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Tcnicas de Extrao Extrao implica em se obter material orgnico livre de sua matriz original (clulas e tecidos).

O isolamento e o estudo de substncias naturais uma preocupao central das cincias qumicas e biolgicas. A bioqumica investiga a qumica de produtos naturais do metabolismo primrio, que produz substncias amplamente distribudas nos seres vivos: aminocidos, lipdios, carboidratos e macromolculas (protenas, polissacardeos cidos nuclicos). A qumica de produtos naturais do metabolismo secundrio (especializado) estudada por qumicos orgnicos, freqentemente reconhecidos como qumicos de produtos naturais. O qumico dispe de uma diversidade de procedimentos e sistemas contnuos e descontnuos para uso na extrao do material biolgico a partir da sua fonte natural, como por exemplo: macerao, soxhlet, percolao, enfleurage, etc. Dependendo do que se deseja extrair algumas tcnicas so mais recomendadas que outras. Apresentar as tcnicas e metodologias utilizadas para a extrao e isolamento de molculas de baixo peso molecular (produtos naturais) a partir de matrizes biolgicas (microorganismos, plantas e animais). 1. 2 Cromatografia Introduzida pelo pesquisador russo Michael Tswett em 1906, quando separou clorofila de uma mistura de pigmentos de plantas, atravs de uma coluna cheia de carbonato de clcio em p, fazendo a lavagem com ter de petrleo. Conforme a amostra descia pela coluna, apareciam bandas separadas e cores distintas. Palavra de origem grega, onde cromo significa cor e grafia significa escrita, ou seja, escrita em cores. Mas a cromatografia pode separar os componentes sem nenhum aparecimento de cor. A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao que se fundamenta na migrao diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis: fase mvel (gs, lquido ou um fluido supercrtico) e fase estacionria (fixa, colocada em uma coluna ou numa superfcie slida), esta separao depende da diferena entre o comportamento dos analitos entre as fases.

A fase estacionria pode ser slida ou lquida, quando slida, o mecanismo da cromatografia baseado na adsoro das substncias dissolvidas (cromatografia por adsoro). medida que a soluo passa atravs da fase slida, os solutos vo sendo sucessivamente adsorvidos e dissolvidos, cada qual com uma caracterstica especfica. Por isso, no processo de escoamento da soluo os que so mais adsorvidos atrasam-se em relao aos menos adsorvidos, e consegue-se separao uns dos outros. Quando a fase estacionria lquida, o mecanismo da separao baseado na diferente repartio dos solutos entre o solvente da soluo e o lquido estacionrio (cromatografia por repartio). A mistura adsorvida em uma fase fixa, e uma fase mvel "lava" continuamente a mistura adsorvida. Pela escolha apropriada da fase fixa e da fase mvel, alm de outras variveis, pode-se fazer com que os componentes da mistura sejam arrastados (eluidos)

ordenadamente. Aqueles que interagem pouco com a fase fixa so arrastados facilmente e aqueles com maior interao ficam mais retidos. Os componentes da mistura adsorvem-se com as partculas de slido devido a interao de diversas foras intermoleculares. O composto ter uma maior ou menor adsoro, dependendo das foras de interao, que variam na seguinte ordem: formao de sais > pontes de hidrognio > dipolo-dipolo > Van der Waals. Dependendo da natureza das duas fases envolvidas tem - se diversos tipos de cromatografia (Figura 1): 1. 2. 1 - Objetivo Apresentar as tcnicas e metodologias preciso, de alta para

utilizadas

anlise de comportamento na separao de substncias em termos cromatogrficos.

2 - METODOLOGIA 2. 1 Mtodos de extrao de produtos naturais Nessa fase, cabe ao enlogo adotar um procedimento para obter uma extrao seletiva dos diferentes compostos naturais de modo a extrair o mximo possvel daqueles que aportam qualidade a extrao e o mnimo possvel dos que concorrem para a limitao da qualidade, sendo que a extrao deve ser rpida e econmica. O mtodo de extrao dos produtos naturais depende de uma srie de fatores, tais como: sua localizao no vegetal, suas propriedades fsico-qumicas, a finalidade a que se destina e a escolha do solvente a ser utilizado na extrao, pois, se tornam extremamente importantes na quantificao do extrato. Idealmente, o solvente deve extrair eficientemente as substncias desejadas, ser atxico, barato e ter ponto de ebulio adequado para se evitar a decomposio trmica das substncias extradas. Conhecidos os princpios ativos inerentes em determinado composto natural, o manuseio da tcnica de extrao se torna mais conveniente. Alguns mtodos utilizados na extrao so: - Mtodos contnuos: 1. Percolao a passagem contnua do lquido extrator atravs do material (sco ou mido, partido ou triturado) em aparelhos conhecidos por percoladores, com controle do fluxo e variao da mistura do solvente extrator a tcnica permiti uma extrao eficiente, sendo que a extrao pode ser realizada pela passagem do solvente a quente ou a frio. Com esta simples operao, podemos obter resultados sumamente interessantes nas mais diversas disciplinas cientficas. 1. Com o uso de Soxhlet(Figura 2)

Mtodo descrito por Franz Von Soxhlet em 1879, onde, o solvente extrator continuamente renovado na cmara de extrao, por destilao, convertido em um lquido que goteja no filtro contendo o material que sofre respectivas lavagens (Percolao). 1. Extrao com dixido de carbono Trata-se de um mtodo recente, que emprega temperaturas mais baixas relativamente s da destilao, o que o torna num mtodo menos agressivo para as plantas. Consiste em colocar as plantas num tanque de ao inoxidvel, posteriormente injetado com dixido de carbono, que aumenta a presso do tanque. Quando submetido a altas presses, o dixido de carbono liquidifica-se, atuando como um solvente que permite extrair os leos essenciais das plantas. Seguidamente, a presso diminui e o dixido de carbono volta ao estado gasoso, no deixando, assim, quaisquer vestgios. - Mtodos descontnuos 1. Macerao Neste processo, a substncia vegetal deixada em contato com o veculo (lquido usado para dissolver o princpio ativo, como por exemplo: lcool, leo, gua ou outro lquido extrator), em temperatura ambiente. O perodo de macerao (horas ou dias) depende do material a ser utilizado. Folhas, flores e outras partes so picadas e ficam macerando por 10 a 12 horas, enquanto as partes mais duras ficam macerando por 18 a 24 horas. Aps este perodo, o solvente deve ser removido por filtrao, e o resduo re-extrado. Em geral, trs extraes por macerao so suficientes para que se obtenha um mximo de eficincia extrativa. Embora lenta, a macerao o mtodo de extrao mais utilizado e excelente para obter o princpio ativo em toda sua integridade. 1. Arraste a vapor A tcnica de extrao pelo arraste de vapor permite a separao de componentes volteis, sem necessidade de temperaturas elevadas, evitando-se assim, a sua decomposio trmica.

Em escala de laboratrio, a tcnica pode ser convenientemente realizada por meio de um sistema de destilao simples, adaptado com um funil de adio, atravs do qual gua adicionada constantemente, permitindo assim, que o nvel da gua no frasco de destilao permanea constante (Figura 4). 1. Enfleurage Mtodo tradicionalmente utilizado para extrair leo essencial de flores delicadas como o jasmim e a rosa, que possuem propriedades fisiolgicas de perder seus perfumes sempre aps serem colhidas aplicao de gordura (graxa) possuidora de alto poder de absoro em contato com as flores aromticas absorve o perfume emitido. Durante o perodo de colheita, nas ltimas oito ou dez semanas, as flores cortadas de fresco so estendidas sobre a superfcie de um preparado especial base de gorduras, por determinado tempo (24 horas no caso de jasmim), sendo substitudo, depois, por flores frescas. At o fim da colheita, a gordura no removida, pois durante o processo torna-se completamente saturada com leo de flores. Por fim o leo extrado da gordura por tratamento com lcool. Porm, o lcool evapora-se, originando, deste modo, leos essenciais muito concentrados, conhecidos como absolutos. Este um mtodo que exige muita diligncia e elevados custos, mas que bastante utilizado pelos produtores de perfumes. 1. Prensagem A prensagem um mtodo fsico pelo qual a planta espremida, obtendo -se deste processo o leo essencial. O exemplo desse processo a retirada de leo essencial de plantas ctricas. Outros processos mais sofisticados permitem obter extratos qualitativamente superiores. Entre eles pode-se mencionar a ESAM Extrao por Solventes Assistidos por Microondas, o VMHD ( Vacuum Microwave HydroDistillation ) e a extrao biotecnolgica ( fermentao e bioconverso). 2. 2 Cromatografia

Os componentes das amostras so distribudos entre duas fases, uma das quais permanece estacionria, enquanto a outra elui entre os interstcios ou sobre a superfcie da fase estacionria. O movimento da fase mvel resulta numa migrao diferencial dos componentes da amostra. O mecanismo envolvido nesta migrao diferencial vai depender do tipo da fase mvel e estacionria utilizado. Os mtodos cromatogrficos possuem uma faixa de aplicao ilimitada. Podem ser usadas para separao de molculas menores, como H2 e O2, at as maiores, como protenas, lipdios, etc.

Cromatografia Gasosa (CG)


uma das tcnicas mais empregadas em anlises qualitativas e quantitativas. Colunas capilares so utilizadas em determinaes por cromatografia gasosa a temperatura que excedem 4OO. Aplicaes a essas temperaturas requerem fases estacionrias especiais e tubos que no se decompem. Devido a isso os tubos de muitas colunas so feitos de ao inoxidvel.

Cromatografia Gs-lquido
A cromatografia gs liquido encontra amplo uso em todas as reas da cincia. Nesta cromatografia, a fase mvel um gs, enquanto a fase estacionria um liquido retido na superfcie de um slido inerte por adsoro ou ligao qumica. A cromatografia gs-liqudo baseada na partio do analto entre a fase mvel gasosa e uma fase lquida imobilizada na superfcie de um material slido inerte de recheio ou nas paredes de um tubo capilar.

Sistema de Gs de Arraste
A fase mvel em cromatografia gasosa denominada gs de arraste e deve ser quimicamente inerte. O hlio a fase mvel gasosa mais comum, embora o argnio, o nitrognio e o hidrognio sejam tambm empregados. Esses gases esto disponveis em cilindros

pressurizados. Reguladores de presso, manmetros e medidores de vazo so necessrios para se controlar a vazo do gs. As vazes so controladas por um regulador de presso de dois estgios no cilindro do gs e algum tipo de regulador de presso ou regulador de fluxo montado no cromatogrfico. Admite-se que as vazes sero constantes se a presso de entrada permanecer constante.

Sistema de Injeo da Amostra


A eficincia da coluna requer que a amostra seja do tamanho adequado e introduzido como uma zona estreita de vapor; a injeo lenta ou de amostras volumosas causa o espalhamento das bandas. Seringas calibradas so empregadas para a injeo de amostras liquidas por meio de uma porta de admisso da amostra aquecida localizada na cabea da coluna. A porta de admisso da amostra mantida a cerca de 50C acima do ponto de ebulio do componente menos voltil da amostra. Para o trabalho quantitativo, volumes de amostra mais reprodutveis para ambos, lquidos e gases, so obtidos por uma vlvula de amostragem. As amostras slidas so introduzidas como solues.

Sistemas de deteco
Detectores so dispositivos que indicam os componentes separados pela coluna. Examinam continuamente o material, gerando um sinal na passagem de substncias que foram separadas. Trs tipos de detectores: Universais geram um sinal para qualquer composto. Seletivos geram um sinal apenas para compostos com determinadas caractersticas. Especficos geram um sinal para compostos que tenham um determinado elemento na sua estrutura.

Colunas e fases estacionrias para a cromatografia gasosa


Dois tipos gerais de colunas so encontrados em cromatografia gasosa: Colunas capilares ou tubulares abertasde dois tipos bsicos:

- Coluna tubular aberta de parede recoberta (TAPR) WCOT, do ingls wall-coated open

tubular so simplesmente tubos capilares recobertos com uma fina camada de fase
estacionria. - Colunas tubulares abertas revestidas com suporte (TARS) SCOT, do ingls support-

coated open tubular - a superfcie interna do capilar revestida com um filme fino (_30 mm)
de um material de suporte, com terra diatomcea. Esse tipo de coluna retm uma quantidade de fase estacionria muitas vezes maior que uma coluna de parede recoberta. As colunas capilares mais empregadas so as colunas tubulares abertas de slica fundida (CTAS) FSOT, do ingls fused-silica open tubular. Os capilares de slica fundida so puxados a partir de slica purificada especial que contm quantidades mnimas de xidos metlicos. Esses capilares apresentam paredes muito mais finas que os de vidro. Os tubos tm sua resistncia reforada por meio do recobrimento externo de proteo de poliimida, o qual aplicado medida que o tubo capilar puxado. As colunas resultantes so bastante flexveis e podem ser enroladas em bobinas com dimetros de poucas polegadas. Colunas recheadas - So densamente recheadas com um material uniforme e

finamente dividido, ou suporte slido, que recoberto com uma camada fina de fase estacionria lquida. A Tabela 1 compara as caractersticas de desempenho de colunas capilares de slica fundida com outros tipos de colunas de parede recoberta, bem como com as de colunas com suporte revestido e recheadas. Fases estacionrias lquidas:

As propriedades desejveis de uma fase lquida imobilizada em uma coluna cromatogrfica gs-lquido incluem (1) baixa volatilidade (idealmente, o ponto de ebulio do lquido deve ser pelo menos 100 C maior que a temperatura mxima de operao da coluna); (2) estabilidade

trmica; (3) inrcia qumica e (4) caractersticas de solvente apropriadas para que os valores
de k e para os solutos a serem resolvidos caiam dentro de uma faixa adequada. O tempo de reteno para um analito na coluna depende da sua constante de distribuio que, por sua vez, est relacionada com a natureza qumica da fase estacionria. Para separar os vrios componentes de uma amostra, suas constantes de distribuio devem ser suficientemente diferentes para possibilitar uma separao bem definida.

Algumas Fases Estacionrias Comuns

A Tabela 2 lista as fases estacionrias mais empregadas em colunas recheadas e colunas tubulares abertas de cromatografia gasosa na ordem crescente de polaridade.

Aplicaes da Cromatografia Gs lquido


A cromatografia gs-lquido pode ser aplicada s espcies relativamente volteis e termicamente estveis a temperaturas de at poucas centenas de graus Celsius. Um grande nmero de compostos de interesse possui essas qualidades. Conseqentemente, a cromatografia gasosa tem sido amplamente aplicada na separao e determinao de componentes em variados tipos de amostras. A Figura 8 mostra os cromatogramas para algumas dessas aplicaes. Figura - Cromatogramas

Cromatografia Gs Slido
A cromatografia gs - solido baseada na adsoro das substancias gasosas sobre as superfcies solidas. Esta cromatografia til para a separao de espcies que no so retiradas pelas colunas gs - liquido, como os componentes do ar, sulfeto de hidrognio, dissulfeto de carbono e gases raros.

A cromatografia gs - slido recheadas ou tubulares abertas com camada porosa o colunas.

Cromatografia Lquida Clssica (CLC)


A cromatografia lquida clssica uma tcnica de partio entre duas fases, slida e lquida, baseada na capacidade de adsoro e solubilidade. Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plstico, preenchida com um adsorvente adequado. O adsorvente pode ser colocado na coluna diretamente (seco) ou suspendido em um solvente adequado (geralmente o prprio eluente a ser usado no processo de separao). O slido deve ser um material insolvel na fase lquida associada, sendo que os mais utilizados so a slica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de p. A substncia a ser separada ou analisada colocada na coluna pela parte superior e o eluente vertido aps, em quantidade suficiente para promover a separao. A coluna pode ser um simples tubo de vidro, aberto em ambas as extremidades, ou semelhante a uma bureta. Em alguns casos aplica-se vcuo pela parte inferior da coluna ou uma ligeira sobrepresso pela parte superior da mesma.Uma seqncia de eluentes normalmente utilizada a seguinte: ter de petrleo, hexano, ter etlico, tetracloreto de carbono, acetato de etila, etanol, metanol, gua e cido actico. Quando a amostra a ser cromatografada possui cor, pode-se visualizar as diferentes zonas coloridas descendo pela coluna, que so recolhidas, separadamente, pela extremidade inferior. Quando a amostra no possui cor, recolhem-se vrias fraes iguais de eluente, testando-as quanto presena ou no de substncias dissolvidas atravs do uso de reveladores adequados (luz UV, reveladores qumicos, etc.). Um exemplo de aplicao da cromatografia em coluna a separao dos pigmentos do espinafre. O fluxo de solvente deve ser contnuo. Os diferentes componentes da mistura mover-se-o com velocidade distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e tambm pelo eluente. Assim, a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente com relao ao composto.

medida que os compostos da mistura so separados, bandas ou zonas mveis comeam a ser formadas; cada banda contendo somente um composto. Em geral, os compostos apolares passam atravs da coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros tm menor afinidade com a fase estacionria. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela no se mover. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eludos sem serem separados. Por uma escolha cuidadosa das condies, praticamente qualquer mistura pode ser separada (Figura 6). Outros adsorventes slidos para cromatografia de coluna em ordem crescente de capacidade de reteno de compostos polares so: papel, amido, aucares, sulfato de clcio, slica gel, xido de magnsio, alumina e carvo ativo. Ainda, a alumina usada comercialmente pode ser cida, bsica ou neutra. A alumina cida til na separao de cidos carboxlicos e aminocidos; a bsica utilizada para a separao de aminas.

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)


Por meio da cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) pode-se detectar a maioria dos compostos e analisar traos de compostos em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos e petrleo. As anlises de fluidos biolgicos so de extrema importncia considerando a medicina veterinria, pois, por meio da separao, identificao e quantificao de determinados compostos em amostra de sangue, urina, contedo gstrico, amostras de rgos em geral possvel determinar resduos de medicaes em leite e carne de animais para consumo, auxiliar no diagnstico de intoxicaes, uma vez que possvel identificao de venenos em amostras biolgicas, estudar metablitos gerados por administrao de drogas, dentre outras inmeras aplicaes. A CLAE o tipo mais verstil e mais amplamente empregado de cromatografia por eluio. Essa tcnica utilizada pelos qumicos para separar e determinar espcies em uma grande variedade de materiais orgnicos, inorgnicos e biolgicos. Na cromatografia lquida, a fase mvel um solvente lquido, o qual contm a amostra na forma de uma mistura de solutos.

Sistema de solventes
Um instrumento moderno de CLAE equipado com um ou mais reservatrios de vidro, cada um deles tendo 500 mL ou mais de um solvente. Freqentemente so tomadas medidas para a remoo de gases dissolvidos e de partculas presentes nos lquidos. Os primeiros produzem bolhas na coluna causando, assim, um alargamento de banda; alm disso, as bolhas e os particulados interferem no desempenho da maioria dos detectores. Os desgaseificadores podem ser constitudos por sistemas de aplicao de vcuo, sistemas de destilao, um dispositivo de aquecimento e agitao ou, como mostrado na Figura 10, um sistema de

sparging, no qual os gases dissolvidos so arrastados para fora da soluo por pequenas bolhas
de um gs inerte que no solvel na fase mvel. Uma eluio com um nico solvente ou com uma mistura de solventes de composio constante isocrtica. Na eluio por gradiente, dois (e s vezes mais) sistemas solventes que diferem significativamente em polaridade so empregados. A razo entre os dois solventes varia em uma forma pr-programada durante a separao, algumas vezes de forma contnua e por vezes em etapas. A eluio por gradiente geralmente melhora a eficincia da separao, da mesma forma que a programao de temperatura o faz na cromatografia gasosa. Os instrumentos modernos de CLAE so equipados com vlvulas que introduzem lquidos a partir de dois ou mais reservatrios em propores que podem ser variadas continuamente (ver Figura 10) A necessidade de se efetuar anlises por gradiente ou empregando misturas de solventes, requer que eles sejam miscveis entre si. Insolubilidade leva formao de gotculas de solvents suspensas na sada da coluna, produzindo rudo nos detectores. A substituio de solventes requer que eles sejam miscveis entre si, a fim de se poder lavar a bomba, a tubulao, a coluna e o detector. A Tabela 3 mostra um diagrama de solubilidade entre os solventes mais empregados em CLAE.

Sistema de Bombeamento
Os requisitos para as bombas de cromatografia lquida incluem (1) habilidade de gerar presses de at 6.000 psi (libras/polegadas quadradas), (2) sada livre de pulsao, (3) vazes na faixa de 0,1 a 10 mL/min, (4) reprodutibilidade relativa da vazo de 0,5% ou melhor e (5) resistncia corroso por uma grande variedade de solventes. As altas presses geradas pelas bombas de cromatografia lquida no representam risco de exploso porque os lquidos no so muito compressveis. Assim, a ruptura de um component resulta somente em vazamento do solvente. Contudo, esse vazamento pode constituir um risco de incndio ou para o ambiente, dependendo do tipo de solvente. H trs tipos principais de bomba: a de seringa acionada por rosca, a bomba recproca e a bomba pneumtica de presso constante. As bombas de seringa produzem uma sada livre de pulsao cuja vazo pode ser controlada facilmente; no entanto, elas apresentam pequena capacidade (_250 mL) e se tornam inconvenientes quando preciso trocar o solvente. A Figura 11 exibe o tipo de bomba mais amplamente empregado, a bomba recproca. Esse dispositivo consiste em uma cmara pequena cilndrica que preenchida e esvaziada pela movimentao de ida e vinda de um pisto. O movimento da bomba produz um fluxo pulsado que deve ser atenuado posteriormente. As vantagens das bombas recprocas incluem o volume interno pequeno, alta presso de sada (at 10.000 psi), pronta adaptao eluio por gradiente e vazes constantes, as quais so bastante independentes da queda de presso imposta pela coluna e da viscosidade do solvente. A maioria dos cromatgrafos comerciais modernos emprega bombas recprocas.

Sistema de Injeo de amostras


Anteriormente, a introduo da amostra era efetuada de forma similar realizada na cromatografia gasosa, ou seja, mediante micro-seringa que injeta a amostra dentro de uma pequena cmara, de onde eluda pela fase mvel. Os equipamentos modernos empregam vlvulas para amostragem, como a ilustrada esquematicamente na Figura 12. A amostra, introduzida na vlvula mediante seringa, deve encher o espao interno da poro do tubo capilar de ao, a ala de amostragem (carga). Normalmente o volume contido na ala de 1 a

100 L. A amostra injetada na coluna, ao girar a vlvula para que a posio de entrada e sada mude (injeo na coluna). Desta forma pode injetar-se na coluna pressurizada um intervalo amplo de volumes de amostra, dependendo do tubo capilar (ala de amostragem) utilizado, com um alto grau de reprodutibilidade. As vlvulas para amostragem so fabricadas somente de material inerte, como teflon e ao inoxidvel, e seu desenho tal que resistem a presses muito elevadas.

Colunas para Cromatografia Lquida de Alta Eficincia


As colunas cromatogrficas so geralmente construdas de tubos de ao inoxidvel, embora tubos de vidro ou Tygon sejam algumas vezes empregados em aplicaes de baixa presso (6 600 psi). A maioria das colunas apresenta comprimento na faixa de 10 a 30 cm e possuem dimetros internos entre 2 e 5 mm. Os recheios das colunas tipicamente apresentam partculas de dimetros entre 3 e 10 mm. As colunas desse tipo fornecem entre 40.000 e 60.000 pratos m_1. Recentemente, as microcolunas tornaram-se disponveis com dimetros internos de 1 a 4,6 mm e comprimentos de 3 a 7,5 cm. Essas colunas, as quais so recheadas com partculas de 3 a 5 mm, contm cerca de 100.000 pratos m_1 e apresentam vantagens quanto velocidade e consumo mnimo de solventes. Essa ltima vantagem de importncia significativa, pois os solventes de altssima pureza necessrios cromatografia lquida custam muito caro, tanto para ser adquiridos como para ser descartados aps o uso.

Detectores
Os detectores em CLAE devem apresentar um volume morto pequeno de forma a minimizar o alargamento de banda extra coluna. O detector deve ser pequeno e compatvel com a vazo de lquido. Nenhum sistema de deteco universal de alta sensibilidade, como aqueles encontrados para a cromatografia gasosa, est disponvel para a cromatografia lquida de alta eficincia. Assim, o detector a ser empregado vai depender da natureza da amostra. A Tabela 4 lista alguns dos detectores comuns e suas propriedades.

Mecanismos de separao

O tipo de cromatografia lquida de alta eficincia geralmente definido pelo mecanismo de separao ou pelo tipo de fase estacionria. Estes incluem (1) partio ou

cromatografialquido-lquido; (2) adsoro ou cromatografia lquido-slido; (3) troca inica ou cromatografiade ons; (4) cromatografia por excluso; (5) cromatografia liquida com fase ligada. 1. A cromatografia lquido-lquido (CLL) foi desenvolvida para separao de vrios aminocidos, usando uma fase estacionria de gua em slica e clorofrmio como fase mvel. O mecanismo de separao neste tipo de cromatografia, ou mecanismo de distribuio como tambm chamado, baseia se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase mvel e na fase estacionria. Ento, os componentes mais solveis na fase estacionria so seletivamente retidos por ela, enquanto os menos solveis so transportados mais rapidamente pela fase mvel. A CLL utilizada para compostos levemente polares, cujas massas moleculares so inferiores a 2000. O maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase estacionria na fase mvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a no reprodutividade nas separaes repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras. A primeira saturando a fase mvel com a fase estacionria por meio de uma pr - coluna, colocada antes do injetor, que contenha uma alta percentagem da fase estacionria. A segunda utilizando materiais que contenham a fase estacionria quimicamente ligada a um suporte slido, o que possibilita a execuo de uma programao da fase mvel. 2. O mecanismo de separao da cromatografia lquido-slido (CLS), ou por adsoro, se baseia na competio que existe entre molculas da amostra e as da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um slido (fase estacionria). Para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na fase estacionria, primeiro uma molcula da fase mvel deve ser deslocada da superfcie. Se assumir que o adsorvente possui uma superfcie polar (slica ou alumina), grupos apolares (hidrocarbonetos) tero pouca afinidade por esta superfcie e no iro deslocar a molcula da fase mvel; por isso, no sero retidos. Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrognio tero fortes afinidades pela superfcie e sero fortemente retidos. Molculas polarizveis iro apresentar interao dipolo-induzindo-dipolo com a superfcie do adsorvente e, portanto, tambm sero retidas; o grau de reteno

depende da polarizao de cada molcula ou grupo funcional. Compostos diferenciados em tipo qumico ou nmero de grupos funcionais so facilmente separados pela CLS; por exemplo, cidos graxos, alcois, alcalides, aminas, antioxidantes, barbitricos, corantes, esterides, fenis, lipdeos, vitaminas, etc. 3. Na cromatografia por troca inica (CTI), a fase estacionria , normalmente, uma resina de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno, a qual se ligam grupos inicos, como, por exemplo, o grupo cido sulfnico (cido forte) no caso do trocador de ctions, e o grupo aminas primrias (base fraca) no caso do trocador de nions. Os grupos inicos tm um contra-on (com carga oposta) que pode ser deslocado pelos ons da fase mvel de carga similar a ele. Exemplos caractersticos dos compostos separados por CTI so cidos Carboxlicos, acares, analgsicos, vitaminas, nions inorgnicos e ctions metlicos ou complexos. Contudo, esta tcnica pode ser tambm aplicada na separao de peptdeos, aminocidos e cidos nuclicos, que podem se ionizar em solues com pH devidamente tamponado. 4. A cromatografia por excluso (CE) efetua a separao de acordo com o tamanho efetivos das molculas. A coluna recheada com matria inerte cujos poros tm tamanho controlado. As molculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros e apresentarem um maior tempo de reteno, enquanto as maiores so excludas de todos os poros. Assim molculas grandes movem-se rapidamente atravs da coluna e as molculas pequenas so eludas lentamente pela fase mvel, no havendo nenhuma interao fsica ou qumica entre o analito e a fase estacionria. O intervalo de massas moleculares em que se pode trabalhar por CE varia desde aproximadamente 1000 at vrios milhes. A CE clssica emprega materiais frgeis, incapazes de resistirem a presses maiores do que quatro bars. Em contraste, a CLAE necessita de matrias com estruturas mais rgidas. Esta tcnica predominantemente usada para anlises de compostos de alta massa molecular, incluindo polmeros orgnicos. 5. A fase estacionria para a cromatografia lquida com fase ligada (CLFL) surgiu como conseqncia de problemas associados com a CLL. Visto que a fase estacionria est quimicamente ligada superfcie de um suporte, elimina-se o problema da solubilidade da fase

estacionria na fase mvel. O mecanismo principal desta tcnica baseia-se na partio, mas tambm ocorre o mecanismo de adsoro. Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionria, possvel obter diferentes tipos de seletividade. Tais grupos podem ser de natureza polar, que, funcionando similarmente s fases polares da CLS, so chamados de fase normal, ou de natureza apolar, que so de fase reversa. Esta tcnica, usando as fases apolares, tem inmeras aplicaes, tendo resolvido vrios problemas cujas solues at ento eram consideras muito difceis. Algumas classes de compostos que so facilmente separadas pela tcnica de fase reversa so alcalides, alcois, antibiticos, aromticos, barbitricos, pesticidas clorados e vitaminas. Algumas classes que so facilmente separadas usando as fases polares so alcalides, alcois, anilinas, aromticos, complexos metlicos, corantes, esterides, fenis, glicis e pesticidas. Compostos fracamente inicos (cidos e bases) podem ser separados se a dissociao for suprimida por tamponao na escala de pH 2-8.

Cromatografia lquida de alta eficincia X Cromatografia gasosa


A Tabela 5 fornece uma comparao entre a cromatografia lquida de alta eficincia e a Cromatografia gasosa. Quando ambas podem ser aplicadas, a cromatografia gasosa oferece a vantagem da velocidade e simplicidade do equipamento. Por outro lado, a cromatografia lquida de alta eficincia pode ser aplicada a substncias no-volteis (incluindo os ons inorgnicos) e a materiais termicamente instveis, enquanto a cromatografia gasosa no pode. Geralmente os dois mtodos so complementares.

Fitoqumica (qumica dos vegetais), que se encarrega de estudar estas substncias ativas, a sua estrutura, a sua distribuio na planta, as suas modificaes e os processos de transformao que se produzem no decurso da vida da planta, durante a preparao do remdio vegetal e no perodo de armazenagem.

As substncias ativas das plantas medicinais so de dois tipos: os produtos do metabolismo primrio (essencialmente sacardeos), substncias indispensveis vida da planta que se formam em todas as plantas verdes graas fotossntese; o segundo tipo de substncias composto pelos produtos do metabolismo secundrio, ou seja, processos que resultam essencialmente da assimilao do azoto.eparao do remdio vegetal e no perodo de armazenagem. A biossntese de metablitos secundrios realizada por rotas metablicas especficas do organismo, ocorrendo estreita relao entre essas rotas e aquelas responsveis pela sntese de metablitos primrios. Essas rotas so interconectadas, e as rotas que sintetizam metablitos primrios fornecem molculas que so utilizadas como precursoras nas principais rotas de sntese de metablitos secundrios. Metablitos Primrios: espcies qumicas essenciais para a sobrevivncia dos organismos; Macromolculas (aucares, aminocidos, cidos graxos, nucleotdeos, polissacardeos,

protenas, lipdios, RNA e DNA etc) Metablitos secundrios: grupos reduzidos de metablitos primrios serve como precursores para a sntese de outros compostos em reaes catalisadas enzimaticamente .

H trs principais precursores dos metablitos secundrios: cido chiqumico, acetato e aminocidos 1 INTRODUO Os aminocidos so unidades bsicas que constituem as protenas, que soconstitudos por um grupo amina, um grupo carboxila e um grupo R (radical, ougrupo lateral), este faz com que os aminocidos diferem se em suas estruturas,tamanhos, cargas e influenciam na solubilidade.O s a m i n o c i d o s p o d e m s e r c l a s s i f i c a d o s e m : A p o l a r e s o u P o l a r e s . Aminocidos apolares so solveis em solues orgnicas, e os Polares em solues polares. Os aminocidos polares

podem ser negativos ou positivos.O s a m i n o c i d o s q u e p o s s u e m u m a c a d e i a l a t e r a l a r o m t i c a , t e n d e m insolubilidade em solues polares, porm, devido ao acrscimo de hidroxilasou amina, alguns tm carter hidrfilo.T a i s fatores so

i m p o r t a n t e s p a r a a i d e n t i f i c a o d o s a m i n o c i d o s n a cromatografia em papel. 2 OBJETIVO Identificar aminocidos de um cromatograma, calculando seu RF . 3.PRTICA3.1.1 Materiais utilizados - 1 tudo de ensaio de 25 x 200 mm com uma rolha de cortia com percevejo;- Papel de filtro Whatman n1, em tiras de 17 x 170 mm;- Tubos capilares;- 1 forro de papel;- Lpis e rgua;Estufa a 90-100C- 2 placas de Petri. 3.1.2 Reagentes utilizados - 3 solues de aminocidos identificados.- 1 soluo de aminocido desconhecido.Solvente: mistura de butanol cido ctico gua (4:1:2)Revelador: soluo de ninidrina 0,25 N em acetona.

3.2 PROCEDIMENTO 01. Em uma das extremidades da tira de papel de filtro, a uma distncia queg a r a n t a n o t o c a r a s u p e r f c i e d o s o l v e n t e , t r a a r u m a t r a n s v e r s a l c o m o referncia para o ponto de origem.02. Tocar com a ponta do tubo capilar, contendo a soluo do aminocido omeio da linha de ponto de origem, deixando escoar um pouco da soluo, masevitando que se espalhe por uma rea de raio maior que 5 mm. Secar.03. Repetir a operao duas vezes, tendo o cuidado de secar a soluo antesdo toque seguinte. Os trs toques colocar o 5 a 10 L de uma soluo a ser cromatografada.04. Fazer uma dobra na extremidade do papel de filtro contrria quela ondefoi feita a aplicao da amostra. Fixar a tira de papel na faze interior da rolha decortia por meio de um percevejo, de modo que a dobra se localize sobre o seudimetro.05. Tampar o tubo de ensaio com a rolha fixada tira de papel filtro, tendo ocuidado de no deixar que a tira permanea em contato coma parede interna do tubo.06. Mergulhar a tira de papel de filtro no solvente +ou - 5 cm, evitando que oponto de aplicao das solues entre em contato como solvente.07. Esperar o tempo

suficiente para a frente do solvente alcanar +ou- 1,5 cmda rolha ou at 10 a15 cm de altura do ponto de origem.08. Retirar a tira de papel de filtro da rolha e tampar novamente tubo.09. Marcar imediatamente a lpis o ponto atingido pela frente do solvente.10. Secar a tira de papel de filtro na estufa a 90-100C.11. Revelar o cromatograma mergulhando rapidamente a tira de papel de filtroem uma placa de Petri contendo o revelador (ninidrina).12. Secar na estufa.13. Calcular os RF. (ver figura-1)

14. Anotar os valores e compara-los com o rtulo das solues identificadas. 4. RESULTADOS A T V H N l i a i a r l s 1 R R R R R F F F = F F = = 0 = = 0 0 , 0 0 , , 2 , , 5 1 9 2 3 4 8 9 8

5. DISCUSO A cromatografia permite a separao dos aminocidos atravs do clculoda distncia de locomoo devido reao de polaridade entre os aminocidose o solvente.De acordo com a ordem crescente de polaridade dos componentes dosolvente segue-se: butanol, cido actico e gua.O soluto (com aminocido) move-se na direo do fluxo do solvente a umavelocidade que depender de sua atrao, seja pela faze aquosa estacionria(Polar) ou pela fase solvente em movimento (Apolar). A atrao do soluto pelafase orgnica (Apolar) implica uma velocidade maior de migrao, em outraspalavras, uma maior distncia percorrida.Aps a revelao do cromatograma, medimos a distncia percorrida por cada aminocido (observar em: Mtodos, ponto 13) e o RF ser ter oresultado da diviso entre o espao percorrido pelo aminocido e o espao dosolvente.Em caso de valores muito

prximos de RF, para uma melhor identificaodo aminocido levamos em considerao a intensidade da colorao, que indica afinidade com o corante, tambm uma caracterstica individual de cadaaminocido.A cromatografia em papel pode ser aplicada para a separao, identificaoe at dosagem de misturas. Exemplos: glcides, cidos graxos, assim comotodos os seus derivados ou polmeros.Existem fatores que influenciam na migrao do soluto, tais como: seu pesomolecular, tipo de suporte, temperatura ambiente, sistema de solventes, pH,polaridade, ao capilar, tempo de corrida, quantidade de soluto aplicado, etc. 6. CONCLUSO Conclui-se que, com a comparao dos resultados de RF e da reao como colorante revelador, aminocido desconhecido a Alanina.