Laboratorios de Biologa Celular y Microbiologa Profesores: Juan Carlos Higuita V. PhD, Ivonne Ximena Cern MSc.

LABORATORIO FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGA

En las ltimas dcadas se han hecho importantes avances en el estudio de la ultraestructura bacteriana, logrndose una identificacin bioqumica de muchas de las fracciones subcelulares, estos avances han permitido ubicar definitivamente a las bacterias en el reino Procariota. El conocimiento en profundidad de las diferentes estructuras y su composicin ha permitido comprender, como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea cuando lo hacen como integrantes de la flora normal o cuando se comportan como agresoras para el mismo. Ha sido fundamental poder demostrar que muchas estructuras bacterianas bien identificadas son importantes inmungenos, siendo posible utilizarlas para la preparacin de vacunas que han significado verdaderos avances en la medicina de los ltimos aos. El conocimiento de la composicin bioqumico de las diferentes estructuras de las bacterias, as como de su metabolismo, ha permitido la comprensin del mecanismo de accin de diferentes antibiticos. Por tal razn, la observacin en el microscopio ptico y la reaccin de las bacterias ante las diferentes coloraciones sigue siendo de fundamental importancia en la taxonoma e identificacin bacteriana.
1. Fundamentacin

Debido al pequeo tamao de la mayora de los microorganismos, se requiere de un microscopio ptico, para realizar la descripcin morfolgica de estos. La observacin de clulas vivas es limitada debido a que las clulas son incoloras y permiten el paso se una gran cantidad de luz. La observacin de frotis teidlos es ms recomendable. Esta se prepara haciendo una extensin de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y tien. De acuerdo a los objetivos de estudio se puede realizar diferentes tipos de tinciones como: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los colorantes ms usados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromforos. La mayora de bacterias son teidas por colorantes bsicos, que permean la pared celular y se adhieren por enlaces inicos dbiles a molculas con cargas negativas de la clula bacteriana. La tincin de las bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de tincin simple que facilita la observacin de forma, tamao y arreglo de las clulas.

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BACTERIAS La tincin propuesta por el mdico dans Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales ms utilizadas ya que clasifica los cultivos bacterianos en Gram positivas y Gram negativas. El mtodo se fundamenta en el hecho de que el colorante primario (Cristal Violeta) tie por igual a todas las bacterias, pero la combinacin con otros colorantes es ms permanente en las Gram positivas. Para establecer esta diferenciacin, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobre las Gram positivas, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo. En estas circunstancias se dificulta la observacin por lo que es preciso adicionarle otro colorante llamado secundario (safranina). Este colorante no modifica el color de los microorganismos que haban retenido el color primario, pero tie a los microorganismos decolorados. Estas diferencias de tincin se deben a los cambios en la composicin qumica y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retencin o eliminacin del colorante primario despus del proceso de decoloracin. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas siendo importante criterio de clasificacin taxonmica. Adems, debido a que algunas especies de microorganismos son patgenas y de gran toxicidad, su deteccin microbiolgica alimentaria y mdica es de gran inters. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:

El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas gram-positivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. La diferencia entre las bacterias Gram Positivas y Gram Negativas, se debe a la morfologa de la estructura de la pared celular. Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cpsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que est en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rgida que da forma a la clula. Los principales constituyentes de la pared celular son los aminocidos, azcares y grasas. Estas sustancias (protenas, Hidratos de carbono, grasas) estn enlazadas formando el polmero complejo que forma la pared celular. Entre los

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constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-positivas contienen menos aminocidos que las gram-negativas; el contenido graso es mucho ms elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicacin del mecanismo de la reaccin al Gram.

Bacteria Gram Positiva

Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplsmica y la pared celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas de transporte.

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del determinante antignico del organismo.

Por lo tanto la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la definicin "taxonmica" de las bacterias: el color que adquiqAeren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas. En lo relativo a la coloracin, los microorganismos Gram-positivos se tien de color azul-violeta y los Gram negativos se visualizan de color rojo-rosado. Identificacin Macroscpica de microorganismos bacterianos. Cuando las bacterias crecen en la superficie de un medio de cultivo slido, las clulas en divisin permanecen aproximadamente fijas en su posicin y forman masas de muchos millones de clulas visibles a simple vista. Las colonias as formadas varan desde un tamao diminuto, apenas visible, hasta masas de varios milmetros de dimetro. Su tamao, forma,
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textura, olor y en algunos casos color son, a veces, muy orientativos para la identificacin de las bacterias que la componen. Aunque estas caractersticas dependen a menudo de la naturaleza del medio de cultivo y de las condiciones de incubacin, cuando stas se controlan cuidadosamente, son muy constantes y, en muchas ocasiones, tienen un valor diferencial considerable. La morfologa de las colonias es una de las caractersticas bsicas de las bacterias y es indispensable su estudio para comenzar correctamente una identificacin preliminar. Las caractersticas morfolgicas ms importantes de una colonia bacteriana aislada sobre un medio de cultivo slido son: Tamao: es en condiciones de cultivo favorable, bastante uniforme para cada especie o tipo. La visualizacin del tamao se suele hacer a simple vista, aunque a veces es preferible utilizar lupas. Las colonias de estreptococos, por ej., son relativamente pequeas (menos de 1 mm de dimetro), mientras que las de estafilococos o las de algunos bacilos pueden alcanzar hasta 1 cm de dimetro. El tamao de las colonias bacterianas se puede expresar en: Pequeas o puntiformes: 1 mm de dimetro o menor Medianas: hasta 4 mm de dimetro Grandes: mayores de 4 mm de dimetro El tamao de las colonias debe ser considerado y medido en la parte final de la zona de aislamiento, que es donde presentan su mximo tamao. No deben valorarse ms que colonias bien aisladas. Morfologa: La morfologa de una colonia viene dada por su borde y forma de elevarse sobre el medio de cultivo. El borde puede ser: liso (redondeado u ovalado) irregular (aserrado, lobulado o espiculado). Si se hiciese un corte en un plano perpendicular a la base de la colonia se podra encontrar las siguientes posibilidades: semiesfrica o convexa plana o en disco acuminada cerebroide plana con bordes elevados (en crter) plana con centro elevado (en huevo frito) Superficie: La superficie de la colonia, examinada mediante luz reflejada, puede mostrar un
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aspecto liso y brillante a la luz o, por el contrario, una textura irregular, rugosa y mate, sin brillo. Puede mostrar un aspecto filamentoso o cerebroide. La utilizacin de una lupa estereoscpica permite la observacin de esta caracterstica mediante la deteccin del reflejo del filamento de la lmpara en la superficie de la colonia. A continuacin, se muestran las caractersticas para la descripcin e identificacin macroscpica de una bacteria.

Identificacin Microscpica de microorganismos bacterianos En lo que tiene que ver con la morfologa bacteriana y se puede observar con la tincin GRAM se tiene: Cocos: Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao

Forma esfrica: se llama Coco

Divisin a lo largo del mismo plano, formando cadenas cortas 2 cocos juntos: Diplococos 4 - 20 en cadenas: Estreptococos Regularmente: Sarcinas Irregularmente: Estafilococos Divisin a lo largo de 2 planos diferentes: Ttradas Divisin a lo largo de 3 planos

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Las diferencias entre los subtipos de cocos se basan en los agrupamientos celulares. Estos aparecen como consecuencia de dos factores: el plano o planos de divisin celular y la tendencia de las clulas hijas a permanecer unidas entre s, una vez que se completa la divisin. Bacilos: variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de vara: se llaman Bacilos

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y

Las formas alargadas o bacilares agrupan una gran cantidad de subtipos morfolgicos. Las diferencias en anchura, longitud y forma de los extremos de la clula proporcionan una considerable heterogeneidad a la forma bacilar. Espirales

Forma espiral rgida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

Las bacterias espirilares pueden considerarse de dos tipos: con espira rgida o con espira flexible. Al conjunto de las formas espirilares flexibles se le conoce como espiroquetas. La clasificacin y diferenciacin de las espiroquetas patgenas se basa en criterios morfolgicos tales como la longitud de vuelta, el ngulo en los extremos de la clula, la presencia de una envuelta externa y la composicin del filamento axial. HONGOS Los hongos son organismos eucariotas y de mayor tamao que las bacterias, se distinguen de otros eucariotas como los animales por ser inmviles y de las algas y las plantas por carecer de pigmentos fotosintticos. Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multicelulares (filamentosos). Las levaduras son clulas de forma esfrica u ovalada, que se reproducen asexualmente por gemacin, un proceso en el cual brota una protuberancia o

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yema de la clula madre que posteriormente se separa como clula individual. El cuerpo o estructura vegetativa caracterstica de los hongos filamentosos (mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas ramificadas que forman el micelio. El mecanismo de reproduccin es asexual por fragmentacin de hifas vegetativas o por la produccin de abundantes esporas en conidiforos y esporangiforos formados en hifas areas llamadas hifas reproductivas. El examen microscpico de los hongos en las muestras o cultivos se efecta previa tincin o directamente en fresco. Los hongos se observan en muestras teidas con la tincin de gran como gram-positivos. Tambin se visualizan, contrastando las muestran con una gota de azul de lactofenol. Existen diferentes tinciones como: PAS, Tinciones agnicas, entre otras. Un hongo se identifica en primer lugar por la morfologa macroscpica de la colonia, color, textura y velocidad de crecimiento. Para observar la estructura microscpica puede tomarse un pequeo fragmento de cultivo y montarlo en el cubreobjetos, en fresco o contrastado con un colorante para su posterior observacin, lo que permitir confirmar si el hongo es levaduriforme o filamentoso, basado en la morfologa colonial.
2. Objetivos:

General Conocer las tcnicas de preparacin de frotis, fijacin y coloracin ms usadas en el estudio microscpico de cultivos microbianos, obtenidos en medios slidos y lquidos. Especficos Identificar las principales formas de bacterias y la importancia de las tinciones en la caracterizacin morfolgica de los microorganismos.

Examinar el aspecto microscpico y macroscpico de la morfologa microbiana.

Conocer los mtodos de tincin para diferenciacin de microorganismos. Diferencial especies bacterianas en Gram Positivas o Gran Negativas de acuerdo a la tincin de gran.

3. Materiales y Reactivos

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Materiales 1 Probeta de 100 mL 1 beaker de 100 mL 1 mechero 1 asa de siembra 5 portaobjetos y cubreobjetos Microscopio Agua destilada Cristal violeta Lugol (solucin yodada) Alcohol cetona Safranina Aceite de inmersin Agua salina fisiolgica Solucin de azul de lactofenol Cultivos lquidos y slidos Toallas o papel absorbente Etanol
4. Procedimiento

Preparacin del frotis 1. Lave los portaobjetos y secarlos con toalla absorbente y etiqutelos. 2. Prenda el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. Cultivos slidos 3. Despus cerca del mechero abrir la caja Petri y enfriar el asa en una esquina del agar del cultivo y as evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos por el calor. 4. Con el asa tomar cuidadosamente la muestra en la seccin donde ms concentradas se encuentren los microorganismos. 5. Marcar por la parte inferior el portaobjetos (el rea de trabajo). Previamente se colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequea muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3 y 4. Extenderla suavemente y dejar secar al aire. Cultivos lquidos

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6. Realizar el paso 1 y 2. 7. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean

destruidos. Despus acercar al mechero el Erlenmeyer de cultivo, quitarle el tapn y flamear rpidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra. 8. Marcar por la parte inferior el portaobjetos (el rea de trabajo). Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en un rea circular de 2 cm. de dimetro aproximadamente.
9. Esterilizar nuevamente el asa hasta el rojo vivo. Dejar secar el frotis al aire

Fijacin del frotis 1. Fijar los frotis de cultivos lquidos con dos gotas de etanol y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas al mechero). 2. Los frotis de cultivos slidos, completamente secos se fijarn con calor. Para esto se pasa el frotis rpidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero. 3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento. Tincin simple 1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto. 2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave de agua destilada. 1. Observar en el microscopio. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. 2. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que daan a estos sistemas.

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Preparacin y fijacin de frotis bacterianos a partir de cultivos slidos y lquidos

Describa macroscpicamente y microscpicamente las formas bacterianas de los cultivos slidos entregados.

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Tincin diferencial de Gram 1. Preparar un frotis para cada una de los cultivos slidos y lquidos. 2. Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 1 minuto. 3. Lavar cuidadosamente el frotis con agua de destilada para eliminar el exceso de colorante (5 segundos). 4. Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol y dejarlo actuar por 1 minuto. 5. Lavar cuidadosamente el frotis con agua para retirar el exceso de lugol (5 segundos). 6. Inclinar el portaobjetos y aplicar lentamente el decolorante por 10 segundos y lave inmediatamente con agua destilada. 7. Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. 8. Lavar nuevamente con agua, y secar cuidadosamente con papel absorbente la superficie de lmina opuesta al frotis. Finalmente dejar secar al aire. 9. Observe en el microscopio. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. 10. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que daan a estos sistemas.
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Tincin de hongos 3. Colocar una gota de agua salina fisiolgica encima del portaobjetos y con la ayuda del asa microbiolgica esterilizada toma una muestra del hongo presente en el muestra y se expande por encima de la gota de agua salina fisiolgica, hasta que se seque. O sino se deja al aire libre para que el portaobjetos se seque. 4. Despus de seca la muestra, se aade una gota de azul de lactofenol a la muestra. Es aconsejable esperar un par de minutos, despus de introducir el reactivo. 5. Observar en el microscopio. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. 6. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que daan a estos sistemas. Reportar las observaciones de forma, agrupacin, color y tamao relativo de los resultados. Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura. Preguntas de consulta 1. Investigue cules son las estructuras celulares o molculas responsables de la tincin simple. De ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse. 2. Por qu se recomienda fijar los frotis de cultivos lquidos con alcohol y no con calor? 3. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple? 4. Explique en forma completa la teora que explica la tincin de Gram. Investigue otros dos ejemplos de tincin diferencial. 5. Explique el fundamento de la tincin de endosporas. Por qu se debe calentar la preparacin? Qu dificultades se tendran si no se adiciona la safranina al final de la tincin? 6. Investigue otra tcnica de tincin selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas. 7. Realice un cuadro que represente las caractersticas ms importantes de bacterias, levaduras, hongos, algas, microalgas y virus. 8. Cmo se conservan, cmo se utilizan y cmo se almacenan los medios de cultivo? BIBLIOGRAFA
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Aquihuti Ramos, Mara de los Angeles; Pres Chabela, Mara de Lourdes. Manual de prcticas del Laboratorio de Microbiologa General. Universidad Autnoma Metropolitana Iztalapa. Mxico. 2004. Gonzlez, Jos; Gonzlez, Boris; Barrial, Rosa. Laboratorio de Microbiologa: Instrumentacin y principios bsicos. La Habana. 2004. Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. Microbiologa: Manual de Mtodos Generales. Segunda edicin. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. 1992 Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Prctica N. 3. Tincin de Gram. Tortora, Gerard; Funke, Berdell; Case, Christine. Introduccin a la microbiologa. Novena Edicin. Madrid 2007.

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