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PROCEDIMIENTO

PR-RES-22

DETERMINACIN DE SULFAS EN HIGADO

Revisin 02

SULFONAMIDAS en HGADO MTODO DE DETERMINACIN 1. ALCANCE DE APLICACIN Y OBJETIVO 1.1 El presente procedimiento consiste en describir la tcnica empleada para la deteccin y cuantificacin de residuos de Sulfonamidas en h !ado de bovinos" ovinos" e#uinos y porcinos. $as sustancias abarcadas son% Sulfacetamida" Sulfadia&ina" Sulfatia&ol" Sulfamera&ina" Sulfametho'ipyrida&ina" Sulfameta&ina" Sulfaclorpyrida&ina" Sulfameto'a&ol" Sulfa#uino'alina" Sulfadimeto'ina. ( efectos de controles de calidad y de desempe)o se usa una me&cla est*ndar representativa" con los compuestos% Sulfatia&ol" Sulfamera&ina y Sulfameta&ina. $as sulfonamidas son compuestos antimicrobianos #ue han sido desarrollados para combatir enfermedades causadas por virus" bacterias" hon!os o proto&oarios. Si se usan en dosis subteraputicas pueden presentar accin como promotores del crecimiento. Si los residuos de estas sustancias lle!aran al consumidor" podr an causar reacciones de hipersensibilidad e incluso uno de ellos se sospecha #ue es carcino!nico. Por ello se fi+an niveles de tolerancia en carnes para el consumo humano. El monitoreo de residuos de sulfonamidas se lleva a cabo para ase!urar #ue el per odo de eliminacin de las dro!as fue respetado. Estructuras

1.2

1.,

-2. .

S/2 .S
S0$1(23(4/$ S0$1(5E2(63.(

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S0$1(5ER(63.(

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MATERIALES Y E%UIPOS 2.1 2.2 2., 2.8 2.7 2.; 2.< 2.= 2.? 2.10 2.11 2.12 2.1, 2.18 2.17 2.1; 2.1< 2.1= 2ubos de centr fu!a de polipropileno de 70 ml. Probetas de 100 ml. 5atraces aforados de 10 y 70 ml. Pipetas autom*ticas de 100 9l" variable de 100 :1000 9l y variable de 1 a 7 ml. Reservorios de polipropileno de 20 ml. (daptadores para columnas SPE. 2ubos de vidrio de 7 ml. >iales para -P$6. 6olumnas SPE : >arian @ond Elut : .-2" 700 m!" , ml. 6olumnas SPE - >arian @ond Elut : S6A" 700 m!" , ml. 6*mara de vac o" 5anifold" para 12 tubos. 6entr fu!a. @alan&a anal tica con sensibilidad 0.01 m!. >orte'. 1ree&er a : <0 B6. @a)o de a!ua termostati&ado a 87 : 8? B6" con corriente de nitr!eno. E#uipo -P$6 Shimad&u" con detector de C(C" inyector y muestreador autom*tico. 6olumna RP : 61=" 127 ' 8 mm D79mE.

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REACTIVOS Y SOLUCIONES ,.1 ,.2 ,., ,.8 ,.7 ,.; ,.< ,.= ,.? ,.10 (cido actico" ppa. (cetona" calidad -P$6. (cetato de etilo" calidad -P$6. -e'ano" calidad -P$6. 5etanol" calidad -P$6. -idr'ido de amonio" ppa. (!ua desioni&ada. Fcido actico 0.1 5G acetona % 870 9l de *cido actico" llevar a <7 ml con a!ua desioni&ada" a!re!arle <7 ml de acetona. (cetato de etiloG*cido actico 7H % 8 ml de *cido actico" llevar a =0 ml con acetato de etilo. 5etanol % hidro'ido de amonio % a ,0 ml de metanol a!re!arle 10 ml de hidr'ido de amonio.

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@uffer acetato de sodio % disolver ;.= ! de acetato de sodio en 1 l de a!ua desioni&ada. (+ustar el p- a 8.7 con *cido actico. (cetonitriloGbuffer acetato de sodio D20 % =0E % me&clar 20 ml de acetonitrilo con =0 ml de buffer acetato de sodio.

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ESTANDARES 8.1 8.2 8., Cro!a estandar % Sulfadimidina DSulfametacinaE" Sulfameracina" Sulfatia&ol" Riedel- de -aen. Se preparan soluciones concentradas de apro'imadamente 1000 9!Gml de cada uno pesando 27 m! de estandar y llevando a 27 ml con metanol. Se conserva a : 1= B6. Se prepara cada , meses. Se prepara solucin de traba+o de apro'imadamente 10 9!Gml" tomando 100 9l de la solucin concentrada y llevando a 10 ml con acetona.

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PROCEDIMIENTO DE E)TRACCIN

(.1

P*e+!*!, -n "e .! /0e12*! 7.1.1 2omar 2.7 ! de h !ado en tubo de pp de 70 ml. 7.1.2 2omar 2 muestras por duplicado y a!re!arle 27 9l de cada una de las soluciones est*ndares de 10 9!Gml. 7.1., 2omar simult*neamente 27 9l de cada est*ndar y ponerlo en vial de 2 ml" para usar lue!o como est*ndar de referencia. 7.1.8 (!re!ar ; ml de la me&cla *cido acticoG acetona. 7.1.7 (!re!ar 12 ml de acetato de etilo. 7.1.; -omo!enei&ar en vorte' 1 min. 7.1.< 6entrifu!ar 17 min a 2700 rpm. 7.1.= 2ransferir el sobrenadante a tubo limpio de pp de 70 ml. 7.1.? Repetir las etapas 7.1.8 al 7.1.<. 7.1.10 Iuntar ambos sobrenadantes. 7.1.11 6olocar los tubos con los e'tractos en free&er a : <0 B6 durante 1, min. 7.1.12 Pretratar las columnas .-2 bond con , ml de he'ano y las S6A bond con , ml de he'ano y lue!o ; ml de la me&cla *cido acticoG acetato de etilo. 7.1.1, Cisponer las columnas y reservorios con adaptadores se!Jn el es#uema #ue aparece +unto al dia!rama de flu+o. 7.1.18 Sacar los tubos del free&er y pasar el sobrenadante or!*nico" l #uido" a tubos limpios de 70 ml" descartando la capa inferior con!elada. 7.1.17 Sembrar el e'tracto coloc*ndolo en el reservorio y haciendo vac o.

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7.1.1; Eluir con ; ml de metanol desde las columnas de .-2. 7.1.1< Cesconectar el vac o y descartar la columna de .-2. 7.1.1= $avar la columna de S6A con ; ml de a!ua y despues con 12 ml de metanol" n3 "e4!* 1e,!*. 7.1.1? Cescartar los reservorios. 7.1.20 Eluir las sulfas con , ml de la me&cla metanol % hidr'ido de amonio" en tubos de vidrio de 7 ml. 7.1.21 Evaporar a se#uedad con nitr!eno en ba)o de a!ua entre 87 : 8? B6. 7.1.22 Retomar con 700 9l K 700 9l de acetona y pasar a vial. 7.1.2, Evaporar en corriente de nitr!eno" +unto al vial del estandar. 7.1.28 Retomar con 1 ml de la me&cla acetonitrilo % buffer acetato D20 . =0E y a!itar ,0 s.

7.2

D !g*!/! "e 5.043. Se ad+unta.

6.

AN7LISIS INSTRUMENTAL.

;.1

6ondiciones instrumentales

6olumna % $i6hrospher RP : 1= de 127 ' 8 mm D79mE 2emperatura % 80 B6 1ase mvil % (cetonitrilo % @uffer acetato de sodio p-L8.7 D20%=0E 1lu+o % 0.7 mlGmin. 2iempo de corrida % 27 min. Cetector % C(C 2;; nm >olumen de inyeccin % 70 9l 6uantificacin % por *rea de pico ;.2 (rmar una secuencia de inyeccin comen&ando con 7 inyecciones del estandar para control del buen desempe)o del e#uipo" el cv de las *reas de los picos de dichas inyecciones no debe ser mayor del 2 H.

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;., ;.8 ;.7 ;.;

( continuacin se colocan las muestras fortificadas y lue!o las muestras en orden creciente de .B de entrada. 6uantificacin por *rea de picos. $a recuperacin del mtodo se calcula comparando las *reas del est*ndar con las de las muestras fortificadas. 6romato!rama est*ndar.

;.<

6urva de 6alibracin

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8.

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD <.1 Est*ndares Ran!o anal tico% Sulfatia&ol% Sulfameracina Sulfametacina Recuperacin aceptable% dentro de los l mites de alerta obtenidos para las cartas de control de cada compuesto" individualmente.

#. BIBLIOFRAFA 6>$ Meybrid!e >alidation Cocument DS/P (60 0,08CE" 1??<

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C3(NR(5( CE 1$0I/
T3/!* $.(g "e 9:g!"3 en 20;3 "e (< /. = 6 /. "e /e>,.! A,.!,?2 ,3@!,e23n!ABC = 1$ /. "e A,e2!23 "e e2 .3 H3/3gene >!* Cen2* 50g!* 1( / n ! $(<< *+/ D 'EC T*!n15e* * 13;*en!"!n2e ! 20;3 . /+ 3 Ag*eg!* 6 /. "e /e>,.! A,.!,?2 ,3@!,e23n! = 1$ /. A,e2!23 "e e2 .3 H3/3gene >!* Cen2* 50g!* 1( / n ! $(<< *+/ D 'EC J0n2!* 13;*en!"!n2e1 C3.3,!* .31 20;31 1& / n. ! F8<EC T*!n15e* * e. 13;*en!"!n2e ! 20;31 . /+ 31 P*e2*!2!*@ S2*!2! NH$ @ & /. HeG!n3 S2*!2! SC)@ & /. HeG!n3 = 6 /. A,E2@(NA,.A,?2 ,3ABBC O*"en "e !** ;! ! !;!43@ Re1e*H3* 3 J NH$ J SC) Se/;*!* e. eG2*!,23 "e A,E2 D L!H!* ,3n 6 /. "e MeOH De1,!*2!* .! ,3.0/ne "e NH$ L!H!* SC) ,3n@ !C 6 /. H$O ;C 1$ /. MeOH NO DEJAR SECAR E.0 * .!1 10.5!1 ,3n@ & /. /e>,.! MeOH@NH&ABBBC EH!+3*!* ! 1eI0e"!" ! '(J'KEC ,3n N$ Re23/!* ,3n@ <.( /. A,e23n! V3*2e*e!* T*!n15e* * ! H !. ,3n + +e2! L!H!* e. 20;3 ,3n 32*31@ <.( /. A,e23n! V3*2e*e!* J0n2!* H3.L/ene1 L.eH!* ! 1eI0e"!" Re23/!* ,3n@ 1.< /. F!1e M-H . HPLCMDAD

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6ondiciones 3nstrumentales
HPLC M DAD F.043@ <.(/.M/ n C3.0/n! @ L C9*313*; RPJC1# "e 1$(// G ' A( O/C Te/+e*!20*!@ '<EC FM @ A,e23n 2* .3@B055e* A,e2!23A1(@#(C L3ng. "e 3n"!@ $66n/ V3.L/en InDe,, -n @ 1<< O.

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