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Orqudeas: su cultivo in Vitro en el mbito domstico

El cultivo in Vitro se hace en frascos cerrados y en condiciones controladas y estriles. El sustrato de cultivo conocido normalmente como medio de cultivo ha de contener los elementos necesarios para que las plantas puedan crecer lo suficiente como para despus ser trasplantadas al sustrato definitivo. Material necesario para llevar a cabo la siembra y procecimientos. Procesos de esterilizacin y procedimientos. embrado y !ernimacin. "epique. Plantado en sustrato. #in$s.

MATERIALES !"u materiales nos #acen $alta %ara llevar a cabo el cultivo in Vitro& %.& ).& ,.& 1.& 4.& 8.& <.& Medio de cultivo' componentes( obtencin( mezclado( esterilizacin y utilizacin( etc... *+mara de esterilidad' descripcin&construccin( esterilizacin y uso. -rascos de cristal con tapa .pueden ser potitos de ni/o( frascos peque/os de mermelada( miel( etc0. 2na olla a presin .que todo el mundo tiene en casa0. *uanto m+s !rande me3or. 5istur6 y pinzas met+licas lar!as .m+s de )7 cm0. e compran en tiendas de materiales de laboratorio y ortopedia. 9lcohol de :8;. 9l!unos tarros de pl+stico .polipropileno PP0 para microondas que sean ba3os. .los he visto en tiendas todo a cien a precios econmicos0. = ' El medio de cultivo: sus com%onentes Estos elementos son b+sicamente' a!ua( sales minerales( az>car( vitaminas( y en al!unos casos hormonas ve!etales. 9dem+s hace falta un elemento que d consistencia al medio que suele ser el a!ar .anti!uamente se usaba !elatina0( aunque tambin es posible usar vermiculita. #a adicin de e?tracto de levadura es muy beneficiosa pues proporciona vitaminas inusuales( al!o de nitr!eno en forma de amino+cidos y oli!opptidos .fra!mentos muy cortos de prote6na de entre dos y %7 amino+cidos0( oli!oelementos y cofactores.

(RO(OR)I*+ ,E )A,A ELEME+TO -.SI)O A ME/)LAR 9bono mineral )7&)7&)7 .sin urea0 9!ar 9!ua 9z>car comercial E?tracto de levadura *omple3o de vitamina 5 Atros aditivos .leche de coco( pl+tano( etc0 % !r @ !r % #itro %7 !r % !r % ampolla( vial #eer ba3o esta tabla

e puede a/adir tambin' leche de coco verde filtrada por un filtro normal de caf .)7 ml por cada litro de medio0( papilla de banana .muy fina0 a razn de media banana por litro )4 ml de zumo de pi/a natural filtrado .BA el de Cetrabri$0( aunque el zumo de pi/a no lo recomiendo si no se tiene forma de controlar el pD( pues es muy +cido y hay que corre!irlo despus( necesitando entonces de aparata3e. Day peachimetros muy econmicos que siempre son >tiles( pero se puede prescindir de ellos. A tener en cuenta que:

#a leche de coco suele ir me3or para !erminacin o cultivo de te3idos y el pl+tano para el desarrollo de pl+ntulas. Bo usar los dos a la vez. #a banana como aditivo funciona muy bien .que no est pasado( los entre verdes y amarillos son ideales0. El a!ua preferiblemente destilada( pero se podr6a usar de lluvia siempre que est bien limpia. i se usa vermiculita como soporte( no se a/ade a!ar. =

Obtenci0n de los elementos anteriores: En cualquier tienda de abonos. i adem+s trae ma!nesio( hierro y oli!oelementos( me3or a>n. i no se encuentra de )7& )7&)7( se corri!e de forma proporcional .Day que tener en cuenta que la re!la de tres es inversa0. 2n e3emplo( ser6a usar ) !ramos si el abono fuera de %7&%7&%7 )(@ !ramos( si el abono fuera de <&<&<. in embar!o es conveniente irse a la mayor concentracin posible( debido a que cuanto m+s puro est( menos residuo insoluble queda. 9z>car comercial' *ualquier supermercado. E?tracto de levadura( En farmacias( tiendas de diettica y productos para vitamina 5 y a!ar' deportistas. 5ananas( cocos( En cualquier comercio. pi/as' = 9bono mineral'

!)0mo me1clamos todo esto& implemente se disuelve todo en una parte del a!ua e?cepto el a!ar. i se usa pl+tano debe hacerse papilla muy fina con una fraccin de a!ua y despus mezclarlo todo. -inalmente verificar el pD si se usa zumo de pi/a natural .debe quedar entre 4.4 y 80 y a/adir el resto de a!ua necesaria. El pD lo podemos corre!ir adicionando una base fuerte .hidr?ido sdico o pot+sico !eneralmente0. -inalmente a/adir el a!ar. Esto se mete en el microondas y como el a!ar tarda en disolverse( para no calentar mucho la mezcla( ser+n necesarios varios !olpes de calor hasta que se disuelva. Entre !olpe y !olpe se saca del microondas y se a!ita con una esp+tula o una cuchar. 2na vez disuelto el a!ar se espera a que enfr6e un poco .b+sicamente para uno evitar quemarse0 sin que lle!ue a volverse slido y se vierte en los frascos de cultivo la cantidad necesaria. -inalmente se meten en la olla a presin para ser esterilizados.

Atencin:
Este medio o substrato es muy rico en nutrientes, y al igual que crecen las plantas lo pueden hacer tambin hongos, levaduras y bacterias con lo cual necesitaremos que est estril. Los medios una vez mezclados deben ser esterilizados, no pueden esperar en la nevera ms de un d a. !na vez esterilizados pueden conservarse hasta un mes, m"imo dos a temperatura ambiente, o varios meses en la nevera #no el congelador$. Es conveniente que mientras se disuelve el agar la mezcla no llegue a hervir pues las vitaminas se descomponen si hierve repetidas veces. = ' )mara de esterilidad: caractersticas bsicas En cultivo in Vitro hablamos de esterilidad cuando no hay bacterias ni otros microor!anismos' slo est+ vivo el material ve!etal que queremos hacer crecer. e hace una ca3a de metacrilato de unos 17 cm de altura por 87 de ancho y 17 de profundidad( sin fondo( que ser+ la superficie de la mesa. En la parte frontal se hacen unos orificios adecuados para introducir las manos a los que se les acoplan unos !uantes lar!os. Por este sistema podremos traba3ar sin tocar los materiales que estar+n estriles.

#a distancia entre a!u3eros y sobre todo el tama/o de los mismos va a ser variable( dependiendo principalmente de la altura de la mesa( de la silla sobre la que traba3aremos y de nuestra constitucin f6sica .a brazos m+s !ruesos l!icamente a!u3eros m+s !randes0. in embar!o en el a!u3ero debe haber al!o de hol!ura para no cortarse en los brazos. El modo de acoplar los !uantes tambin se puede hacer de varias formas' e pueden acoplar dos bolsas alar!adas pe!adas con cinta aislante al a!u3ero por el e?terior y al fondo de3ar una abertura para las manos. *on las manos ya en la c+mara nos ponemos unos !uantes de l+te? .tipo ciru3ano0 que se superponen parcialmente sobre la bolsa( pues son m+s sensibles para traba3ar. Estos se pueden tratar con alcohol simplemente pulverizando con el que se va a esterilizar la c+mara de modo que se evitan contaminaciones. Atra forma de acoplarlos es de3arlos permanentes( usando !uantes de cocina lo m+s sensibles posible acopl+ndolos a la bolsa y fi3+ndolos con cinta. = (RO)ESOS ,E ESTERILI/A)I*+: %.& ).& ,.& Ee materiales y medios de cultivo. Ee semillas y c+psulas. Ee la *+mara de Esterilidad. Euracin de la esterilizacin. = ' Esterili1aci0n de materiales 2 medios de cultivo Alla a presin !rande( cuanto m+s me3or. Papel de aluminio. Carros para microondas con la indicacin PP .Polipropileno0.

El medio de cultivo mezclado como anteriormente se indic en FG*mo mezclamos todo estoHF se vierte en los frascos de mermelada( echando unos , cm de altura. Istos se introducen en la olla con la tapa del frasco flo3a pues si no se rompen .la olla por supuesto con a!ua( pero que no rebose los frascos0. El resto de los materiales .pinzas( tarros de microondas( etc0 puede ir sobre los frascos .nunca nadando en el a!ua0. Cambin es conveniente tener trozos de papel de filtro y papel de aluminio estriles para poder hacer cualquier manipulacin en esterilidad dentro de la c+mara. Estos se pueden esterilizar previamente en la olla en tarros de microondas o envueltos en papel de aluminio. 2na vez que est+n todos los materiales en la olla se cuecen %7 minutos .contados a partir de que empieza a hervir0. Pasado ese tiempo se de3a enfriar se sacan con cuidado y se aprietan .sin abrirlos0 las tapas de los frascos de medio de cultivo. e de3a todo en un lu!ar fresco y seco hasta su uso.

Atencin:
%odos los materiales han de estar envueltos en papel de aluminio y abrirlos slo en la cmara de esterilidad una vez esterilizada. Es conveniente no usar los &rascos preparados con el medio de cultivo hasta pasados tres o cuatro d as, desechando los que se hayan contaminado #lo normal es que no se contamine ninguno$. 'uardados en un lugar &resco, pueden usarse hasta despus de unos meses. 9 tener en cuenta que'

En el caso de usar vermiculita como soporte para el cultivo( se ponen tambin unos , cm de vermiculita y se adiciona medio l6quido .sin a!ar0 hasta que se mo3e. Es muy importante que no haya e?ceso de l6quido. #as semillas no deben .ni saben0 nadar. 9l!unos tarros para microondas no sirven. Cienen que tener la indicacin PP .polipropileno0. En al!unos la tapa no es de polipropileno con lo cual estos no sirven( se derretir6an en la olla a presin. =

' Esterili1aci0n de Semillas 2 c%sulas: Papel de filtro .ya esterilizado0 2n recipiente con #e36a al )7J Cres recipientes con a!ua esterilizada Pinzas met+licas 5istur6

#as semillas son muy peque/as por lo que se usan peque/os sobrecitos hechos con papel de filtro( para esterilizar y lavar. *ada sobrecito no deber6a contener m+s volumen de semilla que el equivalente a tres o cuatro !ranos de arroz. Esto supone unas )777 a )7777 semillas dependiendo de las especies( cantidad m+s que suficiente para obtener suficientes seedlin!s. *omo dato orientativo( con c+psulas !randes se puede hacer un m6nimo de %7 %4 bolsitas. e esterilizan en le36a al )7J .% parte de le36a y 1 de a!ua0 durante %4&)7 minutos( moviendo al!o el sobrecito de vez en cuando para que la le36a act>e m+s eficientemente y no queden zonas no estriles( tratando de evitar que se rompa y sal!an las semillas( pues despus nos ser+ casi imposible reco!erlas. Eespus se lavan varias veces en a!ua estril. Para este proceso( es necesariotener un frasquito con le36a al )7J y cuatro frasquitos estriles con a!ua para hacer cuatro lavados .) , minutos cada lavado. Para pasar las semillas de uno a otro se toman los sobrecitos con las pinzas .que tambin han de estar estriles0. i se usan c+psulas verdes( stas interiormente est+n estriles .microbiol!icamente0( por lo que se mane3an simplemente con las pinzas a travs de la le36a y los lavados. 9dem+s no es necesario meterlas en los sobrecitos' se esterilizan por fuera y despus de los lavados se abren .lon!itudinalmente0 con el bistur6 y se siembran las semillas inmaduras que hay en el interior. *ada especie tiene diferentes tiempos de recoleccin como c+psula verde y de maduracin hasta semillas secas. Estos tiempos son e?tremadamente variables y van en ambos casos desde menos de un mes hasta varios a/os.

Atencin:
%odos los materiales que toquen las semillas han de estar estriles #&rascos, agua, etc$, pues de lo contrario nos crecern hongos y bacterias en vez de las semillas. %odo el proceso #esterilizacin, lavado y siembra$ ha de hacerse en la cmara de esterilidad #previamente esterilizada$. ,el bien #acer dentro de la cmara de%ender el 3ito del cultivo =

' Esterili1aci0n de la cmara de esterilidad: #a c+mara de esterilidad la podemos esterilizar de dos maneras' a0 b0 *on la aplicacin de alcohol de <7J( proceso. *on l+mparas !ermicidas( proceso. E?isten en el mercado tubos o l+mparas !ermicidas fluorescentes econmicas( seme3antes a los de los rayos 2V9( que emiten radiacin ultravioleta y matan todo lo que hay en su radio de accin en unas ) horas( sustituyendo al tratamiento con alcohol que es bastante en!orroso. Estas l+mparas se usan de forma industrial en alimentacin .c+maras fri!or6ficas( pasteler6a( etc0.

9 tener en cuenta que'

9unque la e?posicin humana moment+nea a esta radiacin no es nociva( no se debemos e?ponernos m+s de ) minutos. El inconveniente es que hay que encenderla ) horas antes de empezar a traba3ar para de3arla apa!ada mientras traba3amos( pero es francamente >til. Cambin es conveniente cubrir la c+mara con un pa/o para evitar accidentes con la radiacin. Kntroducimos en la c+mara todos los materiales .ya estriles0 con los que ten!amos que traba3ar que han salido de la olla y est+n cubiertos por papel de aluminio( pues una vez esterilizada la c+mara no se puede abrir( y si hay que hacerlo( la esterilizacin ha de repetirse de nuevo. e nebuliza cuidadosamente con alcohol con la ayuda de un pulverizador toda la c+mara( de manera que matemos todos los microor!anismos que est+n continuamente flotando en el aire. Para evitar que los materiales se nos empapen de alcohol se cubren con papel de aluminio. 9dem+s es conveniente tener dentro papel de cocina para reco!er todo el alcohol que se va depositando sobre la mesa. 9ntes de empezar a traba3ar se debe esperar 4 minutos a que se deposite todo el alcohol nebulizado. Encender las l+mparas durante dos horas( teniendo en cuanta las precauciones mencionadas anteriormente.

(rocedimiento con Alco#ol:

(rocedimiento con lm%aras 4ermicidas

Atencin:
(urante la esterilizacin de la cmara, a las semillas hay que cubrirlas con papel de aluminio para que no les haga da)o el alcohol ni la radiacin. ,uraci0n de la esterili1aci0n de la cmara: i la c+mara est+ m+s o menos estanca .que no entre aire0 se podr6a traba3ar toda la tarde. in embar!o( es conveniente tener en la c+mara un vasito con alcohol que nos permita esterilizar de vez en cuando pinzas o bistur6( sobre todo si traba3amos con diferentes semillas( pues al!unas podr6an estar contaminadas y trasladar esta contaminacin a otros materiales. 2na inmersin del material durante unos minutos es suficiente .en una parada para tomar un caf o descansar un ratito0. El instrumental as6 esterilizado debe ser secado con un trozo de papel de filtro estril previamente a volver a traba3ar( pues el alcohol tambin es nocivo para las semillas de las orqu6deas.

= SEM-RA,O 5 6ERMI+A)I*+ e esterilizan las semillas yLo c+psulas en sobrecitos hechos de papel de filtro .para que entre la le36a0( se!>n he indicado. Bo sobrepasar los )7 minutos pues tambin matar6ais las semillas. 9l!unas especies s6 necesitan m+s de )7 minutos( pero no suele ser el caso de las orqu6deas tropicales. #os sobrecitos se abren con las pinzas y bistur6 sobre trozos de papel de aluminio estril que hemos situado sobre las tapas de los tarros de microondas estriles y se introducen unas %77&)77 semillas en cada frasco( lo m+s separadas posible .las semillas se pueden reco!er del sobrecito con una cucharilla de caf muy peque/a estril0. En !eneral( la !erminacin es me3or en oscuridad( as6 que despus me3or !uardar los frascos en una ca3a bien cerrada y observarlas semanalmente. Eespus de unos %4 d6as a un mes .a veces m+s0 se empiezan a ver las semillas en!rosar y m+s adelante formar la yema apical y la primera ra6z. = RE(I)A,O *uando tienen apro?imadamente medio cm ya han consumido casi todo el nutriente( por lo que se cambian al mismo medio fresco( tambin en esterilidad de3ando apro?imadamente %7& ,7 plantitas por frasco y sacar ya a la luz .no luz directa( puede ser cerca de una ventana o en un lu!ar sin sol directo en el invernadero. Cambin se puede aplicar luz .y ser6a lo me3or0 con ) fluorescentes puestos a unos ,7 cm de los frascos que estn funcionando %8 horas al d6a( pero encarece el proceso. in fluorescentes crecen un poco m+s despacio( pero para uso particular pueden valer perfectamente. = (LA+TA,O E+ S7STRATO *omo norma !eneral( cuando las plantas tienen unos ,&1 cm de alto .estn suficientemente desarrolladas0( se pueden adaptar al sustrato 9l principio se debe usar un sustrato menos poroso .puede ser vermiculita( abonada con abono l6quido0( y cubrirlas con bolsitas de pl+stico invertidas tipo celof+n. #a adaptacin tiene que ser pro!resiva( pues estas plantitas tan peque/as se secan muy r+pidamente. Cambin los botellines de a!ua cortados por la mitad y puestos sobre la planta son ideales para evitar la deshidratacin r+pida. Poco a poco se va abriendo a intervalos de tiempo .o me3or haciendo peque/os a!u3eros en los botellines0 hasta que la planta ya puede crecer y desarrollarse sin proteccin como las dem+s.

9dem+s( se hace necesario un tratamiento con un fun!uicida( pues en esta etapa de adaptacin hay una fuerte tendencia a la infeccin por hon!os. *uando se ha desarrollado adecuadamente se la puede instalar en el sustrato definitivo que depender+ de la especie. En laboratorio( con medios de cultivo m+s controlados( la luz adecuada y aparata3e se pueden obtener plantas en menos de un a/o. En casa( en apro?imadamente un a/o( se podr6an poner las pl+ntulas .seedlin!s0 en sustrato( y a partir de otros dos a/os .dependiendo de la especie0 podr6an florecer. &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&& Cen!o que se/alar que esta no es la forma en que se hace el cultivo in Vitro en un laboratorio. Para hacer cultivo in Vitro en laboratorio se utiliza un aparato que se conoce como cabina de flu3o laminar( y que b+sicamente es un aparato que !enera una suave corriente de aire estril( donde te permite traba3ar en condiciones de esterilidad. Esta corriente de aire estril se !enera mediante un motor que hace pasar el aire normal a travs de dos filtros( uno retiene las impurezas !randes y el si!uiente que elimina hasta las esporas del ambiente. Bo es muy dif6cil hacerse una de ellas( pero los materiales son muy espec6ficos y no se encuentran en cualquier parte( adem+s de ser relativamente caras .si al!uien se atreve le ayudo a conse!uirlos0. E?isten al!unos aparatos de aire acondicionado para alr!icos que tienen sistemas de filtros para el polen que producen aire estril y se podr6a usar en cultivo in Vitro( pero ya hablamos de encarecer el proceso y tratamos de hacer al!o asequible a todo el mundo. Por el sistema que he descrito( aficionados de todo el mundo est+n reproduciendo sus h6bridos a escala domstica. = M.S I+8ORMA)I*+ SO-RE EL TEMA (ERO +O E+ )ASTELLA+O: http'LLMMM.@un!.atLedererNthomasLorchideenL http'LLMMM).labs.a!ilent.comLbotanyLcpLslidesLtcLhood.htm

9os Manuel Sevillano Vieira dbv3svOhotmail.com