondiciones apropiadas pues los vapores son nocivos (2).

2. 9. Interacciones microbianas
2.9.1. Antibiosis
Un microorganismo puede producir metabolitos que hagan el ambiente desfavorable para el desarrollo de otros o que perturben su metabolismo hasta el punto de que mueran o sean incapaces de reproducirse. El fenmero recibe el nombre de antibiosis o antagonismo. Los antibiticos constituyen un grupo heterogneo de molculas orgnicas relativamente pequeas, producidas por unos microorganismos para inhibir a otros a una concentracin muy baja. La mayora de los microorganismos notoriamente productores de antibiticos se alojan en el suelo (8). Otro grupo se molculas antagonistas son las bacteriocinas. Constituyen un grupo relativamente heterogneo de pequeas protenas sintetizadas en los ribosomas

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microbianos. Actan sobre bacterias estrechamente relacionadas al agente productor pero no afectan a ste. Algunas bacteriocinas son: nisina producida por Lactococcus Iactis, subtilina por B. subtilis, colicinas por E. coIi, pediocina por Pediococcus acidilactici
(26).

Productos metablicos microbianos que actan como antibiticos (1, 25) antibacterianos producido por modo de accin aminoglucsidos estreptomicina Streptomyces griseus induce sntesis anormal de protenas neomicina Streptomyces fradiae cefalosporinas Acremonium cephalosporium inhiben sntesis de pared celular cloranfenicol Streptomyces venezuelae eritromicina Saccharopolyspora erythraea interfiere con sntesis de protenas lincomicina Streptomyces lincolnensis penicilinas Penicillium chrysogenum inhiben sntesis de pared celular polipptidos polimixinas BaciIIus polymyxa deterioro de membrana celular bacitracina BaciIIus subtilis inhibe formacin de pared celular rifamicinas Amycolatopsis mediterranei interfiere con sntesis de protenas tetraciclinas Streptomyces spp. vancomicina Arnycolatopsis orientalis viomicina Streptomyces griseus antifngicos anfotericina B Streptomyces nodosus interfiere con funcin de membrana griseofulvina PeniciIIium griseofulvum daa la membrana celular lipopptidos iturina A BaciIIus subtilis interfiere con funcin de membrana surfactina BaciIIus subtilis nistatina Streptomyces noursei daa la membrana celular

2.9.2. Mutualismo y simbiosis

Los microorganismos que habitan en un ecosistema presentan varios tipos de asociaciones e interacciones entre las especies. A veces se asocian diferentes especies bacterianas, o bien bacterias y otra clase de organismos, como levaduras, mohos, algas, protozoos e incluso plantas, u hongos con plantas como en el caso de las micorrizas. En muchos casos, el crecimiento y la reproduccin son ms vigorosos en asociaciones favorables de dos tipos de organismos que en cultivos de una sola especie (9). El mutualismo es la vida en comn de dos o ms organismos asociados en beneficio mutuo pero no implica necesariamente el contacto fsico. Simbiosis es una asociacin especfica entre dos tipos de organismos que estn en contacto fsico. Generalmente el de menor tamao (simbionte) vive dentro o est adherido a la superficie del mayor (hospedador). La simbiosis no siempre implica mutualismo. El hospedador es siempre un organismo eucaritico y puede mantener al simbionte (eubacteria, actinomiceto, hongo o alga) intracelular o albergarlo en el interior de cavidades u rganos (12). Por otra parte, la sintrofia es la accin cooperante de dos microorganismos con metabolismos complementarios (un tipo de mutualismo) alcanzando un efecto que no es logrado separadamente por ninguno de ellos (9). Un organismo puede ser incapaz de crecer en presencia de cierto substrato, pero si coincide con un microorganismo capaz de degradarlo y producir molculas tiles para el primero, se observa su crecimiento. Esta asociacin recibe el nombre de comensalismo o vida en comn de dos especies con beneficio para una de ellas y sin

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 dao ni provecho para la otra, por ejemplo cuando los microbios colonizan la superficie externa de una planta obteniendo energa de la metabolizacin de exudados producidos por el hospedador. Otro ejemplo es la influencia favorable de un microbio facultativo sobre el desarrollo de uno anaerobio, el primero reduce la tensin de oxgeno y crea un ambiente adecuado para que prospere el segundo (27). Las comunidades microbianas estn caracterizadas por siete diferentes mecanismos biolgicos: a) provisin de nutrientes especficos por los diferentes miembros de la comunidad, b) moderacin de la inhibicin del crecimiento, c) interacciones que causan la alteracin de los parmetros de crecimiento de las poblaciones individuales, produciendo un desempeo de la comunidad ms eficiente y/o competitivo, d) actividad metablica combinada no expresada por las poblaciones individuales aisladas, e) cometabolismo, f) reacciones de transferencia de hidrgeno, g) interaccin entre varias especies dominantes (28).
2.9.2.1. Fijacin simbitica del nitrgeno

Una particularidad de las plantas leguminosas es su capacidad para asociarse con bacterias fijadoras de nitrgeno pertenecientes a los gneros Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium. Esta simbiosis se traduce en el desarrollo del ndulo en cuyo interior las bacterias se multiplican y transforman el nitrgeno del aire en amonio (ver 3.10). La asimilacin de ese amonio por parte de las plantas les permite crecer en suelos pobres en nitrgeno. En la primera etapa, la planta secreta en su exudado radicular unos flavonoides que atraen a los rizobios por quimiotactismo y activan en la bacterias la expresin de ciertos genes que determinan la produccin, en los rizobios, de molculas fundamentales para el reconocimiento y la infeccin de la planta hospedadora induciendo la formacin de los ndulos. Las bacterias se adhieren a los pelos absorbentes de la raz e inducen la curvatura del extremo de los mismos (29). Los rizobios infectan la planta mediante un filamento de infeccin que avanza hacia la base del pelo y el interior de la raz, simultneamente las clulas de la corteza interna de la raz se dividen y forman el primordium nodular. La multiplicacin muy intensa de estas clulas provoca la aparicin del ndulo, que es un verdadero rgano especializado en el intercambio metablico entre ambos asociados. Algunas especies de bacterias fijadoras de nitrgeno en simbiosis (33) Gnero, especie, biovar Planta hospedadora Sinorhizobium meliloti alfalfa Rhizobium leguminosarum biovar trifolii trbol Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli poroto Rhizobium ciceri garbanzo Bradyrhizobium japonicum soja Azorhizobium caulinodans Sesbania (ndulos en el tallo)

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Las simbiosis entre rizobios y leguminosas son muy especficas, por ejemplo R. leguminosarum induce la nodulacin en el poroto pero no en la alfalfa (30). Las bacterias no se mezclan con los orgnulos citoplasmticos, sino que se mantienen confinadas en los simbiosomas que son vesculas protegidas por membranas. Los simbiosomas del lupino tienen una sola bacteria, los de la soja varias. La figura 4 muestra el corte de un ndulo. La membrana del simbiosoma acta a modo de barrera que controla el flujo de cidos carboxlicos (malato, succinato, fumarato). stos constituyen la fuente de carbono para los bacteroides. Tales cidos proceden de la oxidacin de azcares sintetizados en las hojas por la fotosntesis. Durante el proceso de formacin de los simbiosoma s, las bacterias se van transformando en bacteroides que expresan diversas protenas especficas como la enzima nitrogenasa y algunos citocromos. Las clulas intersticiales sin infectar intervienen en las ltimas etapas de la sntesis de ureidos, asparagina o glutamina, por incorporacin del nitrgeno fijado. stos se exportan hacia la parte area a travs de los vasos del xilema. Para que los ndulos de las leguminosas fijen nitrgeno es imprescindible que contengan leghemoglobina cuyo grupo hemo es sintetizado por el vegetal (32). La fijacin de nitrgeno requiere gran cantidad de energa que se produce en los bacteroides durante la oxidacin de los cidos dicarboxlicos y la leghemoglobina transporta el O2 a una concentracin baja pero estable que permite mantener una elevada actividad respiratoria sin afectar la nitrogenasa, pues esta enzima se inactiva en presencia de oxgeno (30). La rizsfera de algunas plantas contienen acumulaciones de bacterias fijadoras, tal como Azotobacter paspali sobre la superficie de la raz de Paspalum notatum y Azospirillum brasilense en la de caa de azcar. Las bacterias se hallan en el espacio intercelular del crtex radical, en una simbiosis donde se benefician los dos participantes de la asociacin. Por otra parte, el helecho de agua Azolla contiene a la cianobacteria Anabaena azollae en las cavidades de las hojas. Nostoc vive simbiticamente en el lquen Peltigera y sobre las races areas de Cycas y Gunnera (29). Varias dicotiledneas que no pertenecen a las leguminosas, tambin contiene ndulos en las races capaces de fijar N2 . En la mayora de los casos se trata de actinomicetos del gnero Frankia. En la figura 5 se esquematiza la forma en que los filamentos penetran a las clulas de la raz y produce ndulos donde tambin se encuentra una hemoglobina que facilita la provisin de O2 al endfito (32). Un inoculante para enriquecer el suelo con la bacteria simbitica deseada, contiene altas concentraciones celulares en un substrato que favorece largos perodos de supervivencia sin prdidas de las caractersticas fisiolgicas del microorganismo. Los pasos a seguir comprenden: a) seleccin de las cepas convenientes por su mayor eficiencia; b) cultivo del microorganismo en un medio lquido; c) eleccin, preparacin y esterilizacin del material de soporte; d) impregnacin del soporte con el cultivo lquido que posee un alto nmero de clulas, e) control del nmero de bacterias vivas en el producto terminado (34).

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2 No todas la cepas infectivas en un hospedador particular son capaces de fijar nitrgeno, debido a la interrrelacin varietal y a la interaccin con los suelos y sistemas de produccin. La cepa seleccionada debe ser genticamente estable, tener una alta competencia frente a las cepas menos eficientes propias del suelo, crecer en los medios corrientemente utilizados en la industria y sobrevivir en el soporte a las condiciones de comercializacin. El empleo de turba estril como soporte, el almacenamiento refrigerado del producto y el control de calidad, permiten mantener altos niveles de rizobios vivos en la distribucin del inoculante. Esto se traduce en un incremento de rizobios por semilla. Se suele exigir 2*109 bacterias/g de inoculante a la salida de la fbrica, para as asegurar que el momento de aplicacin permanezcan vivos unos mil millones por gramo. Las condiciones de transporte, almacenamiento y uso determinan el xito de la inoculacin (34).
2.9.2.2. Micorrizas

Una de las funciones ms importantes de las micorrizas (asociaciones entre hongos y plantas) es absorber los elementos minerales menos mviles del suelo (fosfato, cobre, zinc) y transferirlos a la planta hospedadora, as como amonio. La planta proporciona azcares al hongo (36). Las ectomicorrizas se caracterizan por una modificacin de la raz, que pierde sus pelos absorbentes. El hongo rodea la raz con un manto de filamentos, del cual parte una red micelial externa que se extiende por el suelo y una red micelial interna que penetra la raz en el espacio intercelular. Los hongos implicados son macromicetos que solamente en simbiosis pueden formar basidiomas (por ejemplo Amanita, Boletus, Lactarius, Pisolithus, Suillus) o ascomas (como las trufas) (ver 7.3). En las endomicorrizas el micelio entra en la raz donde inicialmente es intercelular, luego penetra en las clulas y se ramifica formando los arbsculos que son ms o menos digeridos por el hospedador, y unas vesculas. Los hongos de las endomicorrizas son micromicetos (Glomus). En la figura 6 se observa un esquema de una endomicorriza y en la 7 de una ectomicorriza.
2.9.2.3. Biopelculas

Las biopelculas que se forman en el forraje ingerido por el ganado vacuno y otros rumiantes, estn inicialmente formadas por microorganismos que digieren la celulosa del m aterial vegetal y producen cidos grasos y otros metabolitos. Luego las clulas de otras especies invaden la pelcula y comienzan a usar

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esas sustancias para su propio metabolismo. As es como el forraje desaparece y es transformado en una masa bacteriana que el animal digiere ms tarde. Estas pelculas son imprescindibles para los rumiantes. Menos de la tercera parte de la biopelcula est constituda por microcolonias de bacterias, el resto es una sustancia blanda y pegajosa (matriz extracelular) secretada por ellas que absorbe agua, atrapa partculas pequeas y mantiene unidas a las microcolonias (figura 8). La pelcula biolgica est atravesada por diminutos conductos que baan a cada agrupacin bacteriana, aportando nutrientes disueltos y eliminando productos de desecho (37).

2.9.3. Predacin

Algunos microorganismos predadores se alimentan de las bacterias, como los protozoos, mixobacterias, acrasiomicetos y varios flagelados fotosintetizantes que no siempre estn clasificados como algas. Siempre que existen protozoos en estado trfico hay una poblacin bacteriana que le sirve de presa. Debido a que una sola clula de protozoo consume entre divisiones 10 3 a 10 4 bacterias, una comunidad con 103 protozoos por mL g est caracterizada por una predacin activa. Un suelo suele tener 109 bacterias/cm3, pero en solucin los protozoos reducen el nmero de clulas a 106 /cm3 Sin embargo, a pesar de su abundancia y actividad, los protozoos no suelen eliminar sus presas porque esto acarreara la desaparicin consecuente del predador. Con una baja densidad de presas el protozoo debe utilizar gran cantidad de energa para llegar a las pocas clulas que le sirven de alimento y puede morir cuando se acaben o bien enquistarse (27).

Referencias
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Leonor Carrillo. 2003. Microbiologa Agrcola. Captulo 2

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