Re Vista

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
Volumen: 1, Nro. 1: 2012
Loja - Ecuador 2012
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
EDITORIAL
El Centro de Biotecnologa (CB) de la Universidad Nacional de Loja, se cre como una entidad res-ponsable de la investigacin cientfica aplicada, innovacin biotecnolgica y docencia, con el obje-tivo de impulsar la Biotecnologa en beneficio de la colectividad, con especial nfasis en lo productivo y social, por lo tanto el CB considera las necesida-des de los sectores agrcola, ambiental, pecuario, de salud pblica, y apoyo a la investigacin para la vida, el desarrollo y la legislacin, siendo esta unidad acadmica un referente para la regin sur y el Ecuador, que ofertar alternativas tecnolgicas, y se proyecta a desarrollar estudios de Posgrado y de Maestra en Ciencias Biotecnolgicas en coordinacin con las reas Acadmicas de la Universidad Nacional de Loja y otras entidades pblicas y privadas nacionales y externas. El Centro de Biotecnologa cuenta con instalacio-nes y equipamiento para realizar estudios, explo-racin y manipulacin de genes de animales, plan-tas, y microorganismos de inters econmico y ecolgico, as como para desarrollar biotecnolo-gas competitivas, con enfoque multi e interdisci-plinario La presente publicacin abarca artculos de revi-sin sobre las temticas biotecnolgicas referentes a los proyectos de investigacin propuestos a desarrollar en el Centro de Biotecnologa, en los que se proporciona en forma resumida y analtica el Estado del Arte con la informacin actualizada generada por centros e investigadores del mundo cientfico. En la segunda seccin se proporciona un resumen de los proyectos de generacin bio-tecnolgica que han sido formulados y elaborados por el personal de investigadores del Centro de Biotecnologa y se han sometido al anlisis de pares externos y a captacin de financiamiento para su ejecucin. Finalmente se describe las actividades vinculadas con la gestin del centro y cumplidas durante el ao 2011
AUTORIDADES UNIVERSITARIAS:
Dr. Gustavo Villacs Rivas, Mg.Sc., RECTOR Dr. Ernesto Gonzlez Pesantes, Mg.Sc., VICERRECTOR Dr. Rmulo Chvez Valdivieso, Ph.D. DIRECTOR DE INVESTIGACIN - UNL
Volumen: 1, Nro. 1 Ao: 2012
COMITE EDITORIAL:
Dr. Rmulo Chvez Valdivieso, Ph. D. Ing. Ivn Granda Mora, Mg. Sc.,
COMIT DIRECTIVO DEL CENTRO DE BIO-TECNOLOGIA:

Dra. Graciela Ypez de Ruz, DIRECTORA DEL REA JURDICA, SOCIAL Y ADMINISTRATIVA (E) Dr. Edgar Bentez Gonzlez, Mg.Sc., DIRECTOR DEL REA AGROPECUARIA Y DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES Dr. Csar Len Aguirre, DIRECTOR DEL REA DE LA EDUCACIN, EL ARTE Y LA COMUNICACIN (E) Dr. Jorge Reyes Jaramillo, DIRECTOR DEL REA DE LA SALUD HUMANA (E) Ing. Jos Ochoa Alfaro, DIRECTOR DEL REA DE LA ENERGA, LAS INDUSTRIAS Y LOS RECURSOS NATURALES RENOVABLES
DIRECTOR DE INVESTIGACIN - UNL DOCENTE INVESTIGADOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA
COMIT DE REVISION:
Aminael Snchez Rodrguez, Ph.D., Roldn Torres Gutirrez, Ph.D. Klever Ivn Granda Mora, Mg. Sc.
EDITOR:
Rmulo Chvez Valdivieso, Ph.D. DIRECCION: Ciudad Universitaria Guillermo Falcon Espinosa, Sector La Argelia EMAIL: centrobiotecnologia@unl.edu.ec Cesar Sandoya V.
RESPONSABLE DE COMUNICACIN INSTITUCIONAL

Byron Gutierrez Q.
DISEO Y DIAGRAMACIN - UNL
Loja Ecuador
Dr. Tito Muoz Guarnizo, Mg. Sc., DIRECTOR DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
CONTENIDOS I.

ARTCULOS DE REVISIN
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RECURSOS GENTICOS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACIN Autor: Ing. Anbal Homero Ruiz Snchez. BIOLOGA DE SISTEMAS Y BIOINFORMTICA: ESTUDIO DE INTERACCIONES FITOPATOLGICAS Autores: Ing. Marlon Pineda Escobar, Dr. Ph.D. Aminael Snchez Rodrguez MICROORGANISMOS DIAZOTRFICOS Y SU CONTRIBUCIN A LA FIJACIN BIOLGICA DEL NITRGENO Autores: Ing. Klever Ivn Granda Mora, M.Sc., Bilogo. Santiago Erazo Sotomayor. USO DE MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS Y SUSTANCIAS NATURALES COMO UNA ALTERNATIVA ECOL-GICA EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN CULTIVOS Autor: Ing. ngel Rolando Robles Carrin, M.Sc. MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIN LYCOPERSICON Autora: Ing. Mara Natalia Morales Palacio Mg.Sc. NANOESTRUCTURAS POLIMRICAS PARA LA DETECCIN DE ADN Autor: Ing. Ivan Burneo Saavedra Mg. Sc.
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II.

RESUMEN DE PROYECTOS:
ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PATGENO-PATGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO (VASCONCELLEA HELBORNII VAR. PEN-TAGONA) Autor: Ing. Marlon Pineda Escobar PRODUCCIN DE UN BIOINOCULANTE EFICIENTE PARA EL CULTIVO DE LEGUMINOSAS: MEDIANTE LA UTILI-ZACIN DE CEPAS NATIVAS DE MICROORGANISMOS DIAZOTRFICOS Autor: Ing. Klever Ivn Granda Mora, M.Sc MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIN LYCOPERSICON Autor: Ing. Mara Natalia Morales Palacio, Mg.Sc AMPLIACIN Y ESPECIALIZACIN DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA, PRIORIZANDO LEGUMINOSAS DE LA ZONA 7 DEL ECUADOR Autor: Ing. Anbal Homero Ruiz Snchez. DESARROLLO DE BIOSENSORES ELECTROQUMICOS LABEL-FREE MEDIANTE EL USO DE MATERIALES NANOESTRUCTURADOS PARA LA DETECCIN TEMPRANA Y RPIDA DE CNCER. Autor: Ing. Ivan Burneo Saavedra Mg. Sc. PRODUCCIN DE BACTERINAS INACTIVADAS PARA PREVENIR LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS DE ORIGEN BACTERIANO EN COBAYOS (Cavia porcellus) DE LA PROVINCIA DE LOJA. Autora: Med. Vet. Vanessa Herrera Yunga
I. Artculos de revisin
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III. INFORMATIVO

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INFORMATIVO DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGA - 2011
Centro de biotecnologa: E-mail: centrobiotecnologia@unl.edu.ec
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RECURSOS GENTICOS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACIN

Anbal Homero Ruiz Snchez1. 1. Centro de Biotecnologa, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falcon Espinosa La Argelia - PBX: 072547252 - Casilla Letra S E-mail: anibalruiz1@hotmail.es _____________________________________________________________________________
ABSTRACT
The diversity among species and within species, biodiversity, is a feature easily observable. Part of this diversity is what we recognize as the definition of genetic resources, FAO (1989), is the heredi-tary material of economic value, scientific or social. With the disappearance of species and wild forms of cultivated plants, due processes such as massive deforestation, de-gradation and pollution of natural habitats, in short, are but results of the abuse of the planets resources, is what is now known as genetic erosion. genetic resources have now been introduced as a new branch of biotech-nology that is independent of Genetics and Molecular Biology, its main objectives are to ensure the conservation and sustainable use of genetic resources for food and agriculture, and the fair and equi-table the benefits. Key words: Genetic Resources, Genetic Erosion, Conservation In situ - Ex situ _____________________________________________________________________________
INTRODUCCIN
RESUMEN
La diversidad entre especies y dentro de cada especie, biodiversidad, es una caracterstica fcilmen-te observable. Una parte de esta biodiversidad es lo que reconocemos como recursos genticos cuya definicin, segn la FAO (1989), es el material hereditario con valor econmico, cientfico o social. Con la desaparicin de especies y formas silvestres de las plantas cultivadas; debida a pro-cesos como la deforestacin masiva, degradacin y contaminacin de los hbitats naturales que, en definitiva, no son sino resultados de la explotacin abusiva de los recursos del planeta, es lo que hoy conocemos como erosin gentica. Los Recursos Genticos en la actualidad se han instaurado co-mo una nueva rama de la Biotecnologa que se independiza de la Gentica y la Biologa Molecular, sus principales objetivos son velar por la conservacin y la utilizacin sostenible de los recursos ge-nticos para la alimentacin y la agricultura, y por la distribucin justa y equitativa de los beneficios derivados. Palabras clave: Recurso gentico; Erosin Gentica; Conservacin In situ Ex situ _____________________________________________________________________________
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Centro de biotecnologa: Dir.: La Argelia - PBX: 072547252; Loja, Ecuador
El Ecuador se localiza en el extremo occidental de Amrica del Sur, entre 1 30 N y 5 S de latitud y 75 W y 81 W de longitud, siendo un pas pequeo en superficie (275 830 km2), pero poseedor de una configuracin climatolgica, fisiogrfica y orogrfica destacable, lo cual le permite disponer de una gama de recursos con singular potencial productivo. (1). La biodiversidad que podramos llamar domesticada, bGeneralidades de los Recursos Genticos. sicamente la agrcola, y ms especficamente el pool de recursos genticos de uso en la aliDesde la aparicin de la vida en la Tierra hace mentacin y la agricultura, es la gran despenunos 3.000 millones de aos, el proceso evosa que garantiza a la humanidad los alimenlutivo ha originado una enorme diversidad de tos, los vestidos y, en una parte importante, las especies e individuos que mediante los procemedicinas. La preservacin de esta riqueza es sos de seleccin permanente esencial en el desarrollo de la se han adaptado a las difeagricultura sostenible y la seLa diversidad gentica es muy rentes condiciones del globo. guridad alimentaria. (2) importante para la alimenta- Esta variabilidad gentica cin humana. Los recursos fito- acumulada resulta esencial La diversidad gentica es genticos cumplen una funcin para el equilibrio del sistema muy importante para la alivital en el desarrollo sostenible y constituye lo que se denomentacin humana. (2). Los de la agricultura en tanto ayu- mina germoplasma del plabancos de germoplasma dan a aumentar la produccin neta. como mecanismos de conde alimentos y a combatir el Dentro de este conjunto, los servacin, son depsitos de recursos filogenticos comhambre y la pobreza. recursos fitogenticos que prenden la diversidad genproporcionan la materia pritica correspondiente al mundo vegetal que se ma para el mejoramiento de los cultivos. Esconsidera poseedora de un valor para el pretos recursos cumplen una funcin vital en el sente o el futuro. Bajo esta definicin se includesarrollo sostenible de la agricultura en tanto yen normalmente las categoras siguientes: ayudan a aumentar la produccin de alimenvariedades de especies cultivadas, tanto traditos y a combatir el hambre y la pobreza. (3) cionales como comerciales; especies silvestres Las semillas que se almacenan en los bancos o asilvestradas afines a las cultivadas o con un
de germoplasma son un recurso vital e irreemplazable, una herencia que se debe conservar para proveer opciones a la agricultura en el futuro, en un mundo que afronta el cambio climtico y otros desafos. La conservacin sostenible de los recursos genticos depende del trabajo eficaz del personal de los bancos de germoplasma, cuyo papel es crtico para garantizar que el germoplasma se conserve de manera efectiva y eficiente. (3).
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valor actual o potencial, y materiales obtenidos en trabajos de mejora gentica (Esquinas- Alczar 1993). (6) Los recursos fitogenticos son el conjunto de combinaciones de genes resultante de la evolucin de las especies, constituyen la base de la seguridad alimentaria mundial tienen potencial de uso agrcola actual o futuro (4). El estudio y conservacin de los recursos fitogenticos es una disciplina emergente en la que obviamente la Gentica es la clave en la que se apoyan otros componentes del arco de las ciencias puras y aplicadas que estudian a los seres vivos y su utilizacin por el hombre. (5) La diversidad entre especies y dentro de cada especie, biodiversidad, es una caracterstica fcilmente observable. Una parte de esta biodiversidad es lo que reconocemos como recursos genticos cuya definicin, segn la FAO (1989), es el material hereditario con valor econmico, cientfico o social contenido en las especies; definicin que incluye una enorme cantidad de especies si se acepta que su valor sea al menos potencial. Sin embargo, frecuentemente el trmino de recursos fitogenticos se entiende por los mejoradores de forma ms limitada, incluyendo los pocos cientos de especies cultivadas, pratenses y forestales con utilidad directa y/o cuya diversidad gentica puede usarse en mejora y domesticacin. Otro de los hechos fcilmente observables en la naturaleza es la adaptacin de los seres vivos a su medio natural, lo que implica adaptacin a condiciones del medio fsico (climtico y edfico) y del medio biolgico: mecanismos de defensa contra predadores y patgenos. (5). Erosin Gentica La prdida de diversidad se acentu entre los aos 1940-50 cuando el desarrollo de la mejora gentica dio lugar a la introduccin de variedades comerciales, uniformes y mucho ms adaptadas a las tcnicas modernas de cultivo y a los nuevos sistemas de comercializacin, siendo incuestionable el beneficio obtenido de ello por una poblacin mundial creciente y subalimentada. Sin embargo, como
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contrapartida, las variedades modernas, con una base gentica muy reducida, han ido desplazando a innumerables variedades tradicionales, heterogneas y menos productivas, pero altamente adaptadas a su ambiente local y poseedoras de una gran diversidad gentica. La consecuencia paradjica es que la aplicacin masiva de los logros de la mejora vegetal ha puesto en marcha un proceso que destruye los materiales esenciales de abastecimiento de los propios fitomejoradores. (6) El problema de la erosin gentica de las variedades locales se ve agravado, adems, por la desaparicin de especies y formas silvestres de las plantas cultivadas debida a procesos como la deforestacin masiva o la degradacin y contaminacin de los habitats naturales que, en definitiva, no son sino resultados de la explotacin abusiva de los recursos del planeta. La prdida de variabilidad gentica supone una limitacin de la capacidad de responder a nuevas necesidades y un incremento de la vulnerabilidad de nuestros cultivos frente a cambios ambientales o aparicin de nuevas plagas o enfermedades. (6). El reconocimiento de la erosin gentica como un problema grave tiene lugar en los aos 50, cuando el desarrollo agrcola empieza a alcanzar a las regiones del planeta con mayor diversidad gentica, siendo en este momento cuando se empiezan a poner en marcha medidas globales para preservar los recursos fitogenticos. En el mbito internacional, la reunin Tcnica organizada por FAO en 1961 Plant Exploration and Introduction puede considerarse el punto de partida en el desarrollo del proceso coordinado de conservacin de recursos filogenticos. Sucesivas actividades y reuniones promovidas por este organismo establecieron las directrices para solucionar los problemas tcnicos relacionados con la recoleccin, conservacin, evaluacin, etc. del germoplasma y sus resultados se han plasmado en dos libros de obligada referencia: Genetic Resources in Plant: Their Exploration and Conservation (Frankel y Bennett, 1970) y Crop Genetic Resources for Today and Tomorrow (Frankel y Hawkes, 1975). En 1983, se estableci el Sistema Mundial de la FAO para la Conservacin y Uso Sostenible de los Re-
cursos Fitogenticos para la Alimentacin y la Agricultura cuyos objetivos son asegurar la conservacin y promover la disponibilidad y utilizacin sostenible de los recursos genticos, para las generaciones presentes y futuras (FAO, 1996).(6) Razones para colectar germoplasma Rescatar una especie en peligro de extincin o de erosin gentica. Usar el germoplasma inmediatamente. Completar colecciones ex situ. Profundizar en los conocimientos sobre la especie. Aprovechar una oportunidad para colectar. La colecta forma parte de una estrategia de conservacin. (11) Evaluacin y Caracterizacin Son actividades complementarias que consisten en describir los atributos cualitativos y cuantitativos de las accesiones de una misma especie para diferenciarlas, determinar su utilidad, estructura, variabilidad gentica y relaciones entre ellas, y localizar genes que estimulen su uso en la produccin o en el mejoramiento de cultivos. Ambas requieren exactitud, cuidado y constancia, e incluyen un componente importante de registro de datos. Estas dos actividades son muy parecidas y su principal diferencia radica en que: 1. En la caracterizacin se persiguen propsitos mltiples, describiendo los fitorecursos en la forma ms amplia posible, para los ms diversos caracteres de dichos materiales. 2. En la evaluacin tiene propsitos definidos, o sea, evala caracteres o cualidades con determinados objetivos. Es importante para identificar rasgos potencialmente valiosos de las muestras, as como las variedades locales que podran utilizar directamente los agricultores. (7). Conservacin El aspecto de cmo conservar es uno de los ms desarrollados. Este aspecto implica los
mtodos de conservacin en s y los previos de recoleccin. Los estudios realizados sobre las tcnicas de muestreo, recoleccin y conservacin son numerossimos. En el aspecto concreto de la conservacin, esta puede realizarse in situ o ex situ. El primer tipo es usado fundamentalmente con especies silvestres, forestales o no, y en muy baja proporcin con especies cultivadas. (5) Las plantas se conservan dependiendo de su necesidad y/o utilidad actuales y futuras. Los recursos fitogenticos se pueden conservar en su hbitat natural (in situ), en condiciones diferentes a las de su hbitat natural (ex situ), o combinando los mtodos in situ y ex situ, es decir, de manera complementaria. La seleccin de uno o varios mtodos depende de las necesidades, las posibilidades y la especie objetivo. (4) La conservacin de los recursos filogenticos es una labor continua, de largo plazo, que implica inversiones importantes en tiempo, personal, instalaciones y operacin, justificables en funcin de las necesidades no del deseo o conveniencia de conservar un material. Las razones para conservar y las especies objetivo se deben definir con base en criterios lgicos, cientficos y econmicos como la necesidad, el factibilidad de conservarlas (Maxted et al. 1997). (4). Requerimientos de la conservacin Como cualquier proceso estratgico, la conservacin de los recursos fitogenticos implica planificar y tomar decisiones con base en informacin previa. La conservacin requiere establecer prioridades en cuanto a: a) el tipo de material que se va a conservar (especies en peligro o de inters para la alimentacin y la agricultura), b) las actividades que se van a realizar con l posteriormente, y c) los recursos disponibles para realizar esas actividades. Las prioridades pueden variar pero hay que tener presente que la conservacin y el uso del germoplasma son los objetivos ms importantes. La conservacin debe disminuir al mximo posible los efectos del nuevo ambiente en las especies objetivo. Quienes conservan germoplasma deben conocer la taxonoma de las especies y las tcnicas para representar su variabilidad gentica y
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conservar estable el genotipo original. Tambin se debe obtener informacin como datos de pasaporte, caracterizacin y evaluacin (Cuevas 1988). (4). Las instalaciones en donde se va a conservar el material deben garantizar el aislamiento tanto de factores ambientales como contra plagas y enfermedades. Las instalaciones pueden variar en diseo y dimensiones dependiendo del nmero y el tamao de las muestras que van a conservar pero deben contar con un suministro constante de energa elctrica y equipos que permitan acondicionar, conservar y regenerar los materiales. Deben ser seguras para que protejan el material de incendios, inundaciones, robo, saqueo y disturbios de orden pblico. El manejo de las colecciones de recursos fitogenticos debe estar a cargo de personal calificado, en lo posible de diversas disciplinas (fisilogos, botnicos, mejoradores y agrnomos), que conozca los aspectos tcnicos y los procedimientos de seguridad inherentes a sus labores. Conviene que la coleccin dependa de un grupo de personas laboralmente estables no exclusivamente del curador que puedan darle continuidad al trabajo de conservacin, sin presiones polticas o de orden pblico. La sola creacin de un banco de germoplasma no garantiza la conservacin de los recursos genticos de inters para un pas. La conservacin requiere apoyo institucional, es decir, proveer de manera sostenida los recursos econmicos, humanos y tcnicos necesarios para mantener las colecciones y realizar las actividades de conservacin. (4) Conservacin ex situ de los recursos fitogenticos Es la conservacin de genes o genotipos de plantas fuera de su ambiente de ocurrencia natural, para uso actual o futuro (Hoyt 1988 citado por Engle 1992). La conservacin ex situ pertenece al importante conjunto de actividades que componen el manejo de los recursos fitogenticos. Se considera complementaria de la in situ por cuanto no es posible conservar ex situ todas las especies. La conservacin ex situ abarca un amplio espectro taxonmico. Sirve para proteger desde especies silvestres y formas regresivas hasta especies cultivadas. Aplicada a
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especies domesticadas, la conservacin ex situ busca conservar fuera de su centro de origen o diversidad tanto las especies como la variabilidad producida durante el proceso evolutivo de domesticacin. Este tipo de conservacin se ha utilizado ampliamente durante las ltimas dcadas (Hidalgo 1991). (4) Conservacin in situ de los recursos filogenticos La conservacin in situ, tambin llamada conservacin dinmica, se realiza en las reas en las que ocurre naturalmente la diversidad biolgica. Para los recursos Fitogenticos silvestres, esta conservacin se realiza en los sitios en que las poblaciones de las especies de inters evolucionaron y se diversificaron. En el caso de los recursos fitogenticos cultivados, la conservacin in situ se realiza en los predios o fincas de los agricultores que poseen variedades locales o criollas y en los huertos familiares. Esta estrategia de conservacin adquiere una importancia creciente ante escenarios globales que afectan a nuestro planeta, tales como la prdida de biodiversidad, el cambio climtico y los procesos de desertificacin. En las prximas dcadas, una poblacin mundial creciente requerir cada vez ms de la diversidad gentica para lograr nuevas adaptaciones a estreses ambientales, resistencia a nuevas plagas y/o enfermedades, productos nutraceticos y otra gran diversidad de productos, farmaceticos y cosmticos, entre otros. La principal diferencia entre ambos tipos de conservacin, es que en la conservacin in situ no se asla a los recursos fitogenticos de su entorno biofsico, socio-econmico y cultural. Continan ocurriendo los procesos evolutivos y co-evolutivos, as como los procesos de seleccin y diversificacin en los agrosistemas. La generacin de variantes genticas adaptadas de forma continuada es sustancial para el mantenimiento de la vida y las especies en el planeta, especialmente importante ante las perspectivas de cambio climtico. La seguridad alimentaria de los pueblos, el mantenimiento de los servicios ecosistmicos, la recreacin, el turismo y el futuro del mejoramiento gentico dependen directamente de la conservacin dinmica de la biodiversidad. (8)
Documentacin e informacin de recursos genticos Se denomina documentacin a la organizacin de la informacin, siendo un componente bsico y fundamental para tomar decisiones respecto al manejo y uso de los recursos genticos. El trmino documentacin incluye todos los procesos necesarios para recopilar, organizar, analizar y distribuir la informacin sobre los recursos fitogenticos. Contiene para una especie o grupo de especies datos sobre estatus taxonmico, estado de conservacin y datos de caracterizacin, entre otros. La actividad de documentacin de recursos genticos debe prever incluir todas las formas en que las especies se encuentren y no quedar restringida al manejo de una estructura tradicional de banco de germoplasma, asociado generalmente a semillas. Incluyen las colecciones a campo, colecciones in situ, cultivos de tejidos, colecciones de ADN, y de herbarios asociados a materiales conservados. La documentacin incluye tambin la informacin sobre variedades criollas de especies introducidas, muchas de ellas conservadas en fincas de agricultores; la de parientes silvestres afines a las cultivadas y la de especies silvestres reconocidas como potenciales recursos genticos. A este cmulo de informacin tambin deben integrarse los datos de evaluacin agronmica realizada por mejoradores, fitopatlogos, la informacin generada por qumicos, citogenetistas, etc., as como la contenida en las publicaciones existentes. La documentacin comprende la obtencin, almacenamiento, procesamiento, anlisis y difusin de los datos e informaciones, tanto por mtodos manuales como computarizados relacionados con las actividades de: 1) ampliacin de la variabilidad gentica disponible (por medio de colectas, mejoramiento gentico, mtodos biotecnolgicos); 2) conservacin in situ (en reas protegidas y en predios rurales o fincas); 3) conocimiento asociado al uso de esos recursos genticos; 4) conservacin ex situ (banco de mediano y largo plazo,
in vitro, colecciones de campo, colecciones de ADN, etc.); 5) estado de las colecciones (inventario, viabilidad, % de germinacin, poder germinativo, nmero de semillas, peso de muestra, etc.), as como actividades de regeneracin y/o multiplicacin llevadas a cabo; 6) caracterizacin (morfolgica, qumica, molecular, otras.); 7) evaluacin agronmica (caracteres cuantitativos). Un sistema de documentacin correctamente diseado debe permitir el acceso de links internos y externos, y facilitar el almacenamiento y recuperacin de objetos digitales, tales como imgenes, hojas de clculo, pdf, etc.). Una caracterstica valiosa de un sistema de documentacin es la capacidad de importar y exportar datos mediante planillas electrnicas para actualizacin y consulta. Esto agiliza enormemente la carga de las bases de datos e incentiva el uso del sistema. Un sistema de documentacin no es un sistema para el anlisis de materiales de ensayos en la etapa de mejoramiento, sino que es para el registro de datos que aporten al conocimiento del germoplasma y promover su uso. La rpida evolucin y diseminacin de las Tecnologas de la Informacin y Comunicaciones (TIC) proveen en la actualidad excelentes mecanismos confiables y probados que son usados para los sistemas de informacin. Las aplicaciones web son herramientas de software que facilitan el acceso a la informacin para fines de mantenimiento y consultas de las bases de datos independientemente de la ubicacin geogrfica del usuario. Ms recientemente, la difusin del uso de dispositivos mviles agrega ms oportunidades al acceso remoto de la informacin. (8) Bancos internacionales y nacionales de genes Once centros GCIAI administran colecciones de germoplasma en nombre de la comunidad mundial. Bioversity International, CIAT , CIMMYT, CIP, ICA RDA, Centro Mundial de Agrosilvicultura (anteriormente ICRAF), ICRISAT , Instituto Internacional de Agricultura Tropical, Instituto Internacional de Investigaciones Agropecuarias, INIBAP , IRRI y el
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Centro Africano del Arroz (antes WARDA). nos, universidades, jardines botnicos, ONG, El total de las colecciones de CIMMYT, ICA compaas, agricultores y dems interesados RDA, ICRISAT e IRRI comprenden ms de de los sectores pblico y privado conservan 100 000 muestras cada una. En conjunto, recursos en bancos de genes a nivel local y los centros mantienen un total aproximado nacional. Albergan una amplia gama de disde 741 319 muestras de 3 446 variedades tintos tipos de colecciones: colecciones nade 612 gneros distintos. Adems, muchas cionales conservadas a largo plazo, colecciootras instituciones internacionales y regionanes de trabajo mantenidas a mediano o corto les conservan colecciones plazo, colecciones de maimportantes, por ejemplo. Los centros de genes mantienen terial gentico y otras. Los un total aproximado de 741.319 cuatro bancos nacionales El AVRDC conserva de genes ms importantes muestras de 3.446 variedades de alrededor de 56 500 son los que se encuentran 612 gneros distintos. muestras de germoplasen el Institute of Crop Germma de hortalizas. plasm Resources, la Aca El Centro Nrdico de Recursos Gentidemia China de Agronoma (ICGR-CAA S) cos (NordGen) conserva cerca de 28 000 de China, el National Center for Genetic Reejemplares de 129 gneros de especies sources Preservation de Estados Unidos de cultivadas. America, el National Bureau of Plant Genetic El Centro Agronmico Tropical de InvesResources (NBPGR) de India y el N. I. Vavitigacin y Enseanza (CATIE) tiene un lov All-Russian Scientific Research Institute of total de ms de 11 000 muestras de horPlant Industry (VIR). Tambin, existen bancos talizas, frutas, caf y cacao. nacionales de genes que hospedan ms de El Centro de Recursos Fitogenticos 100 000 muestras en Alemania, Brasil, Cana(SPGRC) de la Comunidad para el Desad, Japn y la Repblica de Corea. rrollo del frica Austral (SADC) conserva ms de 10 500 ejemplares de varios El NPGS del Departamento de Agricultura de cultivos importantes para la agricultura los Estados Unidos trabaja con un sistema de africana. conservacin de germoplasma que establece La West Indies Central Sugarcane Breeuna red entre 31 bancos de genes dentro del ding Station (WICSBS) de Barbados conpas y conserva ms del siete por ciento de las serva alrededor de 3 500 muestras. tenencias de germoplasma, lo que representa El banco de genes International Cocoa ms del 50 por ciento de los gneros conservaGenebank de Trinidad y Tobago (ICGT), dos en los bancos de genes a nivel mundial. El en la Universidad de las Indias Occidenbanco de genes de semillas Millennium Seed tales, conserva aproximadamente 2 300 Bank es el ms grande del mundo dedicado ejemplares. a la conservacin de especies silvestres. Est El Centro para los Cultivos y los rboles dirigido por el Jardn Botnico Real de Kew, del Pacfico (CePaCT) de la Secretara que tambin cuenta con colecciones vivas de de la Comunidad del Pacfico mantiene envergadura, as como tambin un herbario y colecciones de aproximadamente 1 500 colecciones carpolgicas.(10) muestras de distintos cultivos, incluyendo colocasias, ames y boniatos. La comisin de recursos genticos para la Un acontecimiento muy significativo desde alimentacin y la agricultura la publicacin del Primer Informe ha sido la creacin del SGSV. Si bien no se trata de un Consciente de la importancia de la biodiverbanco de genes en sentido estricto, el SGSV sidad en la alimentacin y la agricultura para ofrece instalaciones seguras para el almacela seguridad alimentaria mundial, la Organinamiento de muestras de seguridad de los zacin de las Naciones Unidas para la Agriejemplares que hay en bancos de genes de cultura y la Alimentacin (FAO) cre en 1983 todo el mundo. En todo el planeta, gobierla Comisin de Recursos Genticos para la
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Alimentacin y la Agricultura, de carcter intergubernamental. El mandato original de la Comisin trata la cuestin de los recursos Fitogenticos en la Alimentacin y la Agricultura se ampli en 1995, para incluir todos los componentes de la biodiversidad relativa a la alimentacin y la agricultura. Con ms de 170 miembros, la Comisin constituye un foro intergubernamental para alcanzar un consenso mundial sobre polticas pertinentes para la biodiversidad en la alimentacin y la agricultura. Sus objetivos principales son velar por la conservacin y la utilizacin sostenible de los recursos genticos para la alimentacin y la agricultura, y por la distribucin justa y equitativa de los beneficios derivados de su uso, para las generaciones presentes y futuras. La tarea de la comisin se centra en el desarrollo y la supervisin de la aplicacin de polticas y nuevas iniciativas complementarias que no estn destinadas nicamente a fomentar la sensibilizacin acerca de estas cuestiones, sino que miren hacia el futuro para saber cmo solucionar los problemas. Adems, se encarga de orientar la preparacin peridica de evaluaciones mundiales acerca del estado y las tendencias de la diversidad gentica, las amenazas para la diversidad gentica y las medidas que estn siendo tomadas para la conservacin y utilizacin sostenible. La comisin tambin negocia planes de accin, cdigos de conducta y otros instrumentos de inters para la conservacin y utilizacin sostenible de recursos genticos relativos a la alimentacin y la agricultura. CONCLUSIONES Los recursos genticos en la actualidad son prioridad de todos los pases y en especial de Amrica Latina y el Caribe, donde se localiza la mayor biodiversidad de especies vegetales en el mundo. Es tal la importancia de los recursos genticos; que hoy en da vemos como se ha instaurado como una nueva rama de la Biotecnologa que se independiza de la Gentica y la Biologa Molecular.
Somos conscientes que los recursos genticos son la base de la subsistencia del ser humano. Ya sea directamente, por su consumo como vegetales para la alimentacin del hombre, como por ser la base de la alimentacin animal, que suministra las protenas tan necesarias para la vida, los recursos genticos estn en el centro de la seguridad alimentaria mundial. REFERENCIAS 1. Leipzig, 1996. Biodiversidad en Ecuador. Instituto Nacional Autnomo de Investigaciones Agropecuarias. QuitoEcuador. 137p. 2. Tapia, C; Zambrano, E; Monteros, A. 2008. Estado de los recursos Fitogenticos para la Agricultura y la Alimentacin en Ecuador. INIAP. Quito Ecuador. 101p. 3. Kameswara, N; Hanson, J; et.al. 2007. Manual para el Manejo de Semillas en Bancos de Germoplasma. Bioversity International. Roma - Italia. 167p. 4. Jaramillo, S; Baena, M. 2000. Conservacin ex situ de Recursos Fitogenticos. IPGRI Espaa. 105p. 5. Prez, M. Recursos Fitogenticos. rea de Gentica, fac. de biologa y E.S. y T. de Ing. Agraria, Universidad de Len. 6. Martin, I. Conservacin de Recursos Fitogenticos. Centro de Recursos Fitogenticos (CRF) Instituto Nacional de Investigaciones y Tecnologa Agraria y Alimenticia (INIA). 7. Rodrguez, C. 2009. Conservacin y Produccin de Recursos Fitogenticos Maestra en Agricultura sostenible. Universidad de las Villas. Cuba. 8. PROCISUR. 2010. Estrategia en los Recursos Fitogenticos para los pases del Cono Sur. 162p. 9. FAO. 2007. La comisin de recursos genticos para la alimentacin y la agricultura. FAO. 2010. Segundo Informe sobre el estado de los Recursos Fitogenticos para la alimentacin y la agricultura en el mundo. 402p. 10. INIA. 2001. Introduccin a la colecta de germoplasma.25p.
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BIOLOGA DE SISTEMAS Y BIOINFORMTICA: ESTUDIO DE INTERACCIONES FITOPATOLGICAS

Marlon Pineda Escobar1, Aminael Snchez Rodrguez2 1. Centro. Biotecnologa, Universidad Nacional de Loja (UNL), La Argelia, Loja, Ecuador. E-mail: mao_os11@yahoo.es, 2. Department of Microbial and Molecular Systems, K.U. Leuven, Kasteelpark Arenberg 20, B-3001 Leuven, Belgium. E-mail: aminael.sanchezrodriguez@biw.kuleuven.be ____________________________________________________________________________
ABSTRACT
With the completion of the human genome and the growth in number of sequenced genomes, a new age of evolutionary research is taking shape. Many technological advances in biology are leading to the unification of diverse scientific fields such as molecular biology, biochemistry, physics, mathematics and computer science, now known as systems biology. In this paper we focus on bioinformatics workflows that allow to go beyond the study of model organisms in isolation to shape a new dimension of study: the biological system. Key words: Systems biology; Bioinformatics; Molecular interactions ____________________________________________________________________________
INTRODUCCIN
La maduracin de la Biologa Molecular, de nuestros tiempos ha cambiado de forma significativa, la forma en que miramos a la clula: ello permite un acercamiento holstico y no determinstico. Las nuevas tecnologas que han dado lugar al acceso a grandes volmenes de datos, el mayor poder computacional y el diseo de nuevos algoritmos, han cambiado la actitud de muchos cientficos sobre cmo solucionar algunos de sus problemas (1). Slo en la ltima dcada hemos tenido acceso a la casi completa diversidad de genomas, que permiten a gran escala, el anlisis comparativo de organismos (ej. comparaciones de familias de genes) (1), y ha propiciado el nacimiento de una nueva disciplina denominada Biologa de Sistemas (2). El acceso a esta inmensa cantidad de datos significa proporcionar una visin profunda en el rbol de la vida a casi todos los niveles de divergencia entre especies. Por ello no es sorprendente que la comprensin de relaciones filogenticas sea un objetivo de investigacin comn entre los bilogos evolucionistas, y en los cientficos interesados en la organizacin y funcin del genoma (1). A partir de esta concepcin se han realizado muchos estudios referentes a las interacciones biolgicas, tratando de explicar el surgimiento de caracteres fenotpicos complejos de manera integrada (2). Una de las dificultades ms importantes que afrontamos proviene, de la enorme cantidad de datos que disponemos: la secuencia de ms de un milln y medio de protenas, la de ms de mil genomas, la estructura tridimensional de ms de 20 mil protenas; tambin
disponemos de muchos datos que indican qu protenas interaccionan entre s; y todo el conocimiento cientfico acumulado a lo largo de las ltimas dcadas se encuentra disperso en ms de 12 millones de artculos. El reto es ser capaces de relacionar todos estos datos, extraer conocimiento de ellos, comprender la biologa de los organismos (3) y empezar a tener un impacto importante en nuestra comprensin de la evolucin molecular (1). Los animales, hongos y plantas son los ms representados en trminos de iniciativa genmica, porque han iniciado el inters de las diversas comunidades cientficas, incluyendo los parasitlogos, fitopatlogos, los oceangrafos, y bilogos en general. A medida que se realizan ms estudios genmicos, se va proporcionando informacin sobre la funcin de los sistemas biolgicos, a travs del bioanlisis mediante el empleo de nuevos mtodos de alto rendimiento como la bioinformtica que permite analizar informacin biolgica a travs de modelos computacionales. (1). Cuando se secuencia un genoma vemos poco ms que una larga serie de caracteres en un alfabeto de cuatro letras (los nucletidos: A, C, T y G). Para lograr extraer patrones significativos de dicha informacin, la bioinformtica tiene un papel protagonista por dos razones principales: por una parte, la enorme cantidad de datos disponibles slo puede ser analizada utilizando ordenadores; por otra, los datos son complejos, entre la maraa que entretejen hay informacin que slo puede salir a la luz utilizando sofisticados algoritmos computacionales, que permiten comprender la informacin que encierran estos libros de
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RESUMEN
Con la finalizacin del genoma humano y el crecimiento en nmero de diversos genomas secuenciados, una nueva era de la investigacin sobre evolucin molecular est tomando forma. La gran cantidad de avances tecnolgicos en el rea biolgica, estn llevando a la unificacin de campos cientficos como la biologa molecular, bioqumica, fsica, matemticas y ciencias de la computacin, lo que ahora se conoce como biologa de sistemas. En este artculo hacemos un nfasis en los flujos de trabajo en bioinformtica que permiten la adopcin de enfoques comparativos que van ms all del estudio de organismos modelos de forma aislada para dar forma a una nueva dimensin de estudios: los sistemas biolgicos. Palabras clave: Biologa de Sistemas; Bioinformtica, Interacciones moleculares ____________________________________________________________________________
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instrucciones encontrando los genes y su funcin. Esta herramienta de bioanlisis ha aportado algunas soluciones que son alternativas de gran valor al lento y costoso trabajo experimental (3). Desde los primeros estudios en esta temtica y hasta el presente, la secuenciacin del genoma humano ha dado un empujn importante a esta disciplina (3).
y temporales entre molculas, clulas, tejidos, rganos y organismos que dan lugar a causa y efecto en sistemas vivos.
La importancia del anlisis comparativo es evidente en la proporcin cada vez mayor rs de las diversas comunidades de nuevos proyectos en gecientficas, incluyendo los para- La Biologa de Sistemas es nomas procariticos que se sitlogos, fitopatlogos, los ocea- un campo emergente de las han elegido por su relacin filogentica con organismos ciencias de la vida con un ngrafos y bilogos en general. modelo como Escherichia carcter multidisciplinario. coli y Bacillus subtilis y sus correspondientes En esta nueva disciplina convergen expertos taxones relacionados. Esta misma tendencia procedentes de reas como la genmica, proest ocurriendo en los eucariotas. Algunos temica, metabolmica, bioqumica y biologa ejemplos destacados son los mltiples promolecular, bioinformtica, biofsica, fisiologa yectos de genmica en Saccharomyces, en y modelacin computacional. Fruto de esta Ascomycetes, en Plasmodium y otras iniciaticolaboracin entre grupos podrn establecervas de genoma en nematodos y Drosophila, y se estndares en bases de datos, software y el gran nmero de los proyectos de genmica algoritmos. La Biologa de Sistemas revolude primates y mamferos. (1). cionar la medicina del futuro. Actualmente, la medicina est enfocada al tratamiento de El objetivo de esta resea es realizar una resntomas mientras que en un futuro ser ms copilacin y anlisis de la informacin relaciopredictiva, previsiva y personalizada. Esto nada con la Biologa de Sistemas, que a traocurrir gracias al apoyo que tendr de discivs de la Bioinformtica permita en conjunto, plinas como la Biologa de Sistemas que peranalizar y entender dos de las preguntas funmitir la caracterizacin y el establecimiento damentales: la funcin de los sistemas biolde diferencias entre estados patolgicos y gicos en las interacciones y el conocimiento normales mediante el diseo de modelos prede la evolucin de la diversidad de la vida. dictivos de estados patolgicos. A partir de esta concepcin se han realizados muchos Parte Especial: estudios referentes a las interacciones biolgicas, tratando de explicar el surgimiento de En los ltimos aos, se han producido grancaracteres fenotpicos complejos de manera des avances en diferentes tcnicas de biolointegrada. ga molecular, que han generado un aumento exponencial en la cantidad de informacin Para llegar a materializar estos objetivos, es proveniente de genes, protenas, dinmica crtico desarrollar herramientas de software celular y respuestas de los organismos frenms potentes y modelos matemticos ms te a mutaciones y el medio que los rodea. El robustos que permitan realizar modelos cuanprincipal objetivo de las ciencias biolgicas es titativos y cualitativos capaces de reproducir comprender la organizacin y dinmica de los detalladamente los fenmenos biolgicos. componentes que forman los sistemas vivos, Paralelamente tambin es necesario desaes decir, investigar las relaciones espaciales
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Frente a la aproximacin tradicional de la biologa al estudio de genes, protenas y clulas como entidades individuales, la Biologa de Sistemas busca la comprensin global de las interacciones que se proLos animales, hongos y plantas ducen a todos los niveles en los seres vivos. Permitienson los ms representados en do mirar a la clula con un trminos de iniciativa genmi- acercamiento holstico y no ca, porque han iniciado el inte- determinstico.
rrollar nuevas tecnologas y metodologas (y abaratar las ya existentes) para miniaturizar, estandarizar y automatizar la obtencin de datos experimentales. (2). ASPECTOS GENERALES DE LA BIOLOGA DE SISTEMAS: La Bioinformtica tradicionalmente se ha centrado en el estudio de las protenas y los genes de forma aislada. Por ejemplo, para predecir la funcin o la estructura tridimensional de una protena nueva, se buscan protenas parecidas cuya funcin o estructura ya se conozcan. Existen multitud de mtodos computacionales en torno a esta perspectiva, y han sido, y sigue siendo, de gran ayuda. Desde hace algunos aos, sin embargo, el panorama se ha ampliado: nuevas tcnicas experimentales nos permiten conocer las redes de interaccin entre protenas de una clula, o cmo se expresan en determinada situacin miles de genes. Este emergente punto de vista, ms amplio, necesita de nuevos mtodos para que seamos capaces de comprender los datos. Una de las dificultades ms importantes que afrontamos en Biologa proviene, paradjicamente, de la enorme cantidad de datos que disponemos. El reto es ser capaces de relacionar todos estos datos, extraer conocimiento de ellos, y comprender la biologa de los organismos. (3). La gran mayora de los fenotipos cuantificables en las especies presentan un gran nivel de variabilidad a nivel poblacional (variacin gentica natural). Mientras que la presencia de esta diversidad es ampliamente reconocida, mucho menos se sabe acerca de las consecuencias de la variacin gentica natural o las fuerzas detrs de su mantenimiento o generacin, que son fundamentales para la evolucin y la ecologa. La utilidad de la biologa de sistemas ha ido ms all de la capacidad para describir fenotipos individuales sino para empezar describiendo la forma de las interacciones (4). La biologa de sistemas tambin ha comenzado a tener un gran avance para ayudar a entender mejor y as describir la biologa de las plantas (5).
Este incluye el desarrollo de enfoques clave para combinar datos de metabolmica y transcripcin en la identificacin de nuevos genes de regulacin enzimtica (6;7). Numerosos mtodos de biologa de sistemas ahora se aplican al estudio de la variacin gentica natural, incluyendo la transcriptmica (8;9), metabolmica (10;11), la protemica (12), compilacin de grandes conjuntos de datos fisiolgicos (8), la red de herramientas de anlisis (13;14), y toda la secuenciacin del genoma (15;16). Cada uno de estos enfoques tiene una mirada fuerte y ayuda en la identificacin rpida de genes subyacentes, fenotipos que van desde la floracin a los mecanismos de resistencia bitica. Sin embargo, su uso potencial es la comprensin de las bases genticas de determinados fenotipos biolgicos que han sido revisados ampliamente en los ltimos aos. (17). Slo en la ltima dcada hemos tenido acceso a la casi completa diversidad de genomas, que permiten a gran escala el anlisis comparativo de organismos. Nuevos genomas, secuencias y mtodos de anlisis estn ayudando a mejorar nuestra comprensin de la filogenia, y al mismo tiempo mejorarlas. Actualmente, sin embargo, el nivel de la secuenciacin del genoma de las diferentes ramas del rbol de la vida est lejos de ser equivalentes. Proyectos de genoma procaritico son abundantes, principalmente debido al pequeo tamao del genoma, con 200 genomas ya publicados y 500 por lo menos actualmente en curso (www.genomesonline.org). En contraste, 300 genomas de eucariotas estn terminados o en curso (www.genomesonline.org). Sin embargo, estos datos estn empezando a tener un impacto importante en nuestra comprensin de la evolucin eucaritica. Los animales, hongos y plantas son los ms representados en trminos de iniciativa genmica. A medida que se realizan ms proyectos genmicos, postgenmicos, la biologa tambin va proporcionando informacin sobre la funcin de los sistemas biolgicos (1).
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La inmensa cantidad de datos obtenidos a travs de los proyectos de secuenciacin del genoma no proporcionan suficiente informacin acerca de funcionamiento de un organismo a nivel molecular. Por esta razn, en los ltimos aos se ha producido un incremento en los esfuerzos por entender la funcin y objetivos de las diversas molculas existentes en la clula (ADN, ARN, protenas, y metabolitos). Para lograrlo es preciso definir la estructura tridimensional de estas macromolculas, su localizacin subcelular, interacciones macromoleculares, y niveles de expresin. Un nuevo tipo de terminologa que emplea el sufijo oma se ha extendido en la comunidad cientfica en los ltimos aos, en referencia a los distintos tipos de subpoblaciones de macromolculas en la clula. Por extensin, a la disciplina o rea de investigacin que se encarga del estudio de cada una de estas subpoblaciones, se le aade el sufijo mica. El nmero de publicaciones es un buen indicador de la situacin de la investigacin en Biologa de Sistemas. Al realizar una bsqueda utilizando como palabra clave Biologa de Sistemas (Systems Biology) en la base de datos de publicaciones cientficas Pubmed, se observan un total de 46448 artculos cientficos publicados entre enero del ao 1999 y octubre del 2011. Si se compara este nmero de artculos con los 71.707 artculos que emplean los trminos Genmica o Genmica Funcional (Genomics) que se han publicado en el mismo perodo de tiempo, podemos hacernos una idea del estado inicial en que se encuentra la investigacin en Biologa de Sistemas (2). BIOINFORMTICA ANLISIS DE DATOS GENMICOS Con mltiples secuencias del genoma a disposicin del pblico, ahora estamos en la era de la post-genmica. La llamada siguiente generacin (NextGen) de tcnicas rpidas y baratas de secuenciacin es lo que permite abordar una amplia gama de aplicaciones de anlisis gentico que incluye: la genmica
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comparativa, de alto rendimiento de deteccin de polimorfismo, el anlisis de la regulacin transcripcional, desentraar los genes mutantes en las enfermedades, y muchos otros estudios, slo limitada por la imaginacin de los investigadores. La genmica comparativa es un paso fundamental en muchos estudios de anlisis de secuencias y la anotacin de genomas completos a travs de la identificacin de regiones codificantes y regulacin. Es adems uno de los principales retos en la investigacin actual en biologa molecular (18) presentando una evaluacin estadstica de las caractersticas discriminatorias de protenas codificantes y no codificantes entre especies. Distintos grupos de investigacin han desarrollado un procedimiento automatizado que permite de forma masiva realizar bsquedas similares de agrupacin de genes, clculo de varias alineaciones, y la reconstruccin de rboles filogenticos dando lugar a la produccin de tres bases de datos: HOVERGEN, HOGENOM y HOMOLENS. (19; 20). ANLISIS DE DATOS DE TRANSCRIPTMICA: La evaluacin de los datos de transcriptmica requiere el uso de enfoques que aprovechen la dinmica de activacin de funciones de los genes. Un nuevo enfoque complejo en la evaluacin de los datos de expresin es presentado por (21). En este trabajo los autores presentan tres nuevos mtodos capaces de capturar los diferentes aspectos de la relacin entre los genes, las funciones y co-expresin que son biolgicamente significativos. Otro aspecto interesante del anlisis a gran escala de datos de transcriptoma es tratado por (22) con EasyCluster, una herramienta de agrupacin capaz de generar nuevos genes. ANLISIS DE DATOS DE PROTEMICA Son dos elementos clave de micas, el anlisis automtico de datos y la visualizacin de datos (23) la una presenta una herramienta nueva llamada agrupacin GIBA y demuestra
cmo la combinacin de los mtodos existentes, en este caso las herramientas de clustering para analizar las interacciones entre protenas, puede aumentar la calidad de los resultados. (24) describe una herramienta de visualizacin para comparar dos protenas LC-MS conjuntos de datos a un nivel muy detallado, mientras que (25) presentan un nuevo enfoque computacional para visualizar y comparar quimiogenmica protenas. INTEGRACIN DE DATOS BIOLGICOS
INTERACCIONES FITOPATOLGICAS En la trada clsica de la epidemiologa, la expresin clnica de la enfermedad infecciosa se entiende como un producto de una relacin compleja de un agente infeccioso, la respuesta inmune del husped y factores ambientales. (28). En sntesis moderna, los genes eran las caractersticas de adaptacin de las especies, no un nivel de evolucin, con una historia profunda o con procesos de ramificacin potencialmente diferentes de las especies. Esta visin estaba relacionada con el supuesto de que la historia de las especies estaba dominada por el ajuste fino de la evolucin de los sub-orgaanlisis gentico nismos rasgos especficos a fines funcionales. (29).
La integracin de los resultados de la prediccin automtica y visualizacin para el anlisis genmico de datos del genoma es un gran problema de la era postgenmica. (26) describen El poder del su trabajo en la anotacin consiste en que, mediante el esy visualizacin de secuentudio de relaciones genotipofe- Los estudios genticos no cias retrovirales endgenotipo, podemos acercarnos a slo nos ayudan a entennas usando el Sistema de los detalles de los sistemas bio- der mecanismos bsicos en Anotacin distribuido (DAS) lgicos. biologa, sino tambin nos y eBioX. (27) aplicar la exbrindan informacin sobre periencia en la interaccin la relacin entre el genotipo contenido gepersona-ordenador para crear componentes ntico de un individuo en forma de ADN y de software reutilizables que analicen a gran el fenotipo la expresin del genotipo en un escala un conjunto de bases de datos (20). determinado contexto ambiental. Entender dichas relaciones entre el genotipo y el fenotiLa Bioinformtica es el rea de la Biologa po nos brinda el potencial de mejorar nuestra donde intentamos aplicar los mtodos comhabilidad para prevenir, diagnosticar y tratar putacionales para analizar esta informacin. enfermedades. Desde los primeros estudios en esta temtica y hasta el presente, la secuenciacin del geEn tiempos recientes, la biologa molecular noma humano ha dado un empujn importancelular ha transitado del estudio de compote a esta disciplina, debido a que se han desnentes moleculares individuales al estudio del crito millones de diferencias en la secuencia conjunto de dichos componentes y sus inteentre distintas personas. racciones (30). Esta aproximacin de biologa de sistemas busca, en la medida de lo posiLa Bioinformtica tradicionalmente se ha cenble, una descripcin integral y cuantitativa de trado en el estudio de las protenas y los gelas clulas y de los organismos, para lo cual nes de forma aislada. Desde hace algunos ha sido necesario el desarrollo de nuevos maos, el panorama se ha ampliado: nuevas todos tanto tericos como experimentales. tcnicas experimentales nos permiten conoLas interacciones genticas son particularcer las redes de interaccin entre protenas mente atractivas para el anlisis de los sistede una clula, o cmo se expresan en determas biolgicos, por su naturaleza trascienden minada situacin miles de genes. Este incien la interaccin fsica y reflejan relaciones piente punto de vista, ms amplio, necesita funcionales entre diferentes componentes de nuevos mtodos para que seamos capagenticos. Gracias a las interacciones gences de comprender los datos. (3) ticas conocemos en la actualidad un nmero
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importante de vas metablicas, de transduccin de seales y de procesos de desarrollo. El poder del anlisis gentico consiste en que, mediante el estudio de relaciones genotipofenotipo, podemos acercarnos a los detalles de los sistemas biolgicos. De hecho, mucho de nuestro conocimiento sobre procesos biolgicos clsicos se recopil incluso antes de que se describiera el dogma central de la biologa molecular. Las ltimas dcadas han visto un progreso sin precedente en el desarrollo de la biologa molecular. Los avances tecnolgicos y de diseo de protocolos han permitido a los cientficos automatizar muchos de los experimentos que tradicionalmente se hacan a mano y a pequea escala. La combinacin de dichas tecnologas con los catlogos genticos completos que representan las secuencias genmicas han resultado en experimentos de alto rendimiento que examinan las propiedades bioqumicas y genticas de un gran nmero de genes en paralelo. De esta forma, podemos interrogar a los sistemas biolgicos de manera sistemtica. Dado el atractivo particular del estudio de las interacciones genticas de los genes entre s y de stos con las condiciones externas, no es de extraar que stas tambin hayan sido sujeto de anlisis funcional sistemtico. Dichos estudios se enfocaron originalmente en organismos modelo como la levadura Saccharomyces cerevisiae (31; 32; 33; 34; 35; 36) y el nemtodo de vida libre Caenorhabditi selegans (37; 38), dada la facilidad con que estos organismos pueden ser manipulados genticamente. Entre tanto, podemos aprender principios bsicos sobre un nmero importante de procesos biolgicos mediante el estudio de interacciones genticas en organismos ms simples, donde muchas de las herramientas pertinentes ya estn a la mano. Con esta idea en mente, muchos grupos de investigacin han desarrollado protocolos para crear combinaciones genticas de diferente naturaleza (inactivacin completa, inactivacin parcial, sobreexpresin, etc.) en parejas de genes. Esto nos permite construir el mapa de inte20
racciones para 2n pares de genes para un nmero n razonable de genes. Es importante destacar que el muestreo en estos casos aumenta de manera exponencial: un estudio de todas las interacciones de cien parejas de genes implica el anlisis de 10.000 muestras experimentales, mientras que para el estudio de mil parejas de genes requerira 1000.000 de muestras. Los primeros estudios sistemticos se concentraron en la identificacin de parejas de mutaciones co-letales (39; 33; 35; 36). La tecnologa ms reciente ha permitido hasta cierto punto el anlisis cuantitativo de interacciones genticas mediante el estudio de fenotipos tales como la velocidad de crecimiento (32; 34). Algunas variantes de estos ensayos han examinado las interacciones de las perturbaciones genticas con las condiciones externas tales como respuesta a estrs o a la presencia de drogas (31; 40). (41). CONCLUSIONES De este estudio se resalta la importancia que tiene el conocimiento profundo de la Biologa de Sistemas. Este conocimiento es vital desde el punto de vista biolgico, debido a que permite una adecuada y mejor comprensin de la organizacin y dinmica de los componentes que forman los sistemas vivos, es decir, investigar las relaciones espaciales y temporales entre molculas, clulas, tejidos, rganos. Y la integracin de los resultados de la prediccin automtica y visualizacin para el anlisis genmico de datos del genoma en estudio. REFERENCIAS 1. Medina M: Genomes, phylogeny, and evolutionary systems biology. PNAS. 2005, 102: 6630 - 6635. 2. Lpez M, Ruiz G, Vega M, 2007. Biologa de Sistemas Informe de Vigilancia Tecnolgica. Genoma Espaa biologa de Sistemas. 128. 3. UCM (2011) Bioinformtica. Disponible en http://www.bbm1.ucm.es/ (accessed October 8, 2011). 4. Albert R: Scale-free networks in cell biology. J Cell Sci 118: 4947 4957.
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MICROORGANISMOS DIAZOTRFICOS Y SU CONTRIBUCIN A LA FIJACIN BIOLGICA DEL NITRGENO

Klever Ivn Granda Mora1, Santiago Erazo Sotomayor1 1. Centro de Biotecnologa, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falcon Espinosa La Argelia - PBX: 072547252 - Casilla Letra S E-mail: ivang100@gmail.com ____________________________________________________________________________
RESUMEN
El nfasis de la comunidad internacional en el desarrollo ambiental sostenible, parece centrar su atencin en el papel potencial de la fijacin biolgica del nitrgeno (FBN), al suministrar nitrgeno para la agricultura con el fin de contrarrestar el indiscriminado empleo de fertilizantes nitrogenados. En la presente revisin exploramos los microorganismos beneficiosos fijadores de nitrgeno (N) asociados a las plantas, que pueden tener una gran influencia en el crecimiento y desarrollo de las mismas, al contribuir al balance del ciclo del nitrgeno (N), aumentando la absorcin de los nutrientes y promoviendo su crecimiento, en esta revisin hacemos nfasis en la interaccin Rhizobium-leguminosa su asociacin y simbiosis con leguminosas de importancia agronmica y su aporte en el incremento de la sostenibilidad de los agro-ecosistemas y los rendimientos agrcolas. Palabras Claves: Fijacin biolgica del N, microorganismos, asociacin, nutrientes, Rhizobium ____________________________________________________________________________
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ABSTRACT
The emphasis of the international community on sustainable environmental development seems to focus on the potential role of biological nitrogen fixation (BNF), to provide nitrogen for agriculture in order to counteract the indiscriminate use of nitrogenous fertilizers. In this review we explore the beneficial nitrogen-fixing microorganisms (N) associated ciated with plants, which can have a major influence on the growth and development of my-more, by contributing to the balance of the nitrogen cycle (N), increasing the absorption of nutrients and growth promoting, in this review we emphasize the Rhizobium-legume interaction and partnership symbiosis with legumes of agronomic importance and its contribution in increasing the sustainability of agro-ecosystems and agricultural yields. Keywords: biological N fixation, microorganisms, association, nutrients, Rhizobium ___________________________________________________________________________
INTRODUCCION
El suministro de nitrgeno (N) al suelo no es suficiente para compensar su creciente demanda por las plantas y organismos vivos que habitan en este planeta, hacindose necesaria la aplicacin de algn fertilizante nitrogenado (Beever et al., 2007). Sin embargo, esta estrategia puede producir una creciente contaminacin ambiental donde se ven afectados todos los factores actuantes, ya sean biticos como abiticos (Urzua et al., 2001). El N es el principal factor nutricional que limita el crecimiento de plantas en los agroecosistemas mundiales (Graham, 1988). Este elemento es un componente esencial en sustancias bsicas para la vida, tales como cidos nucleicos y la conformacin de protenas (Harrison, 2003), por lo que el cultivo de plantas con capacidad para incorporar este elemento tanto a su metabolismo como para el adecuado comportamiento del ciclo del N en la biosfera es de vital importancia. Las plantas pertenecientes a la familia leguminosa (Fabaceae) son unas de las mximas responsables del equilibrio del N en los ecosistemas (Broughton et al., 2003). Estas son capaces de realizar el proceso de fijacin biolgica del N (FBN) mediante la estrecha relacin con bacterias del suelo comnmente conocidas como rizobios (Weir, 2006). En la presente revisin se abordan los principales problemas causados por la aplicacin indiscriminada de N sinttico a los suelos, as como el aporte de los microorganismos dia24
zotrficos al ciclo de este vital elemento para el desarrollo y crecimiento de las plantas y a la FBN. Impacto del nitrgeno (N) en los ecosistemas. A partir de la dcada del 40, millones de toneladas de N sinttico eran suministradas a las producciones agrcolas anualmente con el fin de aumentar sus rendimientos potenciales. La alta demanda de alimentos fue un factor determinante de tal incremento en la produccin y aplicacin de fertilizantes nitrogenados. La revolucin verde se convirti en el punto sublime de la difusin de los mencionados fertilizantes, trayendo consigo el gasto incalculable de fuentes de energa natural para su produccin y los nefastos problemas que han ocasionado en la ecologa y el equilibrio biolgico (Biological Nitrogen Fixation, 2001). Desde 1972, con la fundacin de la IFOAM (Internacional Federation of Organic Agriculture Movements), se estableci que la agricultura orgnica deba aumentar la fertilidad de los suelos, su actividad microbiana e incrementar el reciclaje de los nutrientes. En la dcada de los 90, los biofertilizantes se convirtieron en un punto comn de investigacin teniendo en cuenta los serios problemas ambientales causados con la aplicacin irracional de los fertilizantes qumicos (IFOAM, 2001), lo cual se ha mantenido hasta la actual dcada. La aplicacin de fertilizantes que contienen
N para las cosechas es esencial para equiprotenico en las cosechas, reduccin de la librar las entradas y salidas de nutrientes y materia orgnica de los suelos, erosin y en por tanto para mantener o mejorar la fertilidad casos extremos, la desertificacin (Barbier y del suelo, para incrementar la productividad Bergeron, 2001). No obstante, existen nefasagrcola y a su vez, para evitar que los ecotos problemas que pueden originarse con el sistemas naturales y los hbitats vrgenes se exceso o la aplicacin irracional de productos conviertan en tierras de cultivo (Beever et al., qumicos nitrogenados. El exceso de NO3- en 2007). Sin embargo, esto ha los suelos comnmente suetrado como consecuencia el La aplicacin de fertilizantes le lixiviarse a los suministros gran uso de fertilizantes nide agua subterrnea y agua que contienen N (un elementrogenados para reponer el potable, contaminando las to necesario en la composicin N del suelo y para obtener fuentes fluviales. Aunque el de protenas, cidos, nucleicos llamado sndrome de nios los rendimientos deseados, y otros componentes celulares) cianticos (enfermedad couna prctica que conlleva para las cosechas es esencial mnmente conocida como a altos costos y que produpara equilibrar las entradas y nios azules, causante de ce efectos severos al medio ambiente (Gustafson y salidas de nutrientes y por tanto la metahemoglobinaemia), Kreys, 2006). Los grandes para mantener o mejorar la fer- la misma que ha sido atriincrementos de las productilidad del suelo, para aumentar buido recientemente a la ciones de cereales en los la productividad agrcola y a su contaminacin bacteriana pases desarrollados entre vez, para evitar que los ecosiste- y no al exceso de NO3- en 1959 y 1990 estn directamas naturales y los hbitats vr- las aguas como originalmenmente relacionados con el te se supona (Lhirondel y genes se conviertan en tierras de aumento de la aplicacin de Lhirondel, 2002). cultivo. fertilizantes nitrogenados. Unido a los altos niveles de Es ampliamente conocido aplicacin de estos fertilizantes se encuentra que el exceso de NO3- en vegetales y alila emisin de xido nitroso (N2O) a la atmsmentos causado por la irrigacin con aguas fera, el deterioro de recursos no renovables, contaminadas con NO3- est estrechamente un desequilibrio en el ciclo global del N y la relacionado con la aparicin de cnceres inlixiviacin del nitrato a las aguas subterrneas testinales y gstricos (Leifert y Dorado, 2000). (Torres-Gutirrez, 2008). El uso de N sinttico (Beever et al., 2007) han reportado que los en los ltimos 40 aos ha aumentado de 3.5 nitratos en aguas superficiales aumentan la a 80 millones de toneladas, tanto en pases carga de N lo cual puede jugar un rol fundesarrollados como en vas de desarrollo, indamental en la eutrofizacin. Este proceso crementndose sus costos de produccin a contribuye a la degradacin de los recursos ms de 20 billones de USD anualmente (Bioecolgicos creando grandes concentraciones logical Nitrogen Fixation, 2001). En este pede algas y organismos en las aguas superfiriodo, el ciclo global del N se ha visto afectado ciales y su contaminacin. En la atmsfera el por el incremento irracional de la fijacin de N oxido de N (NO2) de manera particular puede mediante procesos industriales, es decir, meexacerbar varias enfermedades en los seres diante la aplicacin de fertilizantes nitrogenahumanos, tales como asma y enfermedades dos; pero su impacto ambiental an est por cardiovasculares. En este medio, el increcalcularse (Montas et al., 2004). mento de las concentraciones de (N2O) contribuye sustancialmente al calentamiento gloImplicaciones de la liberacin de N reactibal y consecuentemente a la salud humana vo en los ecosistemas (Graham y Vance, 2003). La falta de N reactivo en los agro-ecosistemas lleva al descenso de la fertilidad de los suelos, bajos rendimientos y escaso contenido Todos los ecosistemas emiten N2O y ms de 50% de las emisiones globales son considerados como naturales (tierras bajo vegetacin
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natural, ocanos, etc.). La agricultura justifica el 86% de las emisiones globales antropognicas de N2O (USEPA, 2006). De las emisiones N2O agrcolas, 44% est relacionado a la administracin y la aplicacin de abono animal; y 14% es asociado directamente con el uso de fertilizantes minerales (Mosier et al., 2004). Sin embargo, est claro que aumentando la aplicacin de fertilizantes nitrogenados aumentar las emisiones de este potente gas invernadero por los procesos naturales de desnitrificacin (Merino et al., 2001). Las proyecciones recientes indican que la demanda global de fertilizantes nitrogenados en el 2050 podran estar entre 107 y 171 t de N (Beever et al., 2007). De acuerdo con los cuatro escenarios reportados por la Evaluacin del Ecosistema del Milenio (2005) as como otros investigadores, corroboran que el consumo global del fertilizante nitrogenado en el 2050 se prev que est entre 110 y 140 t de N (Heffer y Prudhomme, 2006). Estos incrementos sin precedentes en la produccin agrcola para satisfacer los niveles de insumos calricos y proteicos para el abastecimiento a la gran poblacin mundial, propicia la bsqueda de nuevos mtodos de produccin agronmicamente y ecolgicamente sustentables. (Biological Nitrogen Fixation, 2001). La fijacin biolgica del nitrgeno (FBN) El N es un elemento necesario en la composicin de protenas, cidos nucleicos y otros componentes celulares, siendo as una molcula esencial para el crecimiento de todos los organismos. En la atmsfera el N ocupa aproximadamente el 80%, existiendo en la forma NN; sin embargo, el N2, debido al triple enlace entre los dos tomos de nitrgeno, que hace a la molcula casi inerte, no puede ser aprovechado por la mayora de las formas vivientes, sino slo por un pequeo grupo de microorganismos altamente especializados, que incluyen algas, bacterias y actinomicetos. Para ser utilizado en el crecimiento, este elemento debe ser primero reducido y luego fijado (combinado) en la forma de iones amonio (NH4+) o nitrato (NO3-). El proceso a travs del cual los microorganismos reducen el nitrgeno hasta una forma utilizable es conocido
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como Fijacin Biolgica del Nitrgeno (FBN), este proceso puede ser llevado a cabo por los microorganismos de vida libre o en simbiosis con plantas. La FBN es una fuente eficiente de N, las entradas anuales de N en la tierra a partir de la FBN como se plantea por (Weir, 2006) oscilan entre 139 y 175 millones de toneladas de N, de este total cerca del 30 % (45 millones de toneladas de N) se lleva a cabo mediante interacciones asociativas planta-bacteria y con el pasto permanente, mientras mediante asociaciones simbiticas (Rhizobium-leguminosas), en terrenos arables representa entre un 25 y un 30 % (entre 35 y 45 millones de toneladas de N). Aunque la exactitud de estas cifras puede ser cuestionada (Beever et al., 2007). Los organismos que pueden fijar N, es decir, convertir el gas N2 estable en la atmosfera en una forma til biolgicamente, pertenecen todos ellos a un grupo biolgico conocido como procariotas. Todos los organismos que reducen el N2 a NH4+ lo hacen con la ayuda de una enzima compleja, la nitrogenasa (Zahran, 1999). Un amplio espectro de microorganismos podra tener la capacidad de fijar N, sin embargo; solamente una proporcin pequea de las especies conocidas pueden hacerlo. Cerca de 87 especies en 2 gneros de archaea, 38 gneros de bacterias y 20 gneros de cianobacterias han sido identificados como diaztrofos u organismos que pueden fijar el N2 atmosfrico (Zahran y Afkar, 1995). La FBN resulta ser, entonces, una tecnologa limpia de produccin y una forma concreta de proteger el medio ambiente. Interacciones asociativas diazotrficas. Contribucin de las plantas no leguminosas a la FBN. El primer diaztrofo de vida libre fue reportado por Beijerinck en 1925 con el nombre de Spirillum lipoferum. Sin embargo, fue solamente cerca de medio siglo ms tarde, despus del descubrimiento de la asociacin Azotobacter paspali-Paspalum notatum altamente especfica y del descubrimiento de Spirillum lipoferum (ahora denominada Azospirillum) (Dbereiner et al., 1972), que los cientficos
aumentaron su inters por las bacterias diazotrficas asociadas con plantas graminceas. Debido al avance de los mtodos de identificacin de microorganismos y a la biologa molecular se ha reportado que varios gneros de bacterias son capaces de incluirse dentro de la denominacion de diaztrofos asociados ntimamente (endfitos) con las plantas, incluyendo entre otros generos; Acetobacter, Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter (Gluconacetobacter), Beijerinckia, Burkholderia, Enterobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Paenibacillus y Pseudomonas (Dobbelaere, 2002). Los esfuerzos para determinar las proporciones de fijacin del N en asociaciones naturales con las plantas han producido una amplia gama de resultados. En los ltimos 30 aos muchos estudios de inoculaciones, unido a las mediciones de reduccin de acetileno (ARA), el equilibrio del N y los experimentos de dilucin del istopo 15N, han sido realizados con bacterias asociadas a las races para determinar si las bacterias proporcionan cantidades significativas de N a las plantas cultivadas (James, 2000). La contribucin de las interacciones asociativas para la FBN global es una evidencia de la importancia econmica del cultivo de las plantas no leguminosas a nivel mundial; sin embargo, las respuestas de las cosechas variadas debido a limitaciones biticas y abiticas (Roesch et al., 2006). El arroz (Oryza sativa), el trigo (Triticum aestivum) y el maz (Zea mays) son las tres fuentes principales de alimentacin de la poblacin mundial. En una cosecha el arroz consume alrededor de 16 o 17 kg de N para producir 1 t (Sahrawat, 2000). Una cosecha de trigo necesita entre 26 y 28 kg de N para producir 1 t de grano (Angus, 2001). El maz requiere de 9 a 11 kg de N para producir 1 t de biomasa (Anuar et al., 1995). La mayora de los suelos carecen de suficiente N y las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados son esenciales para la obtencin de buenos rendimientos de tales cereales. Generalmente la urea es la fuente ms conveniente de N pero menos del 50% del producto aplicado es usada por las plantas (Halvorson et al., 2002). Esta baja eficiencia tiene su causa fundamentalmente en la
volatilizacin del NH4+, la desnitrificacin y las perdidas por escapes hacia la atmsfera (Bijay-Singh et al., 1995). Un determinado nmero de estudios realizados en el cultivo del arroz sugieren que del 20 al 25 % de las necesidades totales de N pueden derivarse de la fijacin asociativa. (James, 2000). Sherestha et al. (1996) realizaron dos experimentos comparando hasta setenta variedades de arroz en cada uno. En un experimento se estim que la cantidad de N derivado de la atmsfera oscilaba entre un 0 y un 20.2 %. En un segundo experimento se encontr que se fijo un equivalente de 16 a 70 % de N por hectrea. Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii comnmente observado en la simbiosis con la planta leguminosa puede colonizar races del arroz de manera endoftica, reemplazando entre un 25 y un 33 % de la cantidad de fertilizante nitrogenado recomendado para el arroz en condiciones de campo (Yanni et al., 1997). Los experimentos de campo demostraron que la inoculacin de esta bacteria aument el rendimiento medio del arroz en 3.8 t.ha-1 (Yanni et al., 2001). La inoculacin con Azospirillum brasilense puede incrementar el rendimiento del grano de trigo hasta un 30 % en condiciones de campo (Okon y Labandera-Gonzalez, 1994), pero solamente con proporciones de aplicacin ms bajas de fertilizante nitrogenado (5060 kg N ha-1). Con aplicaciones ms elevadas (110170 kg N ha-1), los efectos de la inoculacin de Azospirillum no fueron estadsticamente significativos (Dobbelaere et al., 2001). En el maz Garca de Salamone et al. (1996) sugirieron que algunos cultivares fijan hasta un 60 % de N despus de la inoculacin con cepas apropiadas de Azospirillum. Recientemente (Roesch et al., 2006) estudiaron la dinmica de las bacterias asociativas en dos genotipos de maz y la influencia del suministro de N los cuales reportaron que la dinmica y la distribucin de las bacterias asociativas de los gneros Azospirillum, Burkholderia y Acetobacter fueron afectados por el estado ontognico de la planta de maz y la pobla27
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cin bacteria fue afectada por la fertilizacin con N durante las primeras etapas del crecimiento de la planta. En la Universidad de Wisconsin: Estados Unidos Riggs et al., (2001) mostraron mediante pruebas de invernadero; usando suelos no esterilizados que los rendimientos del grano de maz aumentaron entre 36 y 48 % al inocular las semillas con B. cepacia AMMDR1. En las pruebas de campo esta bacteria fue capaz de incrementar el rendimiento del maz entre 5.9 y 6.3 %. De igual forma Rhizobium etli bv. phaseoli y Ensifer sp. (anteriormente Sinorhizobium sp., puede colonizar las races del maz e incrementar el peso seco de la planta (GutirrezZamora y Martnez-Romero, 2001), y a la vez incrementar los rendimientos del maz en 34 y 11 % en condiciones de invernadero y de campo, respectivamente. Estos resultados enfatizan la importancia de evaluar combinaciones de diferentes cepas de Rhizobium con genotipos de maz. Simbiosis de las bacterias que fijan N con las plantas. Las interacciones simbiticas de las bacterias con varios grupos de plantas son las mejores estudiadas para el suministro biolgico de N. En estas interacciones se encuentra una multiplicidad de bacterias con diferentes antecedentes fisiolgicos, incluyendo las proteobacterias Gram negativas como Rhizobium sp. y Burkholderia sp., Gram-positivas Frankia sp. (Benson y Silvester, 1993) y las cianobacterias filamentosas o unicelulares (Rai et al., 2000). Las caractersticas fisiolgicas y morfolgicas de estas simbiosis van desde comunidades extracelulares hasta interfaces altamente adaptadas dentro de rganos o compartimentos especiales. La simbiosis mutualista entre varias proteobacterias no fotosintticas del orden Rhizobiales con plantas de las ordenes Fabales, Curcurbitales y Rosales son las interacciones entre bacterias y plantas ms ampliamente estudiadas (Kneip et al., 2007). En esta revisin nos centramos en la interrelacin entre Rhizobium y plantas
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leguminosas por su contribucin sustancial al ciclo del N y a la FBN. La simbiosis Rhizobium-Leguminosa Un anlisis de la historia de la FBN muestra que el inters generalmente se ha enfocado en el sistema simbitico de las plantas leguminosas con las bacterias conocidas genricamente como especie rizobia, debido a que estas asociaciones han tenido el mayor impacto cuantitativo en el ciclo del N. Entre las leguminosas existe un gran potencial para la contribucin del N fijado a los ecosistemas (Tate, 1995). Hay aproximadamente 650 gneros y alrededor de 20 000 especies de leguminosas (Sprent, 1985), y solamente cerca del 20% (Sprent y Sprent, 1990) han sido estudiadas para la nodulacin y han mostrado tener la capacidad de fijar N2 atmosfrico. La FBN, en particular mediante la simbiosis Rhizobium-Leguminosa tiene un papel crucial en el aumento de la sostenibilidad de los rendimientos con mnimas entradas externas no renovables (Vance, 2001). La simbiosis entre las plantas de la familia Leguminosae y los procariticas se caracteriza tpicamente por la formacin de ndulos en la raz y parte del tallo que son inducidos y posteriormente invadidos por micro simbiontes especficos (Weidner et al., 2003). Weir (2006) reporta que entre ellas se encuentran el muy conocido grupo alfa-proteo bacterial de Rhizobiaceae que contiene los gneros Azorhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer, Mesorhizobium y Rhizobium; junto con otros grupos tales como Methylobacterium (Sy et al., 2001), Ochrobactrum, Phyllobacterium (Valverde et al., 2005) y Shinela (Lin et al., 2008) y miembros de las Beta proteo bacterias Burkholderia (Moulin et al., 2001) y Cupriavidus (Chen et al., 2001). El apoyo de la microscopia para examinar la simbiosis nodular ha ganado nueva importancia a la luz de estos descubrimientos y varios estudios han unido el enfoque visual con la caracterizacin molecular de los simbiontes (Elliott et al., 2007). La taxonoma rizobial actual tiene 5 gneros y 79 especies, la mayora de los cuales fueron descritos en la ltima d-
cada usando tcnicas de biologa molecular (Weir et al., 2006).
la capacidad de nodular el frejol comn en diferentes ambientes en Tnez, reportando que las cepas varan entre las regiones y los cultiAplicacin y contribucin practica de Intevares, con R. leguminosarum. Recientemenraccin Rhizobium-Leguminosa. te (Tajini et al., 2008) demostraron la efectiva combinacin Rhizobium etli y (R. tropici Los efectos cuantitativos de las interaccioCIAT899) en los genotipos del frejol comn. nes Rhizobium-leguminosa pueden medirse Fue evidente que las cepas nativas de rizoen trminos de cmo las bacterias responbia eran ms eficientes que la cepa CIAT899. den al genotipo del hospedero. Varios invesTodos estos resultados indican una estrecha tigadores han estudiado cmo la capacidad interaccin entre el genotipo del hospedero y de las cepas para competir por la ocupacin rizobia. Se supone que esta interaccin es el del ndulo es afectada por resultado de la coevolucin el genotipo del hospedero. Las interacciones simbiticas de entre las cepas de RhizoLa incapacidad de las celas bacterias con varios grupos bium y los genotipos del hospas introducidas que fijan de plantas son las mejores estu- pedero (Aguilar et al., 2004). el N para competir con las diadas por el suministro biolgi- En estudios en condiciones cepas propias del suelo por co de N. (un elemento necesario controladas, Granda Mora et la ocupacin del ndulo es en la composicin de protenas, al. (2010) reportan la variabiuna limitante importante en cidos, nucleicos y otros compo- lidad genotpica de diferenel desarrollo de los inoculannentes celulares). tes de Rhizobium (Snoeck tes aislados de Rhizobium et al., 2003). Cregan et al., provenientes de ndulos de (1989) encontraron efectos significativos en frejol comn en la zona central de Cuba. Los los genotipos de soya (Glycine max) sobre la resultados demostraron que todas las cepas competitividad de cepas de Bradyrhizobium fueron capaces de establecer adecuadas rejaponicum estrechamente relacionadas. Un laciones simbiticas con el macro simbionte, ejemplo de ello lo constituye la limitacin de observndose que muchas de estas cepas la nodulacin del genotipo de soya PI417566 superaron los parmetros de nodulacin (nucepa USDA 129 resultando en una baja ocumero de ndulos totales y peso fresco y seco pacin nodular mientras que al inocular este de los ndulos) en comparacin con la cepa mismo genotipo con las cepas USDA 123 o tipo de R. etli CNPAF512. con USDA 127 se obtuvieron buenos resultados en la nodulacin total. Sin embargo en La aplicacin de combinaciones de diaztrootro cultivar de soya, la cepa USDA 129 ocufos ha sido uno de los apartados de inters po ms del 87 % de los ndulos (Josephon para cientficos en todo el mundo, lo cual poet al., 1991) coinocularon dos cepas, KIM5 y tencia el efecto de los diaztrofos simbiticos. Viking-1, en 12 cultivares de frejol comn, miLas asociaciones bacteriales diazotrficas dieron la ocupacin porcentual del ndulo de contribuyen de manera sustancial a la FBN cada cepa para cada cultivar y encontraron en cosechas de no leguminosas importantes. una significativa interaccin cultivar por cepa. En las leguminosas la combinacin de PGPR De acuerdo con los primeros estudios reporcon diaztrofos simbiticos ejerce un martados por Amarger (1986), la fijacin del N decado efecto en los parmetros fisiolgicos y pende de la interaccin rizobia con el cultivar. fenotpicos. (Rodelas et al., 1999) reportaron Esto enfatiza la importancia de examinar la para el frejol blanco que las respuestas a la interaccin entre la diversidad de cepas natiinoculacin de Azotobacter y Azospirillum en vas de rizobia con un cultivar nuevo, adems combinacin con Rhizobium conduca a camde la influencia del genotipo de la planta en bios en el contenido total y/o la distribucin la nodulacin y la efectividad en una especie de macro y micro nutrientes (K, P, Ca, Mg, determinada. (Mhamdi et al., 2002) describieFe, B, Mn, Zn y Cu) cuando se comparaba ron la variabilidad de las cepas de rizobia con con plantas inoculadas solamente con RhiCentro de biotecnologa: E-mail: centrobiotecnologia@unl.edu.ec
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zobium. Torres-Gutirrez (2004, 2008) reporta el beneficio de la co-inoculacion de cepas de Azotobacter y Azospirillum conjuntamente con cepas tipo de Rhizobium etli y R. tropici. La combinacin de los diaztrofos logr estimular la nodulacin, componentes del rendimiento y el rendimiento agrcola de genotipos de frejol comn en comparacin con la inoculacin en solitario de Rhizobium y con la fertilizacin mineral, reduciendo las tasas de aplicacin de fertilizante e incrementando las producciones. Existen evidencias de algunos modos de accin para la estimulacin de PGPR en la simbiosis Rhizobium-leguminosa, pero el modo ms comnmente implicado es la estimulacin de crecimiento mediante la liberacin de la fitohormona inducida (cido indol-3-acetico) (Vessey y Buss, 2002). De esta forma la estimulacin de nodulacin es ms comnmente un efecto indirecto; las PGPR estimulan el crecimiento de la raz lo cual proporciona ms sitios para la infeccin y la nodulacin. Burdman et al. (2000) relacionaron la estimulacin mediada de Azospirillum brasilense en la nodulacin del frejol comn con una produccin incrementada de flavonoides por el hospedero de la leguminosa. Estos flavonoides son las seales qumicas iniciales segregadas por el hospedero de la legumbre para inducir genes Nod en rizobia y por tanto iniciar la simbiosis Rhizobium-leguminosa (Schultze y Kondorosi, 1998). Se reportan otras evidencias por Thilak et al. (2006) mostrando que PGPR unido al eficiente Rhizobium puede tambin afectar positivamente en el crecimiento y la fijacin del N en arveja. Recientemente Figueredo et al., (2007) reportaron la nodulacin mejorada y la fijacin del N en el frejol comn con la co-inoculacin de Rhizobium y varias cepas de Paenibacilus. En este estudio la coinoculacin con Rhizobium tropici (CIAT899) y Paenibacillus polymyxa (DSM 36) tuvieron concentraciones ms altas de legemoglobina, actividad de nitrogenasa y eficiencia de la fijacin de N2 y por tanto se formaron asociaciones de mayor eficiencia simbitica. CONCLUSIONES
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Los procesos naturales de FBN juegan un importante rol en la activacin de los sistemas agrcolas sustentables por su beneficio ambiental. El incremento de su aplicacin puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintticos con su consiguiente efecto benfico al ciclo del N, el calentamiento global y el saneamiento de las aguas subterrneas y superficiales. Estimular la aplicacin de microorganismos diazotrficos, ya sean de vida libre como simbiticos, traer consigo el incremento de las producciones agrcolas sin la utilizacin de elementos no renovables, disminucin de los costos de produccin y la reduccin de las emisiones de gases con efecto invernadero. REFERENCIAS Aguilar OM, Riva O and Peltzer E (2004). Analysis of Rhizobium etli and its symbiosis with wild Phaseolus vulgaris supports coevolution in centers of host diversification. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 1354813553. Amarger N (1986). Nodulation competitiveness among Rhizobium leguminosarum strains. Votr Pflanzenzuchtung 11:186 194. Angus JF (2001). Nitrogen supply and demand in Australian agriculture. Aus J Exp Agr 41: 277 288. Anuar AR, Shamsuddin ZH, Yaacob O (1995). Contribution of legume-N by nodulated groundnut for growth of maize on an acid soil. Soil Biol Biochem 27: 595601. Barbier B and Bergeron G (2001). Natural resource management in the hillsides of Honduras. International Food Policy Research Institute. ISBN 0-89629-125-1. pp. 123. Beever D, Brentrup F, Eveillard P, Fixen P, Heffer P, Herz B, Larson R and Pallire R (2007). Sustainable Management of the Nitrogen Cycle in Agriculture and Mitigation of Reactive Nitrogen Side Effects. Paris, France ISBN 2-9523139-1-1. pp. 53. Benson DR and Silvester WB (1993). Biology of Frankia Strains; actinomycete symbionts of actinorhizal plants. Microbiol Rev
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USO DE MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS Y SUSTANCIAS NATURALES COMO UNA ALTERNATIVA ECOLGICA EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN CULTIVOS
ngel Rolando Robles Carrin1 1. Centro de Biotecnologa, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falcon Espinosa La Argelia - PBX: 072547252 - Casilla Letra S E-mail: aroblescarrion@gmail.com ____________________________________________________________________________
ABSTRACT
This paper presents a literature review on the main applications of antagonistic microorganisms and natural substances to control crop diseases, with the goal of giving a technical and scientific overview of the current state of the use of these bio-fungicides in the field. First we review the concepts of biological control and of the various mechanisms of action (antagonism, antibiosis, competition, fungistasis, systemic acquired resistance and mycoparasitism) against the various diseases in plants. Secondly, we introduce antagonistic microorganisms and natural substances that are important in the control of plant diseases, some of which have been successfully tested as biofungicides. This review offers a glimpse of the great potential of these bioproducts in agriculture. Key words: antagonistic microorganisms, natural substances, mechanisms of action, plant diseases. ____________________________________________________________________________
INTRODUCCIN
En los ltimos aos el control biolgico de plagas y enfermedades en la agricultura ha adquirido gran importancia frente a los problemas fitosanitarios ocurridos por el uso indiscriminado de plaguicidas qumicos en la agricultura, lo cual ha trado como consecuencia severos problemas de contaminacin al medio ambiente y ha generado la resistencia de plagas y enfermedades, as como la presencia de nuevas especies de microorganismos fitopatgenos con un grado de afectacin ms virulento (Bravo et al. , 2006). La mayora de los microorganismos fitopatgenos tienen antagonistas biolgicos que se pueden emplear como estrategia de lucha en un programa de control biolgico. En los ltimos aos el empleo de bacterias y hongos antagonistas de enfermedades agrcolas ha cobrado una singular importancia, debido a que no solo actan contra un grupo determinado de microorganismos fitopatgenos (como lo hacen los plaguicidas qumicos), sino que se estn utilizando para un grupo muy amplio de microorganismos fitopatgenos (Prez, 2004; Mondino y Vero, 2006). Aunque el control biolgico no pretende reemplazar completamente los sistemas de control qumico, puede ser utilizado junto con otras tcnicas como parte de un sistema integrado de control y ha de ser puesto en prctica integrndolo con los mtodos y con las estra-
tegias de produccin existentes actualmente. El control biolgico depende de un funcionamiento efectivo del microorganismo antagonista apropiado para cada ecosistema particular planta-patgeno (Prez, 2004). Concepto de Control Biolgico Prez (2004), define el control biolgico como la utilizacin de microorganismos naturales o modificados, para reducir los efectos de organismos indeseables, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de los microorganismos beneficiosos para las plantas. Microorganismos antagonistas como agentes de biocontrol en enfermedades de las plantas. Varios tipos de microorganismos (hongos, bacterias y virus) se han descrito como agentes de control biolgico de enfermedades en cultivos. Prcticamente todas las plagas y enfermedades son afectadas en alguna medida por organismos antagonistas. En muchos casos estos entes biolgicos representan el factor ms importante en la regulacin de las poblaciones de microorganismos fitopatgenos en la naturaleza (Prez, 2004; Ezziyyani et al., 2006; Mondino y Vero, 2006). Mecanismos de accin En la naturaleza existe una continua interaccin entre los microorganismos fitopat35
RESUMEN
En este trabajo se presenta una revisin bibliogrfica sobre las principales aplicaciones de microorganismos antagonistas y sustancias naturales en el control de enfermedades en los cultivos, con el objetivo de tener una visin ms tcnica y cientfica del estado actual de uso de estos biofungicidas en este campo. En primer lugar se revisa el concepto de control biolgico y los diversos mecanismos de accin (Antagonismo, Antibiosis, Competencia, Fungistasis, Resistencia sistmica adquirida, y Micoparasitismo) con que actan frente a las diversas enfermedades en plantas. En segundo trmino se presentan los microorganismos antagonistas y sustancias naturales ms importantes en el control de enfermedades en plantas, algunos de los cuales han sido probados como biofungicidas satisfactoriamente. La revisin realizada permite vislumbrar un gran potencial de aplicacin de estos bioproductos en el rea agrcola. Palabras claves: microorganismos antagonistas, sustancias naturales, mecanismos de accin, enfermedades de plantas. ____________________________________________________________________________
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genos y sus antagonistas, de forma tal que ellos ayudan a la regulacin natural de las enfermedades. En condiciones naturales los microorganismos estn en una proporcin dinmica en la superficie de las plantas. No es fcil establecer con precisin los mecanismos que actan en las interacciones entre los microorganismos antagonistas y los microorganismos fitopatgenos sobre la planta.
cimiento de las clulas de los microorganismos fitopatgenos. Competencia
rrespondientes genes de avirulencia (Avr) de los patgenos. Algunos de los procesos bioqumicos y fisiolgicos asociados con la resistencia gen por gen son la generacin de especies reactivas de oxgeno, la produccin de oxido ntrico, la produccin de compuestos antimicrobianos, la peroxidacin de lpidos, el flujo de iones, y la induccin de genes de defensa, entre otros. (Prez, 2004; Mondino y Vero, 2006). Micoparasitismo Es la accin antagnica entre dos hongos, el uno (hiperparsito) parasita al otro (micoparsito) a travs de una sntesis de exoenzimas hidrolticas para facilitar la degradacin de la pared celular del hospedante. Un antagonista puede utilizar a un hongo como fuente de alimento. Basado en el micoparasitismo se dividen en dos grupos: biotrpicos, tienen un rango restringido de hospedantes, y necrotrpicos, matan a la clula antes o despus de la invasin, excretan sustancias txicas y utilizan sus nutrientes (Michel-Aceves, 2001; Prez, 2004). Microorganismos antagonistas como controladores biolgicos de enfermedades Trichoderma sp. Varias investigaciones han demostrado que el control biolgico a travs del uso de hongos benficos como Trichoderma es una alternativa potencial respecto al uso de fungicidas o fumigantes en la agricultura (Paredes-Escalante et al., 2009). Agrios (2005), afirma que el gnero Trichoderma comprende un conjunto de especies sin fase sexual evidente (anamorfo). Pertenece a la Subdivisin Deuteromycotina; Clase Hyphomycetes; Orden Hyphales (Moniliales) y Familia Moniliaceae. Hasta el momento no se conoce que dicho hongo sea patgeno de ninguna planta, exceptuando a T. viride. Sin embargo es capaz de controlar e hiperparasitar muchos hongos, nematodos y otros fitopatgenos, que atacan y destruyen los cultivos
La competencia surge cuando al menos dos organismos requieren para su funcionamiento del mismo alimento. El consumo de uno reduce la cantidad disponible del otro; al final se impone uno de ellos. La competencia por En general los antagonistas tienen varios monutrientes y espacio dentro de su nicho ecodos de accin y la combinacin de estos es lgico se realiza en la superficie de la hoja, importante para poder elegir un antagonista es el principal mecanismo involucrado en el ideal. Si estos poseen divercontrol de bacterias fitopatsos modos de accin, se reVarios tipos de microorganis- genas; en el caso de hongos ducen los riesgos de que los mos (hongos, bacterias y virus) es variable. La competencia microorganismos fitopatgees un modo de accin indise han descrito como agentes de nos adquieran resistencia, recto (Michel-Aceves, 2001; control biolgico de enfermedalo cual se logra mediante el Prez, 2004; Mondino y des en cultivos. uso de combinaciones de Vero, 2006). antagonistas con diferente modo de accin. As, se han descrito varios Fungistasis mecanismos mediante los cuales los antagonistas ejercen su accin para controlar el Es la imposicin por parte del controlador desarrollo de microorganismos fitopatgenos biolgico de dormancia especialmente de es(Michel-Aceves, 2001; Prez, 2004; Mondino poras fungales por medio de la limitacin de y Vero, 2006; Ezziyyani et al., 2006). nutrientes. La ms comn de esta, es la relacionada con la disponibilidad de elementos Antagonismo nutritivos, el ms estudiado hasta el momento el carbono (Prez, 2004). Es una interaccin entre microorganismos Resistencia sistmica adquirida donde uno interfiere con el otro, es decir causa la prdida o la actividad de uno de ellos. Consiste en una o varias molculas excretaEsta es la base sobre la que se sustenta el das por los microorganismos controladores verdadero control biolgico de microorgabiologicos con la capacidad de inducir aunismos fitopatgenos en las plantas (Prez, todefensas en las plantas frente a la accin 2004). del cualquier microorganismo fitopatgeno. Antibiosis Existen dos tipos de resistencia: la constitutiva, propia de la planta y que se expresa en Michel-Aceves (2001) y Prez (2004) definen cualquier momento, y la inducida, expresada a la antibiosis como un proceso de interaccin solo ante determinados estmulos. Las inteentre organismos en el cual uno o ms metaracciones planta-patgeno son de dos tipos: bolitos son excretados (enzimas hidrolticas, compatible, cuando ocurre la enfermedad, e metabolitos secundarios voltiles y pequeas incompatible, cuando la planta resiste. molculas txicas) por un organismo y tienen efecto daino sobre uno o ms organismos, De ah se sustenta la teora del gen para el normalmente actan en bajas concentraciogen, la cual dice que la resistencia de las nes. Adems, los antibiticos y otros producplantas a las enfermedades frecuentemente tos txicos que son voltiles (como el cianuro resulta de la interaccin especfica de genes de hidrgeno), son capaces de afectar el crede resistencia (R) de las plantas con los co36
(Cueva, 2007). Actualmente se conoce las siguientes especies del gnero Trichoderma: T. aggressivum, T. lbum, T. arundinaceum, T. asperellum, T. atroviride, T. aureoviride, T. brevicompactum, T. citrinoviride, T. citrinoviridex, T. crassum, T. erinaceum, T. fasciculatum, T. fertile, T. gamsii, T. ghanense, T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. koningiopsis, T. longibrachiatum, T. lignorum, T. minutisporum, T. oblongisporum, T. ovalisporum, T. pleuroticola, T. polysporum, T. pseudokoningii, T. pubescens, T. reesei, T. saturnisporum, T. spirale, T. strictipile, T. strigosum, T. stromaticum, T. tomentosum, T. virens, T. viride, T. viridescens. (Michel-Aceves, 2001; Cruz, 2007; Cobos, 2010; Samuels et al., 2010). El gnero Trichoderma es un grupo de hongos aislados del suelo que se reproducen asexualmente. Adems, es un hongo filamentoso anamrfico, hetertrofo, aerobio facultativo, con una pared celular compuesta de quitina, de rpido crecimiento. De conidiforo hialino muy ramificado no verticilado, filides individuales o en grupos, conidios hialinos de una clula, ovoides, nacidos en pequeos racimos terminales. Muchas cepas crecen eficientemente en medios slidos o lquidos y en un amplio rango de temperaturas, adems son relativamente tolerantes a humedades bajas y tienden a crecer en suelos cidos (Michel-Aceves, 2001; Cruz, 2007). Los mecanismos de accin antagonista con que acta frente a los hongos fitopatgenos son: competencia por espacio y nutrientes, micoparasitismo, antibiosis, la secrecin de enzimas y la produccin de compuestos inhibidores (Infante et al., 2009). Ezziyyani et al. (2004) manifiestan que T. harzianum controla a Phytophthora capsici, agente causal de la podredumbre de pimiento, aumentando los niveles de enzimas hidrolticas -1,3-glucanasa (lisis enzimtica), ejerciendo una mayor competencia por espacio y nutrientes e interacciona directamente con el microorganismo fitopatgeno (micoparasitismo), todo lo cual juega un rol importante en la reduccin y destruccin del microorganismo fitopatgeno. Adems, los gneros de T.
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harzianum y longibrachiatum han demostrado efectividad al reducir in vitro hasta un 65 % las enfermedades causadas por Alternaria solani Sorauer y Phytophthora infestans Mont de Bary en tomate. Tambin se ha demostrado que las especies del gnero Trichoderma controlan una amplia gama de hongos patogenos y dentro de ellos se encuentran los hongos fitopatgenos, tales como: Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Paracercospora fijiensis, Rhyzopus stolonifer, Mucor spp., Penicillium digitatum, Aspergillus niger y Pythium sp., Alternaria sp., entre otros (Michel-Aceves et al., 2008; Cholango, 2009; Gudez et al., 2009; Guilcapi, 2009; Infante et al., 2009).
de diversas enzimas hidrolticas que degradan la pared celular de los microorganismo fitopatgenos, produccin de siderforos (los producidos por estas bacterias tienen mayor afinidad por compuestos de hierro) y el incremento de la capacidad de respuesta sistmica de la planta frente a los microorganismo fitopatgenos. Dentro de este grupo se puede mencionar a las Pseudomonas (aeruginosa, fluorescens, putida), Bacillus y Burkholderia, que son las ms usadas en el control de enfermedades en plantas (Mondino y Vero, 2006; Gato, 2006; Rodrguez et al., 2009). Bacterias del gnero Pseudomonas
de siderforos, la antibiosis y la induccin de resistencia a la planta, mediante la produccin de cido saliclico, el cual acta como una molcula de sealizacin que activa la resistencia sistmica inducida (RSI) (Gato, 2006; Rodrguez et al., 2009). La especie P. aeruginosa fue aislada por primera vez de muestras ambientales. Debido a que las colonias son pigmentadas, tiene el color caracterstico de azul-verdoso hidrosoluble debido a la produccin de pigmentos. Adems, es un bacilo Gram negativo aerobio, muy verstil metablicamente, pudiendo utilizar ms de 80 compuestos orgnicos como fuentes de carbono y energa. Es oxidasa positiva y puede crecer a temperaturas superiores a 42 C. Dicha bacteria produce toxinas como la piocianina, puede colonizar una amplia variedad de cultivos y ser antagonista de diversas enfermedades fngicas (Gato, 2006; Ruiz, 2007). Bacterias del gnero Bacillus El gnero Bacillus se caracteriza por ser bacterias Gram positivas, no patognicas, con propiedades antagonistas, son de forma bacilar, aerobias estrictas o anaerobias facultativas, en condiciones estresantes forman una endospora que es termorresistente a los factores fsicos (desecacin, radiacin, cidos y desinfectantes qumicos), es decir tiene la capacidad de formar esporas que sobreviven y permanecen metablicamente activas bajo condiciones adversas. (Lisboa, 2003; Chaves, 2007; Rodrguez y Martn, 2009). Muchas especies producen enzimas hidroflicas extracelulares que descomponen los polisacridos, cidos nucleicos y lpidos, permitiendo que el organismo emplee estos productos como fuentes de carbono y donadores de electrones. Tambin producen antibiticos (bacitracina, polimixina, tirocidina, gramicidina y circulina), lipopptidos que actan como biosurfactantes y solubilizadores de fosfatos, son buenas secretoras de protenas y metabolitos, fciles de cultivar y altamente eficientes para el control de plagas y enfermedades. Los mecanismos de accin de Bacillus como antagonista de enfermedades fngicas y bac-
terianas son: competencia por espacio y nutrientes, antibiosis, induccin de resistencia, y promotores del crecimiento de las plantas (Chaves, 2007; Rodrguez y Martn, 2009). Bacterias del gnero Burkholderia El gnero Burkholderia est compuesto por: bacilos rectos; Gram negativos; oxidasa y catalasa positivos; con una proporcin de G+C que oscila entre el 59 y el 69,5 %. Son bacterias mviles con un flagelo polar nico o bien con un penacho de flagelos polares segn las especies. Tambin son mesfilos y no esporulados. Su metabolismo es aerobio y muy verstil. Como sustancia de reserva utilizan el polihidroxibutirato (Stoyanova et al., 2007; Parra, 2009). Burkholderia cepacia fue descubierta por Walter Burkholder en 1949 en las catfilas de cebolla y en su epidermis radicular. La identificacin y clasificacin de la B. cepacia es extremadamente complicada; se conoce ahora como un complejo Burkholderia cepacia y est compuesto por al menos 9 especies distintas que constituyen los denominados genomovars o genotipos: B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. vietnamienses, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina y B. pyrrocinia; con la excepcin de B. mallei y B. pseudomallei, las que son patgenas de animales y humanos. El gnero Burkholderia ecolgicamente es saprfito, es decir que interviene en el reciclaje de materia orgnica, adems es uno de los gneros bacterianos utilizados para biorremediacin de herbicidas y plaguicidas recalcitrantes, como agentes de control biolgico de hongos fitopatgenos y para promover el crecimiento de las plantas (Stoyanova et al., 2007; Parra, 2009). Parra et al., (2009) y Trujillo et al., (2007) quienes exponen la actividad antifngica de B. cepacia aislada del maz amarillo, lograron inhibir la esporulacin de los hongos como F. solani, F. moniliforme, F. oxysporum, Aspergillus niger, Penicillium expansum, A. alternata y Curvularia sp., adems indican que esta bacteria produce sustancias qumicas quinolisidnicas de naturaleza antibitica, y antibiticos
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Las rizobacterias del gnero Pseudomonas Bacterias como controladores biolgicos han sido estudiadas como importantes agende enfermedades tes de biocontrol por su capacidad de inhibir el crecimiento de ciertos microorganismos Las bacterias forman parte de la gran cantidad fitopatgenos, como bacterias, hongos, nede microorganismos biolgicos que existen matodos y virus, los cuales pueden llegar a como agentes de control de enfermedades reducir considerablemente la produccin de fngicas y bacterianas, tanto en la parte acultivos. Estos organismos ejercen ciertos rea como en la raz de las plantas hospedemecanismos de accin antagonista que invoras, y estn presentes en la lucran la produccin de comrizosfera, adems favorecen Las bacterias forman parte de la puestos bacterianos como: el crecimiento y desarrollo gran cantidad de microorganis- siderforos, cido cianhdride las plantas (Mondino y mos biolgicos que existen como co y antibitico. Adems, se Vero, 2006). A este grupo de agentes de control de enferme- ha comprobado que indubacterias antagonistas de cen un sistema de resistendades fngicas y bacterianas, enfermedades se les denocia en las plantas que hace tanto en la parte area como en que puedan tolerar el ataque mina PGPB (Plant Growth la raz de las plantas hospederas, de diversos microorganisPromoting Bacteria), es dey estn presentes en la rizosfera, mo fitopatgenos del suelo cir aquellas asociadas a las adems favorecen el crecimiento (Chaves, 2007). P. fluoresplantas que promueven el crecimiento de ellas. Dentro y desarrollo de las plantas. cens es un cocobacilo Gram de los mecanismos para la negativo que se encuentra promocin del crecimiento vegetal podemos como saprfito en el suelo y es ampliamenencontrar: mecanismos directos, son aquellos te conocido por ser una PGPR. Abunda en la en donde los microorganismos actan sobre superficie de las races, y es verstil en su la planta, dentro de ellos podemos encontrar a metabolismo, adems puede utilizar varios los promotores del crecimiento vegetal (auxisustratos producidos por ellas mismas, y no nas, giberelinas y citoquininas), y mecanismos establecen una relacin simbitica con la indirectos, aquellos en donde el microorganisplanta. Entre sus mecanismos de accin se mo es capaz de inhibir diferentes microorgaencuentran el aumento de la toma de agua nismo fitopatgenos (hongos y bacterias) que y nutrientes por la planta, la solubilizacin de interfieren con el desarrollo de la planta y son fosfatos, la produccin de reguladores del neutralizados por diversos mecanismos como: crecimiento vegetal y el control biolgico de competencia por espacio o nutrientes, producmicroorganismo fitopatgenos, la produccin cin de metabolitos y antibiticos, secrecin
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como: A. cepacidina, B. xilocandina y pirrolnitrina, capaces de inhibir el desarrollo de diversos hongos fitopatgenos. En Venezuela se ha utilizado la bacteria B. cepacia en control de enfermedades en especies forestales como la mancha azul en Pinus caribae causada por Lasiodiplodia theobromae; tambin muchas especies del complejo B. cepacia se han utilizado en biorremediacin ambiental por su capacidad de degradar plaguicidas recalcitrantes. (Alemn et al., 2003, Bentez y McSpadden, 2008). Un aspecto importante a sealar sobre esta bacteria es: la capacidad de inhibir a hongos entomopatgenos y a antagonistas como Beauveria bassiana y Trichoderma harzianum, por lo que se debe tener cuidado si se usa en combinacin para un programa de Manejo Integrado de Plagas. (Santos et al., 2004; Parra, 2009). Sustancias naturales: Quitosana La Quitosana es un producto obtenido de la desacetilacin alcalina de la quitina, que es el principal componente del exoesqueleto de crustceos como el camarn y el cangrejo. Las propiedades antimicrobianas de la Quitosana eran conocidas por el hombre desde la antigedad, por lo cual la usaban como cicatrizante de heridas. El uso en la agricultura comenz su auge en la dcada de los setenta, aunque actualmente se siguen descubriendo otros usos de este compuesto (Lrez, 2008; Porras et al., 2009). Son muchos los resultados exitosos de la utilizacin de Quitosana, as podemos mencionar los experimentos de Snchez-Domnguez et al., (2007) quienes estudiaron el efecto in vitro de Quitosana en el desarrollo y morfologa de Alternaria alternata en tomate, y obtuvieron reduccin del grado de inhibicin y crecimiento de este hongo en un 50,6 %. La Quitosana en los ltimos aos se ha demostrado tener un efecto negativo contra diversos hongos fitopatgenos. Esto depender del grado de polimerizacin, de acetilacin, naturaleza del hospedante, composicin de los nutrientes, condiciones del medio ambiente y perodo de incubacin; adems, mientras menor sea el grado de polimerizacin de la Quitosana menor ser el nmero de especies
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de hongos que controle (Porras et al., 2009). Lrez (2008) y Fernndez (2010) reportan que la Quitosana tiene diversas propiedades como: actividad antibacteriana (controla un gran nmero de bacterias Gram negativas mediante la interaccin electrosttica con diferente grado de acetilacin), actividad antifngica (controla las enfermedades como: Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Phytophthora capsici, Pythium debaryanum y Sclerotium rolfsii) y actividad antiviral (una solucin acuosa 0,1 % de Quitosana controla completamente la infeccin en hojas de frijoles producida por el virus del mosaico de la alfalfa (AMV), el virus de la necrosis del tabaco (TMV), virus del no crecimiento del man, virus del mosaico del pepino y el virus X de la papa. Asimismo se ha demostrado la inhibicin del viroide que afecta a las solanceas, denominado potato spindle tuber viroid. Adems de ser antagonista de diversos microorganismo fitopatgenos en plantas, se ha sealado que Quitosana estimula el crecimiento de la planta e induce a la resistencia frente al ataque de microorganismo fitopatgenos (Lrez, 2008; Rodrguez-Pedroso et al., 2006). CONCLUSIONES La presencia de residuos txicos en los alimentos debido a la utilizacin de productos qumicos en la agricultura, hace que los microorganismos antagonistas como: Trichoderma sp., Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, Bacillus y Burkholderia. A pesar que el uso de los biocontroladores es promisorio, es necesario estudiar en detalle los patosistemas desde el punto de vista molecular para hacer una mejor proyeccin del controlador que seria efectivo en cada caso. Por ello el Centro de Biotecnologa de la Universidad Nacional de Loja, est desarrollando el proyecto titulado ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PATGENO-PATGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO
(Vasconcellea helbornii var. pentagona), con el objetivo de estudiar este patosistema entre microorganismos desde el punto de vista molecular, para ello se utilizar tcnicas de Secuencia Genmica de Nueva Generacin, para mayor informacin referirse a la seccin de resumen proyectos de investigacin en la pagina 76. BIBLIOGRAFA Agrios G. (2005): Plant Pathology. (5th Ed.). Publishing, Elsevier Academic Press Publications. United States of America. 453 - 635 pp. Alemn Ingrist; Snchez J.; Sealey M.; Otoniel J. y Lpez G. (2003): Empleo de una cepa de Burkholderia cepacia en el control de la mancha azul en la madera de pino caribe (Pinus caribaea). Maracaibo, Venezuela. Revista, Ciencia. 11(1). 39 46 pp. Bentez Mara y McSpadden B. (2008): Aplicacin de perfiles moleculares de la comunidad microbiana para la identificacin de microorganismos asociados a la supresin de enfermedades del suelo. Quito, Ecuador. Trabajo presentado para XI Congreso Ecuatoriano de la Ciencia del Suelo. 1-10 pp. Bravo Alejandra; Ibarra J.; Mara Cristina del Rincn Castro; Galindo E.; Patio M.; Serrano L.; Garca R.; Pereyra Alfrez B.; Andrea Alczar Pizaa; Luna Olvera H.; Galn Wong L.; Liliana Pardo; Muoz Garay C.; Isabel Gmez y Sobern M. (2006): Los microorganismos en el control de insectos y patgenos. Cuernavaca, Mxico. Revista, Latinoamericana de Microbiologa. 48(2). 113 -120 pp. Chaves Mndez Nancy Patricia (2007): Utilizacin de bacterias y hongos endofticos para el control biolgico del nematodo barrenador Radopholus similis (Cobb) Thorn. Tesis presentada en opcin al Ttulo Acadmico de Magister Scientiae en Agricultura Ecolgica. Centro Agronmico Tropical de Investigacin y Enseanza (CATIE). Turrialba, Costa Rica. 85 pp. Cholango Martnez Luisa Paulina (2009):
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MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIN LYCOPERSICON

Mara Natalia Morales Palacio1 1. Centro de Biotecnologa, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falcon Espinosa La Argelia - PBX: 072547252 - Casilla Letra S E-mail: nataliamorales88@yahoo.es ____________________________________________________________________________
Palabras clave: Tomate, Solanum, Lycopersicon, Filogenie, Gentica, Marcador, Especie, Silvestre ____________________________________________________________________________
ABSTRACT
Tomato (Solanum lycopersicum) is the most important vegetable around the world and it has a very high economic value. This situation has caused too much interest for investigation in scientist around the entire. Molecular genetics has had a significant impact for the estimation of genetic diversity, in the phylogeny studies from wild species of Lycopersicon section, and from generation of molecular markers which have been used by geneticist in order to be attended from the genetic improvement of the tomatoes cultivars. Has been generated for tomato studies, a long information for many of the mapped cDNA markers, which have been joined into the General Index in Tomato Institute for Genomic Research, has made the mapping of cDNA markers, multilocus tests in order to determine the effects of the subdivision of closely related species, has been designed specific primers based on published data about cDNA or genomic DNA sequences, the amplified products were sequenced and generated new sequences, and joined in the Gene Bank Database. In this moment, the entire scientific community has enough information about the genome, as well as the level of relationships between genetically related wild species belonging to the section Lycopersicon. Key words: Tomato, Solanum, Lycopersicon, Phylogeny, Genetics, Marker, Wild ____________________________________________________________________________ PROBLEMTICA El tomate rin (Solanum lycopersicum), es la hortaliza ms difundida en todo el mundo y la de mayor valor econmico, por lo que su cultivo, produccin y comercio, se han incrementado en los ltimos aos; por ello, el principal objetivo de los mejoradores ha sido el de obtener variedades hbridas mejoradas que presenten resistencia a factores biticos y abiticos, mayor productividad y mejor calidad del fruto. En el Ecuador, el tomate se cultiva en dos regiones. En el litoral se cultiva principalmente el tomate industrial, registrndose en el 2008 un total de 1023 ha cultivadas y una produccin de 15323 Tm; mientras que en los valles clidos de la regin interandina se cultiva mayoritariamente tomate de mesa, con 1586 ha cultivadas y una produccin de 35151 Tm en ese mismo ao. El total de tomate producido a nivel nacional en el 2008 fue 2610 Ha cultivadas, con una produccin de 50551 Tm [1]. En el extremo Sur oriental de la regin Interandina (provincia de Loja), su cultivo constituye una importante forma de ingresos para pequeos y medianos productores, sin embargo a nivel regional su produccin es muy deficiente y se ha ido decrementando paulatinamente, de manera que en el ao 2004 aqu se produca el 34,8% de tomate de la regin y en el ao 2008 solamente el 4,7%. [1] La baja productividad de ste agroecosistema, se debe principalmente a que con el inicio de la explotacin petrolera en el Amazonas, el Ecuador experiment un auge econmico que aceler la modernizacin de su agricultura en la zona costera del Pacfico, basada en el alto uso de insumos. [2] La agricultura tradicional de la serrana, tambin fue influenciada por esta tendencia de modernizacin, donde los pequeos agricultores de la Sierra producen productos para el autoconsumo y el mercado local, con el empleo exagerado de agroqumicos, particularmente, con hortalizas econmicamente rentables como el tomate; por lo que , el fcil acceso a los plaguicidas, la poca capacitacin sobre su uso seguro y el uso de variedades mejoradas para las condiciones de los pases donde se producen,
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RESUMEN
La hortaliza ms difundida en todo el mundo y la de mayor valor econmico es el tomate rin (Solanum lycopersicum). Esta situacin ha despertado desde hace mas de una dcada, enorme inters en cientficos de todo el planeta. La gentica molecular ha tenido un impacto significativo en la estimacin de su diversidad gentica, en la determinacin de la filogenie existente entre las diferentes especies silvestres de la seccin Lycopersicon, as como en la generacin de marcadores moleculares que han asistido a los genetistas, en la mejora gentica de los cultivos comerciales. Ha sido generada para su estudio, abundante informacin para muchos de los marcadores de ADNc mapeados, los cuales han sido integrados dentro de un extenso consensus en el Tomatoe Gene Index en el Insitute for Genomic Research, se ha realizado el mapeo de marcadores de ADNc, pruebas multilocus para determinar los efectos de la subdivisin de especies estrechamente emparentadas, se han diseado primers especficos basados en datos publicados sobre ADNc o secuencias de ADN genmico, los productos amplificados han sido secuenciados y las nuevas secuencias generadas depositadas en la base de datos del Gene Bank, de manera que al momento la comunidad cientfica cuenta con basta informacin sobre el genoma, as como con el grado de filiacin de las diferentes especies silvestres relacionadas genticamente pertenecientes a la seccin Lycopersicon.
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ha provocado la difusin del uso incorrecto de estos productos en Ecuador, adems del efecto negativo en la calidad de los frutos, la salud de los consumidores y productores el medio ambiente y los sistemas agrcolas. INTRODUCCIN
El Ecuador es mundialmente conocido por su flora y fauna nicas y posee una enorme variabilidad gentica en varias especies de As por ejemplo, un estudio publicado en inters econmico y social para el pas. Nu1996, mediante el empleo de cerca de 2000 merosas especies silvestres de la seccin secuencias de especies de solanceas reLycopersicon en las cuales reside toda la gistradas en el EMBL y la base de datos del variabilidad gentica disponible y que estn Banco de Genes, se encontraron 220 regioemparentadas a las variedanes microsatlite STRs des cultivadas de tomate, se Un estudio publicado en 1996, (Short Tndem Repeats) en encuentran abundantemenmediante el empleo de cerca la familia Solanaceae y 80 te distribuidas en las estride 2000 secuencias de especies regiones microsatlite en el baciones de los Andes del de solanceas registradas en el gnero Lycopersicon. Las Ecuador: (Solanum pimpiEMBL, y la base de datos del repeticiones dinucleotdicas nellifolium, S. habrochaites, fueron encontradas en reBanco de Genes, se encontraron S. lycopersicum var. ceragiones no codificantes del 220 regiones microsatlite en la siforme, S. cheesmanii, S. ADN, mientras que las repefamilia Solanaceae y 80 regio- ticiones trinucleotdicas fuechmielewskii, S. chilense, S. nes microsatlite en el gnero ron predominantemente enneorickii, S. peruvianum, S. [3] Lycopersicon. pennellii). contradas en los exones del ADN. De las 80 regiones miEl enorme inters econmico mundial sobre crosatlite del gnero Lycopersicon, escogieestas especies ha ocasionado que se hayan ron 44 loci, identificando 36 pares de primers potencialmente utilizado para el mejoramienque mostraron fragmentos legibles o grupos to gentico de las variedades cultivadas, por de fragmentos en cultivares de L. esculentum poseer caractersticas interesantes para el y otras especies de Lycopersicon. Encontramejoramiento tales como tolerancia a la huron 29 bandas polimrficas para 4 especies medad, resistencia a hongos e insectos, pode Lycopersicon y 10 pares de primer resuldredumbre de las races, mejora del color de taron polimrficos en 7 cultivares de tomate. los frutos, tolerancia a la sal, alto contenido de azcar, tolerancia al fro y heladas, resisEl porcentaje de loci polimrficos entre cultitencia a la sequa; alto contenido de licopeno, vares vari desde el 6% en los loci ms peetc. [3] queos, hasta 60% en los grupos con nmero Sin lugar a dudas, en las ltimas dcadas la de repeticiones mayores, sin embargo entre gentica molecular ha tenido un impacto sigespecies, encontraron hasta un 83% de ponificativo en la estimacin de la diversidad gelimorfismo. En el trabajo se reportan entre ntica de las especies, en la determinacin de 2 y 4 formas allicas diferentes, aunque en la filiacin gentica, en la bsqueda de genes unos pocos casos encontraron ms de 8 forresponsables de caracteres agronmicos de mas allicas distintas; por lo que, mediante el inters; as como, en la generacin de marcaestudio se presentan loci microsatlites tiles dores moleculares que han permitido asistir para distinguir entre cultivares de tomate que a los genetistas, en la mejora gentica de los se encuentren genticamente estrechamente cultivos comerciales. El tomate rin, siendo relacionados unos con otros. [4]
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una hortaliza de consumo masivo, posible de cultivar prcticamente en todos los pases del mundo y casi en todas las latitudes, justifica el hecho de que haya despertado profundo inters en cientficos de todo el mundo, quienes han generado informacin en el campo molecular sobre las especies silvestres, las cuales constituyen el pool de genes para el mejoramiento de los cultivares comerciales.
En un estudio posterior, publicado en el 2005, otros autores publican los resultados de un estudio multilocus con el cual evalan los patrones de polimorfismo de nucletidos dentro y entre tres especies autoincompatibles de tomates silvestres (Clado Lycopersicon) estrechamente relacionadas. Basados en los datos de secuencias de ADN para 13 loci nucleares, encontraron que la especiacin ocurri bajo un flujo de genes residuales, lo que implica a la seleccin natural, como una de las fuerzas de la evolucin de conducir a la diversificacin de los linajes de tomate. [5] Las relaciones genticas existentes entre las diferentes especies silvestres relacionadas con el tomate cultivado haban sido hasta el momento estudiadas por diversas tcnicas como los RFLPs (restriction fragment length polymorphisms), ADN mitocondrial, ADN nuclear y cloroplstico; regiones microsatlites, isoenzimas, ITS (secuencias de genes de transcritos espaciadores internos) o de ADN ribosmico nuclear, SNPs (single copy nuclear polymorphism), GBSSI (granule-bound Starch Synthase gene), datos morfolgicos, etc. En el 2005, se publican los resultados de un estudio en el que se emplean marcadores de tipo AFLPs, pero que adems compara los resultados obtenidos, con aquellos generados previamente por diferentes tcnicas. El estudio considera 10 especies de tomate silvestre, incluyendo el recientemente descrito en ese entonces S. galapagense, con una concentracin en la mayora de especies variables y distribuidas de S. peruvianum. Los datos generados mediante AFLPs, resultan largamente concordantes con aquellos generados con el GBSSI y los datos morfolgicos; y, en general apoyan los resultados publicados por C.M. Rick; sin embargo, demuestran la distinta naturaleza de las poblaciones del norte y el sur del Per (S. peruvianum) o sugieren que la taxonoma necesita una revisin. Solanum ochranthum es mantenido como hermano de las especies silvestres de tomate y S. habrochaites y S. pennellii se ubican en el clado del tomate. [6]
Posterior al trabajo antes descrito y durante el mismo ao, se reportan dos nuevas especies de tomate silvestre (Solanum arcanum y S. huaylasense) segregadas de Solanum peruvianum. Estas dos especies se ubican en el clado con otros dos segregantes de S. peruvianum (S. peruvianum sensu stricto y S. corneliomulleri) y junto a la morfolgicamente similar (S. chilense). En la publicacin adems presentan una lista de todas las 13 especies de tomate silvestre reconocidas y sus equivalentes nombres en la seccin Lycopersicon. [7] En el 2007 se publican los resultados de la secuenciacin de ocho loci nucleares no ligados en 4 poblaciones de dos especies relacionadas (Solanum peruvianum y S. Chilense), con un total evaluado de 40 a 46 alelos por locus y por especie. Tanto el polimorfismo como la diversidad nucleotdica para cada locus y cada poblacin fueron cuantificadas, reportndose que la mayora de los loci y de las poblaciones muestran polimorfismo. El mayor nivel de polimorfismo lo encontraron en las poblaciones de S peruvianum del norte peruano, respecto de las poblaciones del sur. En cuanto a Solanum chilense, tres poblaciones muestran comparables niveles de diversidad, mientras que otras 2 muestran una diversidad tan alta como las que encontraron en S. peruvianum. En el trabajo reportan que ambas especies mostraron gran variacin de nucletidos y proponen que la estructura de la poblacin es una de las ms importantes fuerzas de la evolucin dentro y entre poblaciones en estos tomates silvestres. [8] En el 2008, se publica un estudio sobre gentica de poblaciones en dos especies de tomate silvestre estrechamente relacionadas (S. peruvianum y S. chilense) pertenecientes a la seccin Lycopersicon, colectadas en el centro y el sur del Per; para ello realizan una secuenciacin multilocus que les permite generar patrones de polimorfismo y divergencia en estas especies de tomate silvestres muy relacionadas. En el estudio focalizan mltiples poblaciones de las dos especies, escogiendo un subset de loci previamente analizados en trabajos iniciales (Roselius et al 2005; Stadler
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et al 2005; Tanksley et al 1992). Los resultados que obtienen sugieren que la especiacin ocurri bajo flujo gentico residual, lo cual implica que la seleccin natural es una de las fuerzas evolutivas que maneja la divergencia de estas dos especies de tomate (tiempo de divergencia igual o menor a 0,55 millones de aos). [9] Tal inferencia es fuertemente consistente con lo reportado por investigadores en trabajos previos, como los anteriormente citados.
Durante el siguiente ao, se publica un estudio el cual seala que en general, tanto la clasificacin como la filogenia de las especies que pertenecen a la seccin Lycopersicon es compleja debido a la ausencia de un consensus que sea ampliamente aceptado; adems, seala que estas especies divergieron recientemente y que an estn estrechamente relacionadas al punto en que en algunos casos son incluso capaces de hibridarse interespecficamente, lo cual disminuye aun ms el poder diferenciar la variacin intra e inteLa poblacin ecuatoriana de especies silvesrespecfica. El estudio permiti dar solucin a tres del grupo Lycopersicon haba estado eslos problemas antes mencionados, mediante casamente representada en estudios previos, hasta que un grupo de investigadores publiel empleo de muchas accesiones que cubrieron el rango natural de cada can en el 2008 los resultados de un estudio de estructura Las poblaciones ecuatorianas especie que emplearon. En poblacional en una especie del sur peruano presentan baja el estudio utilizan para la silvestre propia de las reas diversidad gentica y alta hete- clasificacin y relacin filocosteras del Per y Ecuador; rocigosidad, posiblemente debi- gentica la tcnica de los y, que ha sido fuente para la do a la alta autogamia, pequeo AFLPs en dos secuencias de genes nucleares; en adigeneracin de muchas vatamao de las poblaciones y forcin para evitar los sesgos riedades comerciales (Somacin de cuellos de botella. debido al mtodo molecular lanum pimpinellifolium). empleado (AFLP), caracteriSu variacin fue detectada zan el material con dos secuencias de genes en 10 regiones microsatlites y analizaron nucleares. Los datos obtenidos sugieren una 248 plantas representativas del rea entera clasificacin similar a aquellos previamente de distribucin, con nfasis en la poblacin propuestos por otros autores, as como alecuatoriana. En el estudio se reportan grandes diferencias genticas en las dos poblagunos cambios significativos. En el estudio ciones; as, las poblaciones peruanas no prese reconocen y distinguen doce especies; sentan estructura gentica, mientras que las adems, proponen que la especie S. corneecuatorianas se encuentran geogrficamente liomulleri es distinguible de S. peruvianum. parchadas. Los autores sealan que una poEn adicin, los arboles obtenidos con ambas sible causa de esta diferencia podra ser la tcnicas (secuencias y AFLPs) sugieren que naturaleza no uniforme del clima ecuatoriano, S. arcanum podra representar un complejo ya que encontraron una importante correlade poblaciones compuesta de dos especies cin entre la estructura gentica y el clima. crpticas. Con la bsqueda de las relaciones Por otro lado, las poblaciones ecuatorianas filogenticas entre especies, encuentran aly del sur peruano presentan baja diversidad gunos grupos claros: Grupo Lycopersicon (S. gentica y alta heterocigosidad, posiblemente pimpinellifolium; S. Lycopersicum; S. cheesdebido a la alta autogamia, pequeo tamao maniae; S. galapagense) Grupo Arcanum: de las poblaciones y formacin de cuellos de (S. chmielewskii; S. neorickii; S. Arcanum; S. botella. El extremo de casi ninguna diversidad huaylasense) Grupo Eriopersicon: (S. perugentica lo presentan las poblaciones de las vianum; S. chilense; S. penellii; S. habrochaiIslas Galpagos, a causa posiblemente de tes); y, no incluido en ningn grupo, pero esuna reciente colonizacin desde regiones del trechamente relacionado S. lycopersicoides. [11] Guayas y Los Ros continental, donde encontraron plantas genticamente idnticas. [10]
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CONCLUSIONES El tomate rin es la principal hortaliza que se cultiva y se consume alrededor del planeta entero y su cultivo y produccin denota gran importancia econmica para sus productores. Las especies silvestres emparentadas al tomate cultivado, son portadoras de un sinnmero de genes de inters agronmico, por lo que estas han constituido por dcadas, la fuente de genes para el mejoramiento gentico de las variedades comerciales que han sido lanzadas al mercado, de manera que al momento existe una enorme cantidad de fenotipos que se comercializan (frutos rojos, amarillos, grandes, pequeos, acorazonados, ovalados, alargados, etc.), as como frutos con gran cantidad de slidos solubles, mejorados para la industria (salsas, jugos, etc.), plantas con ciclos de cultivo ms cortos, con tipo de crecimiento determinado, resistentes a factores biticos (hongos, insectos, bacterias) como a factores abiticos (sequas, heladas, salinidad del suelo, etc.). Tal situacin ha sido posible por supuesto al enorme inters que ha despertado su investigacin en cientficos de todo el mundo, quienes han generado numerosos estudios sobre las especies de la seccin Lycopersicon, de manera que al momento se cuenta con enorme cantidad de informacin, ya sea publicada en artculos cientficos, as como informacin ingresada en las bases de datos del Banco de genes y que estn disponibles para la comunidad en general; as mismo su estudio ha permitido establecer en forma clara la relacin filogentica que existe entre estas especies estrechamente emparentadas.. REFERENCIAS 1. INEC (www.inec.gob.ec). 2. Nuez F, Prohens J, Blanca JM (2004) Relationships, origin, and diversity of Galpagos tomatoes: implications for the conservation of natural polulations. Am J Bot 91:86-99.Fernandez de Cordova P, Soler S, Valdivieso E, Solrzano V (1999) Germoplasm of Solanaceae horticultural crops in the south of Ecuador. Plant Gene-
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NANOESTRUCTURAS POLIMRICAS PARA LA DETECCIN DE ADN

Ivn Burneo Saavedra1, Programa de Mster en Nanociencia y Nanotecnologa Centro de Biotecnologa Universidad Nacional de Loja Supervisores: Olivier Henry1*, Ciara K. OSullivan1*, 1Nanobiotechnology and Bioanalysis Group, Department of Chemical Engineering, Universitat Rovira I Virgili, Avinguda Pasos Catalans, 26, 43007, Tarragona, Spain, Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats, Passeig Llus Companys 23, 08010 Barcelona, Spain e-mail: olivier.henry@urv.cat, ciara.osullivan@urv.cat ____________________________________________________________________________
revestimiento por centrifugado, mediante eliminacin de la fase de poli(metil-metacrilato) (PMMA) de la capa de poli(estireno-b-metilmetacrilato) (PS-b-PMMA), usando el mtodo de degradacin UV y grabado qumico con cido actico. Las condiciones de la operacin de revestimiento por centrifugacin fueron optimizadas para preparar filmes de 10-20 nm de espesor, medido por reflectometra de Rayos X. La morfologa de las pelculas fue caracterizada mediante microscopia de fuerza atmica (AFM) y las tcnicas electroqumicas tales como voltametra cclica y espectroscopa de impedancia electroqumica (EIS) se usaron para evaluar el comportamiento electroqumico de los electrodos nanoestructurados resultantes para la fabricacin de sensores electroqumicos de ADN. Palabras clave: Diblock copolmeros, nanoporos, bisoensores electroqumicos de ADN. ____________________________________________________________________________
ABSTRACT
The development of new detection methods remains a very active research topic in the field of optical and electrochemical biosensors. The prospect of a rapid analysis requires processing and handling of samples in a few steps, and this coupled with rapid screening diagnoses would enable a more economic and obtain results faster. The use of nanostructured films in biosensing is a versatile tool to develop and meet the re-quirements size of many lab-on-a-chips. To achieve this goal, we prepared films of block-copolymers containing cylindrical spaces gold substrates produced by spin coating, by eliminating the phase of poly (methyl methacrylate) (PMMA) layer of poly (styreneb-methyl methacrylate) (PS-b-PMMA), using the method of UV degradation and etching with acetic acid. The conditions of the coating operation by centrifugation were optimized to prepare films of 1020 nm thickness, measured by X-ray reflectometry The morphology of the films was characterized by atomic force microscopy (AFM) and electrochemical techniques such as cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were used to evaluate the electrochemical behavior of nanostructured electrodes resulting in the manufacture of electrochemical sensors DNA. Key words: Diblock copolymers, nanopores, DNA electrochemical bisoensozres. ____________________________________________________________________________
1.
INTRODUCCIN
RESUMEN
El desarrollo de nuevos mtodos de deteccin sigue siendo un tema de investigacin muy activo en el campo de los biosensores pticos o electroqumicos. La perspectiva de un anlisis rpido requiere el procesamiento y manejo de las muestras en pocos pasos; esto unido a una deteccin rpida permitira diagnsticos ms econmicos y la obtencin de resultados ms rpidamente. El uso de filmes nanoestructurados en biodeteccin es una herramienta verstil para desarrollar y satisfacer los requerimientos de tamao de muchas tecnologas lab-on-a-chip. Para lograr este objetivo, se prepar films de block-copolmeros que contienen espacios cilndricos sobre sustratos de oro, producidos por
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La consecucin de patrones nanoscpicos funcionales regulares y el control de estructuras superficiales a la escala nanomtrica son esenciales para el desarrollo de superficies con propiedades nuevas y tiles[1, 2]. Los filmes porosos han sido usados para la fabricacin de materiales nanoestructurados que tienen aplicaciones potenciales en catlisis y nanolitografa, en electrnica, ptica y magnetismo, as como en biosensores [1, 3-5]. Los materiales nanoestructurados constituyen nuevas plataformas para la deteccin biomolecular que pueden proporcionar una mayor sensibilidad y susceptibilidad a la miniaturizacin [4, 5]. Los nuevos mtodos de modelado basados en top-down, incluyen varios enfoques litogrficos que emplean UV, rayos X, interferencia, zone plane array, scan-
ning ptico de campo cercano, haz de iones focalizados, haz de electrones, dip-pen y nano-impresin [6] para obtener nanoestructuras altamente ordenadas. Sin embargo, estas tecnologas siguen siendo caras y con limitaciones intrnsecas. Como alternativa, la auto-organizacin de macromolculas es una tcnica emergente, promisoria y flexible [2], que se caracteriza por la formacin espontnea de dominios de escala nanomtrica que exhiben un alto grado de ordenamiento [7]. En este sentido, los block copolmeros (BCPs) son materiales ideales debido a la conectividad de las dos cadenas qumicamente distintas en morfologas ordenadas con una escala de tamao limitado por la dimensiones moleculares de las cadenas del polmero. Adems, el tamao y forma de los nanodominios pueden ser convenientemente controlados simplemente cambiando sus pesos molecula51
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res y su composicin [6, 8]. Los filmes delgados nanoporosos de BCPs son el centro de una intense investigacin debido a su alto impacto para fabricar matrices de alta densidad para el almacenamiento de datos, la electrnica, la separacin molecular, la qumica combinatoria, o la deteccin de ADN [5, 9-11]. Los blocopolmeros pueden ser considerados como dos o ms fragmentos qumicamente homogneos de polmeros, es decir, cadenas de homopolmeros, unidas por enlaces covalentes para formar macromolculas ms complejas tales como los copolmeros lineales, di-, tri, o multibloque, y arquitecturas no lineales como multibrazo, starblock o graft copolmeros [12].
mes ultra delgados (<100 nm de espesor) de nanoelectrodos se prepararon por spin-coating de una capa de poliestireno-b-polimetil metacrilato (PS-b-PMMA) sobre sustratos de oro. Bajo condiciones ptimas, los bloques se auto-organizan para formar dominios cilndricos perpendiculares a la superficie. Los bloques de PMMA pueden ser grabados por simple exposicin a luz ultravioleta y cido actico para exponer la superficie de oro. La razn principal para el uso de nanoelectrodos es el beneficio obtenido por la transferencia de masa mejorada debido al dominio de la difusin radial, disminucin de las corrientes de carga y reduccin de los efectos deletreos debidos a la resistencia de la solucin [16]. Como el electrodo disminuye en tamao, la difusin radial se vuelve predominante y dando como resultado un transporte de masa ms rpido y mejor sensibilidad, tiempos de respuesta ms rpidos, y respuestas independientes de conveccin en comparacin con los electrodos de tamao macro. [14, 16,17]. El uso de filmes porosos nanoestrucurados en biodeteccin aparece como una herramienta verstil para desarrollar y satisfacer los requerimientos de tamao de muchas tecnologas lab-on-a-chip [6]. Los sensores de ADN basados en nanomateriales pueden detector la presencia de genes o la mutacin de genes asociados a enfermedades humanas hereditarias y pueden usarse directamente para el monitoreo directo de los eventos de hibridacin [18]. Muchas tcnicas que incluyen la fluorescencia, espectrometra de masa, electroqumica, espectroscopia de resonancia de plasmones de superficie y microbalanza de cristal de cuarzo, se han desarrollado para la deteccin de ADN [19]. Sin embargo, las tcnicas electroqumicas ofrecen grandes ventajas debido a su simplicidad, rapidez, bajo costo y alta sensibilidad. Muchas metodologa se han propuesto para el monitoreo electroqumico de la hibridizacin del ADN [19, 20] de acuerdo a como se haga la medicin elctrica, por ejemplo, voltametra, amperometra/culombimetra, o espectroscopia de impedancia [21, 22].
La espectroscopia de impedancia (EIS) se usa ampliamente en el campo de la investigacin biomdica [23]. El potencial de la EIS se basa en que la impedancia del sistema puede ser escaneado en un amplio rango de frecuencias para determinar las propiedades electrnicas de las varias interfaces que lo componen, por lo general se describe como un circuito equivalente de las resistencias, los condensadores e inductores en paralelo o en serie. Los modelos de los circuitos equivalentes son tiles para la interpretacin del espectro de impedancia, y como tal la EIS es una tcnica valiosa para la investigacin de la cintica y la morfologa de los electrodos, de polmeros, de semiconductores, de sensores bioqumicos, de tejidos animales y vegetales [24]. El principal motivo para el estudio de sensores de impedancia es su capacidad para realizar detecciones label-free [21, 23, 25]. Esta tcnica junto con indicadores electroactivos como el ferrocianuro de potasio, ha sido usada frecuentemente para caracterizar cadenas simples o dobles de ADN [24], para el seguimiento de la hibridizacin del ADN [26, 27] y para la deteccin de polimorfirmos de un solo nucletido [28] usando electrodos modificados. En este trabajo, presentamos los resultados tras el estudio de superficies de electrodos de oro modificados con nanoestructuras que de superficies de nanogaps polimricos ultradelgados preparados mediante auto-organizacin de blocopolmeros de PS-b-PMMA de longitud de bloque variable para la fabricacin de matrices de nanoelectrodos.
to hybridisation and blocking of the pore structure.
Estos electrodos se usaron posteriormente para preparar sensores electroqumicos de ADN, inmovilizando cortas secuencias de ADN tiolado dentro de los poros polimricos y monitoreando el evento de hibridizacin con una cadena de ADN complementario utilizando espectroscopia de impedancia electroqumica. La combinacin de EIS y las matrices de nanoelectrodos podra ofrecer un mtodo electrnico de deteccin simple basado en el aumento de la resistencia interfacial de la transferencia de electrones, asociada con el bloqueo de los poros seguido por la formacin de un aducto de ADN, como se muestra en el Esquema 2. La voltametra cclica junto con la EIS se us para monitorear la calidad del graba qumico de los dominios de PMMA tanto como la deteccin de los eventos de hibridizacin despus de la funcionalizacin de los electrodos con cadenas cortas de ADN, de 20 bases de longitud. La secuencia Exon 16, presente en el gen BRCA1 del cncer de mama se us como sistema modelo de ADN. Para caracterizar la morfologa y el espesor de los films nanoporosos se us Microscopia de Fuerza Atmica (AFM) and y reflectometra de rayosX. El presente trabajo demuestra que las estructuras de nanoporos permiten al sustrato de oro subyacente mantener la actividad electroqumica y ser usadas en la deteccin de ADN. 2. PARTE EXPERIMENTAL 2.1 Materiales. Ferrocianuro de potasio (III), tetrahidrofurano, tolueno y tampn fosfato salino pH 7.4 con Tween 20 (PBS-T) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Espaa), Sodio hexacianoferrato (II) decahidratado, cloruro de potasio, cido sulfrico, cloroformo y acetona fueron adquiridos de Scharlau Chemie (Barcelona, Espaa), cido actico glacial fue adquirido de Panreac (Barcelona, Espaa). Se us agua ultrapura (18 M cm) obtenida con un
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Esquema 1. Representacin de varias clases de BCPs y los nanodominios formados. Adaptado de Lazarri et al. [12].
Los enfoques para controlar la orientacin de los microdominios de blocopolmeros incluyen el uso de vapores de solventes, campos elctricos, sustratos qumicamente modelados, grafo epitaxia, cristalizacin epitaxial, control de interacciones interfacial, gradientes trmicos y zone casting [13]. Una vez fundida, se producir la separacin de fases entre los distintos bloques lo que se traduce en la formacin de dominios laminares o cilndricos como se representa en el Esquema 1. El espesor del film, el tiempo y la temperatura de annealing pueden ayudar a controla la uniformidad y la orientacin del las pelculas auto-organizadas, mientras que el peso molecular del polmero y la variacin de la longitud del bloque controlan el tamao y la separacin de los diferentes dominios. [7,14]. Para la fabricacin de nanoestructuras, se remueve, posteriormente, uno de los bloques usando plasma o grabado qumico [15]. Los fil52
Esquema 2. Schematic of (a) surface nanostructure (top view), (b) effect of hybridisation and de-hybridisation event on the blocking of the pore structure and (c) read out of resulting surface impedance variation due
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sistema Milli-Q RG (Barcelona, Espaa). Los oligonucletidos fueron comprados a Eurogentec (Eurogentec, Espaa) y a Biomers.net GmbH (Ulm, Alemania). Las secuencias de oligonucletidos empleadas en este trabajo se enumeran a continuacin: DNA-SH target (Exon 16): 5-SH-AG-GGTCAT-CAG-AGA-AGA-GG-3 Sonda complementaria (Exon 16 A): 5-CCTCTT-CTC-TGA-TGA-CCC-T-3
PMMA se degradaron usando una lmpara UV (350 W) durante 10 min, que consiste en el entrecruzamiento de la matriz de PS y la degradacin de los dominios cilndricos de PMMA. Posteriormente, la degradacin dominios de PMMA se elimina por lavado con cido actico glacial durante 5 min. 2.2.2. Caracterizacin
trodos de trabajo fueron chips cuadrados (2 cm 2 cm) de silicio-oro. El dimetro de los electrodos de trabajo se defini por un agujero circular perforado en una mscara de plstico adhesivo de 6 mm de dimetroo. El electrolito usado fue 10 mM Fe (CN)63-/10mM Fe(CN)64- en solucin acuosa 0,1 M de KCl. Todos los potenciales se registraron con respecto al electrodo de referencia. 2.2.3. Ensayos analticos Inmovilizacin del AND. La inmovilizacin de las cadenas sencillas de ADN tiolado (HSssDNA) en la matriz de nanoelectrodos se logr mediante absorcin qumica [29]. En resumen, 50 L de una solucin 1M de la sonda tiolada, recin preparada en 1 M KH2PO4 se deposit sobre la superficie del electrodo y se inmoviliz durante toda la noche en una cmara hmeda para evitar la evaporacin. Luego los electrodos fueron lavados en una solucin de PBS-Tween durante 5 min para eliminar las sondas no adsorbidas. Hibridizacin. La hibridacin se llev a cabo a travs de la adicin de 50 L (100 nM) de la sonda complementaria. El la secuencia de ADN blanco, Exon 16, se aadi a la superficie del electrodo de trabajo, seguido por un periodo de incubacin de al menos una hora en una cmara hmeda, el electrodo fue lavado con PBS Tween por 5 minutos para remover cualquier secuencia no hibridada. La regeneracin de los electrodos se logr por lavados con una solucin acuosa de 20 mM Nao durante 5 min, seguido por enjuague con PBS 600 por 10 min, y finalmente con agua Milli-Q. Los procesos de hibridizacin fueron realizados dos veces. Los niveles de inmovilizacin, hibridizacin, y deshibridizacin fueron medidos usando voltametra cclica y EIS. 3. RESULTADOS Y DISCUSIN Morfologa de los films delgados di-blockcopolimricos por Microscopa de Fuerza Atmica. Se realizaron una serie de experimentos en los cuales se vari sistemticamente los pa-
rmetros de procesamiento (temperatura de annealing y tiempo de grabado) con el fin de optimizar el proceso de auto-organizacin. Para caracterizar la morfologa de los films resultantes, se analiz la distribucin de permetros de poros observados por de AFM, como una medida indirecta de la distribucin del tamao del poro. Efecto del espesor del film Todas las pelculas de block-copolmero en los sustratos de oro se prepararon por recubrimiento por rotacin a diferentes velocidades de giro. Utilizando Reflectometra de Rayos-X (XRR), se estim el espesor de las pelculas fabricadas a velocidades de 2000, 3000 y 4000 rpm se estim su espesor en 49, 36 y 16 nm, respectivamente.
Los blocopolmeros (BCP) block-metil metacrilato) (PSb-PMMA) fueron comprados a Polymers Source Inc. (Montreal,Canada) y usados como fueron recibidos. Los espectroscopia de resonancia d sistema de blocopolmeplasmones de superficie y micro- Morfologa de las pelcuros usados en este trabajos balanza de cristal de cuarzo, se las polimricas. Se us fueron PS(24 KDa)-b-PMhan desarrollado para la detec- Microscopa de Fuerza AtMA(11.5 KDa) with Mw/Mn= cin de ADN. 1.06, PS(39.8 KDa)-b-PMmica (AFM) para caracteriMA(17 KDa) with Mw/Mn= zar la morfologa de los films 1.06, PS(68 KDa)-b-PMMA(33.5 KDa) with preparados. Se us un 5400 Scanning Probe Mw/Mn= 1.08, y PS(140 KDa)-b-PMMA(60 Microscope (SPM)/Atomic Force MicroscoKDa) with Mw/Mn= 1.08. pe para obtener imagines de microscopa de La obleas de silicio de 4 de dimetro y 525 m fuerza atmica en modo tapping (Agilent Tede espesor, recubiertas con 10 nm de titanio chnologies, USA). Cantilveres de silicio con y 100 nm de oro fueron adquiridos a Platypus constantes elsticas de resorte entre 5 y 40 Technologies (Madison, USA), fueron usados N.m-1 y frecuencias de resonancia de 150 y como sustrato a menos que se indique lo con300 Hz se usaron para obtener las imgenes. trario. Se obtuvo chips de 2 x 2 cm2 usando un El radio tpico de los tips fue inferior de 10 lpiz de diamante a partir de las obleas de silicio nm. El anlisis de las imgenes de AFM fue (RS electronics, Michigan,USA), luego lavadas realizado usando el software WSxM (Nanotec en agua milipore, acetona y secadas bajo fluElectrnica, Espaa). jo de nitrgeno, y finalmente limpiadas usando ozono con el sistema PSD-UVT ozone (NovasVoltametra cclica y Espectroscopa de Imcan Technologies, USA) durante 10 minutos. pedancia. Los ensayos de voltametra cclica (CV) y Espectroscopa de Impedancia (EIS) se 2.2. Mtodos realizaron usando un potenciostato/galvanostato Autolab PGSTAT controlado con los soft2.2.1. Fabricacin de filmes polimricos wares General Purpose Electrochemical Sysdelgados. Los blocopolmeros PS-b-PMMA tem (GPES) y Frequency Response Analyser fueron disueltos en THF o tolueno para for(FRA) (Eco Chemie B.V., Holanda). Las memar soluciones stock de 1 % w/v. Los films diciones se llevaron a cabo en una sola celda delgados fueron preparados por revestimienelectroqumica en un arreglo de tres electroto por centrifugacin en chips de silicio-oro 2 dos que consiste en filmes copolimricas/DNA x 2 cm2 centrifugados a velocidades de 4000 como electrodos de trabajo, un alambre de Ag/ rpm y cocidos a 170C por 72 horas para obAgCl como electrodo de referencia y un alamtener dominios cilndricos. Los dominios de bre de Pt como electrodo de conteo. Los elec54
Medicin del espesor de los films. El espesor de las pelculas de PS-b-PMMA se depoli(estirenotermin utilizando reflectometra de rayos-X (XRR) antes de la radiacin Muchas tcnicas que incluyen UV, las mediciones se realila fluorescencia, espectrome- zaron con un difractmetro tra de masa, electroqumica, de rayos-x D-500 (Siemens, Alemania)
Figura 1. Espectros de reflectometra de rayos X (XRR) utilizados en la determinacin del espesor de pelculas delgadas de blocopolmeros recubiertos por centrifugacin a 4000 rpm.
En la determinacin del espesor (Figura 1), el ngulo de incidencia del haz de rayos X utilizado es mayor que el ngulo crtico C. La medida resultante consiste en un patrn de interferencia entre el haz incidente y el haz reflejado, que consta de un patrn peridico de fase lo que puede estar relacionado con el espesor total de la capa de en cuestin. El espesor se determin usando la ecuacin 1. E. 1
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donde d es el espesor de la pelcula delgada, es la longitud de onda del rayo-x, y m+1 - m es la diferencia entre el ngulo de incidencia de dos mximos y mnimos cercanos [30]. El auto-ensamblaje de las plantillas ordenadas depende en gran medida del espesor pelculas de polmeros, como se muestra en la Figura 2. Est bien establecido que la morfologa de las pelculas de blocopolmeros depende en gran medida el grosor de la superficie debido a las interacciones tienen lugar dentro de las pelculas [15].
muestran la distribucin del permetro de los poros. Se puede observar que el valor medio de los poros fue de aproximadamente 20 nm, suponiendo poros circulares, y la distancia entre poros ms cercanos fue de 34 nm. Sin embargo, frente a la fabricacin de pelculas delgadas como plataformas para el desarrollo de sensores de ADN, se prefiri las superficies ordenadas entre 10 y 20 nm de espesor a fin de evitar la limitacin de la difusin del ADN presente en la muestra a travs de los huecos en el ADN inmovilizado. Por tanto, se seleccion una velocidad de revestimiento por centrifugado de 4000 rpm para el trabajo futuro. Efecto de la naturaleza del sustrato Las interacciones interfaciales entre los bloques de polmero determinan tanto el sustrato y las interfaces de superficie y, en consecuencia, la orientacin de los microdominios dentro de la pelcula [31].
de silicio con recubrimiento de de oro y obleas de silicio nativo, sobre la morfologa y orientacin de las estructuras porosas. Las imgenes AFM de la figura 3 presentan la morfologa de las pelculas sobre los dos sustratos. Las pelculas de las soluciones de PS (39.8kDa)-b-PMMA (17) fueron revestidas por centrifugado a 2.000 rpm, y cocidas a 165 C durante 48 h. Se puede observar que, esencialmente, la morfologa en ambos sustratos es la misma, debido a las similares interacciones polmero-sustrato. Sin embargo, se puede observar patrones ligeramente ms ordenados en las pelculas centrifugadas sobre sustratos de Si nativo. La relacin del rea- permetro y la distancia de primer vecino, que representan el dimetro de poro y el espaciamiento de los poros [7], fueron de 34,5 nm y 3,6 nm para pelculas sobre sustratos de silicio y 38 nm y 5,4 nm para las pelculas en Au. Estos resultados sugieren una mejor distribucin de los poros, una mejora en el espaciamiento y poros ms grandes. Efecto de las condiciones de post procesamiento
PS-b-PMMA. Las imgenes de altura y fase, y distribucin del permetro de los poros de PS (39.8kDa)-bPMMA (17kDa) 1% en THF centrifugado a 4000 rpm. a-b) 3 minutos de tiempo de grabado, c-d) 5 minutos, y e-f) distribucin de permetros de poros de 3 min y 5 min, respectivamente.
Se investig tambin la evolucin de la morfologa de los poros como una funcin del tiempo de grabado. La figura 4 muestra las imgenes de AFM de las pelculas despus de 3 y 5 minutos de grabado usando cido actico glacial seguido por cocido trmico a 165 C durante 48 horas. Para todos los tiempos de grabado utilizados, las superficies observadas fueron consistentes con una orientacin perpendicular cilndrica. La morfologa resultante no mostr diferencias entre 3 y 5 minutos, y, en general la distribucin de los poros son iguales con un valor medio del permetro de los poros de 50 nm, aproximadamente 16 nm de tamao de poro. Adems, se observ que los tiempos de grabado ms cortos de 2 minutos no son suficientes para completar la eliminacin de los microdominios de PMMA. El efecto del campo externo tambin fue utilizado en un intento de alinear microdominios de los blocopolmeros siguiendo varios informes de Thurn-Albrecht et al. [8, 32], que afirman que un campo elctrico podra orientar pelculas de hasta 1m de espesor.
Figura 2. Anlisis del efecto del espesor de PS-b-PMMA en el procesamiento de pelculas delgadas. Imgenes de altura y fase, y distribucin del permetro de los poros de la PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kDa) 1% (w / v) en THF, a-c) girar a 2000 rpm,. d-f) 3000 rpm, y g i) 4.000 rpm.
La pelcula ms gruesa, de 49 nm centrifugada a 2000 rpm demostr una distribucin ordenada y homognea del tamao de poro (Fig. 2a-c). Las pelculas ms delgadas de 36 nm y 16 mostraron grandes distribuciones de tamao de los poros con muy poco orden (Fig. 2d-i). Todas las pelculas se prepararon a una temperatura fija (165 C) durante 48 horas, que fue suficiente para asegurar la formacin de una estructura equilibrada y mostraron una morfologa que consta de poros redondeados y una orientacin perpendicular. Las figuras 2c, 2f y 2i,
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Figura 3. Anlisis del efecto de la interaccin de la superficie de silicio nativo y obleas de silicio con recubrimiento de oro, en pelculas delgadas de PS-bPMMA. Imgenes de altura y fase, y de distribucin del permetro de los poros de PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kDa) 1% en THF centrifugado a 2000 rpm, 10 min exposicin UV y 2 min ataque qumico con cido actico glacial. a-b) imgenes de topografa y fase en la obleas recubiertas de oro, d-e) imgenes de topografa y fase en obleas de Si nativo, y c-f) distribucin de permetros de poro sobre el oro y Si, respectivamente.
El cocido del diblock-copolmero se llev a cabo durante 14 horas a 165 C, por encima de la temperatura de transicin vtrea de los dos componentes (105 C para el PS y 115 C durante PMMA) bajo la aplicacin de un campo elctrico [32]. El tiempo de recocido se extendi a 48 horas sin detectar cambios en la morfologa y la orientacin como se puede observar en la Figura 5, que presenta las imgenes topogrficas y de fase posteriores a la exposicin ultravioleta y la eliminacin de los dominios de PMMA degradado por lavado con cido actico.
Como tal, ya que la mayora de los informes de pelculas delgadas de copolmeros en bloque patrn se han desarrollan en sustratos de silicio, se investig tambin la influencia de los sustratos, es decir, en obleas
Figura 4. Anlisis del efecto del tiempo de grabado usando cido actico glacial, en pelculas delgadas de
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crementan, los voltamogramas se vuelven ms sinusoidales, caracterstica de la difusin esencialmente no lineal. Estas observaciones indican que la nanoelectrodos se comportan casi de forma independiente el uno del otro, aunque a velocidades de barrido mayor sus perfiles de difusin se superponen [14].
Los datos de la figura 7 se extrajeron para estimar la superficie real en un 2.16 x 10-7 cm2, es decir, aproximadamente tres rdenes de magnitud menor que la geometra real del electrodo. Prueba de concepto del sensor electroqumico de ADN por voltametra cclica y espectroscopa de impedancia electroqumica. Las pelculas nanoporosas de blocopolmeros sobre sustratos de oro, y la electroactividad de las sales de ferri/ferrocianuro de potasio (Fe(CN)63-/Fe(CN)64-) se probaron utilizando voltametra cclica despus de la inmovilizacin de las sondas de ADN tiolado, la hibridacin con la secuencia complementaria y la regeneracin de los electrodos, es decir, dehibridacin (Esquema 2). Un ejemplo tpico se presenta en la Figura 8. La intensidad de la seal es proporcional a la concentracin de las molculas que sufren oxidacin/reduccin, y la diferencia entre el potencial mximo est relacionado con la cintica del proceso electroqumico [1].
Figura 5. Imgenes de AFM de la orientacin de pelculas delgadas aplicando un campo elctrico. PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) 1% en tolueno, centrifugadas a 2000 rpm. a) Topografa y b) imgenes de fase.
Efecto del Tiempo de annealing en atmsfera de solvente. En el proceso de solvent-annealing, la movilidad de las cadenas de copolmeros se ve reforzada por la presencia del disolvente y la reorganizacin del copolmero, conduciendo a la recuperacin de estructuras ordenadas cilndricas [33]. Tras la exposicin a vapor saturado de cloroformo en una cmara sellada a temperatura ambiente durante diferentes perodos de tiempo, las muestras de pelculas delgadas de recubiertos con PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) fueron llevadas a atmsfera ambiente y secadas rpidamente. El efecto del tiempo de recocido disolvente se presenta en la Figura 6. Despus de 24 h (Figura 6), la pelcula muestra una estructura muy desordenada con seales de separacin de las microfase. La exposicin prolongada al vapor saturado de cloroformo (48 h, en la figura 6b) conduce a una estructura ordenada porosa con una relacin rea-permetro de aproximadamente 6 nm y la distancia de primer vecino de 35 nm. La ampliacin de la duracin del disolvente tratamiento de vapor (> 72 horas, la figura 6c, d), dio lugar a franjas y morfologa laminar, de acuerdo con Xuan et al, 2004 [10].
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Figura 6. Anlisis del efecto del tiempo de solvent annealing utilizando cloroformo. Altura y distribucin del permetro de los poros de PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) 1% en THF centrifugadas a 2000 rpm. a) 24 h, b) 48, c) 72, d) 92 h y e) distribucin del permetro sobre sustratos de oro.
Caracterizacin electroqumica de los filmes delgados de matrices de nanoelectrodos por Voltametra Cclica En la caracterizacin de la profundidad de los poros por AFM, las incertidumbres en las mediciones son demasiado grandes para la conclusin definitiva de que los poros de penetrar la pelcula por completo. Los mtodos electroqumicos constituyen una forma sencilla para la caracterizacin de electrodos nanoporosos. Los informes anteriores han demostrado que los nanoelectrodos presentan una dependencia scan-rate [14], como se ve en la Figura 7., los voltamogramas cclicos fueron tomados a velocidades de barrido diferentes (Figura 7), y las intensidades de los picos se representa en funcin de la raz cuadrada de la velocidad de barrido (Figura 7b). Una relacin lineal entre la corriente y la raz cuadrada de las tasas de exploracin muestran que el proceso electroqumico est limitado slo por la difusin habitual de las especies electroactivas en la proximidad del electrodo [1]. Sin embargo, a velocidades de barrido bajas, los voltamogramas de la sonda de ferricianuro de potasio redox presenta un pico de forma sigmoidea, caracterstica de un perfil de difusin radial de la sonda redox para los dominios nano-poros, mientras que las tasas de exploracin se in-
Figura 7. Voltamogramas cclicos a velocidades de barrido (10, 50, 100, 150, 200, 300, 400 y 500 mV / s) de Fe (CN) 63 - / Fe (CN) 64 - en sustratos de oro despus de cubrir con pelcula delgada de PS (39.8kDa)b-PMMA(17kDa). Recuadro: Relacin lineal entre la intensidad de pico y la raz cuadrada de la velocidad de exploracin.
Un anlisis cuantitativo de los datos de la cintica facilit la estimacin de la superficie real del oro subyacente utilizando la ecuacin de Randles-Sevcik [34]:
donde: ip es la corriente mxima (A), A es el rea de los electrodos (cm2), D es el coeficiente de difusin (cm2 s-1), C es la concentracin (mol cm-3) y v es la velocidad de barrido (V s-1). El coeficiente de difusin del ferricianuro potsico se determin primero utilizando un electrodo de rea conocida, A. Los voltamogramas fueron adquiridos a velocidades de barrido diferentes (10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400 y 500 mV/s), y la ip resultante se grafic contra v1/2. El coeficiente de difusin se calcul a partir de la pendiente de la recta resultante como
Figura 8. Voltamogramas cclicos a una velocidad de barrido de 100 mV/s de la Fe (CN)63 - / Fe (CN)64 en sustratos de oro despus del recubrimiento con PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kD). a) Pelcula delgada, b) despus de la inmovilizacin, c) despus de la hibridacin, d) regeneracin (dehibridizacin) y e) segunda hibridacin.
Tras la inmovilizacin, la corriente mxima medida aument considerablemente de 1,15 nA para la matriz de electrodos desnudos hasta 4,22 nA. Tras la hibridacin, la corriente aument, adems, a 5,38 nA y disminuy a 5,26 nA despus de la hibridacin. Este comportamiento es muy diferente de los senso59
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res de ADN electroqumico preparados sobre electrodos de oro puro, donde por lo general, el ADN monocapa forma corrientes de pico que disminuyen debido a la obstruccin parcial de los sitios de los electrodos activos. Sin embargo, en la hibridacin, la corriente puede aumentar [36] o disminuir [37] dependiendo de la configuracin de los electrodos y monocapas inmovilizadas. En todos los casos, tras la re-generacin, la seal del sensor se volvi a la registrada antes de la hibridacin. A raz de los resultados reportados por los grupos de investigacin de Gooding et al. y Barton et al., se puede sugerir que a la inmovilizacin y la hibridacin o la transduccin de carga a travs del ADN ocurrido o que de iones de puertas abiertas [37, 38]. Las grficas de EIS despus de cada derivatizacin etapas brindan una visin ms clara de los resultados obtenidos [21]. Como se indica en los diagramas de Nyquist en la Figura 9, la impedancia total del sistema en gran medida el aumento de 3.200 a ms de 12.000 en la inmovilizacin siguiente.
zado podra haber removido de la superficie. Sin embargo, despus de una segunda hibridacin, la impedancia aument hasta un valor similar a la medida despus de la primera hibridacin, es decir, un aumento de la impedancia de aproximadamente 6 veces, lo que confirma la presencia de sondas de ADN inmovilizado y la funcionalidad del sensor. La inmovilizacin del ADN y los eventos hibridacin aumentan la carga global negativa de la superficie del electrodo debido a las cargas negativas presentes en el esqueleto de fosfato del ADN, y limitan an ms la difusin del ferricianuro con carga negativa a la superficie del electrodo, lo que resulta en un aumento de la impedancia. La impedancia inicialmente alta despus de la inmovilizacin por tanto, podra atribuirse a la interaccin no especfica del ADN tiolada con los patrones de poliestireno, la mayora de los cuales se lav despus de la hibridacin y la regeneracin con hidrxido de sodio [21]. La inmovilizacin de la sonda de ADN tiolada en la superficie de oro con una densidad ptima, el radio y el espaciamiento ptimo para la hibridacin eventual son tcnicas claves para mejorar la eficiencia de deteccin de ADN. Todos estos parmetros se puede mejorar mediante el desarrollo de una plataforma porosos bien ordenada que permita una inmovilizacin tiolada ADN fcil y bien orientada. 5. CONCLUSIONES
Figura 9. a) Resultados de impedancia electroqumica sobre sustratos de oro despus del recubrimiento con pelcula delgada PS(39.8kDa)-b-PMMA(17kDa). b) Despus de la inmovilizacin, c) despus de la hibridacin, d) regeneracin (dehibridizacin) y e) segunda hibridacin.
Sin embargo, en la hibridacin la resistencia a la transferencia de carga disminuye a aproximadamente 20.000. Despus de la hibridacin, la resistencia a la transferencia de carga casi volvi a su valor inicial, aunque se observa la contribucin de un componente capacitivo. A partir de estos resultados existe cierta preocupacin de que el ADN inmovili60
En conclusin, hemos analizado la calidad de auto-ensamblado de las pelculas delgadas de blocopolmero, se caracteriz la uniformidad y el grado de orden mediante microscopa de fuerza atmica, y se extrajo informacin sobre la distribucin de los poros y el parmetro de distancia poro a poro (distancia al primer vecino) . Hemos demostrado maneras convenientes de ordenar pelculas de blocopolmeros, cambiando las condiciones de elaboracin y el uso de diferentes enfoques, tales como thermal annealing, campos elctricos y solvent annealing. Otros enfoques de proceso tambin fueron considerados, tales
como recubrimiento por inmersin, pero el mejor resultado se logra mediante spin-coating. Los experimentos se realizaron usando dos solventes diferentes, tolueno y tetrahidrofurano, y se encontr un incremento ligero en el ordenamiento usando el primer solvente, debido a una mayor reactividad del solvente en la formacin de los puentes de hidrgeno. Las mejores ordenadas basadas en pelculas delgadas de blocopolmeros se lograron usando solvent y thermal annealing, mientras que el espesor de las pelculas pudo ser controlado variando la velocidad de centrifugacin. Mostramos que usando solvent annealing se puede conseguir microdominios cilndricos porosos, ordenados y orientados en las pelculas, y que su morfologa se mantiene estable despus del annealing. Adems, la caracterizacin de las superficies por espectroscopa de impedancia y voltametra cclica mostraron que, el ADN tiolado puede ser inmovilizado en oro desnudo dentro de los poros y el sensor de ADN resultante puede usarse para detectar la unin del ADN complementario mediante la medicin de los cambios en la impedancia. Estos resultados prometedores de la funcionalizacin inicial, indican el potencial de las matrices de nanoelectrodos porosos para la deteccin de ADN. Sin embargo, se requieren trabajos adicionales para controlar el tamao de los poros y su distribucin como requisitos cruciales para estudiar de forma fiable y mejorar el rendimiento del sensor, en parmetros como selectividad, sensibilidad, lmite de deteccin y la reproducibilidad. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue llevado a cabo con la ayuda financiera del Sptimo Programa Marco de la Comisin Europea (FP7/2007-2013) bajo el acuerdo FP7-IEF-221198. Por otra parte, agradezco a la Secretara Nacional de Educacin Superior, Ciencia Tecnologa e Innovacin (SENESCYT), por la beca otorgada para realizar los estudios de Mster en Nanociencia y Nanotecnologa en la Universidad Rovira y Virgili, Tarragona, Espaa.
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II. Resumen de proyectos
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ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PATGENO-PATGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO (VASCONCELLEA HELBORNII VAR. PENTAGONA) Resumen
La investigacin propone estudiar las bases genticas de la interaccin patgeno patgeno entre Fusarium oxysporum spp. y Phytophthora sp., en la enfermedad del marchitamiento vascular en el Babaco, estas interacciones ser el objetivo general de este proyecto. Para caracterizar la interac-cin patgeno - patgeno durante la infeccin del material vegetal, haremos uso de tcnicas de se-cuenciacin de nueva generacin; ambas cepas colonizadoras del Babaco sern secuenciadas. Subsecuentemente se llevar a cabo un anlisis comparativo de las secuencias obtenidas respecto a genomas de especies relacionadas con Phytophthora sp y Fusarium oxysporum spp., lo que reve-lar determinantes genticos nicos de las cepas secuenciadas. Estos factores genticos distintivos son candidatos a participar en interacciones especficas del tipo patgeno - patgeno. Adicional-mente se estudiar el transcriptoma de ambas especies de forma aislada o en comunidad. Tal estu-dio de expresin gnica mostrar genes que son activados o reprimidos durante la interaccin pat-geno - patgeno. Toda esta informacin en su conjunto facilitar determinar cules son las caracte-rsticas genticas que un agente usado en el biocontrol de la enfermedad de la marchitez radicular en Babaco debe tener para que sea efectivo y por tanto propiciar su identificacin de forma racio-nal. ____________________________________________________________________________
MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIN LYCOPERSICON Resumen

La hortaliza ms difundida en todo el mundo y la de mayor valor econmico es el tomate rin (So-lanum lycopersicum). Esta situacin ha despertado desde hace mas de una dcada, enorme inters en cientficos de todo el planeta. La gentica molecular ha tenido un impacto significativo en la esti-macin de su diversidad gentica, en la determinacin de la filogenie existente entre las diferentes especies silvestres de la seccin Lycopersicon, as como en la generacin de marcadores molecula-res que han asistido a los genetistas, en la mejora gentica de los cultivos comerciales. Ha sido ge-nerada para su estudio, abundante informacin para muchos de los marcadores de ADNc mapea-dos, los cuales han sido integrados dentro de un extenso consensus en el Tomatoe Gene Index en el Insitute for Genomic Research, se ha realizado el mapeo de marcadores de ADNc, pruebas multi-locus para determinar los efectos de la subdivisin de especies estrechamente emparentadas, se han diseado primers especficos basados en datos publicados sobre ADNc o secuencias de ADN genmico, los productos amplificados han sido secuenciados y las nuevas secuencias generadas depositadas en la base de datos del Gene Bank, de manera que al momento la comunidad cientfica cuenta con basta informacin sobre el genoma, as como con el grado de filiacin de las diferentes especies silvestres relacionadas genticamente pertenecientes a la seccin Lycopersicon. ____________________________________________________________________________
PRODUCCIN DE UN BIOINOCULANTE EFICIENTE PARA EL CULTIVO DE LEGUMI-NOSAS: MEDIANTE LA UTILIZACIN DE CEPAS NATIVAS DE MICROORGANISMOS DIAZOTRFICOS Resumen
El presente trabajo se llevara a cabo con el objetivo de caracterizar e identificar genticamente bac-terias diazotrficas las mismas que sern aisladas de 8 zonas de muestreos en la provincia de Loja, as como determinar el efecto de estos aislados sobre parmetros morfolgicos, fisiolgicos y la fijacin de nitrgeno en leguminosas de importancia agronmica, El anlisis morfolgico se basara en determinar las diferencias de las colonias obtenidas del aislamiento, donde se evaluara la tincin al Gram, tipo de crecimiento, color, produccin de mucus, bordes y elevacin. La identificacin gen-tica de los aislados resultantes de la caracterizacin morfolgica se realizara mediante la secuencia-cin total de los genes de la regin 16S ARNr en estrecha colaboracin con las Universidades de Gent y Lovaina de Blgica. El anlisis fenotpico de los aislados se llevar a cabo en condiciones controladas y de campo, evalundose los parmetros de nodulacin, morfolgicos, fisiolgicos y la fijacin de nitrgeno en leguminosas como frejol, soya, man, arveja y haba. Los resultados obteni-dos de estas evaluaciones y determinados los mejores aislados cepas-genotipos, de estos se obten-drn bioinoculantes comerciales eficientes para el cultivo de leguminosas, para el efecto se seguirn protocolos establecidos segn estndares internacionales de fabricacin.
AMPLIACIN Y ESPECIALIZACIN DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA, PRIORIZANDO LE-GUMINOSAS DE LA ZONA 7 DEL ECUADOR. Resumen
El presente proyecto est relacionado a la ampliacin del banco de germoplasma actual del Centro de Biotecnologa, priorizando leguminosas de la zona 7 del ecuador. El proyecto bsicamente con-siste en el rescate de accesiones de leguminosas del banco actual, con el fin de conformar un banco especializado de leguminosas que almacene colecciones de semillas, como; las que se puedan res-catar y otras que se colectaran. Para el cumplimiento de lo expuesto nos hemos planteados los si-guientes objetivos. Garantizar la sobrevivencia del Recurso Gentico de Leguminosas de la Zona 7 del Ecuador, con miras a desarrollar investigacin en la Universidad Nacional de Loja; Establecer un Banco de Germoplasma de Leguminosas para la Universidad Nacional de Loja; Conservar el Recur-so Fitogentico de la Zona 7 del Ecuador; Evaluar el germoplasma e instaurar una base de datos digital. Las actividades a desarrollarse en el trascurso del proyecto estn relacionadas con; pruebas de viabilidad del material germoplasmico actual, implementacin de protocolos para el tratamiento adecuado de las semillas, adquisicin de equipos, instrumental y recipientes para una adecuada conservacin, evaluacin agro morfolgica del material obtenido a travs de la siembra e instaura-cin de una base de datos digital software que almacene toda informacin obtenida. El proyecto como tal tiene una duracin de 36 meses y el monto requerido es de 126672.10 Dlares America-nos.
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DESARROLLO DE BIOSENSORES ELECTROQUMICOS LABEL-FREE MEDIANTE EL USO DE MATERIALES NANOESTRUCTURADOS PARA LA DETECCIN TEMPRANA Y RPIDA DE CNCER Resumen
El proyecto de investigacin propuesto tiene como objetivo el estudio y desarrollo de nuevas superficies nanoestructuradas para la fabricacin de biosensores electroqumicos de ADN. Biosensores de ADN utilizan ampliamente las herramientas de diagnstico en el campo de la genmica y perfiles de expresin, a menudo organizados en el formato de microarrays para permitir el anlisis en paralelo. La capacidad para detectar una sola muestra de una multitud de parmetros genticos al mismo tiempo ha permitido a los investigadores lograr avances considerables en la comprensin de enfermedades como las enferme-dades mentales, enfermedades del corazn, enfermedades infecciosas y el cncer con el objetivo de adaptar el tratamiento necesario de forma adecuada. Para la consecucin de este objetivo es clave el estudio de la qumica de la superficie nanoestructurada necesaria para la realizacin exitosa de este dispositivo, con el fin de lograr el aumento de la sensibilidad y lmites de deteccin ms bajos de los bio-sensores. Este proyecto contribuir al desarrollo de microarrays electroqumicos de ADN. El proyecto es multidisciplinario y aborda los campos del auto-ensamblaje molecular y el reconocimiento molecular en superficies, la biologa molecular, el diseo de instrumentos y tcnicas de microfabricacin. La metodolo-ga de la investigacin se centrar en la preparacin de las superficies de los electrodos nanoestructura-dos. Se investigarn metodologas para la fabricacin de monocapas de superficies nanoporosas, bus-cando optimizar el tamao y el grosor de los poros de las superficies polimricas. Las superficies prepa-radas sern funcionalizada con sondas de ADN cancergeno y se monitorear los eventos de inmoviliza-cin e hibridacin con el ADN complementario. Por ltimo, a fin de evaluar los dispositivos preparados se usarn tcnicas como la microscopa de fuerza atmica, la voltametra y espectroscopia de impedancia electroqumica rutinariamente para confirmar la funcionalizacin eficiente y el funcionamiento del disposi-tivo. ____________________________________________________________________________
III. Informativo
PRODUCCIN DE BACTERINAS INACTIVADAS PARA PREVENIR LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS DE ORIGEN BACTERIANO EN COBAYOS (Cavia porcellus) DE LA PROVINCIA DE LOJA. RESUMEN
Actualmente uno de los mecanismos de prevencin que se est empleando es el uso de bacterinas (pro-ducto biolgico que se obtiene a partir de exudados o productos del animal enfermo, el cual es procesa-do, para posteriormente inocularlo y estimular al sistema inmunolgico, provocando una respuesta espe-cfica), con la finalidad de generar inmunologa (anticuerpos) frente a los agentes patgenos, y con ello evitar el uso de productos antimicrobianos, que se expresara en el abaratamiento de los costos de pro-duccin y por ltimo y no por ello menos importante, como una medida de prevencin del posible impacto que dichos medicamentos pueden producir en el medio ambiente. Cabe destacar que en el mercado nacional no se encuentran bacterinas para esta especie, ni para prevenir, en particular, los problemas respiratorios, principal causa de la alta morbi-mortalidad de los cobayos, razones por las cuales el Cen-tro de Biotecnologa de la Universidad Nacional de Loja, se ve en la necesidad de implementar un labora-torio para producir bacterinas y ofertar a los productores para la prevencin de problemas de salud de sus animales, que les causa serios daos econmicos.
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ACTIVIDADES Y EVENTOS REALIZADOS EN EL CENTRO DE BIOTECNOLOGA

Seminario interno de anlisis de los proyectos en formulacin, con miras a recoger los criterios del grupo de investigadores del centro de biotecnologa. Presentacin de los proyectos para anlisis, ante los profesores y estudiantes del rea Agrope-cuaria y de Recursos Naturales Renovables, 18 de mayo de 2011 en el Aula Magna de la Ca-rrera de Medio Ambiente. Socializacin de los proyectos con investigadores del Centro Biotecnologa en el aula de proyecciones, 05 de octubre de 2011. Gestin ante la Cooperacin Belga en el marco del programa VLIR- UOS para aprobacin del proyecto Estudio de las interacciones patgeno-patgeno, que se establecen durante el desarrollo de la enfermedad de la marchitez vascular en el babaco (vasconcellea helbor-nii var. pentagona), con asistencia directa del Dr. Aminael Snchez Rodrguez, Ph. D. a eje-cutarse en coordinacin con el Centro de Gentica de Plantas y Microorganismos de la Univer-sidad Catlica de Lovaina y el Centro de Biotecnologa de la Universidad Nacional de Loja. El proyecto se encuentra aprobado.
nebuliza-cin para el invernadero del Centro de Biotecnologa y la compra de 2 bombas de mochila para fumigacin.
Reparacin e instalacin de dos cmaras frigorficas para conservacin de material fitogentico.
Creacin de una base de datos del banco de germoplasma, que recopila informacin de las ac-cesiones; ao de ingreso, cdigo de banco, nmero de estante, nmero de frasco, nombre co-mn, nombre cientfico, pas, provincia, cantn y localidad.
Desarrollo de la tesis titulada Repotenciacin de cmaras frigorficas para el centro de Biotecnologa de la Universidad Nacional de Loja.
Readecuacin de los espacios logsticos del Banco de Germoplasma como: cambio de cubierta, puntos de luz, toma de agua, reservorios, implementacin de un sistema de riego por
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Creacin del laboratorio de Microbiologa y Bioinoculantes, adquisicin de equipos, materiales y reactivos.
Tutotia de Dr. Rmulo Chvez Valdivieso Ph. D. a: - Identificacin de las patologas de los rganos genitales de las vacas faenadas en el camal fri-gorfico de Loja, CAFRILOSA - Estudio de la eficacia de protocolos en la sincronizacin del celo de cabras del bosque seco tropical de la provincia de Loja, a base de la combinacin de progestgenos con estradiol y en asociacin con gonadotropina corionica Tutoria de Ing. Ivn Granda Mg. Sc., a: - Identificacin y caracterizacin de cepas nativas de Rhizobium: sobre genotipos de frejol comn (Phaseolus vulgaris), en diferentes condiciones agroecolgicas de la provincia de Loja. Realizacin del curso: Biologa Molecular para la Identificacin de Microorganismos y Anlisis Computacional de Informacin Gentica los das 20-29 de julio de 2011, dictado por los profesores: Dr. Aminael Snchez, Ph.D., y, Dr. Roldan Torres, Ph.D., de Blgica y Cuba respectivamente. Formulacin de la propuesta y preparacin de la documentacin soporte para el desarrollo de la Maestra en Ciencias en Biotecnologa Genmica, que se pretende ejecutar con el apoyo del Instituto Nacional Politcnico de Mxico, - IPN, Centro de Biotecnologa Genmica de Rey-nosa, Mxico. Elaboracin de la Programacin Institucional, a nivel de proyecto: POA 2012; PAC 2012. Defensa y sustentacin de los proyectos ante la Comisin de Investigacin de la Universidad Nacional de Loja, logrndose su aprobacin e inclusin en el Presupuesto General de Investigacin de la Universidad Nacional de Loja.. ____________________________________________________________________________
CURSOS Y EVENTOS EN LOS QUE HA PARTICIPADO EL PERSONAL DEL CENTRO

Apoyo en la formulacin de tesis de pregrado y direccin de proyectos de investigacin de tesis, por el personal del centro de biotecnologa: Tutoria de Ing. Natalia Morales Mg. Sc. a: - Caracterizacin morfolgica y molecular de 100 accesiones de aj (Capsicum baccatum) del banco de germoplasma del Centro de Biotecnologa de la Universidad Nacional de Loja. - Caracterizacin molecular de la resistencia del tomate a Fusarium oxysporum Curso Terico-Prctico Fundamentos de la PCR en Tiempo Real y Aplicaciones en Biologa Molecular. 06-07 de abril del 2011. Pontificia Universidad Catlica del Ecuador. Quito. Seminario Taller Lectura, Escritura y Comunicacin de la Ciencia. 30 de mayo al 03 de junio de 2011. UNL. Loja. Taller Diseo y Elaboracin de Proyectos de Investigacin Cientfica. 11-15 de julio del 2011. UNL. Loja. Curso Terico-Prctico Uso y Aplicaciones de Marcadores Moleculares en Biotecnologa
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Agr-cola, 14 al 18 de noviembre de 2011. INIAP. Estacin Experimental Pichilingue, Quevedo. VIII Simposio Internacional de Recursos Genticos de Amrica Latina y el Caribe. 21 al 23 de noviembre de 2011. Quito. Taller Bioseguridad y Desechos Infecciosos. 25-26 de noviembre del 2011. MSP. Loja. ____________________________________________________________________________
GRUPO DE INVESTIGADORES DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA 2011 - 2012

Dr. Rmulo Chvez Valdivieso, Ph.D. E-mail: rchaval.24@gmail.com Ing. Mara Natalia Morales Palacio Mg.Sc. E-Mail: nataliamorales88@yahoo.es Ing. Ivn Patricio Burneo Saavedra Mg.Sc. E-mail: ivanburneo@gmail.com Ing. Klever Ivn Granda Mora Mg. Sc. E-mail: ivang100@gmail.com Ing. Angel Rolando Robles Carrin Mg. Sc E-mail: aroblescarrin@gmail.com Ing. Anbal Homero Ruiz Snchez E-mail: anibalruiz1@hotmail.es Ing. Marlon Oswaldo Pineda Escobar E-mail: mao_os11@yahoo.es Blgo. Omar Santiago Erazo Sotomayor E-mail: santiagoe07@hotmail.com Med. Vet. Vanessa Herrera Yunga E-mail: vanpa_06@hotmail.com
APOYO A LA FORMACION EN CALIDAD DE DOCENTES:

Ing. Mara Natalia Morales Palacio, Mg.Sc., en las Carreras de: Ingeniera Agronmica; y, Manejo y Conservacin del Medio Ambiente Dr. Rmulo Chvez Valdivieso, Ph.D., en la Carrera de Medicina Veteriana y Zootecnia.
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

Loja - Ecuador 2012

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

Volumen: 1, Nro. 1 Ao: 2012

COMIT DIRECTIVO DEL CENTRO DE BIO-TECNOLOGIA:

DIRECTOR DE INVESTIGACIN - UNL DOCENTE INVESTIGADOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

RESPONSABLE DE COMUNICACIN INSTITUCIONAL

DISEO Y DIAGRAMACIN - UNL

INFORMATIVO DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGA - 2011

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RECURSOS GENTICOS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACIN

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BIOLOGA DE SISTEMAS Y BIOINFORMTICA: ESTUDIO DE INTERACCIONES FITOPATOLGICAS

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MICROORGANISMOS DIAZOTRFICOS Y SU CONTRIBUCIN A LA FIJACIN BIOLGICA DEL NITRGENO

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cada usando tcnicas de biologa molecular (Weir et al., 2006).

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cimiento de las clulas de los microorganismos fitopatgenos. Competencia

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MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIN LYCOPERSICON

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NANOESTRUCTURAS POLIMRICAS PARA LA DETECCIN DE ADN

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to hybridisation and blocking of the pore structure.

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II. Resumen de proyectos

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MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIN LYCOPERSICON Resumen

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