2 Docentes responsables del dictado de la asignatura Farmacognosia
Directora Acadmica del rea: Prof. Asociada Dra. Susana A. Zacchino Prof. Adjunto Dr. Ricardo L. E. Furlan Prof. Adjunto Dra. Silvia N. Lpez Prof. Adjunto Dr. Maximiliano A. Sortino J.T.P. Dra. Mara Victoria Castelli J.T.P. Dr. Marcos G. Derita Auxiliar de 1 Dr. Mario O. Salazar Auxiliar de 1 Dra. Laura A. Svetaz Auxiliar de 1 Lic. Carlos M. Solis Auxiliar de 2 Lic. Estefana Butassi
3 Indice
Tabla de contenido ............................................................................................. 4 Hidratos de carbono ........................................................................................... 5 Ejercitacin sobre hetersidos ............................................................................ 9 Lpidos .............................................................................................................. 12 T.P. Lpidos ...................................................................................................... 31 T.A. Lpidos ..................................................................................................... 33 Alcaloides ......................................................................................................... 39 Ejercitacin sobre alcaloides ............................................................................ 40 Alcaloides de la Quina ..................................................................................... 43 T.P. Alcaloides de la Quina ............................................................................. 46 Aceites Esenciales ............................................................................................ 48 T.P. Aceites Esenciales .................................................................................... 70 T.A. Aceites Esenciales .................................................................................... 78 Carotenoides ..................................................................................................... 81 T.P. Carotenoides ............................................................................................. 88 Hiprico generalidades ..................................................................................... 91 T.P. Hiprico .................................................................................................... 96 Anexos .............................................................................................................. 98 Recristalizacin ................................................................................................ 98 Cromatografa en Capa Delgada .................................................................... 107 Desecacin y Agentes Desecantes ................................................................. 110 Cromatografa de Adsorcin en Columna ...................................................... 118
4 Trabajos Prcticos 2014
Para el desarrollo de los trabajos prcticos el alumno debe conocer: Metodologa de Trabajo en Productos Naturales (clase terica con la bibliografa indicada en ella) y Mtodos Espectroscpicos (fundamentalmente IR, UV y 1 H-RMN).
TRABAJO PRCTICO (T.P.) CONOCIMIENTOS NECESARIOS LIPIDOS
Tarea de aula T.P. Obtencin de trimiristina a partir de Nuez Moscada y saponificacin del triglicrido
- Lpidos: generalidades - Recristalizacin - Cromatografa en Capa Delgada - Gua de T.P. Obtencin de trimiristina a partir de Nuez Moscada ALCALOIDES
Tarea de aula Obtencin de quinina y quinidina a partir de Quina - Alcaloides: generalidades - Metodologa de trabajo con alcaloides - Agentes desecantes - Teora sobre Quina - Gua de T.P. Obtencin de alcaloides de la Quina ACEITES ESENCIALES
Tarea de aula Obtencin de aceite esencial de Clavo Obtencin de eugenol a partir de aceite esencial de Clavo - Aceites Esenciales: generalidades - Destilacin de lquidos inmiscibles - Agentes desecantes - Gua de T.P. Obtencin de aceite esencial de Clavo y Manzanilla CAROTENOIDES
Obtencin de |-caroteno a partir de Zanahoria - Carotenoides: generalidades - Cromatografa de Adsorcin en Columna - Agentes desecantes - Gua de T.P. Obtencin de -caroteno a partir de Zanahoria HIPRICO
Estudio comparativo de extractos y productos comerciales que contienen Hiprico por CCD - Generalidades de Hiprico - Principales componentes - Monografas farmacopeicas - Gua de T.P.
Ejercitacin de Hidratos de carbono y Hetersidos
5 HIDRATOS DE CARBONO: INTRODUCCIN
Los carbohidratos o hidratos de carbono son polihidroxialdehdos, polihidroxicetonas o compuestos que por hidrlisis se convierten en aquellos. Un carbohidrato que no es hidrolizable a compuestos ms simples, se denomina monosacrido. Los monosacridos que contienen un grupo aldehdo, se le conoce como aldosa; si contiene una funcin cetona es una cetosa. Segn el nmero de tomos de carbono que contenga, se conoce como triosa, tetrosa, pentosa, hexosa, y as sucesivamente. La mayora de los monosacridos naturales son pentosas o hexosas, siendo la ms importante la aldohexosa (+)-glucosa (frmula molecular: C 6 H 12 O 6 ). Si examinamos la frmula estructural de las aldohexosas, se observa que contienen cuatro centros quirales o carbonos asimtricos (marcados con asteriscos):
Figura 1: aldohexosa
Para representar en un plano los carbonos asimtricos se han ideado varias representaciones convencionales en proyeccin. La ms utilizada es la de Fischer. Segn esta convencin, se proyecta la molcula sobre el plano del papel con las siguientes condiciones: - La cadena carbonada se sita en vertical, con las valencias que la integran en direccin a la parte posterior del plano. - La cadena se orienta con la parte ms oxidada hacia arriba y la ms reducida hacia abajo. - Las valencias que no integran la cadena carbonada resultan horizontales y dirigidas hacia la parte anterior del plano Como estndar de referencia, se eligi el compuesto gliceraldehdo, por ser el carbohidrato ms sencillo (una aldotriosa) capaz de exhibir isomera ptica. Ejercitacin de Hidratos de carbono y Hetersidos
6
As, se denomina ismero D al que presenta el OH a la derecha del espectador e ismero L al que lo tiene hacia la izquierda en el gliceraldehdo: - en los azcares se considera grupo OH unido al penltimo carbono (por ser el carbono asimtrico ms alejado del grupo aldehdo o cetona) La nomenclatura D-L permite designar la configuracin espacial absoluta de un enantimero que posee un solo carbono asimtrico. Las letras D y L proceden de las palabras latinas dextro y levo, pero no se debe confundir con la nomenclatura relativa que clasifica a los enantimeros en formas dextrgiras y levgiras. La D-(+)-glucosa puede describirse tambin como un hemiacetal cclico, resultante de la reaccin entre el grupo aldehdo y el hidroxilo del C-5 de la estructura de la cadena abierta. Hay dos formas ismeras de la D-(+)-glucosa debido a que estas estructura cclica tiene un centro quiral ms que la estructura abierta original de Fischer. La -D-(+)-glucosa y la -D-(+)- glucosa son diastermeros, puesto que difieren en configuracin del C-1. Tal par de diastermeros se llaman anmeros.
Figura 2: Ciclacin de la glucosa y posterior reordenamiento
Ejercitacin de Hidratos de carbono y Hetersidos
7
Figura 3: Formas de representar la estructura de la -D-(+)-glucosa (p.f. 146, [] = + 112). (a) Fisher; (b) Haworth; (c) silla.
BIBLIOGRAFA
1. Robert Thornton Morrison/Robert Neilson Boyd. Qumica Orgnica; Fondo Educativo Interamericano S.A., 1976; pp. 1097-1133.
EJERCITACIN DE HIDRATOS DE CARBONO 1. Entre los siguientes azcares distinga: a) aldosas y cetosas. b) D y L.
Ejercitacin de Hidratos de carbono y Hetersidos
8 2. a - Indique el nombre completo de las siguientes cuatro estructuras de la galactosa. b Marque los pares de enantimeros. c Escriba las cuatro estructuras con frmulas de Haworth.
3. La imagen especular de la -L-(-)-galactopiranosa es: a) -L-(+)-galactopiranosa. b) -L-(+)-galactofuranosa. c) -D-(+)-galactopiranosa. d) -D-(+)-galactofuranosa.
4. El smbolo (+) o (-) es: a) Un valor terico. b) Un valor relacionado con la estereoqumica absoluta. c) Un valor experimental. Explique su eleccin.
5. Dibujar la frmula conformacional para la -D-galactopiranosa y dibujar: a) Su enantimero. b) Su anmero. c) Un diastermero. d) Un epmero.
Ejercitacin de Hidratos de carbono y Hetersidos
9 EJERCITACIN SOBRE HETERSIDOS
1. Clasifique los siguientes hetersidos desde todos los puntos de vista que Ud. conoce. 2. Indique cuales son los compuestos que daran reaccin de Fehling positivo. Explique por qu. 3. Explique la reaccin de hidrlisis con HCl diluido de los compuestos Digoxina, Sensido C, Vitexina, Asiaticsido y Rutina.
Ejercitacin de Hidratos de carbono y Hetersidos
10
Ejercitacin de Hidratos de carbono y Hetersidos
11
Lpidos
12 LPIDOS Desde el punto de vista bioqumico se considera que los lpidos son aquellas sustancias que siendo insolubles en agua, pueden ser extradas de las clulas con disolventes orgnicos de baja polaridad como ter y cloroformo. Esta definicin comprende una amplia variedad de sustancias (esteroides, terpenos, grasas, aceites, ceras, fosfolpidos, etc.) que difieren mucho desde el punto de vista estructural. Sin embargo, en este captulo nos centraremos en los aceites, grasas, ceras y fosfolpidos o sea en los steres de los cidos grasos con diferentes alcoholes. En el caso de los aceites, grasas y fosfolpidos, el alcohol es el glicerol y en el caso de las ceras, es un alcohol de alto peso molecular. Veremos steres naturales en otra parte de esta asignatura, por lo que debe quedar bien claro quines son los componentes de los steres lipdicos desde el punto de vista qumico.
GRASAS Y ACEITES Las grasas son los constituyentes principales de las clulas almacenadoras de stas en animales y plantas, y constituyen una de las reservas alimenticias importantes del organismo. La diferencia entre grasas y aceites se da en que las primeras son slidas a temperatura ambiente, en tanto que, los aceites son lquidos. Desde el punto de vista qumico tanto los aceites como las grasas son steres carboxlicos de un alcohol, el glicerol, con cidos grasos. Si los tres hidroxilos del alcohol estn esterificados con un cido graso, el ster se llama triglicrido (Figura 1). Si los cidos grasos que forman el triglicrido son del mismo tipo se los denomina triglicridos homogneos, en caso que alguno o todos los cidos grasos que formen un triglicrido sean diferentes entre s se denomina triglicrido heterogneo.
Lpidos
13
Figura1: Reaccin de formacin de triglicridos.
Si ese glicrido tiene dos hidroxilos esterificados se llama diglicrido, y si tiene un hidroxilo esterificado se llama monoglicrido (Figura 2).
Diglicridos Monoglicrido
Figura2: Estructura de los dos posibles diglicridos y monoglicridos.
Los cidos grasos componentes de los lpidos naturales contienen en la mayora de los casos un nmero par de tomos de carbono (de 2 a 22 tomos de carbono), lo cual es un resultado natural de la biosntesis de los mismos (Tabla I). Aquellos que contienen 14, 16 y 18 carbonos son los que se encuentran en mayor proporcin en las grasas y aceites de origen natural.
TABLA I: CIDOS GRASOS SATURADOS
Etanoico o actico
2:0 Butrico o butanoico
4:0 Hexanoico o caproico
6:0 Octanoico o caprlico
8:0
Lpidos
14 Decanoico o cprico
10:0 Dodecanoico o lurico
12:0 Tetradecanoico o mirstico
14:0 Hexadecanoico o palmtico
16:0 Octadecanoico o esterico
18:0 Eicosanoico o araqudico
20:0 Docosanoico o behnico
22:0
En la naturaleza se encuentran cidos grasos conteniendo instauraciones en una proporcin considerable. Los ms comunes son aquellos que presentan dobles enlaces en sus estructuras. El nmero de dobles enlaces pude variar de uno a seis (en plantas superiores el nmero raramente excede los tres, pero en animales y algas puede llegar a seis) y en aquellos casos que presentan ms de uno, los mismos no se encuentran conjugados (Tabla II).
TABLA II: CIDOS GRASOS INSATURADOS
Lpidos
15 Adems de los cidos grasos mostrados anteriormente se han descripto otros que se encuentran en menor proporcin como por ejemplo los hidroxilados, acetilnicos (conteniendo triples enlaces) y cclicos (Tabla III).
TABLA III: CIDOS GRASOS HIDROXILADOS, ACETILNICOS Y CCLICOS.
HIDROXILADOS
ACETILNICOS
CCLICOS
Lpidos
16
NOMENCLATURA Para nombrar los cidos grasos se han desarrollado diversos tipos de nomenclatura. El nombre trivial es el ms comnmente empleado. Pero, si por ejemplo consideramos el cido linoleico (Tabla II), las distintas posibilidades de nombrarlo que se encuentran en la literatura son: - Segn la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry): cido cis, cis- octadeca-9, 12-dienoico. - En forma reducida: C18:2 9,12 , donde el C18 indica el nmero de tomos de carbono; 2 el nmero de insaturaciones y (delta mayscula) indica la localizacin de los dobles enlaces de configuracin cis. - Para los estudios de bioqumica y biosntesis, se usa: C18:2 :6. C18 indica el nmero de tomos de carbono; 2 el nmero de insaturaciones y (omega) el nmero de tomos de carbono desde el metilo terminal hasta el doble enlace. Para la nomenclatura IUPAC se debe considerar que el carbono carbonlico siempre es el C1. Esta nomenclatura tiene el inconveniente de que la oxidacin de los cidos grasos durante su metabolismo intracelular se efecta con acortamientos de la cadena de tomos de carbono en unidades de dos tomos de carbono, (la -oxidacin), proceso que ocurre a partir del carboxilo (C1); por lo tanto, la relacin del nuevo carboxilo que se forma en la cadena de carbono respecto de la posicin de el o los dobles enlaces, cambia. La ltima nomenclatura tiene la ventaja de que denomina C1 al del extremo opuesto, es decir al del metilo, y por lo tanto durante la -oxidacin del cido graso, la relacin entre el C1 y los dobles enlaces no resulta alterada. Nomenclatura de triglicridos Los glicridos se designan como steres; por ejemplo: tripalmitato de glicerilo o nombres derivados del cido graso cambiando la terminacin ico por ina (para el caso anterior sera tripalmitina). El grado de esterificacin se indica por los prefijos mono, di o tri en el caso de glicridos simples que tienen un solo tipo de cido graso (Figura 3.a). Para los glicridos mixtos, se usan los prefijos de acuerdo con el nmero de radicales presentes, sealando las posiciones que ocupan con la letra del alfabeto griego (Figura 3.b y c). Lpidos
17
(a) Tripalmitato de glicerilo (o tripalmitina)
(b) o estearo | palmitato olena
(c) | monopalmitato de glicerilo
Figura 3: Estructura de: (a) tripalmitato de glicerilo, (b) o palmitato | estearo olena y (c) | monopalmitato de glicerilo.
CIDOS GRASOS ESENCIALES Las grasas son nutrientes indispensables y se admite que en la alimentacin deben constituir del 30 al 35% del aporte calrico diario. Si bien esto es cierto, debe quedar claro, que no todos los cidos grasos tienen igual importancia en la dieta. Algunos cidos grasos poliinsaturados son indispensables y se los denomina cidos grasos esenciales (AGE) porque el organismo humano no los sintetiza (ej. cido linoleico) y por eso deben ser aportados necesariamente con la dieta. Los AGE poseen un importante papel biolgico, siendo constituyentes de fosfolpidos y precursores de eicosanoides (prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos). Bsicamente se distinguen tres cidos grasos esenciales: cido linoleico, cido linolnico y cido araquidnico. En caso de dficit, los cidos linolnico y araquidnico podran sintetizarse a partir del cido linoleico, por eso el cido linoleico se considera como el ms esencial de todos ellos. El cido araquidnico (20:4) es quizs el cido graso ms importante de los tipo Omega (), dado que es precursor directo de los eicosanoides. o Lpidos
18 Los AGEs se encuentran en alimentos de origen animal y vegetal; especficamente, los alimentos ricos en AGEs incluyen las semillas vegetales y los aceites de pescados de agua fra. Cuando se habla de cidos grasos alimentarios generalmente se refiere a ellos como Omega 3 ( 3) y Omega 6 ( 6) (Figura 4); que como se ha explicado antes, est relacionado con la posicin del primer doble enlace desde el extremo metilo.
cido linolnico cido linoleico
Figura 4: Numeracin segn la nomenclatura omega () de los cidos linolnico ( 3) y linoleico ( 6).
Estos no son los nicos tipos de omega que existen sino que todos aquellos que tengan instauraciones en esas posiciones van adquirir tal denominacin, por lo tanto los cidos grasos insaturados en estas posiciones con mayor nmero de carbono tambin son considerados cidos grasos tipo omega.
CONFIGURACIN DE LOS CIDOS GRASOS INSATURADOS NATURALES La configuracin de los dobles enlaces de los cidos insaturados naturales es casi siempre cis. Esta preferencia en la configuracin est directamente relacionada con el punto de fusin de los cidos grasos. En estado slido las molculas se acomodan entre s lo mejor que pueden, mantenindose unidas por fuerzas de Van der Waals. Cuando mejor logran acomodarse, tanto ms alto resulta el punto de fusin. Las cadenas de cidos saturados (Figura 5a) se hallan extendidas en zig-zag debido a los ngulos de enlace tetradricos de modo que encajan bien unas con otras. Las cadenas insaturadas trans (Figura 5b) se parecen mucho a las saturadas, pero en las cadenas insaturadas cis (Figura 5c) el zig-zag no es lineal por lo que el acomodamiento mutuo es bastante deficiente. El resultado neto es que la instauracin cis disminuye el punto de fusin del triglicrido (Tabla IV). Lpidos
19
Figura 5: Estructura de cido graso saturado (a) y cido graso monoinsaturado configuracin trans (b) y cis (c).
TABLA IV: PUNTOS DE FUSIN
CIDOS GRASOS SATURADOS CIDOS GRASOS INSATURADOS Nombre Estructura P f Nombre Estructura P f
ACEITES Y GRASAS VEGETALES La formacin de grasas y aceites es particularmente activa en el perodo de maduracin de los frutos y semillas, almacenndose preferentemente en el endosperma, generalmente en cantidades entre el 20-50%. Los aceites y grasas naturales estn constituidos por mezclas de triglicridos lquidos y slidos en las que normalmente predominan uno o dos cidos grasos (Tabla V). La extraccin de las mismas se realiza con solventes orgnicos o por expresin en prensas hidrulicas en fro o caliente. Junto a los triglicridos, en los aceites y grasas vegetales se encuentran siempre cidos grasos libres y una fraccin constituida por sustancias lipfilas no saponificables, variable en cantidad en los distintos aceites. Como componente de esta fraccin insaponificable se encuentran esteroles (fitosteroles como sitosterol, estigmasterol) tocoferoles (alfa-tocoferol), carotenos, escualeno, alcoholes terpnicos, etc. El aceite de oliva, por ejemplo, contiene un alto porcentaje de cido oleico mientras que el aceite de maz se compone principalmente de los cidos linoleico y oleico. La manteca contiene muchos cidos grasos, la mayora saturados.
REACCIONES QUE PUEDEN EXPERIMENTAR LOS TRIGLICRIDOS El grupo ster y los dobles enlaces de los triglicridos pueden experimentar reacciones qumicas, entre ellas:
1) HIDRLISIS DE LOS ACEITES FIJOS O SAPONIFICACIN: es la hidrlisis en medio alcalino que produce sales de cidos carboxlicos y glicerol (Figura 6), ambos solubles en agua. El jabn corriente actual es una mezcla de sales sdicas de cidos grasos de cadena larga.
Figura 6: Reaccin de saponificacin.
Lpidos
21 2) HIDROGENACIN DE DOBLES ENLACES: la hidrogenacin de alguno de los dobles enlaces de cidos grasos convierte a los triglicridos en slidos. Este endurecimiento de los aceites es la base de una industria importante que produce grasas para cocinar y oleomargarinas. La hidrogenacin no slo cambia las propiedades fsicas de una grasa sino tambin las propiedades qumicas y adems una grasa hidrogenada es menos propensa a ponerse rancia que una no hidrogenada. 3) ENRANCIAMIENTO: es un proceso degradativo de oxidacin, como consecuencia del cual las grasas adquieren caracteres organolpticos desagradables. La rancidez se debe a la presencia de cidos y aldehdos voltiles de mal olor, sustancias que resultan del ataque por el oxgeno a posiciones allicas reactivas en las molculas del triglicrido. La causa ms comn de enranciamiento es la oxidacin atmosfrica espontnea, la luz, el calor, la humedad y ciertos metales la aceleran. Por efectos de la rancidez, no solamente se alteran los caracteres organolpticos sino que las grasas rancias son inconvenientes porque destruyen factores indispensables en la alimentacin (Vitamina A y E, etc). La estabilidad de algunos aceites a la rancidez se debe a la presencia de sustancias que actan como inhibidores de la oxidacin llamadas antioxidantes. Son antioxidantes naturales los tocoferoles, la cefalina y el gosipol. Es posible que la hidrogenacin retarde el desarrollo de la rancidez, reduciendo el nmero de dobles enlaces y luego el nmero de posiciones allicas. 4) ISOMERIZACIN DE DOBLES ENLACES: en presencia de catalizadores de hidrogenacin, los compuestos insaturados no slo se hidrogenan sino que tambin se isomerizan (con desplazamientos de dobles enlaces o transformaciones estereoqumicas) lo que afecta las propiedades fsicas y qumicas.
DIFERENCIA ENTRE GRASAS Y ACEITES Grasas: Son mezclas complejas de triglicridos que contienen mayor proporcin de cidos grasos saturados (Figura 7) y por tal razn son slidas a temperatura ambiente.
Figura 7: Estructura de tripalmitina.
Lpidos
22 Aceites: Son mezclas complejas de triglicridos que contienen mayor proporcin de cidos grasos insaturados (Figura 8) y por tal razn son lquidas a temperatura ambiente.
Figura 8: Estructura de o linoleil | palmitato oleina.
USOS DE ACEITES Y GRASAS Los aceites vegetales son de amplio uso en cosmtica como el aceite de almendras, oliva, man, coco, jojoba, etc., aunque tambin encuentran muchas otras aplicaciones. Como ya dijimos mediante el proceso denominado hidrogenacin cataltica es posible adicionar hidrgeno a los dobles enlaces de los glicridos insaturados de aceites, para convertirlos en grasas slidas o semislidas, segn la extensin en la que se haya llevado a cabo el proceso. Muchas grasas comestibles se producen por hidrogenacin de aceites de maz y de semillas de algodn. Las margarinas se preparan por hidrogenacin de aceites hasta alcanzar la consistencia de la mantequilla, mezclando ntimamente el producto con sobrantes de leche, completando con vitamina A y aadindole un colorante artificial. En los ltimos aos, la grasa saturada de la dieta se ha considerado como un factor causante de las enfermedades ateroesclerticas, las ms serias de las cuales son la trombosis coronaria y la parlisis cerebral. A consecuencia de las posibles implicaciones en la salud, los aceites como el de maz y crtamo, que contienen grandes porcentajes de cido linoleico (poliinsaturado), se emplean cada vez en mayor cantidad como alimentos. Las grasas de cocina semislidas y las margarinas pueden hacerse a partir de esas grasas poliinsaturadas mediante el empleo de emulsionantes, en lugar de la hidrogenacin, que se convierte as en una prctica del pasado.
Lpidos
23 CARACTERIZACIN DE LOS LPIDOS NATURALES
Si los aceites naturales contienen cidos grasos distintos son posibles estructuras diferentes de triglicridos. Algunas de ellas se deberan a que determinados cidos grasos ocupan diferentes posiciones (por ejemplo la l-palmitato diestearina, es diferente de la 2- palmitato diestearina) y otras a pares DL (por ejemplo la l-palmitato diestearina puede existir como D o como L). Adems pueden existir triglicridos de diferente composicin como la palmitodiestearina y la estearodipalmitina. Todos estos compuestos difieren muy poco en sus propiedades fsicas por lo que resultan muy difciles de separar. Es por eso que para caracterizar a un aceite o una grasa natural, se usan las propiedades medias de la muestra y no las de sus componentes particulares. En la pgina siguiente se detallan los diversos ensayos cuantitativos que se utilizan para caracterizar grasas y aceites.
ndice de acidez Es la cantidad en mg de KOH necesaria para neutralizar los cidos libres contenidos en un gramo de sustancia. REACCIN QUMICA
PROPIEDADES DESCRIPTAS: cantidad de cidos libres que forman parte de esa sustancia.
ndice de saponificacin Es la cantidad en mg de KOH necesaria para neutralizar los cidos libres y saponificar los steres contenidos en un gramo de sustancia. REACCIONES QUMICAS Reaccin de neutralizacin:
Reaccin de saponificacin:
PROPIEDADES DESCRIPTAS: cantidad de cidos totales (libres y esterificados) que forman parte de esa sustancia. Lpidos
24
ndice de ster Es la cantidad en mg de KOH necesaria para saponificar los steres contenidos en un gramo de sustancia. Si el ndice de saponificacin y el ndice de acidez han sido determinados, por diferencia entre los dos, se obtiene el ndice de ster. REACCIN QUMICA
PROPIEDADES DESCRIPTAS: cantidad de cidos esterificados que forman parte de esa sustancia. Se puede calcular el peso molecular medio, por ejemplo para un triglicrido seria: PM tg = 168 x 1000 168 = 3 x PM KOH
ndice de ester tg=triglicrido
ndice de iodo El ndice de iodo de un aceite o grasa representa los gramos de iodo capaz de ser fijado, en determinadas condiciones, por 100 gramos de la muestra en ensayo. REACCIN QUMICA
PROPIEDADES DESCRIPTAS: grado de instauracin, un milimol de sustancia consume dos miliequivalentes (256 mg) de iodo.
ndice de hidroxilo o ndice de acetilo Es la cantidad en mg de KOH necesaria para neutralizar el cido actico obtenido por hidrlisis de un gramo de aceite o grasa acetilado. Se obtiene por diferencia entre el ndice de saponificacin de la muestra acetilada y de la muestra sin acetilar (ver ensayos para aceites y grasas de la Farmacopea Nacional Argentina) REACCIN QUMICA
Lpidos
25
PROPIEDADES DESCRIPTAS: el cido graso primero se acetila con anhdrido actico que se combina con todos los grupos hidroxlicos presentes. Como stos no existen en la mayora de los cidos grasos (tanto libres o formando parte de glicridos), los pequeos valores de ndice de acetilo que suelen obtenerse se deben a cantidades relativamente pequeas de esteroles. En cambio en un aceite como el de ricino, el ndice de acetilo es elevado (146-150) como consecuencia de la gran cantidad de cido ricinoleico, un hidroxicido.
La acetilacin se realiza segn el siguiente esquema Muestra de aceite + Anhdrido actico Calentamiento a reflujo durante 2 hs. Agregar 500 mL de agua destilada y hervir haciendo burbujear N 2 y CO 2 Enfriar y separar el agua Agua Aceite acetilado Agregar Na 2 SO 4 y dejar en contacto 1 hora Filtrar y secar en estufa ACEITE CLARO Y BRILLANTE
ACEITES SECANTES Ciertos aceites contienen gran proporcin de glicridos muy insaturados. Los ms notables de ellos son, el aceite de linaza (semilla de lino) y el aceite de tung (de la nuez de tung). Tales aceites se polimerizan dando una pelcula resistente y lustrosa cuando se ponen en contacto con el oxgeno de la atmsfera. Se conocen con el nombre de aceites secantes y se emplean considerablemente en la formulacin de pinturas, especialmente para superficies exteriores. El ndice de Iodo da una medida de las propiedades secantes de un aceite (ver ms adelante). Los aceites empleados en alimentacin son los semisecantes, por ejemplo el de soja y el de girasol.
ndice de iodo < 100 = no secante Lpidos
26 ndice de iodo entre 100 y 150 = semisecante ndice de iodo > 150 = secante
CERAS Las ceras son productos naturales muy distribuidos en vegetales y animales, y cumplen una funcin de recubrimiento. Qumicamente son steres de alcoholes saturados, monohidroxilados y de alto peso molecular (C12 a C36), con cidos grasos de peso molecular elevado (Figura 9). Es caracterstico que tanto los alcoholes como los cidos grasos sean de un nmero par de tomos de carbono (Tabla VI). La mayora de estos alcoholes slo se han encontrado en las ceras, siendo casi todos de cadena recta aunque en algunas ceras se puedan encontrar alcoholes cclicos como los esteroles.
Figura 9: Estructura de palmitato de miricilo (a) y cerotato de cetilo (b).
Las ceras de plantas son en general de punto de fusin superior a las de otro origen. El mejor solvente solubilizador de ceras es el benceno; son tambin solubles en ter, cloroformo y casi todas son solubles en alcohol caliente. La solubilidad est en razn inversa al peso molecular de los componentes.
TABLA VI: COMPONENTES DE LAS CERAS Alcoholes primarios saturados Lurico C 12 H 26 O Mirstico C 14 H 30 O Cetlico C 16 H 30 O Octadecanol C 18 H 38 O Eicosanol C 20 H 42 O Carnaublico C 24 H 50 O Cerlico C 26 H 54 O Octacosanol C 28 H 58 O Miriclico C 30 H 62 O Lacerol C 32 H 66 O Incarnatlico C 34 H 70 O
SIGNIFICADO BIOLGICO DE LAS CERAS Las ceras son generalmente secreciones de insectos o cubiertas protectoras de las hojas o de los frutos, muy raramente son constituyentes celulares. En los animales las ceras sirven para formar una cubierta protectora contra el agua, por su propiedad de hidrofobicidad. Este es el papel de la secrecin crea elaborada por las glndulas esteatofrigias de las aves acuticas, las que segregan una cera con la cual recubren su plumaje evitando que se moje. Tambin es evidente esta accin protectora de la cera de abeja en los panales de miel, de la lanolina en la lana de oveja, etc. En los vegetales, las ceras se hallan como componentes de la capa cuticular o como ceras epicuticulares que recubren hojas, tallos, frutos, etc. y probablemente su principal funcin es protegerlos contra la transpiracin excesiva. Las hojas de casi todas las conferas se hallan recubiertas por una membrana cuticular crea que contribuye a retener la humedad.
DIFERENCIA ENTRE CIDOS GRASOS, GLICRIDOS Y CERAS Una diferencia prctica importante entre cidos grasos, glicridos (aceites o grasas) y ceras est relacionada con los diferentes tipos de reacciones y reactividades en medio alcalino. La saponificacin, del griego sapon (jabn), es la reaccin de hidrlisis de enlaces steres bajo condiciones bsicas en medio acuoso o alcohlico que experimentan aceites, grasas y ceras (obtenindose las sales de los cidos grasos y alcohol). Esta reaccin es diferente a la que experimentan los cidos grasos libres en las mismas condiciones, estos se neutralizan (N) formando la sal correspondiente. Si bien glicridos y ceras saponifican, las condiciones en las que esta reaccin se lleva a cabo son diferentes para cada grupo. Las ceras saponifican (S) solo cuando se utiliza un medio alcohlico en tanto que los glicridos saponifican en este medio como en acuoso.
Lpidos
28 TABLA IV: Diferencia de reactividad de cidos grasos, glicridos y ceras.
NaOH aq. NaOH aq. KOH alcohlico KOH alcohlico T ebullicin T ambiente T ebullicin T ambiente AC. GRASOS N N N N GLICRIDOS S NS S NS CERAS NS NS S NS (N= NEUTRALIZA, S= SAPONIFICA y NS= NO SAPONIFICA)
FOSFOLPIDOS Tambin llamados fosftidos, incluyen todos los componentes lipdicos que contienen fsforo en sus molculas. Los fosfolpidos son en general solubles en los solventes orgnicos de las grasas, pero difieren considerablemente por ser insolubles en acetona, solvente que tiene la propiedad de precipitarlos desde sus soluciones en alcohol, cloroformo, etc. La cefalina y la esfingomielina son tambin insolubles en alcohol fro; la esfingomielina es casi insoluble en ter etlico. Los fosfolpidos son insolubles en agua, pero son muy higroscpicos y fcilmente emulsionables, son precipitados por los cidos y con numerosas sales como cloruro de platino y cadmio forman compuestos de adicin insolubles. Son componentes esenciales de las clulas animales y vegetales. Se clasifican en: A) LECITINAS (son los nicos fosfolpidos de aplicacin en farmacia) B) CEFALINAS C) ESFINGOMIELINAS Las lecitinas son sustancias complejas que se encuentran en todos los tejidos, abundando especialmente en el cerebro, en los nervios, en el esperma y en la yema del huevo de gallina (aproximadamente un gramo por yema). Las lecitinas derivan del glicerol, como los aceites y las grasas pero se diferencian de ellas en que una funcin alcohlica se encuentra esterificada por un cido inorgnico, el ortofosfrico. Siendo posible dos cidos glicerofosfricos, las lecitinas pueden derivar de ambos tipos (Figura 10). Lpidos
29
Figura 10: Estructura de o-cido glicerofosfrico (a) y |-cido glicerofosfrico (b).
Los cidos grasos hallados en las lecitinas son, entre los saturados: palmtico y esterico; y entre los no saturados: oleico, linoleico, linolnico y araquidnico, este ltimo, se halla en las lecitinas vegetales. Se acepta que en general los cidos grasos presentes en una molcula de lecitina son diferentes, y que uno de ellos es saturado y el otro es etilnico. No se descarta la posibilidad de que existan lecitinas con un solo cido graso. Las lecitinas ms abundantes pertenecen a la serie o y generalmente el cido graso insaturado est en posicin |. Otro constituyente importante que se encuentra en la lecitina (Figura 11, a) es la colina (Figura 11, b), la cual est esterificando una funcin cido fosfrico. La colina es una base muy fuerte, y funciona en el organismo impidiendo la acumulacin de grasa
Figura 11: Estructura de lecitina (a) y colina (b).
Fuentes de obtencin de lecitina -Ovolecitina: yema de huevo -Vegilecitina: porotos de soja -Cerebral: sesos de ternera Usos: emulsionante, debido a los grupos polares que contiene es fcilmente dispersable en agua y puede favorecer la formacin de emulsiones O/A. Sin embargo es muy raro que sea utilizada sola, como agente emulsionable. Por otro lado es difcil de conservar por su fcil oxidacin. Lpidos
30 Otras funciones: antioxidante, estabilizante de alimentos y preparados farmacuticos.
CARACTERSTICAS FSICAS DE LOS FOSFOGLICRIDOS Son slidos blancos de consistencia crea, por exposicin al aire se oscurecen y experimentan cambios complejos a causa de la tendencia de sus cidos grasos no saturados a peroxidarse por la accin del oxgeno atmosfrico.
Esquema de saponificacin y separacin de cidos grasos, glicerol y sustancias insaponificables
MATERIAL VEGETAL FRACCION LIPIDICA GLICEROL + SALES POTASICAS + SUSTACIAS INSAPONIFICABLES FASE ETEREA Sustancias insaponificables FASE ACUOSA Sales de cidos grasos + Glicerol Extraccin con solventes Saponificacin (KOH alcohlico) 1) Evaporar el solvente 2) Extraccin con ter/ agua 1) Acidificar (HCl diluido) 2) Extraccin con solvente orgnico FASE ETEREA Mezcla de cidos grasos FASE ACUOSA Glicerol
BIBLIOGRAFA 1-Farmacognosia. Fitoqumica de Plantas Medicinales 2, Jean Bruneton, Editorial Acribia, S.A. Zaragoza (Espaa). 2001. 2- Dewick, P.M. Medicinal natural products: a biosynthetic approach 2 Ed, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, UK. 2002. 3- Lipid libray: Lipid Chemistry, Biology, Technology & Analysis. The American Oil Chemists Society. Libre acceso via Internet HtT.P.://lipidlibray.aocs.org. Lpidos
31 Gua de Trabajo Prctico: Lpidos
OBJETIVOS *Obtencin de trimiristina a partir de Nuez Moscada. *Generacin de cido mirstico a partir de trimiristina.
OBTENCIN DE TRIMIRISTINA A PARTIR DE NUEZ MOSCADA La Nuez Moscada es la semilla madura y desecada de Myristica fragrans (Flia. Miristicceas), desprovista de sus tegumentos y del arilo y a veces provista de una delgada capa de cal que le sirve para ahuyentar los insectos (Figura 12). El secado de la semilla dura de 3 a 6 semanas, luego de las cuales se le quitan las testas. Los rboles de Myristica fragrans, cultivados en regiones tropicales, fructifican 2 a 3 veces al ao. (a) (b) (c) (d)
Figura 12: Fruto carnoso de Myristica fragrans (a y b), semilla cubierta del arilo (c) y semilla seca desprovista del arilo y de la capa carnosa externa (d).
Constituyentes de las semillas: 25-40% de un aceite fijo slido a temperatura ambiente (manteca de Nuez Moscada) constituido por trimiristina (Figura 13, a). 8-15% de un aceite voltil que contiene safrol y miristicina (Figura 13, b y c respectivamente) como constituyentes principales.
Figura 12: Estructura de trimiristina (a), de safrol (b) y de miristicina (c).
Lpidos
32 AISLAMIENTO DE LA TRIMIRISTINA 1. Calentar a reflujo 2,5 gr. de Nuez Moscada finamente pulverizada en 15 ml. de ter de petrleo durante 40 minutos en bao de agua. 2. Filtrar por gravedad con papel de filtro plegado. Desechar el residuo slido. 3. Eliminar el solvente por destilacin. Se obtiene un residuo semislido. Guardar una muestra en tubo de Khan. 4. Recristalizar desde etanol. Se obtiene la trimiristina cristalina cuyos cristales son incoloros e inodoros y cuyo punto de fusin est comprendido entre 54-55 C (las aguas madres y las aguas de lavado contienen miristicina y otros productos que no sern extrados en ste trabajo prctico y por lo tanto se descartan).
GENERACIN DE CIDO MIRSTICO A PARTIR DE TRIMIRISTINA: SAPONIFICACIN DE LA TRIMIRISTINA 1. Calentar a reflujo 500 mg de trimiristina con 7,5 ml. de solucin de KOH alcohlico al 3,5 % P/V durante una hora en un bao de agua. Separar una porcin de muestra para el anlisis final. 2. Agregar 15 ml de agua al baln. Agitar para ver la formacin de espuma. 3. Acidificar con HCl concentrado (hasta pH cido) y dejar a temperatura ambiente hasta que solidifique el cido mirstico. 4. Filtrar por succin y lavar los cristales con agua destilada. 5. Analizar los resultados por CCD. Sembrar: (1) Extracto crudo, (2) TM pura, (3) cido mirstico Fase Estacionaria: Slica Gel 60F Fase Movil: Hexano:AcOEt (9:1) Revelador: Vapores de I 2 .
CUESTIONARIO 1. Cules son los pasos a seguir en la recristalizacin de la trimiristina y del cido mirstico? 2. Explique por medio de ecuaciones y frmulas qumicas que obtiene por la saponificacin de la trimiristina. Cul es el objeto del agregado de HCl cc. luego de la saponificacin y qu producto se obtiene? 3. Considera Ud. suficiente la cantidad de KOH usado en ste trabajo prctico para la saponificacin de la trimiristina? Justifique su respuesta.
Lpidos
33 TAREA DE AULA DE LPIDOS A. EJERCITACIN SOBRE CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA 1. Ordene los siguientes solventes en orden creciente de polaridad (ver pg. 123). Dibuje sus frmulas qumicas Metanol Cloroformo Hexano Acetato de etilo Agua 2. Ordene las siguientes mezclas de solventes en orden creciente de polaridad Hexano puro Hexano:acetato de etilo 5:5 Hexano:acetato de etilo 7:3 Hexano:acetato de etilo 2:8 Acetato de etilo puro
3. Se realiza una CCD de los compuestos A y B, utilizando como fase estacionaria slica Gel y como fase mvil hexano:acetato de etilo 5:5, dando como resultado el cromatograma de la figura. a) Qu mancha corresponde a cada compuesto? Justifique b) Cmo ser el cromatograma si utilizamos como fase mvil hexano? c) Y si usamos metanol? A B OH C H 2 C CH 3 HO OH
4. Qu relacin existe entre la posicin relativa en una CCD y el orden de elucin en una cromatografa en columna? (suponer que se utilizan las mismas fases mviles y estacionarias en ambos casos) Punto de siembra
Frente de solvente Desarrollo Lpidos
34 5. El siguiente cromatograma fue realizado con las siguientes condiciones: fase mvil hexano:acetato de etilo 5:5 y fase estacionaria Slica gel. Qu cambios realizara para lograr una mayor separacin de las manchas?
B. EJERCITACIN SOBRE LPIDOS 1. Si realiza una CCD utilizando slica gel y cloroformo, de una mezcla de tripalmitina y cido palmtico. a) Cul sera el resultado de la misma una vez revelada con vapores de Iodo? b) A qu compuesto corresponde cada mancha? c) Cul sera el resultado si utilizara metanol como fase mvil? d) Y si utilizara hexano? e) Qu sucedera si cambiara la fase estacionaria por almina? f) Y si la cambiara por RP18? 2. El grado de insaturacin de lpidos de membranas en las patas de reno es mayor en las clulas cercanas a los cascos que en las cercanas al cuerpo. Qu valor tiene este gradiente de insaturacin para la supervivencia? 3. Escriba las estructuras de todos los glicridos que sean formados por los cidos oleico y palmtico. 4. Calcular el PM de un triglicrido puro cuyo ndice de saponificacin es 200. 5. Calcular el ndice de saponificacin y el de iodo de un triglicrido puro de PM = 718 y que incluye dos insaturaciones. Clasifquelo de acuerdo a su secatividad. 6. Calcule el ndice de acidez de un aceite de densidad 0.9 g/ml, sabiendo que en la titulacin de 10 ml de aceite se consumieron 9 ml de KOH 0.1 N. 7. Se tienen los siguientes ndices de iodo para varios aceites: A=80, B=180, C=0, D=100.Clasifquelos de acuerdo a su secatividad. Cules eligira para alimentacin? 8. El punto de fusin de las grasas naturales estar dado por un valor neto? Por qu? Punto de siembra
Frente de solvente Desarrollo Lpidos
35 9. Escriba un ejemplo de un aceite, una grasa y una cera marcando sus semejanzas y diferencias. Diga si el aceite que escribi es un triglicrido simple o mixto. Explique por qu. 10. Defina los ndices de lpido. Bajo qu condiciones determina el ndice de acidez y de saponificacin. A qu se debe esa diferencia? Indicar si los valores de los ndices de lpido sern iguales o distintos de cero. ndice de acidez ndice de ster ndice de saponificacin ndice de yodo ndice de acetilo Triestearina pura Tripalmitina con cido palmtico
Trirricinolena pura Trilinolena con cido linoleico
11. Cul de los siguientes glicridos simples tiene mayor ndice de iodo: palmitina, triolena o trilinolena? Escriba sus frmulas y explique. 12. Cmo estn compuestos los aceites y grasas vegetales? 13. Cmo explica la capacidad detergente de los jabones en relacin con su estructura (sales sdicas de cidos grasos)? 14. Realice un esquema indicando reactivos y condiciones de trabajo para lograr la separacin de cido palmtico y cido esterico a partir de una mezcla de: a) cido palmtico y triestearina b) cido esterico y palmitato de cetilo c) Estearato de cetilo y tripalmitina 15. Qu mtodo/s de extraccin por solventes utilizara para obtener un lpido termolbil a partir de una muestra vegetal? qu tipo de solventes utilizara? 16. Ud. recibe en su laboratorio una muestra que contiene Acido linolnico y triestearato de glicerilo a) Indique cmo esperara que le dieran los ndices de lpido (acidez, saponificacin, ster, acetilo, yodo) y justifique. b) Esquematice cmo esperara que le diera una Cromatografa en Capa Delgada de la muestra que Ud. recibi y justifique. b.1- Fase estacionaria: Slica Gel 60 GF-254 Lpidos
36 Fase mvil: Hexano-Acetato de Etilo (9:1) Revelador: Yodo. b.2- Fase estacionaria: Slica Gel 60 GF-254 Fase mvil: Hexano-Acetato de Etilo (7:3) Revelador: Yodo. b.3- Fase estacionaria: Slica Gel 60 GF-254 Fase mvil: Hexano-Acetato de Etilo (3:7) Revelador: Yodo. b.4- Fase estacionaria: RP18 Fase mvil: Solvente adecuado para que ambos tengan relaciones de frente entre 0,3 y 0,8. Revelador: Yodo. c) Esquematice de la manera ms completa posible (indicando reactivos y condiciones) cmo procedera para obtener por separado el cido estarico y cido linolnico. d) Qu metodologa utilizara para verificar la pureza del cido esterico?
17. Si Ud. tiene una mezcla que contiene Trilinolena y en menor proporcin cido Ricinoleico: a) Cmo esperara que dicha mezcla se presente a temperatura ambiente? b) Caracterice a la muestra segn los ndices que debera presentar, explicando en cada caso qu sustancia aporta ese resultado y por qu. c) Proponga un esquema que permita separar a los componentes del extracto hasta obtener los cidos grasos totales en forma libre, detallando reactivos y condiciones de trabajo. d) Qu consideraciones prcticas debe tener en cuenta para realizar la purificacin de una sustancia por recristalizacin? e) Las cromatografas en capa delgada (CCD) A, B y C muestran los cromatogramas obtenidos de la muestra. A) Fase estacionaria: Slica Gel 60 GF-254 Fase mvil: Hexano Revelador: Vapores de Yodo. B) Fase estacionaria: Slica Gel 60 GF-254 Fase mvil: Hexano: Acetato de Etilo (5:5) Revelador: Vapores de Yodo. C) Fase estacionaria: Slica Gel 60 GF-254 Fase mvil: Hexano: Acetato de Etilo (2:8) Revelador: Vapores de Yodo.
Lpidos
37
e.1- Cul de las tres fases moviles propuestas es la ms adecuada para la separacin de los compuestos? Fundamente su respuesta. e.2- Indique en las placas cromatogrficas a qu compuesto corresponde cada una de las manchas. Justifique. e.3- Esquematice el cromatograma que obtendra con fase estacionaria: RP18, Fase mvil: Hexano: Acetato de etilo (5:5) y Revelador: Vapores de Yodo, indicando qu mancha corresponde a cada compuesto 18. Al extracto de una planta se le realizan diferentes ensayos para caracterizarlo y se llega a la conclusin de que est compuesto por un triglicrido simple con trazas del cido graso libre. Dicho cido graso tiene un doble enlace y no posee grupos hidroxilos. El triglicrido tiene un peso molecular de 968 y es termoestable. a) Qu resultados se obtendrn en los diferentes ndices de lpido? Justificar b) Bajo qu condiciones se pudo lograr la saponificacin completa de la muestra? c) Cmo se pueden separar el cido graso del triglicrido? Realice un esquema indicando condiciones de trabajo y reactivos. d) Cul es el resultado de una CCD del extracto si utilizaron slica gel y una fase mvil de hexano:cloroformo 5:5? e) Con qu mtodos se pudo haber obtenido el extracto? Qu tipo de solventes se utilizaron?cul considera el ms adecuado?Por qu? f) Con qu mtodo se puede confirmar la estructura del triglicrido?
A B C
Frente de solvente
Lpidos
38 EJERCITACIN SOBRE EL T.P. DE LIPIDOS 1. Qu ventajas tiene el mtodo de extraccin usado en el T.P. para la extraccin de Trimiristina con respecto a: a) Tiempo de extraccin b) Temperatura de trabajo c) Volumen de solvente necesario 2. Indique si los siguientes mtodos podran ser utilizados para el mismo fin: -Maceracin -Soxhlet -Infusin -Lixiviacin -Decoccin a) En los casos que contest afirmativamente, qu consideraciones debe tener en cuenta con respecto al solvente. b) En los casos que contest negativamente, justifique su respuesta. 3. Realice un esquema sobre el procedimiento de recristalizacin utilizado en el T.P., indicando en cada paso reactivos, condiciones de trabajo y productos obtenidos. 4. Para lograr una buena recristalizacin: Qu consideraciones deben tenerse en cuenta respecto a: a) Eleccin del solvente b) Proceso de recristalizacin 5. Esquematice el resultado de una CCD fase normal donde se sembr: - Testigo de trimiristina - Trimiristina antes de la recristalizacin - Trimiristina despus de la recristalizacin a) Cmo puede evaluar la eficacia de la recristalizacin? b) Cmo puede identificar a la trimiristina? 6. Qu cantidad de KOH y condiciones de reaccin son necesarias para lograr la completa saponificacin de la trimiristina? Cmo lo realiza en el T.P.? Por qu? 7. Realice un esquema sobre el procedimiento de saponificacin de Trimiristina utilizado en el T.P., indicando en cada paso reactivos, condiciones de trabajo y productos obtenidos. 8. Esquematice el resultado de una CCD fase normal donde se sembr: - Testigo de trimiristina - Testigo de cido mirstico - Trimiristina antes de la saponificacin - Producto de la saponificacin si el KOH fue insuficiente - Producto de la saponificacin si el KOH fue suficiente Alcaloides
39 ALCALOIDES
CHCl 3 , agitar y decantar
Alcaloides
40 EJERCITACIN SOBRE GENERALIDADES DE ALCALOIDES 1.
Indique cul es la basicidad de cada nitrgeno en las siguientes estructuras. Fundamente su respuesta e indique el pK b aproximado.
2. En las siguientes estructuras indique cul de los nitrgenos es ms bsico y por qu.
Alcaloides
41 3. a) Indique cul es la basicidad de cada uno de los nitrgenos de estos alcaloides. Fundamente su respuesta. b) Ordenar los alcaloides por orden decreciente de basicidad. c) Dibuje la estructura de todos los alcaloides en medio i) cido clorhdrico acuoso (pH = 1) y ii) amonaco acuoso (pH = 8).
N OCH 3 OCH 3 O O H 3 C N N H OH O O H 3 C N H 3 CO H 3 CO OCH 3 OCH 3 i) Papaverina ii) Queletrina iii) Colchicina iv) Yohimbina O OH H 3 CO H 3 CO OCH 3 NH H O CH 3
4. De la divisin toxicolgica le traen para analizar una muestra lquida que da positiva la reaccin de Draggendorf. El poseedor de dicha muestra declar que tena codena (antitusgeno). Cmo demuestra Ud. que en realidad tiene morfina?
Alcaloides
42 5. En base a sus conocimientos sobre basicidad de alcaloides esquematice un diagrama de separacin de los siguientes compuestos, indicando reactivos, operaciones y condiciones de trabajo.
Justifique detalladamente mediante un anlisis inicial que indique las caractersticas cido-base de cada uno de los nitrgenos de cada compuesto.
6. Utilizando la estructura de orbitales del imidazol, explique su aromaticidad y sus propiedades bsicas (pKb = 7).
Alcaloides
43 ALCALOIDES DE LA QUINA
INTRODUCCIN: Algunos de los ejemplos ms interesantes de alcaloides con ncleos indlicos modificados se pueden hallar en el gnero Cinchona. Ellos son quinina, quinidina, cinconidina y cinconina. En sus estructuras, el ncleo indlico se ha reacomodado en un sistema quinolnico. Quinina y quinidina son pares de diasteremeros y tienen quiralidades opuestas en dos centros, C-8 y C-9 (Figura 1). Cinconidina y cinconina son anlogos demetoxilados de quinina y quinidina respectivamente.
R = OMe: (-) Quinina (8S, 9R) R = H: Cinconidina (8S, 9R) R = OMe: (+) Quinidina (8R, 9S) R = H: Cinconina (8R, 9S) N R H OH N H H 8 9 N R H OH 9 N H 8 H
Figura 1: Alcaloides de la Quina
CINCHONA. La droga vegetal Quina (segn FA 6 Ed) es la corteza desecada de tallos y races de Cinchona calisaya Weddell (Rubiaceae) y de sus variedades o hbridos, conocida con el nombre de Quina amarilla. No deber contener menos de 5% de alcaloides totales, ni ms de 2% de otras materias orgnicas extraas, y por incineracin no deber dejar ms de 4% de cenizas. La Cinchona es un rbol alto, originario de sudamrica. Los rboles son cultivados en muchas partes del mundo y alrededor de una docena de especies de Cinchona han sido utilizadas comercialmente, pero existe una gran variabilidad del contenido de alcaloides y el rango de los mismos, esto ha favorecido el cultivo de tres especies principales. C. succirubra provee la corteza roja (5-7% alcaloides); C. ledgeriana provee la corteza marrn (5-14% alcaloides) y C. calisaya, la corteza amarilla (hasta 17% alcaloides). Un nmero considerable de alcaloides han sido caracterizados en la corteza de Cinchona, cuatro de ellos dan cuenta del 30-60% del contenido de alcaloides. Ellos son quinina, quinidina, cinconidina y cinconina, Alcaloides
44 siendo quinina el constituyente principal. Estos alcaloides a menudo se encuentran presentes en la corteza en combinacin con cido qunico.
RELEVANCIA EN EL TRATAMIENTO DE MALARIA. Los alcaloides de Cinchona, en particular quinina, han sido utilizados durante muchos aos en el tratamiento de malaria, una enfermedad causada por el protozoo Plasmodium falciparum que an significa una gran amenaza para la salud. Quinidina, cinconina y cinconidina tambin tienen propiedades antimalricas pero no son tan efectivos como la quinina. La habilidad de Plasmodium para desarrollar resistencia a las drogas modernas (muchas de ellas desarrolladas a partir de la propia quinina) reintrodujo en algunos pases a la Quina para el tratamiento de la malaria. Es por eso que la Quina sigue teniendo gran relevancia econmica y en la mayora de las farmacopeas se incluyen sales de quinina y de quinidina.
BASICIDAD DE ALCALOIDES DE LA QUINA. Los alcaloides de la Quina son derivados del rubano que, a su vez, proviene de la unin entre una quinolina y una quinuclidina (figura 2). Por lo tanto estos alcaloides tienen dos nitrgenos, uno de la porcin quinolina y otro de la porcin quinuclidina, cuyas basicidades son diferentes. N N Quinolina Quinuclidina N N Rubano
Figura 2
El nitrgeno de la quinuclidina es un nitrgeno de amina terciaria. Su par electrnico libre tiene poco carcter s ya que est en un orbital sp 3 ; adems no tiene posibilidades de deslocalizacin, por eso es un nitrgeno bsico (pKb = 4). El par electrnico del nitrgeno de la porcin quinolina est localizado en un orbital sp 2 , es decir, estos electrones poseen un mayor carcter s respecto de los electrones del otro nitrgeno. Esto hace a este nitrgeno mucho menos bsico (pKb = 8,6). Los alcaloides tipo Quina se encuentran en forma de base libre a pH mayores a 10. Debido a la presencia de dos Alcaloides
45 grupos amino de basicidades diferentes, los alcaloides de la Quina pueden formar dos series de sales: las sales bsicas y las sales neutras.
N OCH 3 H OH N H H pKb = 8,6 pKb = 4
Figura 3
Para el caso de la quinina, su sal bsica (Figura 4a) es aquella en la que slo est protonado su nitrgeno quinuclidnico; es una sal mono-inica, que es bsica porque an le queda un nitrgeno por protonar. sta sal da reaccin neutra en agua ya que a pH = 7 el nitrgeno protonado posee mayor afinidad por su protn que el agua por lo que no hay reaccin cida. Por su parte, el nitrgeno quinolnico no captar un protn debido a que su pKa (5,4) est casi dos puntos por debajo de pH del medio por lo que no hay reaccin alcalina. N + OCH 3 H OH N H + H H H a) Sal bsica de quinina b) Sal neutra de quinina N OCH 3 H OH N H + H H
Figura 4a-b. En su sal neutra (Figura 4b), la quinina posee los dos nitrgenos protonados. Puesta en agua, esta sal da reaccin cida ya que a pH neutro el nitrgeno quinolnico posee menor afinidad por su protn que el agua, cedindoselo. La sal neutra es an ms soluble en agua que la bsica por ser di-inica.
Alcaloides
46 Gua de Trabajo Prctico: Alcaloides de la Quina
OBJETIVO: *Extraer y purificar los alcaloides de la Quina y detectar la presencia de quinina.
TCNICA: 1. Mezclar 1 gramo de droga vegetal Quina en un baln y agregar 2 ml de solucin de NaOH 5% P/V. 2. Extraer a reflujo con 15 ml de etanol utilizando agitacin durante 20 minutos. Filtrar y descartar el residuo slido. Separar una pequea pocin de extracto en un tubo de Kahn para realizar CCD al final del TP. 3. Eliminar el etanol por evaporacin a presin reducida. 4. Agregar H 2 SO 4 0.5 M hasta alcanzar un pH final de 2-3 (utilizando indicadores de pH). Filtrar aplicando vaco. 5. Lavar el filtrado con 2 porciones de 10 ml de CH 2 Cl 2 . Rotular como FO 1. 6. Alcalinizar la solucin acuosa con solucin de NaOH 10% P/V hasta pH 12-13 y extraer dos veces con 10 ml de CH 2 Cl 2 . 7. Juntar las fases clorofrmicas y secarlas con Na 2 SO 4 anhidro. Filtrar. 8. Eliminar el CH 2 Cl 2 del filtrado por destilacin simple o evaporacin a presin reducida. Rotular como FO 2. 9. Realizar una cromatografa en capa delgada sembrando las siguientes soluciones: a) Extracto etanlico del paso 2. b) Solucin de lavado del paso 5 (FO 1). c) Patrn de quinina d) FO 2 obtenida en el paso 8. Fase Estacionaria: Slica Gel 60 F Fase Movil: CHCl 3 :MeOH:Dietilamina (8:2:2 gotas). Revelador: luz UV =254 nm.
ANALIZAR: 1. Por qu se agrega cido previo a realizar los lavados con CH 2 Cl 2 ? 2. Por qu la solucin de mezcla a sembrar debe estar lo ms concentrada posible? 3. Por qu se agrega una solucin de NaOH en la extraccin etanlica de los alcaloides a partir de la droga vegetal?
Alcaloides
47 Espectro de RMN 1 H quinina: N N R H H H HO 6 8 7 5 2 3 6 4 3 10 11 2 7 8 9 5 9 10 1 4 1
48 ACEITES ESENCIALES GENERALIDADES Los aceites voltiles son los principios voltiles de olor intenso responsables de los olores de las flores y del sabor de las especias. Son ampliamente utilizados como saborizantes, en perfumera y aromaterapia. La ISO (International Standard Organization) define aceites voltiles como los productos obtenidos de partes de plantas a travs de destilacin por arrastre con vapor de agua u obtenidos por expresin de los pericarpios de frutos ctricos (familia Rutceas). Sin embargo, sta es una definicin que no aporta ninguna informacin respecto de su composicin o de su estructura qumica. De forma general, son mezclas complejas de sustancias voltiles, lipoflicas, generalmente odorferas y lquidas. Tambin pueden ser llamadas aceites esenciales, aceites etreos o simplemente esencias. Estas denominaciones derivan de algunas de sus caractersticas fsico-qumicas. As, son llamados aceites debido al aspecto oleoso que presentan; etreos (en latn, aetheroleum) debido a su solubilidad en solventes orgnicos apolares como el ter y esencias o esenciales debido al agradable e intenso aroma que la mayora de ellos presenta. Sin embargo su principal caracterstica es la capacidad de evaporarse cuando son expuestos al aire a temperatura ambiente, difiriendo as, de los aceites fijos (mezclas de sustancias lipdicas, obtenidas generalmente de semillas). En agua, los aceites voltiles presentan solubilidad limitada, pero suficiente para aromatizar las soluciones acuosas. Por lo general, reciben el nombre de la especie de la que proceden, como aceite esencial de tomillo, aceite esencial de salvia, etc. Sus caractersticas generales son: - Mezclas complejas de aspecto oleoso, pero que no dejan mancha oleosa sobre el papel; - Aromticos (confieren aroma); - Generalmente lquidos a T ambiente; - Volatilizan a T ambiente; - Solubles en solventes orgnicos apolares y alcoholes de alta graduacin; - De sabor generalmente acre (cido) y picante; - Recientemente extrados, son generalmente incoloros o ligeramente amarillentos; son pocos los aceites que presentan color, como el aceite esencial de Manzanilla, de coloracin azulada, por su alto tenor en azulenos; - Estabilidad: En general, los aceites voltiles no son muy estables. Principalmente en presencia de aire, luz, calor, humedad y metales, se oxidan y resinifican; Aceites Esenciales
49 - No son saponificables; - La mayora de los aceites voltiles poseen ndices de refraccin elevados y muchos de ellos son pticamente activos, propiedades estas usadas en su identificacin y control de calidad. - La densidad de los AE suele ser inferior a la del agua, constituyendo una excepcin los obtenidos a partir de la Canela, el Clavo y el Sasafrs, cuya densidad es superior a la unidad. Los contenidos en AE no superan el 1% en la mayora de los casos; una excepcin la constituye el Clavo (botn floral de Eugenia caryophyllus) con un contenido superior al 15%. En la mezcla, los compuestos que forman el aceite esencial se presentan en diferentes concentraciones; normalmente, uno de ellos es el compuesto mayoritario, existiendo otros en menores tenores y algunos en bajsimas cantidades (trazas). Por ejemplo, el 1,8-cineol ( eucaliptol) es el componente mayoritario del aceite de eucalipto y generalmente, su tenor es en torno del 80%; entretanto, esta misma sustancia fue detectada en el aceite de bergamota en una concentracin 40.000 veces menor que en el aceite de eucalipto, o sea, en torno de 0,002%. As, en esos casos, se dice que este compuesto es un constituyente traza del aceite de bergamota. La composicin de los aceites esenciales vara de acuerdo a factores del entorno (condiciones ambientales, temperatura, humedad, clima), prcticas de cultivo (suelo, riego, abono), edad y ciclo vegetativo al momento de la recoleccin, etc. Durante la extraccin, sta puede resultar alterada por el mtodo mismo de extraccin o por el tipo de solvente utilizado. En el mercado se pueden encontrar aceites sintticos que pueden ser imitaciones de los naturales composiciones de fantasa. Para el uso farmacutico, solamente los naturales son permitidos por las farmacopeas. Excepciones son aquellos aceites que contienen solamente una sustancia, como el aceite voltil de vainilla (que contiene vainillina). En esos casos, algunas farmacopeas permiten tambin los equivalentes sintticos.
CLASIFICACIN Los aceites esenciales pueden clasificarse de varias maneras, de las cuales las ms comunes son por origen biosinttico por el grupo funcional del compuesto responsable de brindarles los caracteres organolpticos. Este compuesto, llamado muchas veces compuesto principal, no siempre es el que se encuentra en mayor proporcin. Por ejemplo, en el caso de la esencia de naranja (Citrus sinensis), el d-limoneno es el componente mayoritario porque se encuentra en un 90% pero el que le otorga las propiedades al aceite (y por lo tanto constituye el componente principal) es el citral, un aldehdo terpnico que se encuentra slo en un 5%. Aceites Esenciales
50
Clasificacin por origen biosinttico Qumicamente, la gran mayora de los aceites voltiles estn constituidos por derivados de fenilpropanoides o de terpenoides, siendo estos ltimos los preponderantes. Muchos aceites contienen tanto componentes aromticos como terpenoides; pero generalmente uno de ellos predomina sobre el otro. En base a esta clasificacin, se presentan dos tablas. La Tabla I muestra aquellos aceites que presentan compuestos principalmente aromticos y que, por lo tanto, derivan de la va del shikimato; En Tabla II se encuentran los aceites constituidos principalmente por compuestos terpenoides.
1. Terpenoides Los terpenoides constituyen una gran variedad de sustancias vegetales. Este trmino es empleado para designar a todas las sustancias cuyo origen biosinttico deriva de unidades de isopreno. La unidad isoprnica, a su vez, se origina principalmente a partir del cido mevalnico. Los esqueletos carbonados de los terpenoides son formados por la condensacin de un nmero variable de unidades pentacarbonadas (= unidades isoprnicas), de acuerdo con la regla del isopreno. En los componentes de aceites voltiles predomina la condensacin cabeza-cola, como ilustra la Figura 1. Los compuestos terpnicos ms frecuentes en los aceites voltiles son los monoterpenos (cerca del 90% de los aceites voltiles) y los sesquiterpenos. Otros terpenoides, como los diterpenos (C 20 ), son encontrados en los aceites voltiles cuando son extrados por mtodos que no requieren volatilizacin de los componentes, como por ejemplo la extraccin con solventes orgnicos (Steinegger y Hansel, 1992). Los monoterpenos pueden dividirse en tres subgrupos: acclicos, monocclicos y bicclicos. En cada uno de esos subgrupos, se encuentran incontables sustancias, caracterizadas por unos 200 tipos diferentes de esqueletos. El nmero de compuestos terpnicos conocidos sobrepasa los 8.000; en aceites voltiles se estima un nmero superior a 150 para monoterpenos y a 1000 para sesquiterpenos. Aceites Esenciales
51 Figura 1. Formacin cabeza-cola de los esqueletos carbonados de los compuestos mono y sesquiterpenoides, constituyentes mayoritarios de los aceites esenciales.
2. Fenilpropanoides Los fenilpropanoides se forman a partir del cido shikmico, que forma las unidades bsicas del cido cinmico y p-cumrico. Estos ltimos, por medio de reducciones enzimticas producen propenilbencenos y/o alilbencenos y, por medio de oxidaciones con degradacin de las cadenas laterales pueden generan aldehdos aromticos, o por ciclaciones enzimticas intramoleculares producir cumarinas (Figura 2).
Figura 2: Formacin de fenilpropanoides Aceites Esenciales
52
Figura 3: Rutas biosintticas de formacin de Aceites Esenciales Aceites Esenciales
53 TABLA I: Aceites Esenciales constituidos predominantemente por compuestos aromticos
Aceites Esenciales
54 TABLA I: Aceites Esenciales constituidos predominantemente por compuestos aromticos (continuacin)
Aceites Esenciales
55 TABLA II: Aceites Esenciales constituidos predominantemente por compuestos terpenoides
Aceites Esenciales
56 TABLA II: Aceites Esenciales constituidos predominantemente por compuestos terpenoides (continuacin)
Aceites Esenciales
57 TABLA II: Aceites Esenciales constituidos predominantemente por compuestos terpenoides (continuacin)
Aceites Esenciales
58 TABLA II: Aceites Esenciales constituidos predominantemente por compuestos terpenoides (continuacin)
Aceites Esenciales
59 Clasificacin por grupos funcionales La composicin de la mayora de los aceites voltiles va desde hidrocarburos terpnicos, alcoholes simples y terpnicos, aldehdos, cetonas, fenoles, steres, teres, xidos, perxidos, furanos, cidos orgnicos, lactonas, cumarinas, hasta compuestos con azufre. En la Tabla III se presentan los aceites esenciales de acuerdo con la clasificacin en base a los grupos funcionales de sus componentes principales.
TABLA III: Clasificacin de los Aceites Esenciales de acuerdo a grupos funcionales Esencia Mtodo de extraccin / Parte usada Origen botnico Componentes importantes Uso HIDROCARBUROS Trementina (aguarrs) Destilacin con vapor extraccin y fraccionamiento de la oleorresina obtenida de la madera Pinus palustris Miller., y otras especies de Pinus L. (Flia. Pinceas) 64% o-pineno, 33% |pineno, dipenteno, metilchavicol, terpinoleno, acetato de bornilo y pinocarveol Irritante local, revulsivo y antisptico dbil ALCOHOLES Azahar (nerol) Destilacin con vapor de las flores frescas Critrus aurantium L.(Flia Rutceas) 30% (-)-linalol, (+)-o-terpineol, geraniol, geranil acetato, |pineno, 7% linalil acetato, limoneno Perfume, Sabor Cardamomo Destilacin con vapor de la semilla madura desecada Elettaria cardamomum (Flia. Zingiberacea) 26-40% cineol, 28-34% oterpinil acetato, 2-14% limoneno, 3-5% sabineno, 2-8% linalil acetato Condimento, carminativo Cilantro Destilacin con vapor del fruto maduro desecado Coriandrum sativum (Flia. Umbelferas) 60-70% (+)-linalol, limoneno, o-pineno, -pineno, p-cimeno, alcanfor Condimento, carminativo Enebro Destilacin con vapor del fruto maduro desecado Juniperus communis L.y su var. depressa Pursh (Flia. Cupresceas) 70% o-pineno, |pineno, o-terpineol, borneol, geraniol, mirceno y sabineno Sabor en bebidas alcohlicas, Diurtico Manzanilla Destilacin con vapor de la inflorescencia seca Matricaria recutita M. chamomilla L. (Flia. Asterceas) 10-25% (-)-o-bisabolol, 1-15% camazuleno, xidos del bisabolol Antinflamatorio, antilgico, estimulante de apetito Menta Destilacin con arrastre de vapor de las partes areas frescas de la planta en flor Mentha piperita L. (Flia. Labiadas) 50-78% mentol libre, 5-20% mentol esterificado, acetaldehido, cido valrico, o-pineno, felandreno, cineol, (-)-limoneno, (+) y (-)-mentona, acetato de mentilo Saporfero, Carminativo, Estimulante, y revulsivo Pino Destilacin con vapor extraccin y fraccionamiento de la madera Pinus palustris Miller., y otras especies de Pinus L. (Flia. Pinceas) 65%(+)-o-terpineol, 10% metilchavicol y teres fenlicos afines, 9% borneol, 8% alcohol fenqulico, 4% mentanoles Desinfectante, Desodorante Rosa Destilacin con vapor de las flores frescas Rosa spp. (Flia. Rosseas) Geraniol, (-)-citronelol, (5-10%) nerol, (-)-linalol y eugenol Perfume Sndalo Destilacin con vapor del leo interno desecado Santalum album L. (Flia. Santalceas) 90% mezcla de o y |-santalol Antisptico urinario, perfume Agua de Hamamelis Destilacin en corriente de vapor de las ramas recin cortadas y parcialmente desecadas Hamamelis virginiana (Flia. Hamamelidceas) 9,7% 2-hexen-1-al, 3,2% acetaldehdo, 3,5% o-ionona, 1% |-ionona, 0.2% safrol Astringente
Aceites Esenciales
60
TABLA III: Clasificacin de los Aceites Esenciales de acuerdo a grupos funcionales (continuacin) ALDEHIDOS Almendras amargas Maceracin con agua y posterior destilacin con arrastre de vapor de la mdula madura y seca (desprovista del aceite fijo) del fruto Prunus amygdalus Batsch var. amara (DeCandolle) Focke (Flia. Rosceas) >80% aldehdo benzico, 2-4% cido cianhdrico Ingrediente en medicamentos antitusgenos Canela Destilacin con vapor de las hojas Cinnamomum cassia Nees ex Blume (Flia. Laurceas) 75-85% aldehdo cinmico, salicilaldehdo, metilsalicilaldehdo, metileugenol Saporfero, carminativa, aromtica, pungente y antisptica Cscara de Limn Expresin en fro del epicarpio fresco del fruto Citrus limon (L.) Burmann filius (Flia. Rutceas) 60-80% (+)-limoneno, 4% citral, 8% |- pineno, 8% -terpineno, citronelal, acetato de geranilo, Saporfero, carminativo, estomquico Naranja amarga Expresin del epicarpio fresco del fruto Citrus aurantium L. (Flia. Rutceas) 1,5-2,5% aurantiamarina, 0.1% cido aurantiamrico, naringina, 0.4-3% isohesperidina, 5-8% hesperidina Saporfero, carminativo y estomquico. Naranja dulce Expresin del epicarpio fresco del fruto maduro Citrus sinensis (L.) Osbeck (Flia. Rutceas) 90% (+)-limoneno, 5% o y |citral Sabor, saporfero CETONAS Alcanfor Destilacin con vapor de la madera Cinnamomum camphora (L.) Nees et Ebermaier (Flia. Laurceas) 27-45% alcanfor, 4-21% cineol, 1-18% safrol Antipruriginoso, antiinfeccioso, Alcaravea Destilacin con vapor del fruto maduro desecado Cadum carvi L. (Flia. Umbelferas) 50-60% carvona, 40-50% (+)-limoneno, trazas de carveol y dihidrocarvona Aromatizante, Carminativa Hierbabuena (Menta Romana o verde) Destilacin con vapor de las partes areas frescas de la planta en floracin Mentha spicata (L) M. cardaca Gerard ex Baker (Flia Labiadas) 45-60% (-)-carvona, 6-20% alcoholes , 4-20% limoneno Saporfero, carminativo FENOLES Clavo de olor Destilacin con vapor de los botones florales desecados Eugenia caryophyllus (Sprengel) Bullock et Harrison (Flia. Mirtceas) (80-90%) eugenol, (2-27%) acetileugenol, (5-12% ) |-cariofileno, metil-K-n-amil cetona Saporfera, antiseptico, carminativo Tomillo Destilacin con vapor de la planta en floracin Thymus vulgaris (L.) T. zygis L. y su var. gracilis Boissier (Flia. Labiadas) timol, carvacrol, p-cimeno, canfeno, limoneno Saporfero, antisptico TERES FENOLICOS Ans estrellado Destilacin con vapor del fruto maduro desecado Illicium verum (Flia. Magnoliceas) 80-90% anetol, metilchavicol y p- metoxifenilacetona Saborizante Ans verde Destilacin con vapor del fruto seco Pimpinella anisum L. (Flia. Umbelferas) 80-90% anetol, metilchavicol, p- metoxifenilacetona y |-cariofileno Saborizante Hinojo Destilacin con vapor del fruto maduro desecado Foeniculum vulgare Miller (Flia. Umbelferas) 50-60% trans-anetol, (+)-fenchona, (+)-o-pineno, metilchavibetol, aldehido anisico, cido anisico, dipenteno Saporfero, carminativo Nuez Moscada Destilacin con vapor de la medula desecada de la semilla madura Myristica fragrans Houttuyn (Flia. Mirtceas) Safrol y miristicina (metoxisafrol), metoxieugenol, 60-80% (+)-canfeno, dipenteno, (+)-borneol, (-)-terpineol, geraniol, (+) y (-)-o-pineno Saporfero, carminativo OXIGENADOS Eucaliptos Destilacin con vapor de la hoja fresca Eucaliptus globulus Labillardire y otras espcies de Eucaliptus L'Heritier (Flia. Mirtceas) 70-85% Eucaliptol (Cineol), o-pineno, |-pineno, (+)-limoneno, p-cimeno, o-pelandreno, canfeno, -terpineno Saporfero, antisptico, diafortico y expectorante
Aceites Esenciales
61 TABLA III: Clasificacin de los Aceites Esenciales de acuerdo a grupos funcionales (continuacin) ESTERES Lavanda Destilacin con vapor de las sumidades floridas frescas Lavandula officinalis Chaix ex Villars (Flia. Labiadas 30-45% acetato de (-)-linalilo, geraniol, (-)-linalol, limoneno Aromatizante Romero Destilacin con vapor de las sumidades floridas frescas Rosmarinus officinalis L. (Flia. Labiadas) 2-6% esteres (acetato de bornilo), 8- 20% alcoholes (borneol), 20% cineol, o-pineno y canfeno Aromaterapia, perfumera, saborizante
QUIMIOTAXONOMA, LOCALIZACIN Y FUNCIONES
1. QUIMIOTAXONOMA Los aceites voltiles son abundantes en angiospermas dicotiledneas, como en las familias Asterceas, Apiceas, Lamiceas, Laurceas, Myrtceas, Myristicceas, Magnoliceas, Piperceas, Rutceas, entre otras. En angiospermas monocotiledneas la ocurrencia es relativamente rara, con excepcin de gramneas (especialmente especies de Cymbopogon y Vetiveria) y zingiberceas (especies de Alpinia y Curcuma, entre otras). Son raramente encontrados en gimnospermas a excepcin de Conferas.
2. LOCALIZACIN Dependiendo de la familia, los aceites esenciales pueden aparecer en estructuras secretoras especializadas, tales como en pelos glandulares (Lamiceas), clulas parenquimticas diferenciadas (Laurceas, Piperceas, Poceas), canales oleferos (Apiceas) o en canales lisgenos o esquizgenos (Pinceas, Rutceas). En trminos generales stos se localizan en la superficie del vegetal o cerca de la misma. Los aceites esenciales pueden estar almacenar en ciertos rganos, tales como las flores (rosas, jazmn, naranjas), sumidades (tomillo, lavanda, romero), hojas (hierba limn, eucalipto, laurel, menta) o incluso en la corteza de los tallos (canela), madera (sndalo, palo de rosa), leos (alcanforero, sasafrs), races (vetiver), rizomas (crcuma, jengibre), frutos (ans estrellado, hinojo) o semillas (nuez moscada, mostaza). Aunque todos los rganos de una planta puedan acumular aceites esenciales, su composicin puede variar dependiendo de la ubicacin. Por ejemplo, el aceite de la corteza de la canela es rico en aldehdo cinmico, mientras que de las hojas y de las races de ese mismo vegetal son ricos en eugenol y alcanfor, respectivamente. Los aceites esenciales obtenidos de diferentes rganos de una misma planta pueden presentar composicin qumica, caracteres fsico-qumicos y olores bien distintos. Cabe recordar que la composicin qumica de un aceite esencial, extrado del mismo rgano de una misma especie vegetal, puede variar significativamente, de acuerdo con la poca de colecta, condiciones climticas y de suelo. Aceites Esenciales
62
3. DATOS FARMACOLGICOS Y TOXICOLOGA Es importante diferenciar las propiedades farmacolgicas de una droga vegetal rica en aceites esenciales de la actividad farmacolgica del aceite aislado de la misma. Por ejemplo, el aceite esencial del romero (Rosmarinus officinalis L., Lamiceas) es antibacteriano, en tanto que la infusin de la planta es empleada para el tratamiento sintomtico de problemas digestivos diversos, por sus propiedades antiespasmdicas y colerticas, debidas a la presencia de compuestos fenlicos. De la misma manera, es necesario diferenciar la toxicidad de plantas medicinales ricas en aceites esenciales y de los aceites esenciales aislados de las mismas. Generalmente los aceites presentan toxicidad elevada, pero se encuentran en baja proporcin en las plantas.
MTODOS DE OBTENCIN DE ACEITES ESENCIALES Destilacin en corriente de vapor (o arrastre con vapor de agua) La destilacin en corriente de vapor o arrastre con vapor es una ingeniosa tcnica para la separacin de sustancias insolubles en agua y ligeramente voltiles, de otros productos no voltiles mezclados con ella. Es la forma ms habitual de obtencin de los aceites esenciales (AE), dado que el arrastre en corriente de vapor hace posible la purificacin adecuada de muchas sustancias de punto de ebullicin elevado mediante una destilacin a una temperatura relativamente baja (la de ebullicin del agua a una dada presin atmosfrica). Esta tcnica es particularmente til cuando la sustancia en cuestin hierve por encima de 100 C y se descompone en su punto de ebullicin o por debajo de ste. Para comprender cmo esto es posible, consideremos cmo se comporta en la destilacin un sistema de dos fases formado por dos lquidos no miscibles. En una mezcla de dos lquidos (x e y) completamente insolubles entre s, cada lquido ejerce su propia tensin de vapor caracterstica e independiente de la del otro. Por lo tanto la tensin de vapor total (P T ) se puede calcular de la siguiente forma:
P T = P x + P y (a T)
Donde P x es la tensin de vapor de x a la temperatura T, y P y es la tensin de vapor de y a la misma temperatura. Las tensiones de vapor son completamente independientes de las cantidades relativas de los componentes existentes en la mezcla. Aceites Esenciales
63 El punto de ebullicin de la mezcla ser aquella temperatura en la que la tensin de vapor total (P T ) sea igual a la atmosfrica (en Rosario: P atm =760 mm de Hg). Esta temperatura ser inferior al punto de ebullicin de cualquiera de los componentes del sistema, a menos que P x o P y sean igual a cero. En la Tabla IV se muestran las tensiones de vapor de clorobenceno (P x ), agua (P y ) y de la mezcla de ambos lquidos inmiscibles (P T ) a diferentes temperaturas del sistema. Notar que cuando la suma de ambas tensiones parciales de vapor alcanza el valor de 760 mm de Hg, el sistema entra en ebullicin (90,8 C) y esta temperatura se mantendr constante hasta que uno de los lquidos se agote (P x o P y = 0 mm de Hg). Slo cuando ha desaparecido una de los dos lquidos inmiscibles, el Peb aumenta hasta que hierve el componente que ha quedado remanente en el baln.
TABLA IV: Presin de vapor de agua, Cl-benceno y de la mezcla agua-Cl-benceno a Temp=(20-132C).
Temp (C) 20 50 70 80 90,8 100 132 Pv Cl-benceno (mm) 9 43 100 147.5 218 296 760 Pv agua (mm) 18 92 234 355 542 760 Pv Total (mm) 27 135 334 502.5 760 105.6 Fuente: "Computer Aided Data Book of Vapor Pressure, 2nd edition".
Si uno de los lquidos es agua y si se trabaja a la presin atmosfrica, se podr separar un componente de mayor punto de ebullicin (por ejemplo eugenol, Peb eugenol =253,5C) a una temperatura menor que 100 C (lo cual es muy importante cuando la sustancia se descompone a temperaturas del orden de su punto de ebullicin). Este procedimiento tambin es til para separar sustancias voltiles de no voltiles o indeseables (resinas, sales inorgnicas, etc.) Ahora bien, puesto que la presin ejercida por un gas (a una temperatura dada) es proporcional a la concentracin de sus molculas, la relacin de las tensiones de vapor de x e y en el punto de ebullicin de la mezcla ser igual a la relacin entre el nmero de molculas de x y el nmero de molculas de y que destilan en la mezcla. En otras palabras, la composicin del vapor se puede calcular de la siguiente forma:
Donde N x /N y es la relacin molar de x e y en el vapor. La relacin de pesos de x e y en el vapor depender no solamente de la relacin de moles, sino tambin de los pesos moleculares de x e y, y esta relacin de pesos (W x /W y ) ser igual a:
Aceites Esenciales
64
Donde M x y M y son los pesos moleculares de x e y respectivamente. Expresando en palabras esta importante ecuacin se puede decir que en la destilacin de una mezcla de dos lquidos inmiscibles, las cantidades relativas en peso de los dos lquidos que se recogen en el colector, son directamente proporcional a: 1) las tensiones de vapor de los lquidos a la temperatura de destilacin, y 2), a sus pesos moleculares. Adems, como se mencion ms arriba, la mezcla destilar a una temperatura constante en tanto exista por lo menos algo de cada uno de los componentes. Estos hechos constituyen la base de la purificacin y separacin de sustancias por arrastre en corriente por vapor. Existen muchos compuestos orgnicos de punto de ebullicin relativamente alto que con agua codestilan en una cantidad en peso lo suficientemente grande para ser destilados con cierta rapidez por debajo de 100 C. Esto se debe a sus pesos moleculares relativamente elevados comparados con los del agua. Para que la sustancia insoluble destile en cantidad apreciable, debe tener una tensin de vapor de por lo menos 5-10 mm de Hg a 100 C. Si en la destilacin en corriente de vapor, la fase insoluble en agua est formada por dos componentes, las dos fases diferentes (la acuosa y la orgnica) destilan segn los principios de la destilacin en corriente de vapor, es decir, la relacin molar de las dos fases en el destilado es la misma que la existente entre las tensiones de vapor de las dos fases. Sin embargo, los componentes de la fase orgnica destilan, respecto uno del otro, segn los principios de la destilacin ordinaria, es decir que el destilado es ms rico que el residuo en el componente ms voltil. La mayora de los compuestos orgnicos que se arrastran en corriente de vapor no son completamente insolubles en agua, especialmente a la temperatura de destilacin. Esto hace disminuir algo de la eficacia calculada del proceso. La adicin de cloruro de sodio para saturar la fase acuosa, presenta la doble ventaja de disminuir la solubilidad del compuesto orgnico en la fase acuosa, y de disminuir tambin la tensin de vapor del agua respecto de la tensin de vapor de la fase orgnica.
Aceites Esenciales
65 Equipo de destilacin por arrastre con vapor de agua La hidrodestilacin se puede realizar al menos de dos maneras. El primer mtodo, y generalmente el ms eficiente (Figura 5), consiste en colocar la droga convenientemente fragmentada (fresca o tras desecacin) en un baln con agua para luego inyectar sobre sta el vapor de agua generado previamente en otro recipiente. Este "vapor de arrastre" en realidad no cumple la funcin de arrastrar el componente voltil, sino de condensarse en el matraz y formar otra fase inmiscible que ceda su calor latente a la mezcla a destilar para lograr su evaporacin. Adems, al hacer burbujear vapor a travs de la mezcla, el sistema se mantiene agitado y se llega a un equilibrio entre el vapor y los dos lquidos. Los vapores de la sustancia, junto con los del agua, son condensados en el refrigerante y recogidos luego en un colector. Si en cambio, slo se requieren pequeas cantidades de vapor para destilar completamente la mezcla, ste puede ser generado directamente en el baln que contiene la droga (Figura 6). Este segundo mtodo no resulta aplicable para destilaciones que requieren grandes cantidades de vapor, pues sera necesario agregar agua continuamente o usar balones inconvenientemente grandes. Cuando el rendimiento del aceite es muy bajo, el equipo se modifica de manera que la porcin acuosa del destilado vuelva al baln repetidas veces. Para ello, se utiliza una Trampa de Dean-Stark. Existen variantes de trampas de Dean-Stark para aceites esenciales menos densos y ms densos que el agua, segn se requiera (figura 4). Esta hidrodestilacin continua se conoce como COHOBACIN.
Figura 4: Trampas de Dean-Stark para aceites menos densos (izquierda) y ms densos (derecha) que el agua. Aceites Esenciales
66
Figura 5: Equipo de destilacin por arrastre con vapor de agua
Figura 6: Equipo de hidrodestilacin simple.
OTROS MTODOS DE EXTRACCIN Los mtodos de extraccin varan conforme la localizacin del aceite voltil en la planta y con el objetivo de utilizacin del mismo.
Extraccin con solventes orgnicos El principal factor para el xito del proceso de extraccin es la correcta eleccin del solvente. Este debe poseer especificidad y elevado poder de solubilizante, bajo punto de ebullicin, baja capacidad residual, baja inflamabilidad y bajo costo. Los disolventes ms usados son apolares (ter etlico, ter de petrleo, benceno o diclorometano). Esta metodologa presenta la ventaja frente a la hidrodestilacin simple de operar a baja temperatura, con lo cual existe una menor posibilidad de alteracin de los componentes termolbiles; por el contrario, se extraen otros compuestos solubles en el disolvente seleccionado que no constituyen el aceite Aceites Esenciales
67 esencial sino que, al contrario, lo adulteran (por ejemplo clorofila cuando se extrae aceite esencial de hojas). Por eso, los productos as obtenidos raramente poseen valor comercial.
Enfloracin (enfleurage) Este mtodo, muy utilizado en el pasado, actualmente se emplea slo en algunas industrias de perfumes, en el caso de especies vegetales con bajo tenor de aceite con alto valor comercial. Es empleado para extraer aceite voltil de ptalos de flores (naranjas, rosas, junquillo, jazmn). Los ptalos son depositados a temperatura ambiente sobre una camada de grasa, durante un cierto perodo de tiempo. En seguida, estos ptalos agotados son substituidos por nuevos hasta la saturacin total de la grasa. La grasa saturada en aceite esencial es tratada con alcohol, y para obtenerse el aceite esencial, el alcohol es destilado a baja temperatura. El producto obtenido de esta manera posee alto valor comercial.
Prensado (o expresin) Este mtodo es utilizado para la extraccin de los aceites esenciales de frutos ctricos. La tcnica consiste en ejercer, bajo una corriente de agua finamente nebulizada, una accin abrasiva sobre la superficie del fruto. Los pericarpios son prensados y el aceite voltil es separado del residuo slido. Posteriormente, el aceite es separado de la emulsin formada con el agua a travs de decantacin, centrifugacin o destilacin fraccionada.
Extraccin con CO 2 supercrtico Este mtodo permite recuperar los aromas naturales de varios tipos y no solamente aceite esencial de modo bastante eficiente y, actualmente, es el mtodo de eleccin para la extraccin industrial de aceites esenciales. La ventaja fundamental de esta metodologa radica en que ninguna traza de solvente permanece en el producto obtenido, tornndolo ms puro que aquellos obtenidos por otros mtodos. Para tal extraccin, el CO 2 es primeramente licuado a travs de compresin y en seguida, llevado a una Temp > 31C (Figura 7). A esta temperatura, el CO 2 alcanza un cuarto estado, en el cual su viscosidad es anloga a la de un gas, aunque su capacidad de disolucin es elevada como la de un lquido. Una vez efectuada la extraccin, se hace retornar el CO 2 al estado gaseoso, resultando en su total eliminacin. Aceites Esenciales
68
Figura 7: Diagrama de fases del CO 2 .
CONSERVACIN La relativa inestabilidad de las molculas que constituyen los aceites esenciales torna difcil su conservacin. Las posibilidades de degradacin son innumerables y pueden ser estimadas a travs de la medicin de algunos ndices (perxido, refraccin), por determinacin de caractersticas fsico-qumicas (viscosidad, miscibilidad con alcohol, poder rotatorio), o mediante anlisis por cromatografa gaseosa (GC). El deterioro de los aceites esenciales reduce su valor comercial, adems de constituir un factor de riesgo cuando ellos son destinados al uso externo, ya que pueden provocar alergia o dermatitis de contacto. Las alteraciones ocurren principalmente, por reacciones de oxidacin y de polimerizacin. Las reacciones de oxidacin producen la llamada RESINIFICACIN del aceite esencial (siendo los constituyentes insaturados ms afectados que los saturados). Los aceites esenciales deben ser guardados libres de agua (desecados con Na 2 SO 4
anhidro) y de impurezas insolubles. Para reducir las degradaciones, se deben utilizar frascos de pequeo volumen, en embalajes neutros, hechos de aluminio, acero inoxidable o vidrio mbar, completamente llenos y hermticamente cerrados, que deben ser almacenados a baja temperatura, o de preferencia, bajo atmsfera de nitrgeno. El uso de recipientes plsticos, especialmente de polietileno y propileno, presenta problemas de permeabilidad y adsorcin de componentes de los aceites voltiles. Se debe evitar el uso de sellos de goma, plstico o cuero, por ser materiales que se pueden disolver o endurecerse con el paso del tiempo. Adems de eso, Aceites Esenciales
69 con el uso de materiales plsticos, agentes plastificantes, como los ftalatos, pueden ser liberados y contaminar el aceite esencial, disminuyendo su valor comercial. Aceites Esenciales
70 Gua de Trabajos Prcticos: Aceites Esenciales
OBJETIVO: *Aislamiento de aceite de Clavo y separacin de eugenol y acetil eugenol
EXTRACCIN DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO El Clavo de olor consiste en los botones florales enteros desecados de Eugenia caryophyllus [Sprengel] Bullock & Harrison (=Sysygium aromaticum (L.) Merr. & Perry) Mirtaceae. La inflorescencia se dispone en forma de umbela. Los botones se recolectan manualmente cuando adquieren color rojo. Separados del pednculo se desecan y toman color pardo-rojizo. Los botones se separan a mano de sus pedicelos.
COMPOSICIN QUMICA: Contiene abundante aceite esencial (15-20%) ms denso que el agua, compuesto principalmente por eugenol (80-90%). Otros componentes son acetileugenol (2-27%) y |- cariofileno (5-12%). El aceite obtenido puede ser tratado simplemente como una mezcla de eugenol y acetileugenol, ya que las trazas no son prcticamente detectadas.
Pednculos de Clavo. A, Esquema del hbito, mostrando la disposicin opuesta y cruzada y los pedicelos ltimos en grupos de tres.
Eugenia caryophyllus: A, Clavo de Penang; B, Clavo de zanzbar; C, fruto (Clavo madre); D, pednculo del Clavo; E, Clavo cortado longitudinalmente. 1, spalo; 2, ptalo; 3, estambres; 4, estilo, 5, vulos; 6, hipando; 7, glndulas de esencia. Aceites Esenciales
71
La droga contiene adems flavonoides (derivados de la quercetina y el kamferol), cidos fenoles (glico, protocatquico) y abundantes taninos (10-13%) entre los que se destaca el elagitanino eugeniina. Contiene tambin pequeas cantidades de esteroles: sitosterol, estigmasterol, y campesterol.
USO: El Clavo se emplea principalmente como especia. Los fitomedicamentos con Clavo se utilizan en preparados para lavados de la mucosa bucofarngea. En odontologa ha sido empleado como anestsico local y antisptico, aunque ha sido reemplazado por un derivado: eugenolato de cinc. El eugenol es un potente inhibidor de la actividad plaquetaria, por ello debe evitarse su utilizacin por va interna en personas que reciben terapia anticoagulante y aspirina. El aceite esencial de Clavo es un carminativo que ha sido empleado en clicos con flatulencia. Tambin se emplea por va tpica en preparaciones destinadas a aliviar dolores reumticos.
TCNICA: 1. En un aparato de destilacin simple, separe el aceite esencial contenido en 2,5 gramos de Clavos molidos. El destilado contiene aceite de Clavo, algo separado y algo emulsionado. 2. Extraiga 15 ml de la mezcla con tres porciones de 15 ml cada una, de ter de petrleo o diclorometano. 3. Reserve una porcin del extracto etreo para una posterior CCD. 4. Para la separacin de los dos componentes principales, extraiga 15 ml de la solucin etrea con 3 porciones de 15 ml cada una de solucin de NaOH al 10%. 5. La capa etrea se seca con Na 2 SO 4 anhidro, se filtra y el solvente se evapora y recupera por medio de evaporador rotatorio. 6. Los extractos alcalinos reunidos se acidifican con HCl hasta reaccin cida al tornasol y se extraen con 15 ml (dos veces) de ter. Secar con Na 2 SO 4 anhidro, filtrar y evaporar. Aceites Esenciales
72 7. Haga una cromatografa en capa delgada para comparar el extracto original respecto de los compuestos separados. Fase Estacionaria: Slica Gel 60 F Fase Movil: DCM:Eter de Petrleo:c. frmico (7:4:2 gotas). Revelador: Vapores de I 2 . Esquematice su resultado y responda si dicho resultado es el que hubiera obtenido en una separacin ptima. Examine los espectros IR y 1 H-RMN del eugenol y analcelos.
MOSTRACIONES
DESTILACIN DE EUGENOL/AGUA Un baln conteniendo 15 mL de eugenol y 50 mL de agua es ensamblado a un equipo de destilacin simple. Mediante la lectura de la temperatura del sistema; se puede calcular la Pv eugenol en la mezcla, a dicha temperatura. (La Pv agua se obtendr de la Tabla 4 al final del texto).
EXTRACCIN DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO POR COHOBACIN Se utiliza una Trampa de Dean-Stark para aceites esenciales ms densos que el agua (Figura 4), con un baln en posicin C y un refrigerante en posicin D. A un baln de fondo redondo (con capacidad de 1000 mL) se le agregan 25 g de Clavo de olor molido, se lo llena hasta cubrir completamente la droga (aproximadamente hasta la mitad de su capacidad) y se le agregan ncleos de ebullicin. Comenzar a destilar y observar el volumen de esencia obtenido en el tubo graduado de la trampa.
EXTRACCIN DE ACEITE ESENCIAL DE MANZANILLA La Manzanilla est constituida por las inflorescencias secas de Matricaria recutita L. Rauschert Matricaria chamomilla L. (Asteraceae). Tambin se la conoce como Manzanilla alemana o Manzanilla dulce.
Aceites Esenciales
73
COMPOSICIN QUMICA: El constituyente principal de los capitulos florales de Manzanilla es el aceite esencial. La esencia (0,25 y 1,5 %) contiene alrededor de un 50% de los sesquiterpenos con esqueleto bisabolano: (-)-o-bisabolol y sus xidos A y B, xido de bisabolona, espiroteres (hasta un 25%) y camazuleno (1-15%) el cual se forma a partir de la matricina (lactona sesquiterpnica) durante la destilacin. El camazuleno es el responsable del intenso color azul de la esencia. Entre los flavonoides se han identificado principalmente hetersidos de la apigenina, como la 7-glucosil-apigenina, y de otras flavonas y flavonoles, que constituyen hasta un 8% de la droga. Otros componentes son: polisacridos mucilaginosos (hasta un 10%), cumarinas (umbeliferota y herniarina), cidos fenoles y lactonas sesquiterpnicas (matricina).
A, Flor; B, lgula de la misma; C, corte longitudinal. 1, Fsculo; 2, lgula; 3, palea; 4, receptculo; 5, brctea del involucro. Farmacognosia, G. E. Trease and W. C. Evans, 3 edicin.
Aceites Esenciales
74
USOS: La Manzanilla es utilizada desde la antigedad por sus propiedades antiinflamatorias, como espasmoltica y antiulcerosa gstrica. El aceite esencial es antibacteriano, antifngico, carminativo y eupptico (digestivo estomacal). Adems la droga tiene accin antiinflamatoria tpica y cicatrizante y diversos ensayos han destacado cierta actividad sedante. Se utiliza por va oral en el tratamiento de afecciones dermatolgicas, as como analgsico y antibacteriano de la cavidad bucofarngea y como antiinflamatorio en irritaciones oculares que no vayan acompaadas de heridas. En cosmtica se utiliza en champes para aclarar los cabellos, y en geles solares.
TCNICA: Se usa una trampa para aceites menos densos que el agua como la de la figura 4, con un baln en posicin A y un refrigerante en posicin B. Usar un baln de fondo redondo (con capacidad 500 1000 mL) conteniendo alrededor de 500 ml de agua en el caso del baln de 1000 ml. En la trampa se coloca 5 ml de xileno exactamente medidos. Agregar al baln 40 g de Manzanilla y luego de colocar el refrigerante, hervir el contenido del baln, manteniendo una ebullicin suave. Destilar a una velocidad de 3-4 ml por minuto durante 4 horas o hasta que la cantidad de aceite voltil se mantenga constante. Leer la cantidad de aceite voltil formado y calcular la concentracin por 100 g de droga.
Aceites Esenciales
75 DESTILACIN DEL ACEITE ESENCIAL DE NUEZ MOSCADA POR ARRASTRE CON VAPOR DE AGUA. La Nuez Moscada es la semilla madura y desecada de Myristica fragrans (Flia. Miristicceas), desprovista de sus tegumentos y del arilo y a veces provista de una delgada capa de cal que le sirve para ahuyentar los insectos. El secado de la semilla dura de 3 a 6 semanas, luego de las cuales se le quitan las testas.
Constituyentes de las semillas: 25-40% de un aceite fijo slido a temperatura ambiente (manteca de Nuez Moscada) constituido por trimiristina. 8-15% de un aceite voltil que contiene miristicina y safrol como constituyentes principales.
Estructura de trimiristina (a), de safrol (b) y de miristicina (c).
La operacin en s, consiste esencialmente en arrastrar una sustancia, la cual es insoluble en agua, por pasaje de vapor de agua dentro de la mezcla del componente y agua. Para ello se utiliza un equipo de destilacin por arrastre con vapor de agua como el de la figura 5. El vapor de agua es generado en un baln o kitasato, provisto de una purga que se cierra cuando el vapor generado es continuo. El vapor de agua all generado pasa al matraz o baln que contiene una mezcla de Nuez Moscada molida (25 g) macerada con agua. En este recipiente se produce el arrastre de la sustancia, cuyos vapores, junto con los del agua son condensados en el refrigerante y recogido luego en el colector. Aceites Esenciales
76 TABLA 4: Presiones de vapor del agua por debajo de 100C Temp C 0 0.2 0.4 0.6 0.8
1. Oliveira Simes, C. M. [et al.]. Farmacognosia: da planta ao medicamento 2 ed. Rev; Ed. Universidade/UFRGS/Ed. da UFSC Porto Alegre/ Florianpolis, 2000; pp. 387-415. 2. Dominguez, X. A., Experimentos de qumica orgnica 3 reimpresin; Ed. Limusa S.A.: Mxico, 1975; pp. 41-42. 3. Roberts, R.M., Gilbert, J.C., Rodewalt, L. B., Wingrove, A.S. Modern Experimental Organic Chemistry 3 ed; Saunders College: Philadelphia, 1969; pp. 44-49. 4. Wiberg, K. B. Tcnica de Laboratorio en Qumica Orgnica; Ed Kapelusz S.A.: Bs As, 1962; pp70-73. 5. Brewster, R.Q., VanderWert, C.A., McEwen, W.E. Curso Prctico de Qumica Orgnica 2 Ed.; Ed Alhambra S.A.: Madrid; pp 37-40. 6. Glasstone, S., Lewis, D. Elementos de Qumica Fsica 2 Ed; Ed Mdico Quirrgica: Bs As, 1965; pp 452-454. 7. Bravo Daz, L. Farmacognosia; Ed. Elsevier Espaa S.A.: Madrid, 2003; pp. 103-104, 209-211. 8. Newall, C. A., Anderson, L. A., Phillipson, J. D. Herbal Medicines. A guide for health-care professional; The Pharmaceutical press, Great Britain at the university press, Cambridge: London, 1996; pp. 69-79. 9. Fitoterapia. Vademcum de Prescripcin. Editores: Vanaclocha, B., Caigueral, S.4 edicin, Masson S.A., Barcelona, Espaa, 2003.
Aceites Esenciales
78 TAREA DE AULA DE ACEITES ESENCIALES 1- Cules son las familias vegetales ms ricas en aceites esenciales? En qu estructuras secretoras del vegetal se encuentran? 2- Para qu sintetiza el vegetal aceites esenciales? 3- Cules son los constituyentes qumicos ms abundantes de los aceites esenciales? 4- Por qu se los llama aceites voltiles y por qu aceites esenciales? 5- El componente de una esencia que le da las caractersticas de olor y/o sabor a la misma, es el compuesto que se encuentra en mayor proporcin en la esencia? 6- Cules son los tipos de aceites voltiles que se conocen y en base a qu se ha hecho la clasificacin? Nombre al menos dos. 7- Qu diferencia biosinttica existe entre los cidos grasos (componentes de los aceites fijos) y los terpenoides (componentes de los aceites voltiles)? 8- Cules son las rutas biosintticas a travs de las cuales se forman los componentes de los aceites voltiles? 9- Qu cambios se producen al someter a los aceites voltiles a: a- Calentamiento con KOH alcohlico? b- Exposicin al aire? 10- Si se coloca sobre un papel de filtro una gota de aceite fijo y una de aceite esencial y se lo deja permanecer al aire un tiempo, qu sucede en cada caso? 11- Busque en la Farmacopea las esencias estudiadas. Qu propiedades de los aceites esenciales utiliza la F.N.A. 6 Ed. para identificarlos? 12- Del anlisis de las tablas 1 y 2 (pginas 53-60) saque conclusiones respecto a: a- Mtodo ms comn de obtencin de aceites esenciales. b- Porcentaje de aceite esencial que contienen las especies vegetales. c- Porcentaje de componente principal que contiene la esencia. Es semejante en todas las esencias? Complete el estudio de las esencias con los siguientes datos: 13- ESENCIA DE MENTA: Aceites Esenciales
79 a- Explique por qu las esencias de menta de buena calidad slo se obtienen de plantas con un gran porcentaje de tejidos maduros. b- Qu diferencia existe entre la esencia de Mentha piperita y la esencia de Mentha arvensis? Usos de cada una. 14- ESENCIA DE NARANJAS AMARGAS: a- Qu diferencia en composicin qumica existe entre la esencia de naranja amarga y de la dulce? Qu semejanzas en composicin qumica tienen ambas? Usos de ambas. b- Qu significa esencia de limn desterpenizada? Para qu se practica este procedimiento? 15- ESENCIA DE ALMENDRAS AMARGAS: a- Por qu se clasifica a este aceite voltil dentro de los aceites voltiles glicosdicos y tambin dentro de los aldehdos? b- Tiene uso farmacutico la esencia de almendras amargas? Por qu? 16- ALCANFOR: Qu diferencia existe entre el alcanfor que se vende en las farmacias y el natural? 17- ESENCIA DE LAVANDA Escriba el acetato de linalilo. 18- Se quiere obtener una mezcla de dos sustancias inmiscibles A y B. Las presiones de vapor (P v ) de los compuestos aislados se detallan a continuacin: 50 80 100 150 P v(A)= 130 240 480 760 P v(B)= 347 520 760 970
Indicar: a. A qu temperatura comienza la destilacin? b. A qu temperatura corresponde T=2? c. Qu compuestos destilan a esas temperaturas? Aceites Esenciales
80 d. Cuando co-destilan, En qu proporcin lo hacen?
19- Calcular la composicin del destilado de una mezcla de la sustancia A con H 2 O Datos: T eb mezcla = 92C T eb A = 170C PM A = 150 P atm = 760 mm de Hg. T (C) P v (agua) (mm de Hg.) 90 525 91 546 92 560 93 588 94 610 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 tiempo Temp T=1 T=2 (C) Carotenoides
81
CAROTENOIDES
PIGMENTOS FOTOSINTTICOS Todas las clulas fotosintticas contienen uno o ms de los pigmentos conocidos como clorofilas, que son los principales pigmentos absorbentes de la luz en la mayor parte de las plantas verdes. Pero, adems de la clorofila, las clulas fotosintticas contienen uno o ms pigmentos accesorios, que incluyen a los carotenoides (amarillos, rojos o prpuras) y las ficobilinas (rojas o azules), que son tambin utilizados como receptores de energa luminosa. Ellos actan como receptores luminosos suplementarios para porciones del espectro visible que no estn completamente cubiertos por la clorofila. Los electrones deslocalizados de su sistema de dobles enlaces conjugados permite la captura y transmisin de energa lumnica, son fotoprotectores frente a radiaciones nocivas y pueden actuar como antioxidantes. Sin embargo, cuando la energa luminosa es absorbida por tales pigmentos, tiene que transferirse como energa de excitacin a las molculas de clorofila antes de que pueda ser utilizada para la fotosntesis. Es por eso que la clorofila es el componente indispensable del aparato fotosinttico y los carotenoides y ficobilinas los accesorios.
Estos pigmentos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, se acumulan en los cloroplastos de todos los tejidos fotosintticos, caroteno, lutena, violaxantina y neoxantina se encuentran en las hojas de casi todos los vegetales. Se localizan en los complejos proteicos de los fotosistemas de membrana de los tilacoides donde intervienen en la fotosntesis. En plantas se pueden encontrar en distintas localizaciones: Carotenoides
82 - flores (pensamientos, maravillas, clavel de la India) - frutos (capsantina en pimientos, licopeno en tomate) - races (carotenos en Zanahoria) - semillas (zeaxantina en maiz)
ESTRUCTURA QUMICA - Nmero de tomos de carbono: Los carotenoides son molculas tetraterpnicas formadas por encadenamientos de ocho unidades isoprnicas (marcadas como ejemplo en la estructura del |-caroteno) y por lo tanto, conteniendo cuarenta tomos de carbono.
- Dobles enlaces: El cromforo caracterstico de los carotenoides es la presencia de al menos diez dobles enlaces conjugados, generalmente con configuracin trans. Este extenso sistema t es responsable que los carotenoides absorban en la regin del visible del espectro electromagntico (entre 450 y 500 nm) y les confiere los colores amarillo, anaranjado o rojo que se observan en los tejidos de las plantas.
- Presencia de grupos oxigenados: De acuerdo a la presencia de grupos funcionales oxigenados en la molcula, los carotenoides pueden dividirse en: - Carotenos: no poseen oxgeno en su molcula, son hidrocarburos solubles en solventes poco polares. - Xantfilas, son derivados oxigenados de los carotenos. Poseen en sus anillos laterales, grupos funcionales oxigenados (alcoholes, aldehdos, cidos, cetonas y epxidos), son solubles en solventes polares como etanol.
- Presencia de ciclos: Estas molculas poseen en sus extremos, ciclos de 5 6 tomos de carbono, que se reconocen por letras griegas (o, , y ). En general, se encuentran unidos a la cadena central por un enlace simple.
De acuerdo con estos ltimos criterios, los carotenoides pueden clasificarse de la siguiente forma:
Carotenoides
83 Ejemplo Carotenoides Carotenos Acclicos (no poseen ciclos) licopeno Con un ciclo -caroteno, -caroteno Con dos ciclos -caroteno, -caroteno Xantfilas zeaxantina violaxantina luteina astaxantina capsantina flucoxantina
Ejemplos de carotenos hallados en la naturaleza:
- Carotenos: Se conocen cinco carotenoides ismeros (o, |, , o ccaroteno) que han sido aislados de Zanahorias (Daucus carota) y son los responsables del color anaranjado. En las Zanahorias la proporcin aproximada es: 85% de |-caroteno, 15% de ocaroteno, 0,1% de -caroteno y proporciones an menores de los ismeros o- y c-. Tambin se encuentran en otros vegetales amarillo-anaranjados como meln, mango, papaya y calabaza; y en vegetales verde oscuro como brcoli y repollitos de Bruselas.
|-caroteno
o-caroteno
o-caroteno
Carotenoides
84
-caroteno
- Licopeno: El licopeno es el ismero acclico del |-caroteno responsable del color rojo del tomate (Lycospersicon esculente) y tambin en pomelo rosado y sanda. Tiene una potente actividad antioxidante protegiendo por el dao de radicales libres, especialmente aquellas causadas por oxgeno singlete.
Ejemplos de xantofilas hallados en la naturaleza:
- Zeaxantina: HO OH
- Capsantina: Es el principal carotenoide del pimiento comn (Capsicum annuum) y en otras especies del mismo gnero, en los que representa hasta el 60% del total de los carotenoides presentes; y tambin en el pimentn, utilizado extensamente como especia, por su color y aroma.
Carotenoides
85 OH O HO
- Luteina: HO OH
- Astaxantina: Es el carotenoide ms comn en los animales. Es el principal pigmento responsable del color rosa de la carne del salmn o de la trucha, y tambin de las huevas de algunos peces. Como los dems animales, estos peces no pueden sintetizar los carotenoides de novo, por lo que dependen de los contenidos en la dieta, que si pueden transformar unos en otros, con ciertas limitaciones. Esto es importante en acuacultura, ya que si se quiere obtener el color habitual en los animales salvajes, deben incluirse carotenoides precursores en los piensos. HO OH O O
- Flucoxantina HO O OAc OH - Violaxantina: HO OH O O
Carotenoides
86 Carotenoides y Vitamina A La vitamina A1 (retinol) y vitamina A2 (dehidro-retinol) son vitaminas liposolubles cuya estructura es de un alcohol constitudo por la mitad de la molcula de |-caroteno (tiene estructura de diterpeno). El retinol y sus derivados se encuentran en productos animales como lcteos, huevos, hgado y riones, principalmente, en el aceite de hgado de bacalao por lo que se lo utiliza como suplemento dietario. Los |-carotenos son precursores de la vitamina A (pro- vitaminas A) en los que se transforman a travs de un proceso enzimtico que ocurre en los tejidos animales y que es catalizado por una dioxigenasa. OH OH Retinol (Vitamina A1) Dehidro-retinol (Vitamina A2) O
La deficiencia en vitamina A causa defectos en la visin, ceguera nocturna (nictalopata) y enfermedad degenerativa de cornea, como tambin retardo en el crecimiento, hiperqueratosis en la piel y aumento de la sensibilidad a infecciones. Los retinoides (vitamina A y anlogos) actan en la sealizacin molecular que regula aspectos de la diferenciacin celular, el desarrollo embrionario, el crecimiento y la visin. Por otra parte, el consumo excesivo de vitamina A puede producir efectos txicos como cambios patolgicos en la piel, prdida del cabello, visin borrosa y dolores de cabeza y, en algunos casos, Sndrome de Hipervitaminosis A. Se ha encontrado evidencia que los carotenoides ejercen una accin preventiva de afecciones degenerativas cumpliendo un papel protector frente a algunos tipos de cnceres. Se utilizan en el tratamiento de sntomas de porfirias, fotodermatosis, fotosensibilidad medicamientosa, urticaria solar, etc. Se los utiliza en pldora autobronceantes y como colorantes naturales no txicos. Se utiliza en la prevencin y curacin de enfermedades oftalmolgicas como xeroftalmia y nictalopa. Carotenoides
87 INTRODUCCIN PARA LA REALIZACIN DEL TRABAJO PRCTICO - Extraccin: Los pigmentos presentes en las plantas: carotenos, xantofilas y clorofilas, como son de estructura diferente, difieren en su solubilidad y, por lo tanto, se los puede extraer usando solventes selectivos. Conviene hacer la extraccin con poca luz y calor porque los pigmentos tienden a oxidarse y polimerizarse cuando estn expuestos a la luz y el calor. - Purificacin: Una vez extrados, la separacin de carotenos de xantfilas se puede realizar utilizando una columna cromatogrfica empleando como fase estacionaria un adsorbente adecuado, muchos de los cuales han sido usados para la separacin de los pigmentos de los cloroplastos: almina, inulina, almidn, slica gel, etc. Los carotenos (ms apolares) pasan rpidamente a travs de la columna y los productos de oxidacin de los mismos, las xantofilas quedan retenidas en la columna. - I dentificacin: La estructura de los carotenos purificados, puede ser determinada a travs de un espectro de 1 HRMN. ste presenta seales caractersticas que para el |-caroteno son: 1.57 2.21 2.21 2.21 2.21 1.74 1.25 1.25 1.82 1.57 1.74 1.96 1.82 1.25 1.25 6.51 6.51 6.51 6.51 6.23 6.23 6.23 6.23 6.51 6.51 6.51 6.51 6.51 6.51 H H H H H H H H H H H H H H
0 1 2 3 4 5 6 7 PPM
Carotenoides
88 Gua de Trabajo Prctico: Carotenoides OBJETIVO: Obtencin de | caroteno a partir de Zanahoria (Daucus carota)
TCNICA: 1. Macerar en oscuridad 4 gramos de Zanahoria rallada en 15 mL de etanol durante 5 minutos. 2. Filtrar con vaco. 3. Guardar el filtrado en un erlenmeyer. 4. Colocar el slido residual en un baln y extraer a reflujo con 10 mL de cloroformo durante 5 minutos. 5. Filtrar. Repetir los pasos 4 y 5, dos veces ms con 10 mL de cloroformo. 6. Juntar las soluciones extractivas y secar con sulfato de sodio anhidro. 7. Filtrar la solucin para separar el agente desecante. Reservar una porcin para Cromatografa en Capa Delgada. Concentrar la muestra hasta un volumen final de 2 mL aproximadamente. 8. Purificar el |-caroteno utilizando la tcnica de Cromatografa en Columna. Carotenoides
89 9. Realizar una Cromatografa en Capa Delgada del extracto crudo y los eluatos de la columna. Fase Estacionaria: Slica Gel 60 F Fase Movil: Hexano: Acetona (9:1) Revelador: Luz visible
TCNICA PARA LA CROMATOGRAFA EN COLUMNA DEL PRCTICO DE |- CAROTENO a) Empaque de la columna: 1. Colocar una bureta en posicin vertical fijndola con una pinza. El robinete debe estar cerrado y sin vaselina si es de vidrio esmerilado. 2. Colocar una torunda de algodn o de lana de vidrio en el fondo de la columna por medio de una varilla de vidrio. 3. Introducir en la bureta 12 mL de hexano-acetona 9:1. 4. Lentamente agregar 7 g. de la fase estacionaria de eleccin (Almina Neutra) en porciones mientras se golpea continuamente con un tubo de goma o con un lpiz forrado con un tubo de goma para favorecer el empaquetamiento uniforme de la columna. 5. Con una alcuota de solvente adicional lavar las paredes internas de la bureta. 6. Abrir la llave inferior de la columna para que salga el exceso de solvente contenido. La altura del solvente no debe exceder de 2 a 5 mm sobre la superficie superior de la fase estacionaria. Ahora la columna est lista para recibir la muestra que se desea separar. En todo momento debe cuidarse que la fase estacionaria no se seque para evitar la formacin de grietas y burbujas.
b) Siembra de la muestra: 1. Disolver la muestra en una mnima cantidad del solvente que se usa para desarrollar la columna. 2. Aadir la solucin a la columna, abrir el robinete para que la misma penetre en la fase estacionaria.
c) Desarrollo del cromatograma: 1. Habiendo introducido la muestra por completo dentro de la fase estacionaria, se agrega la fase movil (hexano:acetona 9:1). Carotenoides
90 2. Se recogen fracciones de 2 ml en frascos o tubos de ensayo. Dado que el |-caroteno es coloreado se puede seguir el progreso del cromatograma observando cmo desciende la mancha anaranjada. 3. Cuando todo el |-caroteno haya salido, suspender el pasaje de solvente.
CUESTIONARIO 1. Cules son las fuentes naturales de carotenoides? 2. Por qu deben ser incluidos en la dieta humana vegetales amarillos y plantas de hojas verdes? 3. Qu relacin estructural tienen las xantofilas con el alfa y beta caroteno? 4. Cul es la relacin biogentica entre carotenoides y terpenoides? 5. Por qu al hacer la extraccin de beta carotenos previamente se hace una extraccin con etanol? 6. Por qu no se debe dejar calentando ms tiempo a reflujo el extracto de Zanahoria? 7. Para qu se coloca la torunda de algodn o lana de vidrio en la columna? 8. Por qu es preferible que el robinete no tenga grasa o vaselina en una columna cromatogrfica? 9. Por qu debe tenerse cuidado que no entren burbujas de aire en la columna? 10. En todo momento debe evitarse que la columna se seque (es decir que se quede sin solvente). Por qu?
BIBLIOGRAFA 1-Farmacognosia. Fitoqumica de Plantas Medicinales 2, Jean Bruneton, Editorial Acribia, S.A. Zaragoza (Espaa). 2001. 2- Dewick, P.M. Medicinal natural products: a biosynthetic approach 2 Ed, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, UK. 2002. Hiprico
91 HIPERICO: CPSULAS DE HIPRICO Composicin Cada cpsula contiene: extracto seco de Hypericum perforatum (equivalente a 500 mcg de hipericina) 400 mg.
Farmacologa Al presente no existen datos suficientemente consistentes como para indicar en forma precisa un mecanismo de accin de los extractos de H. perforatum. La actividad antidepresiva es mediada probablemente por una activacin de los sistemas serotoninrgicos, noradrenrgicos y dopaminrgicos. Se ha demostrado que el extracto aumenta el contenido de serotonina, norepinefrina y dopamina en el cerebro, mientras que la hiperforina inhibe la recaptacin de estas sustancias. La hipericina tambin ha demostrado actividad antidepresiva, la cual en un principio fue descripta como un inhibidor de la MAO. El efecto antidepresivo aparecera unas dos semanas despus del comienzo de la administracin de la droga. Indicaciones Distimia. Depresin de intensidad leve o moderada, incluso la asociada a sntomas neurovegetativos. Dosificacin Dosis recomendada: 1 cpsula 4-5 veces al da con las comidas. Se recomienda un perodo mnimo de tratamiento de 4 a 6 semanas con una determinada dosis para obtener la actividad antidepresiva plena. La duracin del tratamiento deber ser evaluada por el mdico tratante. Actualmente se recomienda la utilizacin de antidepresivos por perodos no inferiores a seis meses. Flor de H. perforatum Hiprico
92
Contraindicaciones Antecedentes de hipersensibilidad a los componentes del producto. Embarazo. Lactancia. Pacientes bajo tratamiento con antidepresivos del tipo IMAO. Pacientes que reciben psoralenos o retinoides. Reacciones adversas Los efectos adversos ocasionalmente asociados al uso de extracto de hiprico son los siguientes: nuseas, vmitos, diarrea, constipacin, mareos, dolor abdominal, ansiedad, sequedad de boca, confusin, sedacin y decaimiento. El efecto ms grave (aunque infrecuente) asociado al uso del extracto de hiprico es la fotosensibilizacin (aumento de la sensibilidad de la piel a la exposicin solar). Este efecto podra ser responsable de la aparicin de quemaduras en pacientes expuestos al sol que no lo hacen en forma adecuada (con protectores solares y en horarios adecuados -antes de las 11.00 horas y despus de las 15.00 horas-), sobre todo en pacientes de piel clara. Conservacin Mantener en sitio seco a temperatura no superior a 25C. Mantener ste y todos los medicamentos alejados del alcance de los nios.
FARMACOPEA ARGENTINA
OCTAVA EDICIN
HIPRICO, hierba Definicin - Hiprico est constituido por las par- tes areas superiores incluyendo hojas, botones flora- les y flor, desecadas, recogidas durante la floracin de Hypericum perforatum L. (Hypericaceae). Debe contener no menos de 0,06 por ciento de hipericinas totales, calculado como hipericina y debe cumplir con las siguientes especificaciones. CONSERVACIN En envases inactnicos bien cerrados, en un sitio fresco y seco. ENSAYOS Identificacin A - Caractersticas macroscpicas - Hojas opuestas, ssiles, oblongo-ovadas, de hasta 3,5 cm de longitud; lminas de bordes lisos, con pelos glandula- res oscuros en el margen y puntos traslcidos en toda su superficie. Las flores son pentmeras, numerosas, de color amarillo y pednculos cortos que forman cimas compuestas (pleiocasios). Spalos 5, lanceola- dos, con puntos negros en el margen. Ptalos 5, de color amarillo oscuro, ovales, oblicuos y con glndulas de color rojo oscuro en el borde. Estambres numero- sos, agrupados de 3 a 6 haces (generalmente 3) con glndula conectival apical. Gineceo gamocarpelar con tres estilos. Fruto cpsula tricarpelar de 8-10 4-6 mm, ovoide o elipsoide-trgona, dehiscente en el pice, rodeada por los restantes verticilos marcescentes. La semilla es de 1 a 1,2 mm, cilindroide, foveolada, de color castao a negro. La droga seca consiste ma- yormente de flores, incluyendo hojas y yemas sin abrir. Las hojas son de color verde o verde plido. Se ob- servan los ptalos de las flores de color amarillo a pardo amarillento, tambin hay alto contenido de fragmentos de inflorescencias. Tanto las hojas como los ptalos se caracterizan por la presencia de numero- sas glndulas redondeadas de aproximadamente 0,5 a 1 mm de dimetro, en las hojas se las observan como puntos traslcidos cuando se las ilumina a contraluz y las de los ptalos son de color rojo oscuro y se presen- tan solamente en los bordes. Los fragmentos de tallos son de color verde plido, cilndricos, huecos y con dos costillas longitudinales opuestas. B - Caractersticas microscpicas - El tallo en seccin transversal muestra clulas epidrmicas rec- tangulares con cutcula conspicua y lisa; la corteza consta de varias capas de colnquima. El floema y el xilema se disponen en un anillo continuo, atravesado por numerosos radios uniseriados; las fibras del xilema son muy engrosadas y se disponen en series radiales. La mdula es parenquimtica se lisa y ahueca. Los canales secretores estn presentes en la corteza, floe- ma y mdula. La hoja en vista superficial presenta la epidermis superior con clulas poligonales de paredes anticlinales rectas; en la epidermis inferior son ms pequeas, con paredes anticlinales marcadamente sinuosas con estomas frecuentemente paracticos o a veces anomocticos; la cutcula es lisa, ms gruesa en la epidermis superior. En seccin transversal la lmina presenta estructura dorsiventral, con 1 2 hileras de clulas en empalizada; glndulas oleosas conspicuas en el mesfilo esponjoso. La nervadura central est constituida por un solo haz colateral. La flor tiene los spalos con caractersticas semejantes a las de la hoja, con numerosas glndulas de color rojo en los bordes. Los ptalos presentan la epidermis superior con clu- las de paredes rectas y la epidermis inferior con pare- des sinuosas, las glndulas de aceite son visibles, a menudo alargadas con un contenido rojizo o amarillo. Los granos de polen son prolados, de aproximada- mente 20 m de dimetro con 3 colporos y exina lisa o verrucosa. C - Droga en polvo - El polvo es de color amari- llo claro a pardo verdoso con un olor aromtico y balsmico. Los fragmentos de hojas vistos en superfi- cie muestran las clulas epidrmicas alargadas, poligo- nales con paredes anticlinales gruesas, en forma de rosario, con estomas paracticos (ocasionalmente anomocticos); abundantes fragmentos de hoja, la mayora conteniendo glndulas, algunas con un conte- nido rojo cerca del margen, los ptalos muestran las clulas de la epidermis superior, estrechas, alargadas, con paredes anticlinales delgadas, rectas y sinuosas en la epidermis inferior; se observan glndulas de aceites alargadas con un contenido rojo o amarillo; numero- sos granos de polen que tienen entre 20 y 25 m de dimetro, prolados, tricolporados. Se observan frag- mentos de tallos y frutos enteros acompaados por estilos. D - Aplicar la siguiente tcnica cromatogrfica. Fase estacionaria - Emplear una placa para cro- matografa en capa delgada (ver 100. Cromatografa) recubierta con gel de slice para cromatografa con indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor. Fase mvil - Acetato de etilo, agua, cido frmico y cido actico glacial (100:26:11:11). Solucin estndar - Preparar una solucin de hipersido y cido clorognico al 0,05% para cada uno en metanol. Solucin muestra - Pesar y reducir a polvo fino aproximadamente 5 g de Hiprico y transferir 500 mg de la droga pulverizada a un matraz de 25 ml. Agre- gar 10 ml de metanol y mezclar. Calentar en un bao de agua a 60C durante 15 minutos agitando con frecuencia. Filtrar. Revelador 1 - Solucin al 1% de difenilborinato de 2-aminoetilo en metanol. Revelador 2 - Solucin al 5 % de polietilenglicol 4.000 en etanol. Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa cromatogrfica, en bandas, 10 l de la Solucin muestra y 10 l de la Solucin estndar. Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente haya recorrido aproximada- mente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cmara, marcar el frente del solvente y dejar que el solvente se evapore. Pulverizar sobre la placa con Revelador 1. Dejar secar al aire. Pulverizar sobre la placa con Revelador 2, dejar secar nuevamente al aire. Examinar el cromatograma bajo luz ultravioleta a 366 nm. En el cromatograma se deben observar dos bandas de fluorescencia rojo- violceas debido a la presencia de hipericina con un valor de R f aproximadamente de 0,85 y pseudohiperi- cina con un valor de R f aproximadamente de 0,80; varias zonas con una fluorescencia amarillo anaranja- da, una de las cuales coincide en valor de R f y color con la banda de hipersido con un valor de R f 0,50 presente en la Solucin estndar. El cromatograma de la Solucin muestra debe presentar una zona de fluorescencia azul que coincide en posicin y color con la banda del cido clorognico con un valor de R f
aproximadamente de 0,40 presente en la Solucin estndar. Cenizas totales (ver 630. Mtodos de Farmacog- nosia) Debe cumplir con los requisitos. Determinacin de aflatoxinas <110> Debe cumplir con los requisitos. Materia extraa (ver 630. Mtodos de Farma- cognosia) No debe contener ms de 3,0 % de tallos con un dimetro superior a 5 mm y no ms de 2 % de otras materias extraas. Prdida por secado <680> No debe perder ms de 10,0 %, determinado sobre 1,0 g de Hiprico pulverizado y secado en estufa entre 100 y 105 C durante 2 horas. VALORACIN Preparacin muestra - Pesar y reducir a polvo fi- no 5,0 g de Hiprico y transferir 800 mg del polvo, exactamente pesado, a un baln de 100 ml. Agregar 60 ml de una mezcla de tetrahidrofurano y agua (80:20) y agitar. Calentar la mezcla a ebullicin en bao de agua a 70 C a reflujo durante 30 minutos. Centrifugar durante 2 minutos a 2.000 rpm y transferir el sobrenadante en un matraz de 250 ml. Suspender el residuo con 60 ml de una mezcla de tetrahidrofurano y agua (80:20). Transferir al baln y repetir la opera- cin por 30 minutos ms. Centrifugar durante 2 minutos a 2.000 rpm y reunir los sobrenadantes. Evaporar hasta sequedad. Disolver el residuo con 15 ml de metanol ayudndose con ultrasonido y llevar a un matraz aforado de 25 ml. Lavar el matraz de 250 ml con metanol y completar a volumen de 25 ml con el mismo solvente. Filtrar y descartar los prime- ros 2 ml del filtrado. Transferir 5 ml del filtrado a un matraz aforado de 25 ml y completar a volumen con metanol. Procedimiento - Medir la absorbancia de la Pre- paracin muestra a 590 nm por comparacin emple- ando como blanco metanol. Calcular el contenido en porcentaje de hipericina en la porcin de Hiprico en ensayo por la frmula siguiente: (125/870)(A/P) en la cual A es la absorbancia de la Solucin muestra a 590 nm; P es el peso de Hiprico en mg y 870 es el coeficiente de extincin especfica E (1 %, 1 cm) de hipericina (ver 470. Espectrofotometra ultravioleta y visible). Hiprico
96
TRABAJO PRCTICO HIPRICO OBJETIVO: Analizar mediante el uso de cromatografa en capa delgada (CCD) distintos preparados farmacuticos que contienen Hiprico (Hypericum perforatum) DESARROLLO EXPERIMENTAL a) Preparacin de extracto metanlico de Hiprico hierba Extraer por calentamiento a reflujo 1 gramo de Hiprico hierba en polvo con 10 ml de metanol durante 10 minutos. Filtrar por gravedad. El extracto obtenido se utilizar para la CCD. b) Preparacin del extracto metanlico del fitoterpico conteniendo droga Hiprico Del preparado farmacutico elegido, tomar una cantidad equivalente a 500 mg de Hiprico y pulverizarlo. Colocar en un erlenmeyer y agregar 15 ml de metanol. Agitar durante 10 minutos con agitador magntico. Llevar a 25 ml con metanol Filtrar la solucin por gravedad. Tomar 1 ml del filtrado y llevar a 5 ml con metanol. El extracto obtenido se utilizar para CCD. 1-Anlisis cromatogrfico por CCD: Sistema cromatogrfico: Fase Estacionaria: Slica gel 60 GF 254: 0,1mm (cromatofolios comerciales) Fase Mvil: Acetato de etilo / Acido frmico / Acido actico glacial / Agua (100:11:11:27) Distancia de desarrollo: 6 cm Testigos: Rutina, solucin al 1% en metanol. Hipericina, solucin al 0,00028% en metanol. Acido clorognico, solucin al 0,05 % en metanol
Hiprico
97
Revelado: - Observacin de la placa a la luz UV de 365 nm antes y despus del revelado con NP/PEG. CCD Identificacin de la droga Hiprico a travs de marcadores por CCD. Comparacin del perfil cromatogrfico de la droga Hiprico con el extracto obtenido a partir del preparado farmacutico. Siembras: Extracto metanlico de Hiprico hierba: 10 l en banda de 0,5 cm Extracto metanlico del preparado farmacutico: 10 l en banda de 0,5 cm Testigo Rutina 10 l en banda de 0,5 cm Hipericina (0,00028 %) 10 l en banda de 0,5 cm Acido clorognico 10 l en banda de 0,5 cm Observar: -Bandas de fluorescencia rojo violceas debido a la presencia de hipericina (Rf aprox 0,85) y pseudohipericina (Rf 0,8) -Varias zonas de fluorescencia amarillo anaranjado, una de ellas debido a la presencia de rutina (Rf 0,35) -Zona de fluorescencia azul que coincide en posicin y color con la banda del cido clorognico (Rf aprox 0,40) Anexos
98
ANEXOS
RECRISTALIZACIN Los compuestos orgnicos obtenidos de fuentes naturales o los de sntesis, rara vez se obtienen puros. Los primeros suelen ir acompaados de otros compuestos orgnicos del medio del cual provienen y los sintticos estn impurificados por los reactivos y otros productos que se originan en la reaccin (productos secundarios). Es entonces imprescindible la purificacin de estas sustancias. De los mtodos de purificacin disponibles, algunos de los ms utilizados son cromatografa de adsorcin en columna, cromatografa en capa delgada preparativa, particin con solventes, destilacin (en caso de lquido) y la recristalizacin fraccionada. Para compuestos orgnicos que son slidos a temperatura ambiente, el proceso de recristalizacin es la tcnica de eleccin para realizar la purificacin. En general, la purificacin por este mtodo se basa en el hecho de que la mayora de los slidos son ms solubles en un disolvente en caliente que en fro. El slido que se va a purificar se disuelve en el disolvente caliente, generalmente a ebullicin, la mezcla caliente se filtra para eliminar todas las impurezas insolubles y, entonces, la solucin se deja enfriar para que se produzca la cristalizacin. En el caso ideal, toda la sustancia deseada debe separarse en forma cristalina y todas las impurezas solubles deben quedar disueltas en las aguas madres. Finalmente, los cristales se separan por filtracin y se dejan secar. Si con una cristalizacin sencilla no se llega a una sustancia pura, el proceso puede repetirse empleando el mismo u otro disolvente.
CONSIDERACIONES PRCTICAS Para efectuar una recristalizacin por disolucin, debern realizarse estos pasos: 1 Eleccin del solvente. 2 Disolucin de la muestra. 3 Decoloracin. 4 Eliminacin de impurezas insolubles. 5 Cristalizacin. 6 Separacin de los cristales del lquido madre. 7 Lavado de los cristales. 8 Secado. Anexos
99
1 ELECCIN DEL SOLVENTE Un disolvente apropiado para recristalizacin debe reunir las siguientes condiciones: a) No reaccionar con el compuesto a purificar. b) Debe solubilizar una cantidad grande de slido a purificar en caliente y muy pequea en fro. Es decir, debe poseer un coeficiente trmico de solubilidad elevado para obtener una buena cosecha de cristales. Es conveniente que la cantidad de solvente necesario para solubilizar 100 mg de sustancia en caliente est entre 1 y 3 ml. c) Que solubilice totalmente a las impurezas en el solvente fro, o que sean totalmente insolubles en el solvente caliente. d) Debe poseer un punto de ebullicin adecuado, relativamente alto, que permita una considerable variacin de temperatura; no muy alto porque dificultara su eliminacin en el secado de los cristales, ni muy bajo pues se evaporara durante la manipulacin. Adems es conveniente que el punto de ebullicin del solvente sea menor que el punto de fusin del slido a purificar, para evitar que ste funda por encontrarse sobresaturada la solucin. e) Al enfriarse debe permitir la formacin rpida de cristales y no impedir el crecimiento de los mismos por viscosidad. f) De fcil manipulacin, no inflamable y econmico.
TCNICA A 100 mg de muestra pulverizada, se la introduce dentro de un tubo de Kahn y se agrega solvente segn el Esquema 1, en proporciones de 0,5 ml, hasta que todo el slido se disuelva a la temperatura de ebullicin o hasta que se haya alcanzado un volumen total de 3 ml de disolvente.
Anexos
100
Esquema 1
Conseguida la disolucin total del slido a temperatura de ebullicin con un volumen de solvente comprendido entre 1 y 3 ml/100mg, la solucin se enfra; si el slido no cristaliza espontneamente, se tratar de inducirla por agitacin o raspado de las paredes del tubo, si no aparecen cristales, el solvente no sirve y se ensaya otro. Si, en cambio, la cristalizacin se produce, se separan los cristales del lquido madre por filtracin, se lavan con pequeas porciones de solvente fro, se secan y se determina el punto de fusin, el que se compara con el de la muestra original. Si en los ensayos anteriores, se ha encontrado un solvente en el cual el slido es muy soluble y otro en el que es muy poco soluble, y ambos solventes son miscibles entre s, se puede probar con una mezcla de ambos, realizndose el ensayo con par de solventes. Se toman 100 mg de muestra pulverizada, se disuelve en 0,5 ml del solvente de gran poder de disolucin. Se lleva a ebullicin y, manteniendo esta temperatura, se agrega gota a gota el de pobre poder de disolucin, hasta turbidez de la solucin en caliente. Se vuelve a agregar el primer solvente hasta que la turbidez de la solucin, en caliente, desaparezca. Se deja enfriar y se contina con la tcnica anterior. No se disuelve en fro Se disuelve en cantidad apreciable en fro + 0,5 ml de solvente No se disuelve Se disuelve enfriar lentamente Observar: - facilidad de cristalizacin - cantidad de cristales formados se calienta a ebullicin Se descarta 100 mg de slido pulverizado Anexos
101
Entre los solventes ensayados, el criterio a seguir en la eleccin del ms conveniente debe basarse en: a) Pureza de los cristales obtenidos. b) Cantidad de cristales. c) Volumen de solvente (comprendido entre 1 y 3 ml por cada 100 mg de sustancia). Si dos o ms de los solventes ensayados renen las mismas caractersticas en relacin a los puntos antes citados, se debe elegir al menos txico, menos voltil y de menor costo. Siempre que sea posible, se utilizar agua.
2 DISOLUCIN DE LA MUESTRA Elegido el solvente, se procede a recristalizar el total de la sustancia. El objetivo es disolver el soluto en la mnima cantidad de disolvente a su temperatura de ebullicin.
TCNICA Si el solvente elegido no es agua, se coloca el slido finamente pulverizado en un erlenmeyer de cuello esmerilado, de tamao adecuado a la solucin a obtener. Se agrega el solvente en cantidad que se juzgue insuficiente para disolver la totalidad del slido a temperatura de ebullicin y se le adapta un refrigerante en posicin de reflujo. Se coloca el sistema sobre una manta de calefaccin, calentando suavemente hasta ebullicin, con agitacin (ver figura 1). Si la disolucin no es total, se agrega ms solvente con pipeta, por la parte superior del refrigerante, calentando a ebullicin y agitando despus de cada agregado, hasta disolucin total de la sustancia a purificar. Es necesario poner especial atencin en que la sustancia no funda, ya que el slido fundido ocluye en su seno impurezas que retiene por solidificacin. Si el solvente utilizado es agua, la solucin se realiza en un erlenmeyer desprovisto de refrigerante.
Efectuada la disolucin, el paso siguiente estar determinado por el aspecto que presente la misma, que puede ser: 1 Incoloro (o del color caracterstico de la sustancia a purificar), que a su vez puede ser: a) sin partculas insolubles. b) con partculas insolubles. Anexos
102
2 Coloreado, que a su vez puede ser: a) sin partculas insolubles. b) con partculas insolubles. En las soluciones de tipo 1-a) se procede a provocar la cristalizacin. A las del tipo 1-b) es necesario filtrarlas en caliente. A las soluciones del tipo 2-a) y 2-b), se las debe decolorar primero y filtrar en caliente despus. En el caso de que la solucin tenga aspecto opalescente, es necesario colocarle un agente adsorbente y luego filtrar en caliente.
3 DECOLORACIN DE LA SOLUCIN Frecuentemente la solucin se colorea con impurezas orgnicas de peso molecular elevado que acompaan al producto natural deseado o que se han formado como productos de descomposicin o subproductos en el proceso de sntesis. En estos casos el color se puede eliminar utilizando una pequea cantidad de carbn activado. Otro caso puede ser que la solucin se presente opalescente, en cuyo caso es necesario tambin el agregado de carbn activado, para que adsorba las impurezas insolubles que provocan las opalescencias, y luego filtrar en caliente.
TCNICA A la solucin caliente, pero por debajo de su temperatura de ebullicin para evitar proyecciones, se agrega con esptula el carbn en una proporcin de 0,1g por 100 ml de solucin, se agita y se deja actuar durante unos minutos. Es importante resaltar que el agregado de carbn activado no sea excesivo, ya que podra adsorber algo de la sustancia que esta siendo purificada. Luego se agrega un 10% de exceso de solvente para facilitar la posterior filtracin de la solucin caliente. Se calienta a temperatura de ebullicin por unos minutos y se filtra.
4 ELIMINACIN DE LAS IMPUREZAS INSOLUBLES La eliminacin de partculas insolubles, en caliente, se consigue haciendo una filtracin en caliente. Como el lquido que se pretende filtrar es una solucin saturada en caliente, debemos tomar todas las precauciones para evitar que cristalice soluto en el embudo. Estas son: Anexos
103
1) Mantener durante la filtracin la solucin en ebullicin. 2) Agregar 10% de exceso de solvente, lo que provoca una dilucin de la solucin, evitando la sobresaturacin por evaporacin del solvente o descenso de temperatura (esto provocado por el manipuleo de la solucin). 3) Mantener el embudo caliente. La temperatura no debe ser mayor a la del punto de ebullicin del solvente elegido. Al estar calentado el embudo al punto de ebullicin del solvente, evitamos que se evapore la solucin. 4) Filtrar rpidamente, para evitar la evaporacin o reducirla al mnimo. Esto se consigue con la ayuda de succin.
TCNICA El equipo consta de un embudo Hirsh o Buchner, segn la cantidad de lquido a filtrar, que se adapta a la boca de un kitasato mediante un trozo de caucho que impide la prdida de vaco. El kitasato se conecta a la bomba de vaco (figura 2). Se cortan varios papeles de filtro de forma circular de modo que cubran completamente los orificios de la placa perforada del embudo pero que no alcancen las paredes laterales (figura 3) porque las impurezas y el carbn pueden filtrarse a travs de los bordes.
- Figura 2 - Equipo de vaco - Anexos
104
- Figura 3 -
Se calienta el embudo a la misma temperatura que el punto de ebullicin del solvente usado. Si el solvente usado es agua, se coloca invertido y completamente sumergido en un bao de agua, mantenindolo a ebullicin durante unos minutos. Si se trata de otro solvente, se coloca en estufa a la temperatura del punto de ebullicin del solvente. El embudo caliente se adapta rpidamente al resto del equipo de filtracin y se coloca el papel de filtro, que debe quedar completamente liso y sin arrugas. Esto se consigue humedeciendo el papel con unas gotas del solvente caliente. Con ayuda de una varilla se agrega la solucin a filtrar (a la que se le ha agregado un 10% de exceso de solvente); mantenindola a ebullicin durante toda la filtracin. Para evitar que la succin provoque el paso rpido de una corriente de aire fro que enfre el sistema y provoque la cristalizacin en el embudo, se debe trabajar de manera tal que siempre haya solucin caliente en el embudo. Si durante la filtracin se produce la cristalizacin del slido en el filtro, habr que redisolverlo. Para ello se unen los cristales a la solucin original, se calienta, y puede ser conveniente agregar un mayor exceso de solvente que se elimina luego por evaporacin.
5- CRISTALIZACIN Es la obtencin de cristales de la solucin. Se trata de obtener la mxima cantidad de sustancia con la mnima cantidad de impureza. Para lograrlo es necesario mantener la disolucin en reposo dejndola enfriar lentamente, primero a temperatura ambiente y luego en bao de agua fra o hielo hasta que no se separen ms cristales. Si enfriamos rpidamente o agitamos se formarn cristales pequeos con gran superficie total, adsorbiendo cantidades apreciables de impurezas. La velocidad de cristalizacin vara entre lmites muy amplios dependiendo entre otros factores de la sustancia disuelta, de las impurezas presentes y muy especialmente de la naturaleza del solvente. Anexos
105
Si dadas las condiciones necesarias la cristalizacin espontnea no se produce, se puede realizar alguno de los siguientes procedimientos para inducirla: a) variacin de la temperatura b) raspado de las paredes del recipiente c) sembrado d) variaciones locales de concentracin
6- SEPARACIN DE LOS CRISTALES DEL LQUIDO MADRE Obtenidos los cristales, es necesario separarlos del lquido madre teniendo en cuenta que ste debe ser eliminado al mximo con una mnima evaporacin para evitar que se deposite sobre el cristal la impureza que se desea eliminar. La filtracin por gravedad es bastante lenta e ineficaz, logrndose mejores resultados por filtracin a presin reducida. Con sta se impulsa el lquido a travs del papel de filtro por una diferencia de presiones que acelera notablemente la operacin y logra una mejor separacin. Es necesaria la mxima eliminacin posible del lquido madre retenido por los cristales para que al evaporarse el solvente no queden impurezas sobre los mismos.
TCNICA El mismo aparato usado para filtracin en caliente (Figura 2) se usa para la filtracin en fro. El tamao del embudo se elegir de acuerdo con la cantidad de slido a recoger, prefirindose el ms pequeo que contenga todos los cristales, con suficiente holgura para no dificultar su posterior lavado. El arrastre de los cristales adheridos a las paredes del recipiente, se realiza con lquido madre, ya que como ste est saturado en ese slido, no hay prdidas por disolucin del mismo. Una vez que estn todos los cristales en el embudo, se les extrae lo ms completamente posible el lquido madre, comprimindolos con una esptula mientras se aplica succin. Valor del lquido madre: el filtrado obtenido, llamado aguas o lquidos madres, no se tratar como residuo, pues a partir de l puede obtenerse una nueva cosecha de cristales. Para ello, es necesario concentrar la solucin por evaporacin parcial del solvente para saturarla nuevamente y permitir su precipitacin. Los cristales as obtenidos son generalmente menos puros por ser ms alta la proporcin de impurezas en el lquido madre, siendo necesario recristalizarlos.
Anexos
106
7- LAVADO DE LOS CRISTALES Si la sustancia purificada no forma soluciones slidas con la impureza, los cristales separados son puros, pero retienen lquido madre que al secarse contaminar al cristal con sus impurezas. La cantidad de lquido madre retenido ser mnima en cristales grandes y uniformes, en contacto con soluciones madres poco viscosas, mientras que cristales pequeos no uniformes de soluciones viscosas, retendrn una cantidad importante. Para separar totalmente la solucin madre depositada, se efecta el lavado. Debe emplearse el mismo solvente que sirvi para la disolucin, previamente enfriado para disminuir la solubilidad de la sustancia. Se efectan repetidos lavados con pequeas cantidades por ser mucho ms efectivo que pocos lavados con el mismo volumen total. Si el disolvente es de punto de ebullicin elevado difcil de eliminar por evaporacin, se puede hacer un ltimo lavado con una pequea cantidad de un disolvente de punto de ebullicin ms bajo, miscible con el anterior en el que el soluto es insoluble.
TCNICA Sin efectuar succin, se cubren los cristales contenidos en el embudo con la mnima cantidad de solvente puro y fro; con una varilla se remueve la mezcla hasta lograr impregnar todos los cristales con el disolvente hacindolo cuidadosamente de modo de no romper ni mover el papel de filtro. Despus de este procedimiento aplicar succin presionando suavemente con la esptula. Se interrumpe el vaco y se repite este proceso varias veces.
8- SECADO DE LOS CRISTALES Para lograr cristales puros debemos eliminar totalmente el solvente empleado en el lavado.
TCNICA Se separa el embudo del kitasato y, con ayuda de una esptula, se retira el papel de filtro junto con los cristales. Se deja secar por evaporacin del solvente. Comprobar la pureza de los mismos determinndoles el punto de fusin.
Anexos
107
CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA
La cromatografa en capa delgada es un tipo de cromatografa de adsorcin solido- lquido. Usualmente se la abrevia como CCD o TLC (siglas en ingles de Thin-Layer Chromatography). La fase estacionaria (FE) es un slido que se extiende en forma de capa delgada (~250 m) en una placa de vidrio, plstico (acrlico) o metal (aluminio). Un pequeo volumen de una solucin de la mezcla a ser separada se siembra cerca de uno de los extremos de la placa y sta dentro de una cuba de elucin que contiene la cantidad necesaria del solvente de elucin como para quedar justo por debajo del punto de siembra (Figura 1). El solvente asciende por capilaridad, arrastrando con l los componentes de la mezcla a diferentes velocidades. Como resultado se obtiene una serie de manchas en la placa, en la lnea perpendicular al nivel de solvente en la cuba cromatogrfica (Figura 2).
Figura 1: Cuba cromatogrfica.
Cuando hablamos de cromatografa de adsorcin, hablamos de una competencia entre los compuestos a separar y el solvente de elucin por los sitios libres en el adsorbente. Los tipos de interacciones que causan adsorcin son los mismos que causan atraccin entre cualquier molcula, es decir, atraccin electrosttica, complejacin, formacin de puente de hidrgeno, fuerzas van der Waals, etc. El poder de elucin de un solvente se refiere a la capacidad del mismo de desplazar las molculas de analito de su unin a la FE (desorcin), con lo cual, stas migran hacia arriba. Si los compuestos a separar tienen mucha mayor afinidad por la FE que la FM, entonces estos compuestos quedaran retenidos en el punto de siembra puesto que el solvente no tiene suficiente fuerza como para desplazarlos. Si por el contrario, la FM tiene mucha mayor afinidad por la FE, entonces los compuestos a separar no podrn competir con la Anexos
108
FM por estos sitios de la FE y corrern con el frente de solvente. En situaciones intermedias a las anteriores, los componentes de la mezcla corrern por debajo del frente del solvente: cada componente se desplazar a lo largo de la placa con una velocidad dependiente de su propia afinidad por la FE. Entonces, al momento en que el frente del solvente llega a la parte superior de la placa, los diferentes componentes de la mezcla habrn recorrido diferentes distancias a lo largo de la placa. En todos los casos, el orden en que eluyen los compuestos no se modifica; puesto que el orden de elucin depende de la FE y no de la FM. Los tipos de adsorbentes slidos son los mismos que pueden ser utilizados en cromatografa en columna, siendo slica gel activada y almina activada las ms ampliamente utilizadas. Ambas fases estacionarias son polares y cuando se trabaja con ellas se dice que se trabaja en fase normal. En estos casos, los compuestos ms polares son los que mayor afinidad tienen por la FE y son los que se desplazan por la placa a menor velocidad. Tambin existen las fases estacionarias reversas, de naturaleza apolar. La slica gel RP es muy utilizada (note que el RP se refiere a Reverse Phase). En estos casos, los compuestos que quedan ms retenidos son los apolares y los polares corren al frente. La tcnica TLC es rpida y fcil de realizar, se presta bien a la rutina de anlisis de composicin de mezclas, y la informacin que brinda respecto del mejor sistema de solventes puede ser aprovechada para la realizacin posterior de una columna cromatogrfica. Una ventaja distintiva de las CCD es que requieren una muy pequea cantidad de muestra. El lmite de deteccin puede alcanzar los 10 -9 g y los tamaos de muestra pueden alcanzar los 0,5 mg en las TLC preparativas. La deteccin de manchas en el cromatograma es fcil para materiales coloreados, y se han desarrollado un gran nmero de procedimientos para detectar manchas en muestras no coloreadas. Por ejemplo, se puede irradiar la placa con luz ultravioleta para localizar aquellas manchas que corresponden a compuestos fluorescentes. Otra alternativa consiste en impregnar el adsorbente slido con una sustancia fluorescente inerte; en estos casos, las manchas que absorben luz UV pero no fluorescen, aparecen como manchas negras en un fondo fluorescente cuando son irradiadas con este tipo de luz. Otros agentes ampliamente utilizados se vaporizan en forma de spray sobre la placa, haciendo que las manchas se vuelvan fcilmente evidentes. Ejemplos de agentes de deteccin utilizados de esta manera son el cido sulfrico, que causa que muchos compuestos orgnicos se carbonicen, y solucin de permanganato de potasio. El yodo es otro agente de deteccin ampliamente utilizado. En este caso, la placa se coloca en un recipiente saturado con vapores Anexos
109
de yodo. El yodo es adsorbido por muchos compuestos orgnicos, y sus manchas se vuelven coloreadas (generalmente de color marrn). Bajo una serie de condiciones dadas (adsorbente, solvente, grosor de la capa y homogeneidad) la movilidad de un compuesto respecto de la movilidad del frente de solvente, R f , es una propiedad del compuesto (Figura 2).
Figura 2: CCD: placa original (izq.); cromatograma desarrollado (der).
BIBLIOGRAFA
1. Roberts, R.M., Gilbert, J.C., Rodewalt, L. B., Wingrove, A.S. Modern Experimental Organic Chemistry 3 ed; Saunders College: Philadelphia, 1969; pp. 44-49.
Siembra Capa de adsobente R f = Distancia migrada por la mancha/ Distancia migrada por el solvente Frente de solvente Anexos
110
DESECACIN Y AGENTES DESECANTES
INTRODUCCIN Se conoce como secado, a la eliminacin de pequeas cantidades de agua, u otros lquidos, presentes en gases, lquidos o slidos, para obtener un producto seco.
IMPORTANCIA DEL SECADO: Pequeas cantidades de humedad modifican el punto de fusin y/o inhiben la cristalizacin de algunos slidos. Adems muchos slidos cuando destilan en presencia de agua, se hidrolizan, reaccionan o se arrastran con ella en la destilacin. Por todas las razones enunciadas, el secado de los solventes y otras sustancias de laboratorio ha llegado a ser una prctica corriente.
MTODOS DE DESECACIN El secado puede realizarse por procedimientos fsicos o qumicos: Agentes desecantes qumicos: Son aquellas sustancias qumicas que, en contacto con el agua, forman: a) un nuevo compuesto (proceso irreversible). b) un hidrato (proceso reversible). En ambos casos los agentes desecantes qumicos deben reunir las siguientes condiciones: 1- No reaccionar con la sustancia a secar. 2- Tener una gran eficacia o poder desecante, o sea eliminar el agua casi completamente. 3- Tener gran capacidad de desecacin, es decir, eliminar una gran cantidad de agua por unidad de peso del desecante. 4- Secar rpidamente. 5- Ser fcilmente separable de la sustancia una vez seca.
AGENTES DESECANTES REVERSIBLES La mayora de los agentes desecantes qumicos actan combinndose con el agua para formar hidratos en un proceso reversible.
Anexos
111
La capacidad de secado depende de la estequiometra de la reaccin de formacin del hidrato. Mientras que la eficacia, depende de la tensin de vapor de equilibrio del sistema a la temperatura del secado. Cuanto menor tensin de vapor presente el sistema agente desecante/hidrato, menor cantidad de agua hay en el mismo y de esta manera se ofrece una alta eficacia desecante. En general se trata de sales, bases fuertes o cidos fuertes, por ejemplo cloruro de calcio, sulfato de calcio, sulfato de sodio, sulfato de magnesio, carbonato de potasio, hidrxido de potasio o de sodio, cido sulfrico, etc. Ej.: el CaSO 4 granulado forma un hidrato que contiene solamente medio mol de agua por mol de CaSO 4 .
Observamos que tiene: a) Capacidad de secado muy pequea, ya que un gramo de agente desecante elimina slo 0,066 gr de agua. b) Sin embargo, la Pv del sistema CaSO 4 - CaSO 4 .H 2 O es slo de 0,004 mm de Hg a 25C. Esto quiere decir que el agua de cualquier fase lquida orgnica en equilibrio con el sistema de sulfato clcico, se elimina hasta que su Pv en la fase lquida, es solamente de 0,004 mm de Hg. Por este motivo el CaSO 4 es un agente desecante muy eficaz. Muchos de los agentes desecantes reversibles forman ms de un hidrato, dependiendo de la cantidad de agua existente en la sustancia a desecar. Por ejemplo: el MgSO 4 puede formar hidratos con 1, 2, 4, 5, 6 y 7 molculas de agua por unidad, variando para cada sistema su presin de vapor en el equilibrio a temperatura constante. Observar que la tensin de vapor en equilibrio de los distintos sistemas agente desecante/hidrato, aumenta con el nmero de molculas de agua de hidratacin, desde 1 mm de Hg hasta 11,5 mm de Hg.
Anexos
112
Como se ve, la presin de vapor de equilibrio de los distintos sistemas aumenta con el grado de hidratacin; si representamos la Pv del sistema en funcin de moles de agua/mol de MgSO 4 , se obtiene, a temperatura constante, el siguiente grfico:
moles de agua por mol de Pv en mm. de Hg. 0 1 2 3 4 5 6 7 12 10 8 6 4 2 MgSO 4
Si queremos hidratar el MgSO 4 anhidro, y lo hacemos agregando cantidades crecientes de vapor de agua, vemos que, a 1 mm de Hg, la Pv se mantiene hasta que todo el MgSO 4 se haya convertido en MgSO 4 .H 2 O. En ese momento, la Pv sube bruscamente hasta 2 mm de Hg, donde comienza a formar el dihidrato y se mantiene a esa presin de vapor hasta que todo se haya transformado en dihidrato; y as sucesivamente hasta llegar a 11,5 mm de Hg. Por esto, con MgSO 4 se pueden lograr secados de distintos grados, segn la cantidad de agente desecante que se emplee respecto del agua existente. Por ejemplo, si se aade 1 mol de MgSO 4 por cada mol de agua, se formar el monohidrato, a una Pv de equilibrio de 1 mm de Hg, por lo tanto la capacidad ser baja, y la eficacia elevada. Anexos
113
Si se usara 1 mol de sulfato por cada 7 moles de agua, se formar el heptahidrato, con una Pv de equilibrio de 11,5 mm de Hg; en ese caso la capacidad ser elevada pero la eficacia baja. Entonces, si tenemos un agente desecante que forma varios hidratos, para lograr un secado ptimo no nos conviene utilizar de una sola vez gran cantidad de agente desecante; debemos realizar el secado en etapas, separando la porcin de desecante puesta antes de aadir la siguiente. De esta manera se elimina la mayor cantidad de agua formando el hidrato mayor (capacidad) y las trazas finales mediante la formacin del hidrato menor (eficacia). A veces resulta ventajoso eliminar la mayor cantidad de agua con un desecante de gran capacidad y barato (como el Na 2 SO 4 ), y despus completar el proceso con un agente de gran eficacia (como el CaSO 4 ). Adems, la Pv de los distintos sistemas que forman hidratos, aumenta rpidamente con la temperatura. Por esto, los agentes desecantes que actan formando hidratos son ms eficaces a temperaturas bajas. Frecuentemente la agitacin ayuda a alcanzar ms rpidamente el equilibrio agente desecante/hidrato, acelerando as la velocidad de secado. Los lquidos nunca deben ser destilados en presencia del agente desecante que se us para secarlos, ya que se producira la reversibilidad de la reaccin, desprendindose nuevamente agua. Finalmente, los agentes desecantes deben separarse de la sustancia seca luego de haber ejercido su accin. Esta separacin se realiza por decantacin o filtracin al vaco, nunca por destilacin por los motivos que se expresaron arriba.
Anexos
118
CROMATOGRAFA DE ADSORCIN EN COLUMNA La adsorcin es un fenmeno que consiste en el aumento de concentracin de una sustancia en la superficie de un slido presente en el seno de una solucin, es un fenmeno fsico que depende de una serie de fuerzas de atraccin tales como las de Van Der Waals, puentes de hidrgeno u otras interacciones electrostticas. Las separaciones por adsorcin en columna se basan en la diferencia de velocidad a la que son transportados los componentes de una mezcla a travs de una fase estacionaria (FE) slida (que es un material adsorbente) por medio de una fase mvil (FM) lquida. En la cromatografa de adsorcin en columna, la FE adsorbente se empaqueta dentro de una columna de vidrio y la mezcla a purificar pasa a travs de ella para que sus componentes sean adsorbidos. La cantidad de soluto debe ser pequea frente a la cantidad de adsorbente para que todo el soluto se adsorba en una pequea zona en la parte superior de la columna. Esta adsorcin de la mezcla en la parte superior de la columna se denomina siembra y constituye el proceso inicial de la separacin. La separacin cromatogrfica de dos sustancias, X y O, presentes en una mezcla se puede entender mejor analizando la Figura N 1. En la Figura 1a se puede observar la muestra sembrada en la parte superior de la columna. Luego de la siembra, se hace pasar a travs de la columna solvente puro (FM) y una parte del material adsorbido en la parte superior de la FE se transfiere al solvente (Figura 1b). Con el primer agregado de FM, una parte de la muestra adsorbida pasa a la FM y es empujada a lo largo de la columna (Figura 1c). La cantidad transferida de un componente de la mezcla va a depender de su coeficiente de adsorcin en el adsorbente y de su solubilidad en la FM. Cuando este solvente que arrastra sustancias adsorbidas llega a una nueva porcin de adsorbente, se establece un nuevo equilibrio y parte de las sustancias se vuelven a depositar sobre el slido. Se suceden muchos de estos equilibrios y el fenmeno de separacin se produce porque las sustancias que tienen mayor afinidad por el adsorbente pasan una mayor cantidad de tiempo adsorbidas en la FE (se mueven ms lentamente) que las que tienen menor afinidad por el adsorbente (que son arrastradas rpidamente). Por lo tanto, el proceso cromatogrfico implica una serie de equilibrios entre la adsorcin-desorcin producidos en la FE y del arrastre por solubilizacin en la FM, en los cuales reside su capacidad separativa. Anexos
119
Figura 1: separacin cromatogrfica de dos sustancias X y O. Se muestran los equilibrios que se producen entre la fase estacionaria (FE) y la fase mvil (FM) a lo largo de la columna. a) Siembra. b) Primer equilibrio entre la FE y la FM de la mezcla X y O. c) Avance de la FM a travs de la columna. d) Segundo equilibrio entre la FE y la FM. e) Avance de la FM. f) Tercer equilibrio de la muestra entre FE y FM. g) Nuevo avance de la muestra en la columna.
La Figura 2 representa la distribucin de X y O a lo largo de la columna despus de haberse producido los equilibrios mostrados en la figura anterior.
Figura 2: distribucin de X y O en cada zona de la columna. Las barras con lneas punteadas representan la concentracin del compuesto O. Las barras de lneas completas representan la concentracin del compuesto X. Anexos
120
En condiciones adecuadas los componentes de una mezcla se distribuyen como campanas en principio superpuestas y luego separadas, al acercarse al final de la columna (Figura 3).
Figura 3: distribucin de X y O en cada zona de la columna. Perfiles de concentracin de las bandas de soluto O y X a dos tiempos diferentes, durante su migracin a lo largo de la columna.
La fase mvil es colectada a la salida de la columna en fracciones de volumen relativamente pequeo que contienen a los componentes de la mezcla en diferentes proporciones. En el mejor de los casos, los compuestos O y X se encuentran separados completamente en diferentes fracciones. Si los componentes de la mezcla son coloreados, el proceso cromatogrfico es fcilmente observable (Figura 4), detectndose una serie de bandas coloreadas, lo que ha dado origen al trmino cromatografa (del griego chromato: color).
Figura 4: proceso de separacin de dos compuestos coloreados.
Anexos
121
Con materiales incoloros los procesos de separacin no pueden ser observados directamente, en esos casos las diferentes fracciones colectadas de la columna se pueden analizar por cromatografa en capa delgada (CCD) y emplear alguna forma de revelado (UV, ninhidrina, I 2 , etc.) que permita detectar a los componentes de la mezcla presentes en cada fraccin (Figura 5).
Figura 5: proceso de identificacin de compuestos por CCD.
A menudo es difcil predecir cules seran las condiciones ptimas para una separacin dada, ms an cuando se desconoce la composicin de la mezcla a separar. Para lograr una separacin eficiente debe elegirse una combinacin adecuada de FE y FM, al respecto existen algunas reglas generales tiles que a menudo permiten una separacin satisfactoria.
ADSORBENTES QUE PUEDEN SER EMPLEADOS COMO FE Muchos materiales son tiles como adsorbentes. La interaccin entre los componentes de la mezcla a separar y el adsorbente no debe ser demasiado fuerte porque esto hara necesario utilizar cantidades muy grandes de solvente para arrastrar los diferentes compuestos a travs de la columna. El adsorbente tampoco debe ser demasiado dbil, porque los compuestos atravesarn la columna muy rpidamente saliendo de la misma sin separarse. Para una mayor efectividad, el adsorbente debe ser de partcula uniforme y de elevada rea por unidad de volumen, pero se debe tener en cuenta que cuando el tamao disminuye, se dificulta el pasaje del solvente a travs de la FE y puede volverse necesario ejercer presin para lograr la separacin. Anexos
122
La almina (Al 2 O 3 ) es un adsorbente polar fuerte muy activo que viene en tres formas: neutra, cida y bsica. Las alminas cida y bsica ofrecen buen poder de separacin para cidos y bases, respectivamente. Para compuestos sensibles a reacciones qumicas bajo condiciones cidas y bsicas, debe usarse almina neutra. La almina, as como muchos otros adsorbentes, adsorber una cantidad considerable de agua al estar en contacto con aire hmedo. El agua es fuertemente adsorbida y su presencia produce un proceso de separacin diferente al de adsorcin, el reparto entre dos fases lquidas. Si se requiere que el proceso de separacin sea por adsorcin exclusivamente, es necesario "activar" la almina (y tambin otros adsorbentes) calentando en estufa y dejando enfriar en un desecador, para evitar que se hidrate nuevamente. El gel de slice, por su parte, tambin es un adsorbente muy comnmente usado y comparable a la almina por su poder adsorbente. Es interesante considerar que a veces un adsorbente puede actuar como catalizador y, en algunas circunstancias, promover cambios qumicos importantes en la muestra. El gel de slice, por ejemplo tiene una acidez considerable.
EFECTO DE LA ESTRUCTURA DEL SOLUTO SOBRE EL GRADO DE ABSORCIN. En general aquellos compuestos que poseen grupos polares y capaces de formar puentes de hidrgenos son retenidos ms fuertemente por adsorbentes polares. El orden usual de adsortividad sobre almina, y en general sobre fase normal, es: cidos y bases > alcoholes y tioles > aldehdos y cetonas > haluros y steres > hidrocarburos no saturados > hidrocarburos saturados. Algunos otros grupos funcionales se muestran en la Figura 6, en orden decreciente de afinidad por los adsorbentes. CONH 2 OH NHCOCH 3 NH 2 OCOCH 3 COCH 3 N(CH 3 ) 2 NO 2 OCH 3 H Cl COOH
Figura 6: clasificacin de grupos funcionales de acuerdo a su afinidad por los adsorbentes.
Anexos
123
SOLVENTE DE ELUCIN. La naturaleza de los solventes usados como fase mvil es muy importante en el diseo de un experimento cromatogrfico. El poder eluyente de una determinada fase mvil es su capacidad para empujar a los componentes de una mezcla a lo largo de la columna. En fases estacionarias normales (slica, almina) el poder eluyente de un solvente se relaciona con su polaridad. Si el solvente es demasiado polar su poder eluyente ser demasiado alto y los componentes de la mezcla saldrn juntos de la columna. Para una separacin efectiva, el solvente debe ser significativamente menos polar que los componentes de la mezcla. Adems los componentes deben ser solubles en el solvente. De otra forma, permanecern adsorbidos en la FE. En un experimento de elucin isocrtico la muestra se coloca en la columna y se usa un nico solvente, o combinacin de solventes, durante toda la separacin. En el procedimiento llamado elusin por gradiente se emplean una serie de solventes de poder eluyente creciente para desarrollar el cromatograma. Los poderes de elucin de varios solventes estn en el orden dado abajo en la Figura 7. Aumento del poder eluyente Tolueno Benceno Diclorometano Cloroformo Eter Etlico Acetato de Etilo Acetona 1-propanol Etanol Metanol Agua Hexano CCl 4
Figura 7: clasificacin de solventes de acuerdo a su poder eluyente.
Una forma de comprobar la capacidad separativa de distintas mezclas de solventes consiste en emplear CCD para ver el comportamiento de la mezcla en cada uno de los solventes propuestos. La fase mvil ms apropiada para la separacin encontrada por CCD ser adecuada para el desarrollo de la columna (Figura 8).
Anexos
124
Figura 8: eleccin del mejor solvente para comenzar una columna por CCD.
Un paso de la cromatografa en columna que es clave y por lo tanto vale la pena resaltar es el de la siembra de la muestra. Una vez llena la columna con la FE, se pasa FM hasta que la FE se encuentre embebida en la misma de forma homognea (Figura 9a). Luego se deja descender el solvente (abriendo el robinete de la columna) hasta que el menisco coincida con la lnea de la FE (Figura 9b) y se adiciona una solucin concentrada de la mezcla a purificar (Figura 9c). Hecho esto se abre nuevamente el robinete para permitir el ingreso de la mezcla a purificar a la columna, y su adsorcin sobre la fase estacionaria (Figura 9d). Es importante en este punto evitar que el solvente descienda por debajo de la lnea de la FE.
Figura 9: siembra de una solucin en la columna cromatogrfica.
Una vez terminada la siembra, se puede comenzar el proceso separativo por agregado cuidadoso de FM en la columna.
Anexos
125
ANALIZAR: 1) Cul de los tres solventes empleados en la Figura 8 es el mejor para producir la separacin en la columna? Por qu? 2) Por qu se evita en todo momento que el solvente descienda por debajo de la lnea de la FE? 3) Por qu la solucin de mezcla a sembrar debe estar lo ms concentrada posible?
BIBLIOGRAFA:
1. D. Abbott; R. Andrews. "Introduccin a la cromatografa", Editorial Alhambra, Mxico, 1966. 2. Royston M. Roberts, John, C. Gilbert, Lynn B. Rodewald, Alan S. Wingrove. "Modern Experimental Organic Chemistry", 3 Edicin, Saunders College Phiadelphia, 1979. 3. Harold, Gomes, Casidy. "Adsorption and chromatography", Interscience Publishers, New York (1951). 4. Kenneth B. Wiberg. "Tcnica de laboratorio en Qumica Orgnica", Kapelusz, Buenos Aires (1962). 5. K. Randerath."Tcnica general de la cromatografa en capa fina", Verlag chemie, Weinheim, 1965. 6. Skoog, West, Holler. Fundamentos de Quimica Analitica, 8va edicin Thomson, 2005.