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ROTEIRO DE PRTICA

DISCIPLINA CURSO PROFESSOR Bioqumica Unificada Joo Paulo Cotrim


Semestre

TTULO DA AULA Protenas Reconhecimento de sua estrutura e desnaturao.

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Materiais e Reagentes Bquer de 150mL Tubos de ensaio Pipeta de Pasteur Soluo de clara de ovo Soluo saturada de Sulfato de amnio [(NH4)SO4] Soluo de cido tricloroactico 10% Soluo de uria 0,4 M pH 7,0 contendo o indicador vermelho de fenol Urease cido Clordrico 10% Lamparina Acetona gua destilada

Quantidade 8 20 15 50mL 50mL 50mL 1 50mL 50mL 50mL 50mL 500mL

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1 DESNATURAO DA PROTEINA


As protenas (polmeros naturais de aminocidos condensados), formam cadeias polipeptdicas longas, dispostas no espao de modos caractersticos. A sequncia dos aminocidos sempre igual, com um nmero variado de combinaes possveis. As cadeias polipeptdicas esto enroladas em forma de hlice ou ligadas lateralmente a outras cadeias formando folhas. As foras intermoleculares responsveis por estes arranjos conformacionais so, predominantemente, as ligaes de hidrognio entre os grupos carbonilo, e os hidrognios do grupo amino. Quando a protena deixa de exercer as suas funes, diz-se desnaturada. A desnaturao ocorre quando os seus enrolamentos e agrupamentos caractersticos so desfeitos. Pode ser provocada por agentes externos diversos - variao da temperatura, foras de cisalhamento ou valores de pH extremos. A albumina uma protena de alto valor biolgico presente na clara do ovo (protena maioritria), no leite e no sangue. solvel em gua, moderadamente solvel em solues salinas e sofre desnaturao por aco trmica. Possui propriedades antignicas que a tornam termo-estvel (resistente desnaturao trmica). Pode ser encontrada no plasma, diferindo das outras protenas plasmticas por no ser glicosilada (no possui um resduo acar). A sua sntese est ligada ao
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fornecimento de aminocidos estruturais ao fgado e da a sua sensibilidade desnaturao proteica.

1.1. Resultados experimentais Reagentes / Procedimento Substncia testada Clara de ovo Aquecimento com a lamparina Amostra Branco Clara de ovo H2SO4 Amostra Branco Clara de ovo NaOH Amostra Branco Clara de ovo lcool etlico Amostra Branco No se verificaram alteraes. No se verificaram alteraes. O reagente dissolveu-se na clara de ovo e verificou-se que o tubo aqueceu ligeiramente. No se verificaram alteraes. A amostra ficou branca. Observaes Entrou em ebulio; verificou-se uma diminuio do volume da mistura e alterao para uma cor prxima do branco. Entrou em ebulio; verificou-se alterao para uma cor prxima do branco mas no se verificou alterao do volume da mistura. O cido misturou-se com a clara de ovo.

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1.2. Anlise dos resultados experimentais No houve alterao em relao amostra-branco quando se adicionou hidrxido de sdio a albumina no desnaturada pela adio de base (aumento de pH). Aps a adio de cido sulfrico apenas se verificou um ligeiro aquecimento do tubo de ensaio, relativamente amostra-branco a albumina no desnaturada pela adio de cido (diminuio de pH). Aps o aquecimento da mistura verificou-se a desnaturao da protena a albumina desnaturada pelo calor. Aps a adio de lcool etlico, a mistura ficou esbranquiada, relativamente amostrabranco (sem alteraes) a albumina desnaturada pela adio de lcool etlico.

2.

Aplicaes
A bateria de testes aplicada tem como objetivos, verificar a desnaturao proteica por agentes externos e determinar a presena de albumina. Este ltimo propsito do procedimento ser importante como base para o estudo dos mtodos utilizados na determinao da presena desta protena em materiais biolgicos diversos. A albumina uma protena com um papel importante na alimentao pois fornece alguns aminocidos essenciais, como a metionina e a cistena, fontes de enxofre. A monitorizao dos seus nveis pertinente, nos alimentos como parte importante de uma dieta saudvel e no sangue como um dos indicadores do estado de sade individual.

3.

Concluses
Com esta experincia verificmos como reage a protena albumina ao calor e adio de cido, base ou lcool, concluindo que se desnatura apenas com o calor e com o lcool. Conhecido o aspeto da albumina desnaturada e reconhecida a sua reao diferenciada a agentes desnaturantes, conclumos poder utilizar esta metodologia para determinar a sua presena especfica numa mistura biolgica. Os testes devero ser sempre realizados com as amostras biolgicas, uma amostra-branco (gua destilada ou solvente orgnico sem azoto) e uma amostra-padro (albumina obtida da clara do ovo), como forma de minimizar erros experimentais (falsos positivos e falsos negativos).

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1 MTODO DE BIURETO


IDENTIFICAO DA PROTEINA

Mtodo de biureto O mtodo de biureto tem sido aplicado para determinar a concentrao de protenas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguneo, lquido crebroPgina 3 de 9

espinhal, urina, alimentos, saliva, fibrinognio e tecido animal. O mtodo de biureto tem sido, tambm, utilizado em anlise por injeo em fluxo, assim como em alguns mtodos cinticos. Apesar de ser rpido, utilizar reagentes de baixo custo e no apresentar grande variao da absortividade especfica para diferentes protenas, este mtodo no muito sensvel, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relao a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substitudo por mtodos mais sensveis. Mesmo assim, o mtodo de biureto continua sendo recomendado para a determinao da concentrao de protenas totais em plasma sanguneo pela Associao Americana de Anlises Clnicas e por diversos autores, bem como para a determinao de protenas totais em saliva e leite, quando comparado com outros mtodos. Ninhidrina um produto qumico usado para a deteco de amnia ou aminas primrias e secundrias. Ao reagir com essas aminas livres, um de cor azul escuro ou roxo conhecido como Ruhemann de roxo evoludo. Ninhidrina mais comumente usado para detectar impresses digitais, como aminas sobram de peptdeos e protenas aminas (terminal ou resduos de lisina) expelido das impresses digitais reagirem com ninhidrina.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A prtica foi realizada de forma que fosse possvel identificar e os aminocidos atravs da reao ou interao com ninhidrina. Dessa forma, utilizou-se o seguinte processo: pegou-se seis tubos de ensaio e em cada um adicionou-se as substncias (gua destilada, glicina 1%, prolina 1%, leucina 1%, aspartame 1% e leite), fora adicionado com uma pipeta 1mL de cada uma das substncias no tubo, em seguida utilizando uma outra pipeta, colocou-se cinco gotas de ninhidrina e homogeinezou-se bem, resultando em uma substncia de colorao diferente, em seguida fora colocado todos os tubos em Banho Maria por trs minutos com um aquecimento em torno de 100 C, com uma pina, retirou-se os tubos e verificou-se que as substancias foram alteradas visualmente. Aps o aquecimento de ambos os tubos de ensaio, observou-se que as solues adquiriram colorao violeta, sendo esta mais intensa. Tendo em vista que tanto a glicina quanto a protena foram utilizadas com o mesmo volume, a diferena na intensidade da colorao de ambas as amostras deve-se a maior superfcie de contato do aminocido (glicina) que contm uma maior quantidade de grupamentos amina disponveis para reao. Porm, isso no ocorre com a protena em funo da presena de ligaes peptdicas entre seus aminocidos, diminuindo assim, sua superfcie de contato. importante ressaltar que houve erro grosseiro no fornecimento de calor aos tubos o que possivelmente influenciou a intensidade da cor.

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PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1 UREASE


As enzimas so protenas especializadas na catlise de reaes biolgicas. Elas esto entre as biomolculas mais notveis devido a sua extraordinria especificidade e poder cataltico, que so muito superiores aos dos catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reaes que caracterizam o metabolismo celular so catalisadas por enzimas, sendo assim, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular. A urease foi primeira enzima a ser purificada e cristalizada, um feito de James B. Sumner em 1926, numa altura em que a maior parte dos cientistas acreditava ser impossvel cristalizar enzimas. A urease catalisa a hidrlise de ureia em dixido de carbono e amnia. Encontra-se principalmente em sementes, microorganismos e invertebrados. Nas plantas, a urease um hexmero (consiste em seis cadeias idnticas) e localiza-se no citoplasma. Em bactrias, constituda por duas ou trs subunidades diferentes. Para ser ativada, a urease precisa ligar-se a dois ons nquel por subunidade. 2.3. Resultados Observados Tabela 1. Resultado da mudana de cor do experimento I: Tubos Ureia tamponada c/ indicador Urease gua destilada AGITAR Mudana de cor 1 3ml 3 gotas + 2 3ml 3 gotas Resultados e discusses Procedimento A: No tubo que continha a soluo de urase percebeu-se uma colorao violeta aps adicionado o biureto, que um indicador prottico e cuja mudana de cor proveniente da reao indica a presena de ligaes peptdicas no tubo com urase. No tubo que trazia apenas gua e o biureto no apresentou mudana significativa de cor, permanecendo azul da cor do biureto,j que a soluo no apresentava ligaes peptdicas.

2.4. Discusso A partir dos resultados obtidos na tabela 1, pode-se inferir que no tubo 1 houve mudana na cor da reao devido a presena da ureia no meio, onde a mesma o substrato da urease. Com isso o produto final dessa reao a amnia constatada pela mudana na colorao, pois ao ocorrer a reao CO(NH2)2 + H2O 2 NH3 + CO2 h um aumento do pH e o indicador vermelho de fenol presente na soluo muda para uma tonalidade rsea. No entanto no tubo 2 no foi observado nenhuma mudana na colorao, visto que no mesmo s foi adicionado gua destilada e urease e com isso a enzima no pode ser ativada uma vez que o seu substrato estava ausente na soluo. Por isto, com o tubo 2, pode-se ainda concluir a natureza da atividade da urase X ureia, sendo o tubo 2 um padro para o experimento. Concluso
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As enzimas em geral tem uma aplicabilidade muito diversificada em vrios ramos da industria, pois so protenas que permite uma interferncia na matria prima de forma desejvel e pratica. Com a pratica realizada conclui-se que, para a aplicao de enzimas como em processos indstrias requer tambm um total controle das condies e aplicao dos mtodos enzimticos, j que em condies extremas como de pH, temperatura, e a presena de inibidores influencia significadamente no processo, na qualidade e na quantidade do produto.

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REFERENCIAS: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABlJ8AL/enzimas

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7-Questes 1) Que so enzimas? So protenas especializadas em reaes catalticas, que aceleram reaes qumicas. 2) Que reao catalisada pela urase? Ela catalisa a reao de hidrolise da uria. 3) Como pode ser evidenciada a natureza a natureza protica da enzima? O biureto detecta a presena de ligaes peptdicas caractersticas de protenas, o que pode ser visualizado no experimento A com a mudana de colorao. 4) Qual a fonte de urase utilizada nos experimentos? No experimento a fonte de urase foi a soja. 5) Explique o uso do indicador cido-base vermelho de fenol no teste de atividade da enzima, qual a justificativa para se empregar um tampo diludo na incubao para a medida da atividade de urase? O vermelho de fenol um indicador cido-base utilizado para determinada variao de pH, no experimento fez-se necessrio a utilizao de uma soluo tampo para que o pH variasse moderadamente. 6) Explique o resultado obtido quando a enzima foi previamente fervida. Com o aquecimento da enzima, a uma alta temperatura, ela desnaturou e perdeu sua atividade enzimtica. 7) Explique o resultado obtido no teste VI. O cloreto de mercrio, como composto por um metal pesado, desativou a enzima.

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