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Universidad Nacional De Trujillo

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGA

ENZIMAS
CURSO: DOCENTE: ALUMNOS: Bioqumica REYES BELTRAN, MARA Chacn Cruz Mara Isabel Chvez Garrido Laura Sofa Daz Soto Dulce Daniela Daz Vega Laura Isabel

Trujillo Per 2013

PRCTICA N1
DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
I. INTRODUCCION
Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energa ms rpidamente debido a la presencia de catalizadores biolgicos llamados enzimas. Como sucede con los catalizadores inorgnicos, las enzimas modifican la velocidad de una reaccin sin alterar el equilibrio final y solo se requieren pequeas cantidades para efectuar la concentracin de un gran nmero de molculas de sustrato. El alfa-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilasa y la amilo pectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilasa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilo pectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilo pectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacridos) como productos. Si bien es cierto existen evidencias de que la enzima poli-ADP ribosa polimerasa-1 (PARP) Desempea un papel muy importante en la modulacin de la expresin gnica durante el desarrollo y en respuesta a seales celulares especficas, ejerciendo su accin a diferentes niveles. PARP-1 pertenece a una familia de enzimas (PARP) que usando NAD+ como sustrato, sintetizan y transfieren homopolmeros de ADH-ribosa en residuos de cido glutmico en protenas aceptoras principalmente involucradas en el experimento a realizar como la actividad enzimtica. Para poder mostrar la actividad enzimtica se debe tener presente fundamentalmente que la accin cataltica de las enzimas es de carcter especfico; o sea, cada reaccin qumica debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia qumica que reacciona para dar un producto en un sistema enzimtico se llama SUATRATO, habra entonces tantos sistemas enzimticos como sustratos reaccionantes existen en un organismo vivo. Debido a que solo se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reaccin dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. Qu es una enzima? Las enzimas son protenas que ayudan a que las reacciones qumicas ocurran con mayor rapidez. Sin enzimas nuestros cuerpos se detendran en seco. En este experimento, las enzimas que estamos utilizando provienen del ablandador de carnes y cortan las protenas tal como un par de tijeras.

El ADN en el ncleo de la clula est moldeado, doblado y protegido por protenas. El ablandador de carne corta las protenas separndolas del ADN.

Qu es el sustrato? El sustrato es cualquier sustancia orgnica o inorgnica sobre las que actan las enzimas produciendo su modificacin en productos finales de la reaccin. Cada enzima acta sobre un sustrato en particular, ya que una de las caractersticas de las enzimas es su ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO. Por ej., las enzimas proteasas actan despoblando a las protenas en cadenas polipeptdicas y luego en Aminocidos sencillos y simples, las proteasas se especializan para desmoronar qumicamente a las protenas y no pueden catalizar la conversin de polisacridos en monmeros de glucosa. En general, la actividad de cualquier sistema enzimtico puede ser demostrada de dos maneras: 1.-Verificado el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) despus de un tiempo determinado de incubacin en condiciones de PH y temperatura debidamente adecuada para poder llevarse a cabo las reacciones. 2.- Verificando los productos liberados despus de un tiempo de incubacin que este en ptimas condiciones especficas de tanto de pH como de la temperatura para que los procesos se lleven con mayor eficacia y poder obtener sustancias a partir de las reacciones. FINALIDAD: La finalidad de la prctica es que tiene que llevarse a acabo procesos experimentales en la prctica de laboratorio es para determinar la actividad enzimtica, utilizando a la enzima AMILASA SALIVAL que es una enzima que tiene la capacidad de producir degradacin del almidn en maltosa que es un (disacrido reductor) y algo de glucosa como ejemplo de un sistema enzimtico. Tambin se tiene que tener en cuenta lo factores que estn involucrados en la determinacin de la actividad enzimtica:

FACTORES QUE AFECTAN LAS REACCIONES ENZIMTICAS

Fuerza osmtica. La mayora de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal


extremadamente altas. Los iones interfieren con los dbiles enlaces inicos de las protenas. Las enzimas tpicas son activas en concentraciones salinas de 1 a 500 mM. Existen excepciones como las enzimas de las algas y bacterias halfilas.

Temperatura. Todas las enzimas trabajan en un rango de temperaturas especficas del


organismo al que pertenecen. Los aumentos de temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reaccin. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la protena debidas a la interrupcin de uniones inicas que resultan en la estabilizacin de la estructura tridimensional de la enzima. La temperatura ptima de las enzimas humanas se encuentra generalmente entre los 35 y los 40 C; la temperatura media del organismo del ser humano es 37 C. As, las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rpidamente a partir de los 40 C. En cambio, las enzimas de las arqueas termfilas, que se encuentran en manantiales calientes, son estables hasta a 100 C. Sin embargo, la idea de de una velocidad "ptima" para una reaccin enzimtica es engaosa, ya que la velocidad observada a cualquier temperatura es el producto de dos velocidades, la velocidad de reaccin y la velocidad de desnaturalizacin. Si se usase un ensayo para medir esta segunda actividad por segundo, la velocidad sera alta a altas temperaturas, y usando un ensayo para cuantificar la formacin de producto sta sera baja a esas temperaturas.

pH. La mayora de las enzimas son sensibles al pH y tiene un rango especfico en el que se
detecta actividad; todas tienen un pH ptimo. El pH puede detener la actividad enzimtica al provocar la desnaturalizacin de la estructura proteica rompiendo enlaces inicos y puentes de hidrgeno. La mayora de las enzimas funcionan entre un pH 6 y 8; sin embargo, la pepsina estomacal tiene un pH ptimo de 2 y la tripsina de 8.

Saturacin del sustrato. Aumentando la concentracin de sustrato aumenta la


velocidad de la reaccin o actividad enzimtica. Sin embargo, el lmite de saturacin limita la velocidad. Una enzima est saturada cuando los sitios activos de todas las molculas estn ocupados la mayora del tiempo. A partir del punto de saturacin la reaccin no puede acelerarse mediante adicin de sustrato, sea cual sea la cantidad aadida. En un grfico la velocidad de reaccin habra alcanzado una meseta.

II.

MATERIALES Y REACTIVOS

De laboratorio tenemos: Tubos de ensayo Pipetas graduadas de 1 ml, 5ml y 10ml. Gradilla Frasco goteros Pinzas para tubos de ensayo

Con respecto a los materiales que se van a emplear como reactivos tenemos: Solucin de almidn con un PH 6.6, al 1%. Cloruro de sodio solucin al 0.1M Enzima al 1% (AMILASA SALIVAL) cido clorhdrico 0.05N Solucin yodada Reactivo folin Wu : A) Solucin Cprica alcalina B) Solucin fosfomolbdica.

Gradilla

(Pipetas graduadas de 1ml, 5ml y 10ml)

III.

PROCEDIMIENTO:

1. Primero se arma el siguiente sistema : TUBOS COMPONENTES Solucin de almidn 1% pH 6.6 Solucin de cloruro de sodio 0.1M Agua destilada I 5 ml. 1 ml. 4 ml. II 5 ml. 1 ml. 3 ml.

1.1. Preparar los tubos I y II con cada componente indicado. 1.2. Colocar los tubos al bao de agua a 37C por 5 minutos. 1.3. Agregar 1 ml. de enzima Amilasa al 1% al tubo II. 1.4. Volverlos a colocar al bao de agua a 37C durante 10 minutos.

Explicacin: A simple vista el contenido del tubo I y II es idntico, lo cual no es correcto, porque en el tubo II ocurri la reaccin de la enzima Amilasa con Almidn (enzima-sustrato) pero no es visible debido a que no usamos un marcador.

2. Luego: TUBOS COMPONENTES cido clorhdrico 0.05 N De los tubos I y II (respectivamente): Etapa 1 Solucin yodada III 5 ml. 0.5 ml. 0.5 ml. IV 5 ml. 0.5 ml. 0.5 ml.

2.1. Preparar los tubos III y IV con cada componente indicado. 2.2. De cada uno de los tubos de incubacin transferir 0.5 ml. de su correspondientes del cuadro siguiente (contenido del tubo I al tubo III y el contenido del tubo II al tubo IV), inmediatamente de cumplidos los 10 minutos. 2.3. Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante.

Explicacin: El cambio de color del tubo III de incoloro a azul-violceo se debe a que el indicador
usado (solucin yodada) reacciono con la presencia del almidn (sustrato), en cambio en el tubo IV el color amarillo claro se debi a que el indicador no encontr sustrato (porque se haba convertido en productos) sobre el cual actuar, manteniendo el color caracterstico de la solucin yodada.

3. Por ltimo:

TUBOS
COMPONENTES

V 1ml. 1ml.

VI 1ml. 1ml.

De los tubos I y II (respectivamente): Etapa 1 Solucin Cprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solucin Fosfomolbdica Agua destilada

1ml. 2ml.

1ml. 2ml.

3.1. Preparar los tubos V y VI con cada componente indicado (de los tubos I y II de la etapa 1 y solucin cprica alcalina). 3.2. Poner los tubos a hervir en bao mara durante 8 minutos.

3.3. Luego ponerlos a enfriar.

3.4. Por ltimo agregar la solucin fosfomolbdica y agua destilada.

Explicacin: En el tubo V se obtuvo un color celeste, distinto al tubo VI en el cual se obtuvo un


color naranja, esto se debi a que la solucin cprica reacciono con los productos de la reaccin enzimtica que son azucares reductores como Glucosa, Maltosa, etc., los cuales actan sobre el cobre, reducindolo. Al agregar la solucin fosfomolbdica ocurren diferentes cosas en los tubos. En el tubo V no se observo ningn cambio en el color debido a que no hay ningn tipo de productos, en cambio en el tubo VI paso del color naranja a un azul-violceo debido a la reaccin reductora de los productos sobre el molibdeno (azul de molibdeno).

IV.

CONCLUSIONES
La presente prctica de laboratorio nos permiti determinar que existen reactivos llamados indicadores capaces de demostrarnos la actividad enzimtica a partir de las variaciones del color que mostraban los tubos despus de cada reaccin. La enzima Amilasa salival tiene la capacidad para degradar el Almidn en azcares ms simples y con carcter reductor como la Glucosa, Maltosa, etc.

V.

CUESTIONARIO

1. Qu mtodos conoces para determinar la actividad enzimtica?


Para determinar la actividad enzimtica se debe tener en cuenta fundamentalmente que la accin cataltica de las enzimas es de carcter especifico como es en cada reaccin debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia o sustancia qumica que reacciona para dar un producto en un sistema enzimtico se llama sustrato, habra entonces tener sistemas enzimticos como sustratos reaccionantes existen un organismo vivo. En esta etapa se puede determinar de dos maneras: a) Verificando el sustrato el sustrato no transformado (sustrato residual) despus de un tiempo determinado de incubacin en condiciones especificas de pH y temperatura. b) Verificando sus productos liberados despus de un tiempo determinado de incubacin en condiciones especificas de pH y temperatura.

2. Cmo se puede objetivar la presencia del sustrato residual?


En los ensayos de aspecto fotomtrico puede seguirse el curso de una reaccin observando como cambia la luz absorbida por la solucin en la que se esta dando la reaccin, para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos a los productos algunos que absorba luz a una longitud de onda determinado y que sea de esta forma, se puede observar el aumento o la disminucin de la observacin a dicha longitud de onda. Cuando la luz absorbida se muestra en el espacio visible es posible observar un cambio en el color de la muestra y entonces hablaramos del mtodo calormetro.

3. Cmo demostrar si se ha producido o no la reaccin enzimtica en el experimento realizado?


Todos los ensayos enzimticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reaccin durante un tiempo. Existe un gran nmero de mtodos diferentes para medir la concentracin de sustratos y productos, y que muchas enzimas pueden ser ensayadas de diferentes maneras habitualmente en bioqumica se estudian las reacciones catalizadas por enzimas. Tenemos 4 tipos de experimentos:

a) MEDIDA DE LA VELOSIDAD INICIAL


Cuando una enzima se mezcla con un gran parte de sustrato, el complejo intermedio E-S se genera en una rpida fase inicial transitoria. Despus la reaccin a una cintica constante durante la cual el complejo E-S se mantiene prcticamente en cantidades invertidas en el tiempo y la detecta fsicamente monitorizada.

b) MEDIDA DEL PROGRESO DE LA CURVA


Este tipo de ensayo se intenta evitar por el error matemtico que se puede introducir y es cada vez menos practicado ampliamente utilizado en los primeros periodos del estudio de la cintica enzimtica.

c) MEDIDA DE LA FASE TRANSITORIA


En estos experimentos se observa el compartimiento de la reaccin durante la rpida fase inicial transitoria en la que el complejo molecular intermedio llega a un periodo cintico constante. Estos son los ensayos mas difciles de realizar porque requieren uso de tcnicas de mezclado y medicin realmente rpidos.

d) EXPERIMENTOS EN LA FASE DE EQUILIBRIO


En estos experimentos se perturba una mezcla de enzimas sustrato y productos que han alcanzado el equilibrio qumico por ejemplo combinando la temperatura, la presin o el pH, el anlisis de estos experimentos requiere que la reaccin sea reversible.

4. Cmo se puede objetivar los productos de una reaccin enzimtica?


Al agregar a los tubos la solucin cprica alcalina y proporcionndole un ambiente adecuado de temperatura observamos que en el TUBO I, es color celeste, mientras que en el TUBO II es color anaranjado debido a la presencia del cobre que va dar por resultado azucares reductores como la glucosa y la maltotriosa, con la que queda demostrado la accin de la enzima amilasa salival degradando al almidn.

(La observacin de los colores que se forman celeste y anaranjado despus de calentar a la cocina elctrica).

(Concluyendo y demostrando los colores de los diferentes procesos realizados tomando color los tubos III, IV, V y VI)

PRCTICA N2
FACTORES FSICOS-QUMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE ENZIMAS, PH, TIEMPO TEMPERATURA, IONES INORGNICOS
I. INTRODUCCION: En general, todas las enzimas, independientemente del tipo de reaccin que catalizan, presentan caractersticas comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reaccin enzimtica sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. Tomando una determinada enzima como patrn es posible tener una idea ms o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo, temperatura, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, pH, iones, etc,) sobre la serie infinita de enzimas que se conoce. Este patrn general, como se comprender, varia en forma caracterstica para cada enzima en particular. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigacin del factor variable no se vea afectada por la variacin que pudieran sufrir los otros. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores, pH, concentracin de enzima, concentracin de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reaccin enzimtica, tomando como ejemplo la hidrlisis enzimtica del almidn y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reaccin enzimtica. II. MATERIALES:

Materiales de laboratorio: 18 tubos de ensayo. 1 gradilla. 3 pipetas. 1 cocina elctrica. 2 pinzas de madera.

Materiales biolgicos: concentracin 1% 0.1M 0.1M 0.1M 2% o.25% 0.05N pH 6.6 4.6 9.0

Solucin de almidn Buffer fosfato Buffer acetate Buffer borato Solucin de cloruro de sodio Amilasa salival dializada cido clorhdrico

Solucin yodada (yoduro potasio + yodato de potasio) Solucin cprico alcalina Solucin fosfomolbdica

de

III. PROCEDIMIENTO: Colocar los componentes mencionados en la siguiente tabla, utilizando 8 tubos de ensayo y tres pipetas (armar el sistema): TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.) Solucin de almidn al 1 % Buffer acetato 0.1M pH 4.6 Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 Buffer borato 0.1M pH 9.0 Solucin de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.0 5.0 1.4 2.6 II 1.0 5.0 3.4 III 2.0 5.0 1.4 1.0 IV 1.0 5.0 1.4 2.0 V 1.0 5.0 1.4 2.0 VI 1.0 5.0 1.4 2.0 VII 1.0 5.0 1.4 2.4 VIII 1.0 5.0 1.4 2.0

Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al bao de agua a 37C, por cinco minutos, para el equilibrio de la temperatura.

El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0C y 4C durante cinco minutos. Luego agregar el preparado enzimtico (amilasa salival dializada al 0.25%) a los tubos: del II al VIII, segn se indica en el siguiente cuadro y tomar el tiempo: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.) Amilasa salival dializada al 0.25% I 0.0 II 0.6 III 0.6 IV 0.6 V 0.6 VI 0.6 VII 0.2 VIII 0.6

Mezclar y continuar la incubacin. Posteriormente invertimos los tubos del II al VIII. Inmediatamente despus llevamos los tubos del I al VII al bao de agua a 37C por 20 minutos; y el tubo VIII mantenerlo en agua helada a una temperatura entre 0C a 4C durante 20 minutos.

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL Cumplidos los 20 minutos de incubacin sacar los tubos del bao mara y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado, 0.5 ml. del incubado de su correspondiente tubo.

TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.) Incubado correspondiente de cada uno de los tubos HCl 0.05N Solucin iodada 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 I II III IV V VI VII VIII

Se obtuvo los siguiente:

CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS Luego procedemos a armar el siguiente sistema utilizando 2 tubos de ensayo nuevos. COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V del sistema 1 Solucin cprico alcalina 1.0 ml. 1.0 ml. TUBOS V 1.0 ml. 1.0 ml.

Mezclar y colocar en bao mara hirviendo por 8 minutos los tubos III y V.

Cumplidos los 8 minutos sacamos los tubos y enfriamos con agua corriente.

Luego agregamos a cada uno de los tubos los siguientes componentes: COMPONENTES III Solucin fosfomolbdica Agua destilada 1.0 ml. 5.0 ml. TUBOS V 1.0 ml. 5.0 ml.

Una vez agregado los componentes a los tubos obtenemos lo siguiente:

III.

RESULTADOS Y CONCLUCIONES:

CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL: A continuacin detallaremos que componentes contena cada tubo, como estos reaccionaron, y el porqu de los colores que se muestran en las anteriores imgenes: I NO reaccin II SI reaccin lenta III SI reaccin rpida IV NO reaccin V SI reaccin ideal VI NO reaccin VII SI reaccin rpida VIII NO reaccin

TUBO I: Contena: _ Solucin de almidn al 1% (1ml) sustrato. _ Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) pH ptimo. _ Solucin de ClNa al 2% (1.4ml) Cl es el in activador de la enzima. _ Agua destilada (2.6ml) brinda el medio lquido a la reaccin. _ HCl 0.05N (5ml) detiene la reaccin. _ Solucin iodada (0.5ml) I2 es un indicador. [S] + pH + Cl + HCl + I2 no hay productos (tie azul morado) Explicacin: Debido a que no hubo enzima (amilasa salival) el sustrato (almidn) no se degrad. Por ende al interactuar el almidn con el indicador (I2) la reaccin se torna azul oscuro como observamos en la imagen.

TUBO II: Contena: _ Solucin de almidn al 1% (1ml) sustrato. _ Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) pH ptimo. _ Agua destilada (3.4ml) brinda el medio lquido a la reaccin. _ Amilasa salival dializada al 0.25% (o.6ml) enzima _ HCl 0.05N (5ml) detiene la reaccin. _ Solucin iodada (0.5ml) I2 es un indicador. [S] + pH + E + HCl + I2 escasos productos (tie mostaza).

Explicacin: Debido a que no hubo Cl (in activador) la reaccin fue lenta por eso se obtuvo escasos productos. Como en la mezcla resultante haba aun presencia de almidn no degradado y escasos azucares reductores, el indicador (I2) tio la mezcla de un color parecido al ambar (una combinacin de colores azul oscuro y amarillo), como podemos observar en la imagen.

TUBO III: Contenido: _ Solucin de almidn al 1% (2ml) sustrato. _ Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) pH ptimo. _ Solucin de ClNa al 2% (1.4ml) Cl es el in activador de la enzima. _ Agua destilada (1ml) brinda el medio lquido a la reaccin. _ Amilasa salival dializada al 0.25% (0.6ml) enzima _ HCl 0.05N (5ml) detiene la reaccin. _ Solucin iodada (0.5ml) I2 es un indicador. [S] + pH + E + HCl + Cl + I2 hay productos (tie amarillo).

Explicacin: Debido a que la cantidad de sustrato estaba aumentada (era el doble comparando con los dems tubos), la velocidad de la reaccin fue aumentando hasta que alcanz un valor mximo y luego se mantuvo constante. A pesar de esto si se formaron productos por ello el indicador al interactuar sobre aquellos tio la reaccin de color amarillo como se muestra en la imagen.

TUBO IV: Contenido: _ Solucin de almidn al 1% (1ml) sustrato. _ Buffer acetato 0.1M pH 4.6 (5ml) pH cido. _ Solucin de ClNa al 2% (1.4ml) Cl es el in activador de la enzima. _ Agua destilada (2ml) brinda el medio lquido a la reaccin. _ Amilasa salival dializada al 0.25% (0.6ml) enzima _ HCl 0.05N (5ml) detiene la reaccin. _ Solucin iodada (0.5ml) I2 es un indicador. [S] + pH + E + HCl + Cl + I2 no hay productos (azul oscuro).

Explicacin: Debido a que el pH de la reaccin fue cido provoco la desnaturalizacin de la enzima, impidiendo su accin sobre el sustrato de esta manera no se form productos (azucares reductores). Por ello el indicador al interactuar sobre el sustrato tio la reaccin de color azul oscuro.

TUBO V: Contenido: _ Solucin de almidn al 1% (1ml) sustrato. _ Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) pH optimo. _ Solucin de ClNa al 2% (1.4ml) Cl es el in activador de la enzima. _ Agua destilada (2ml) brinda el medio lquido a la reaccin. _ Amilasa salival dializada al 0.25% (0.6ml) enzima _ HCl 0.05N (5ml) detiene la reaccin. _ Solucin iodada (0.5ml) I2 es un indicador. [S] + pH + E + HCl + Cl + I2 hay productos (amarillo).

Explicacin: En esta reaccin no hubo ningn factor que altere la accin de la enzima sobre el sustrato por ello la formacin de productos (azucares reductores) se dio sin ningn inconveniente. Este tipo de reaccin es ideal. Al interactuar el indicador con los productos tio la reaccin de color amarillo.

TUBO VI: Contenido: _ Solucin de almidn al 1% (1ml) sustrato. _ Buffer borato 0.1M pH 9.0 (5ml) pH bsico. _ Solucin de ClNa al 2% (1.4ml) Cl es el in activador de la enzima. _ Agua destilada (2ml) brinda el medio lquido a la reaccin. _ Amilasa salival dializada al 0.25% (0.6ml) enzima _ HCl 0.05N (5ml) detiene la reaccin. _ Solucin iodada (0.5ml) I2 es un indicador. [S] + pH + E + HCl + Cl + I2 no hay productos (marrn oscuro).

Explicacin: Debido a que el pH de la reaccin fue bsico provoc la desnaturalizacin de la enzima, impidiendo su accin sobre el sustrato de esta manera no se form productos (azucares reductores). Por ello el indicador al interactuar sobre el sustrato ti la reaccin de color marrn oscuro, como observamos en la imagen.

TUBO VII: Contenido: _ Solucin de almidn al 1% (1ml) sustrato. _ Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) pH optimo. _ Solucin de ClNa al 2% (1.4ml) Cl es el in activador de la enzima. _ Agua destilada (2.4ml) brinda el medio lquido a la reaccin. _ Amilasa salival dializada al 0.25% (0.2ml) enzima _ HCl 0.05N (5ml) detiene la reaccin. _ Solucin iodada (0.5ml) I2 es un indicador. [S] + pH + E + HCl + Cl + I2 hay pocos productos (amarillo oscuro).

Explicacin: Debido a que la cantidad de enzima fue baja (a comparacin de los dems tubos) esta se saturo muy rpido. Por ello la cantidad de almidn no se degrado en su totalidad. Como en la mezcla resultante haba aun presencia de almidn no degradado y azucares reductores, el indicador (I2) tio la mezcla de un color amarillo oscuro, como observamos en la imagen.

TUBO VIII: Contenido: _ Solucin de almidn al 1% (1ml) sustrato. _ Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 (5ml) pH optimo. _ Solucin de ClNa al 2% (1.4ml) Cl es el in activador de la enzima. _ Agua destilada (2ml) brinda el medio lquido a la reaccin. _ Amilasa salival dializada al 0.25% (0.2ml) enzima _ HCl 0.05N (5ml) detiene la reaccin. _ Solucin iodada (0.5ml) I2 es un indicador. T + [S] + pH + E + HCl + Cl + I2 hay productos (amarillo plido).

Explicacin: Debido a que la temperatura fue baja la enzima debi desnaturalizarse, en este caso el color de la reaccin debi ser azul oscuro, pero no se obtuvo esto, debido a que la temperatura del refrigerador utilizado no estuvo entre los 0C y 4C, como se esperaba. Por ello la enzima no se desnaturalizo por completo generando pocos productos motivo por el cual la reaccin se tio de color amarillo plido, como se observa en la imagen.

CUADRO PARA LA VALORACIN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS III RPIDA ENZIMA SATURADA MENOS PRODUCTOS COLOR AZUL OSCURO V MODERADA ENZIMA NO SATURADA MAS PRODUCTOS COLOR AZUL MUY OSCURO

TUBO III: Debido a que mucha cantidad de sustrato la enzima se saturo, y no alcanzo a degradar a toda la cantidad de sustrato (almidn), por ende hubo no hubo totalidad de productos (azucares reductores). Por eso el indicador (solucin fosfomolibdica) lo tio de un color azul no muy oscuro. TUBO V: En esta reaccin no hubo ningn factor que altere la accin de la enzima sobre el sustrato por ello la formacin de productos (azucares reductores) se dio sin ningn inconveniente. Este tipo de reaccin es ideal. Al interactuar el indicador con los productos lo tio de un color azul ms oscuro

IV. CUESTIONARIO: 5. Cmo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas? En la prctica para demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de reaccin enzimtica, fue importante considerar que la mayora de las enzimas son sensibles a este indicador y tiene escalas especficas en el que se detecta su actividad. El pH provoca la desnaturalizacin de la estructura proteica rompiendo puentes de hidrgeno y enlaces inicos, por lo que en las diversas reacciones realizadas en esta prctica se pudo apreciar los distintos cambios de colores, varios de ellos resultado del efecto del pH sobre estos. 6. Cmo puede demostrar el efecto de la presencia de un in activador sobre la velocidad de las

reacciones enzimticas? En la prctica con el objetivo de demostrar el efecto del in activador se puede inferir que la presencia de este favorece la reaccin enzimtica produciendo un incremento en su velocidad, llegando a veces a unos lmites en los cuales la ausencia del in dificulta la realizacin de la reaccin enzimtica.