Desarrollo de Métodos Analíticos Ftir Nir Discusion Ojo

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
DESARROLLO DE MTODOS ANALTICOS MEDIOAMBIENTALMENTE SOSTENIBLES POR ESPECTROMETRA FTIR
JOSEP FRANCESC VENTURA GAYETE
UNIVERSITAT DE VALENCIA Servei de Publicacions 2007
Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a Valencia el dia 30 de Mar de 2007 davant un tribunal format per: D. ngel Ros Castro D. Jordi Coello Bonilla D . Pilar Ortega Barrales D . Mara Rosario Pereiro Garca D . Adela de los Reyes Mauri Aucejo
Va ser dirigida per: D. Miguel de la Guardia Cirugeda D. Salvador Garrigues Mateo
Copyright: Servei de Publicacions Josep Francesc Ventura Gayete
Depsit legal: I.S.B.N.:978-84-370-6800-8 Edita: Universitat de Valncia Servei de Publicacions C/ Artes Grficas, 13 bajo 46010 Valncia Spain Telfon: 963864115
DESARROLLODEMTODOSANALTICOS MEDIOAMBIENTALMENTESOSTENIBLES PORESPECTROMETRAFTIR
JosepFrancescVenturaGayete UniversitatdeValncia Valencia,2006
Los directores de Tesis: El Dr. Miguel de la Guardia Cirugeda, Catedrtico de Universidad, el Dr. Salvador Garrigues Mateo, Catedrtico de Universidad, del Departamento de Qumica Analtica de la Universidad de Valencia, Certifican: Que Don Josep Francesc Ventura Gayete, Licenciado en Qumica por la Universidad de Valencia, ha realizado bajo nuestra direccin y supervisin la presente Tesis Doctoral que lleva por ttulo: Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por
espectrometra FTIR Para poder optar al grado de Doctor en Qumica y autorizamos la presentacin y defensa de la correspondiente memoria en la Facultad de Qumica de la Universidad de Valencia. Y para que as conste y a los efectos oportunos, expedimos y firmamos la presente autorizacin. Valencia, Diciembre de 2006
Fdo.: Dr. Miguel de la Guardia
Fdo.: Dr. Salvador Garrigues
ndicesdeimpacto
Las revistas en las que se han publicado los trabajos que forman parte de esta Tesis presentanlossiguientesndicesdeimpacto(ao2005): Talanta:2.391 AnalyticaChimicaActa:2.760 MicrochemicalJournal:1.806 LosartculosdelosqueconstaestaTesisporcompendiodepublicacionessonlossiguientes: 1. Attenuated total reflectance infrared determination of sodium nitrilotriacetate in alkaline liquiddetergents. JosepF.VenturaGayete,MigueldelaGuardia,SalvadorGarrigues Talanta70(2006)870875 2. Multicommutation ATRFTIR: determination of sodium alphaolefin sulfonate in detergentformulations. Josep Francesc VenturaGayete, Boaventura F. Reis, Salvador Garrigues, ngel Morales Rubio,MigueldelaGuardia MicrochemicalJournal78(2004)4754 3.MulticommutationFouriertransforminfrareddeterminationofbenzeneingasoline. Eva RdenasTorralba, Josep VenturaGayete, ngel MoralesRubio, Salvador Garrigues, MigueldelaGuardia AnalyticaChimicaActa512(2004)215221
ii
Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR
4.MulticommutationNIRdeterminationofHexythiazoxinpesticideformulations. Josep F. VenturaGayete, Sergio Armenta, Salvador Garrigues, ngel MoralesRubio, MigueldelaGuardia Talanta68(2006)17001706 5. Online FourierTransform Infrared determination of methidathion and tricyclazole in watersamplesaftersolidphaseextraction. Josep F. VenturaGayete, M. Khanmohammadi, Salvador Garrigues and Miguel de la Guardia Enviadoparapublicacin 6.PressurizedsolventextractionFourierTransformInfrareddeterminationoffat. JosepF.VenturaGayete,SalvadorGarrigues,AgustnPastorandMigueldelaGuardia Enviadoparapublicacin 7. Online sample treatment and FTIR determination of doxylamine succinate in pharmaceuticals. JosepF.VenturaGayete,MigueldelaGuardia,SalvadorGarrigues Talanta70(2006)11001106
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Agradecimientos
Condensar en unas pocas palabras todo aquello que debo agradecer a quienes han formado parte de mi mundo durante estos aos es una tarea difcil. Por una parte, no habra sido posible realizar esta tesis sin el apoyo y supervisin de mis directores. Gracias a Miguel y a Boroporsuayudaduranteestosaosyporconfiarenmcomodoctorando. Gracias tambin a mis compaeros del laboratorio durante estos aos, a los dems profesores del departamento (ngel, Marisa y Agustn), que siempre me han echado una mano cuando haca falta, al profesor Khanmohammadi por su colaboracin en mi ltimo trabajoyespecialmenteaBoaporsuayudayporserunaexcelentepersona. GraciasamisamigosdelaUniversidadporsuscomentariosyapoyo. Por otra parte, no puedo dejar de lado a mis amigos y amigas del Orfen Universitario de Valencia, con los que he compartido los ltimos aos y he vivido mil momentos emocionantes.Nocaben aqu ni todoslos nombresni todoloquelesdebo,perosinellosno habraterminadoestaTesis. Por ltimo, gracias a mi familia, a mis padres, abuelos, hermana, cuado, y a mi sobrino. Especialmenteamispadres,quehansoportadoestoicamentequedecidieraterminarlaTesis apesardelasdificultades. Paradjicamente, me siento afortunado de vivir en este pas, en el que, sin recibir beca alguna,heconseguidorealizarestaTesis.
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Lasestrellasensucurso combatenporelhombrejusto. Proverbiochino.
Amifamilia
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Prefacio
QuesyqunoesestaTesis. La obtencin del ttulo de doctor requiere, segn el RD 56/2005, la presentacin y defensa de una Tesis Doctoral. La modalidad de Tesis por compendio de publicaciones que hasta ahora representaba una alternativa a la Tesis en formato clsico desaparece de la nuevanormativa.EstaTesisser,portanto,unadelasltimasqueseajustenalformatopor compendiodepublicaciones. Por un lado, el formato clsico permite explicar en toda su extensin el trabajo realizado durante los aos de investigacin, aunque existe el riesgo de que la Tesis se convierta en una enumeracin ms o menos elaborada de los datosya sean experimentales o bibliogrficos recopilados durante ese tiempo. Implica, en cierta medida, la mxima cantidad de informacin sobre el trabajo que se ha realizado, y la pone a disposicin del lector especializado en el tema. La redaccin de una Tesis de estas caractersticas supone unainversinenormedeesfuerzoytiempo. Por otra parte, la modalidad por compendio de publicaciones se centra en el rendimiento obtenido por el doctorando a la hora de publicar los trabajos incluidos en la Tesis.Parecerainjustoobviarelprocesoqueconducealapublicacindeunartculoenuna revista cientfica. Una Tesis en este formato no puede dar cabida a todo este proceso, slo a los resultados publicados desde una perspectiva unitaria. De otro modo no existira diferencia con una Tesis por formato clsico. As se sacrifican todos los detalles sobre los resultados no satisfactorios, las investigaciones fallidas y todo aquello que no se incluye en un artculo por prudencia o porque no hay ms remedio. La contrapartida a esta visin parcial es la de la posibilidad de una mayor claridad en la Tesis y el consabido ahorro de tiempo y papel, que es lo que el doctorando ms desea despus de aos contando los das quelequedanparaterminar.
vii
La cuestin radica en si una Tesis es til o no, si ofrece una idea justa del trabajo quesehallevadoacaboysiproporcionainformacinclaveosloesrellenoburocrtico.En caso de una Tesis como sta creo que el factor ms importante a tener en cuenta es que resulte til para cualquier persona que est interesada en la Qumica Analtica, desde el punto de vista de la Industria o la Universidad, aunque no sea un especialista en el tema. Pienso que as se cumple una de las premisas ticas que debiramos seguir siempre: hacer comprensiblenuestrotrabajo. En esta Tesis Doctoral en modalidad por compendio de publicaciones se pretende lograr este objetivo a travs de la exposicin de la teora bsica en que se fundamenta la investigacindesarrolladaylosantecedentesdesta(CaptuloI,Introduccin),losobjetivos de la Tesis y el plan de trabajo (Captulo II), el resumen de los artculos y de los resultados obtenidos (Captulo III), los artculos propiamente dichos (Captulo IV) y las conclusiones finales (Captulo V). Se incluye un apndice (Captulo VI) que he juzgado necesario para explicar cmo se crea y cmo funciona el software utilizado en los trabajos de multiconmutacin.Finalmente,elCaptuloVIIsededicaalabibliografa. EstaTesisDoctoralseenmarcadentrodelaslneasdetrabajoquenuestrogrupoha venido explotando durante los ltimos aos. Por un lado, la bsqueda de aplicaciones de la espectroscopiaFTIRconfinescuantitativosy,porotro,laautomatizacindelosmtodosde anlisis. Ambas lneas de investigacin han tenido en comn una caracterstica fundamental: el desarrollo, en la medida en que ha sido posible, de prcticas respetuosas con el medio ambiente en lo que a los mtodos analticos se refiere. La espectroscopia FTIR ha utilizado tradicionalmente disolventes txicos y nocivos (p.ej. organoclorados). As pues, como consecuencia natural de los cambios en las legislaciones estatales e internacionales y de la concienciacin medioambiental que, afortunadamente, se ha ido produciendo a todos losniveles,laespectroscopiaFTIRaplicadaalanlisisqumicohatenidoqueevolucionaren sentidopositivo.Respectoalusodedisolventesorganoclorados,latendenciaesareducirsu consumo a travs de la automatizacin y miniaturizacin de los mtodos analticos, a la par que se estudian alternativas vlidas que permitan la medida de disoluciones acuosas (como el empleo de la tcnica de Reflectancia Total Atenuada o ATR). Como efectos secundarios viii
de estas tendencias, aunque no por ello menos interesantes desde el punto de vista del anlisis qumico, se producen mejoras en la eficiencia analtica y en la versatilidad de los mtodos. Resultado de la investigacin en este campo, esta Tesis Doctoral incluye los elementos bsicos de los avances en la espectroscopia FTIR aplicada al anlisis cuantitativo que, al ser en formato de compendio de publicaciones, se han materializado en artculos publicadosopendientesdepublicarenrevistasdeQumicaAnaltica. Los trabajos incluidos en la Tesis se han agrupado en funcin de las caractersticas de los mtodos desarrollados y empleados en cada uno de ellos. As pues, aparecen cuatro gruposquesecorrespondencon: 1. Anlisis directos de muestras acuosas. En este caso se utiliza la tcnica ATRFTIR. Este grupo incluye un nico artculo, sobre la determinacin de nitriloacetato sdico en detergenteslquidosdepHelevadoporATRFTMIRconceldadediamante. 2. Mtodos de anlisis por espectrometra FTIR que utilizan multiconmutacin. Se incluyen tres artculos en este grupo, uno para el MIR (Infrarrojo medio) acoplado con medidas ATR, un segundo tambin para el MIR pero con medidas de transmisin y, finalmente,otromsparamedidasdetransmisinperoenelNIR(Infrarrojocercano): 2.1. Determinacin de olefinsulfonato sdico en detergentes lquidos por ATR FTMIR. 2.2.DeterminacinFTMIRdebencenoengasolina. 2.3.DeterminacinFTNIRdehexythiazoxenformulacionesfitosanitarias. 3. Mtodos FTMIR con extraccin previa del analito. En este grupo se presentan dos artculos. En el primero de ellos se aplica la tcnicade extraccindenominadaExtraccinen FaseSlida(SPE),yenelsegundolatcnicaPSE(ExtraccinPresurizadaconDisolvente): 3.1. Determinacin de methidathion y tricyclazole en aguas con preconcentracin medianteSPEyposteriorelucinenlnea. ix
3.2.Determinacindegrasaenlecheenpolvo,empleandolaextraccinPSE. 4. Mtodo de anlisis FTMIR con extraccin en lnea. En este grupo se incluye un nico trabajo, correspondiente a la determinacin de succinato de doxilamina en especialidades farmacuticasconextraccinenlnea. EnelCaptuloII(Objetivos)sepresentandetalladamentelosobjetivosdeestaTesis debidamentejustificados. As pues, esta Tesis est centrada en los logros obtenidos y en las dificultades encontradas a lo largo del desarrollo de los mtodos de anlisis FTIR propuestos, ms que en los resultados en s mismos. Las lneas de investigacin que en su da fueron abandonadas por los resultados negativos obtenidos no se comentan en esta Tesis pero, de alguna manera, s que han servido para encauzar y reconducir el trabajo hasta alcanzar los objetivosfijados.
Listadeacrnimos
AOS ASE ATR CV EPA FA FFT FIA FIR FT HG HPLC olefinsulfonatosdico Extraccinaceleradacondisolvente(AcceleratedSolventExtraction) ReflectanciaTotalAtenuada(AttenuatedTotalReflectance) Coeficientedevariacin EnvironmentalProtectionAgency Anlisisenflujo(FlowAnalysis) FastFourierTransform Anlisisconinyeccinenflujo(FlowInjectionAnalysis) Infrarrojolejano(FarInfrared) TransformadadeFourier(FourierTransform) Generacindehidruros(HydrideGeneration) Cromatografa lquida de alta resolucin (High Performance Liquid Chromatography) IR LLE MIR MS NIR NTA PFE PLE PSE PTFE SIA SPE UE UV VPG Infrarrojo(Infrared) ExtraccinLquidoLquido(LiquidLiquidExtraction) Infrarrojomedio(MidInfrared) Espectrometrademasas(MassSpectrometry) Infrarrojocercano(NearInfrared) Nitrilotriacetatosdico Extraccinpresurizadaconfluido(PressurizedSolventExtraction) Extraccinpresurizadaconlquido(PressurizedLiquidExtraction) Extraccinpresurizadacondisolvente(PressurizedSolventExtraction) Politetrafluoroetileno Anlisisconinyeccinsecuencial(SequentialInjectionAnalysis) Extraccinenfaseslida(SolidPhaseExtraction) UninEuropea Ultravioleta Generacindefasevapor(VaporPhaseGeneration)
xi
ndice
ndicesdeimpacto.. Agradecimientos. Prefacio..... Acrnimos ndice I.Introduccin 1.IntroduccinalaEspectroscopiavibracional. 1.1.OrgeneshistricosdelaEspectroscopia 1.2.FundamentostericosdelaEspectroscopiaMIRyNIR... 1.2.1.Elespectroelectromagntico... 1.2.2.EspectroscopiaIR.. Modosdevibracin.. CaractersticasdelespectroIR. 2.Instrumentacinymodosdemedida.. 2.1.EspectrmetrosdeTransformadadeFourier.. 2.2.Materialesdelaceldademedida.. 2.3.Modosdemedida 2.3.1.MedidasporTransmisin Celdasdelquidos. 2.3.2.MedidasporReflectancia. 3.Aspectosoperativosdelosmtodosdeanlisiscuantitativo.. 3.1. Tipos de operaciones analticas y caractersticas de los mtodos 3.1.1.Tratamientodelamuestra:tcnicasdeextraccin... Extraccinenfaseslida(SPE) Extraccinpresurizadacondisolvente(PSE) ii iv vii xi xii 2 2 2 4 5 8 9 11 16 16 22 24 24 25 26 29 28 30 30 33
xii
3.2. Mtodos de anlisis: tipos de medidas y diseo de montajes experimentales 3.2.1.Medidasenmododiscontinuo........ 3.2.2.Medidasencontinuo 3.2.3.Multiconmutacin. 3.3.Acoplamientoconlastcnicasvibracionales... 4. El papel de la espectrometra vibracional en el control de calidad. 5.Anlisismedioambientalmentesostenible. 6.AntecedentesdelaTesis II.Objetivos III.Resumendelostrabajosydiscusin.. 1. Anlisis directo por ATRFTIR con celda de diamante: determinacindeNTAendetergentes Introduccin. Resumenydiscusin.. Conclusiones...
35 36 38 39 45 51 53 56 60 64 64 64 65 74 75 75 75 76 80 81 81 81
2.Desarrollodemtodos deanlisis por espectrometravibracional conmulticonmutacin... 2.1. Determinacin ATRFTIR de alfaolefinsulfonato sdico: sistemasconmulticonmutacinymedidasenstoppedflow.. Introduccin. Resumenydiscusin.. Conclusiones
2.2. Determinacin FTIR de benceno en gasolina: uso de la multiconmutacincomoestrategiaalternativaalFIA.. Introduccin. Resumenydiscusin..
xiii
2.3.
Conclusiones........ Determinacin de hexythiazox en formulaciones
86 87 87 88 94 95 95 95 97 102 103 103 105 109 111 111 112 120 122 122 129
fitosanitarias: aplicacin de la multiconmutacin acoplada a la espectrometraFTNIR... Introduccin. Resumenydiscusin.. Conclusiones
3. Desarrollo de mtodos de anlisis FTMIR con extraccin previa delanalito. 3.1. Determinacin de methidathion y tryciclazole en aguas con preconcentracinmedianteSPEyelcucinenlnea.. Introduccin. Resumenydiscusin.. Conclusiones
3.2. Determinacin de grasa en leche en polvo con extraccin presurizadacondisolvente.... Introduccin. Resumenydiscusin.. Conclusiones
4. Tratamiento en lnea de la muestra: determinacin de succinato dedoxilaminaenespecialidadesfarmacuticas. IV.Resultados. 1. Anlisis directo por ATR FTIR con celda de diamante: determinacindeNTAendetergentes.... 2.Desarrollodemtodos deanlisis por espectrometravibracional conmulticonmutacin.... Introduccin. Resumenydiscusin.. Conclusiones
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2.1. Determinacin ATRFTIR de olefinsulfonato sdico: sistemas con multiconmutacin y medidas en modo stopped flow................... 2.2. Determinacin FTIR de benceno en gasolina: uso de la multiconmutacin como estrategia alternativa al
129 138 146 154 154 179 199 207 216 216 222 224
FIA 2.3. Determinacin de hexythiazox en formulaciones
fitosanitarias: aplicacin de la multiconmutacin acoplada a la espectrometraFTNIR... 3. Desarrollo de mtodos de anlisis FTMIR con extraccin previa delanalito 3.1. Determinacin de methidathion y tricyclazole en aguas con preconcentracinmedianteSPEyelucinenlnea... 3.2. Determinacin de grasa en leches en polvo con extraccin presurizadacondisolvente 4. Tratamiento en lnea de la muestra: determinacin de succinato dedoxilaminaenespecialidadesfarmacuticas. V.Conclusiones.. VI.Apndices. VII.Bibliografa. ApndiceI:programacinconQuickbasic4.5... ApndiceII:glosario......
xv
Captulo I: Introduccin
I.Introduccin
1.IntroduccinalaEspectroscopiavibracional
1.1.OrgeneshistricosdelaEspectroscopia La Qumica Analtica se sirve de tcnicas instrumentales espectroscpicas desde finales del siglo XIX. Por este motivo comenzaremos esta Introduccin con una breve historia general de la Espectroscopia, para describir ms tarde los fundamentos tericos de lastcnicasespectroscpicasvibracionalesutilizadasenlasinvestigacionesquedanorigena estaTesisDoctoral. Seentiendecomoespectroscopiaelestudiodelosfenmenosdeabsorcin,emisin y dispersin de la radiacin electromagntica producidos por la interaccin de sta con la materiatomos neutros, iones o molculas. La radiacin electromagntica se distingue en funcin de su longitud de onda caracterstica. A grandes rasgos, la espectroscopia requiere una radiacin procedente de una fuente, un selector de longitud de onda y un detector. Su desarrollo se haya ntimamente relacionado, por tanto, con el de la ptica y otras ramas de laFsica. El primer antecedente clsico que se puede asociar con el concepto de espectroscopia (del latn spectrum, imagen, y del griego , mirar) se corresponde con la serie de experimentos llevados a cabo por Isaac Newton (16431727) a partir de 1665 (Hollas, 2004). En estos famosos ensayos, Newton estudi la descomposicin de la luz blanca en bandas de diferentes colores conseguida con la ayuda de un prisma triangular. Este fenmeno se conoca, no obstante, desde la Antigedad. El arco iris y otros fenmenos meteorolgicosproducenelmismoespectrodecolores.SinembargofueNewtonelprimero enidentificarcorrectamenteladescomposicindelaluzcomocausadeesteefecto.Tendran que pasar ms de cien aos para que se diera otro paso importante en el campo de la 2
Espectroscopia. En el ao 1800, el astrnomo William Herschel (17381822) midi la temperatura de las bandas de luz producidas al descomponer la luz blanca con un prisma (Davies, 1998). Advirti que el termmetro meda temperaturas ms altas conforme se pasaba del extremo azul del espectro al rojo. Y ms all todava, en la zona en la que el ojo humano no perciba color alguno, la temperatura continuaba en aumento. Denomin infrarrojo (IR) a esta parte del espectro, que est ms all (Latn infra) del color rojo. Puesto que el prisma estaba construido con vidrio y ste absorbe la radiacin en la regin del espectro correspondiente al infrarrojo medio, Herschel haba descubierto el infrarrojo cercano(NIR). Un ao ms tarde, J. Ritter (17761810) detecta por primera vez la radiacin ultravioleta al hacer incidir el espectro solar sobre cloruro de plata, encontrando la mxima descomposicindelcompuestoenlareginespectralanterioralcolorazul(Meadows,2001). En 1802, William Wollaston (17661828) descubre lneas oscuras en el espectro solar. Una dcada ms tarde, Josef Fraunhofer (17871826) estudia estas lneas con precisin, hasta encontrar ms de 600 (lneas de Fraunhofer) (Meadows, 2001). Es en los primeros aos del siglo XIX cuando se comienza a relacionar la naturaleza qumica de una sustancia con su espectrocaracterstico.LonFoucault(18191868)eselprimeroenidentificarlosprocesosde absorcin y emisin de la luz como origen de las lneas oscuras (absorcin) y las brillantes (emisin)queaparecenenelespectrosolar(Meadows,2001). A la par de estos avances, se desarrollan en aquellos aos las bases tcnicas que permitieronlapuesta a puntode losprimerosespectrgrafos.En 1830,L.Nobili(17871835) describeeltermopar,cuyoprincipiodefuncionamientoesfundamentalenlaEspectroscopia infrarroja:cuandoincideunrayodeluzenlauninentredospiezasdemetalesdiferentesse produceunacorrienteelctricadebidaalcalorgenerado.Porotraparte,Langley(18341906) construye en 1881 el primer bolmetro, dispositivo que detecta el calor producido por la radiacin infrarroja al producir cambios en alguna propiedad fsica del material que lo constituye (Allegheny Observatory, 2001). En ese mismo ao Alexander G. Bell (18471922) desarrolla una versin primitiva de un detector fotoacstico, que utiliza un micrfono para
captarelcalentamientodeungasencerradoenunaceldahermticacuandoincideradiacin sobresta(Ciurczak,1995). Robert Bunsen (18111899) y Gustav Kirchhoff (18241887) sientan a partir del ao 1860 las bases del diseo de los instrumentos al construir un espectrgrafo con el que obtienen los espectros de numerosos compuestos qumicos (Kirchhoff, 1860). De esta manera consiguen descubrir los elementos Cesio, que presenta dos lneas de emisin de color azul, y el Rubidio, que presenta dos lneas de color violeta. Son los primeros pasos de la Espectroscopia de Emisin Atmica, y por ende, de la aplicacin de la espectroscopia al anlisisqumico. La aplicacin de la Espectroscopia Infrarroja a la Qumica Analtica, si bien como primeros balbuceos, surge con los trabajos de Abney y Festing en 1882, que obtienen fotografas de los espectros IR de varias sustancias (Ciurczak, 1995). El empuje final a esta disciplina lo realiza W. W. Coblentz (18731962), con la publicacin en 1905 de Investigations of Infrared Spectra y diversos artculos (Coblentz, 1905). A partir de este momento, la investigacin en el campo de la Espectroscopia Infrarroja prosigue con xito. Durante la II Guerra Mundial, el inters por el infrarrojo surge tanto de los Aliados como del Eje. Tras el conflicto, el diseo de instrumentos asequibles y rpidos hace posible la expansin de la tcnicahastalosnivelesactuales(Gilbert,2000). 1.2.FundamentostericosdelaEspectroscopiaMIRyNIR Definiremosenprimerlugarelconceptoderadiacinelectromagntica.staesuna forma de energa que presenta caractersticas de corpsculo y onda. Su origen se encuentra en el movimiento de las partculas con carga elctrica. Consiste en unos campos elctricos y magnticos oscilantes, perpendiculares entre s y que se propagan en direccin perpendicular a s mismos con velocidad constante. La radiacin electromagntica puede estar polarizada, de modo que el campo elctrico y el magntico oscilan en un plano definido. Habitualmente, la radiacin no se encuentra polarizada, as que en ella existen campos oscilando perpendicularmente a su direccin de propagacin en todos los planos 4
posibles. La Figura 1 reproduce el esquema de la radiacin electromagntica polarizada en elplano.

y E
AE
x B z
Figura 1. Representacin de la radiacin electromagntica polarizada en el plano, siendo E el campo elctrico y B el campo magntico. De manera ilustrativa se indica la longitud de onda , y la amplitud AE, para el componente elctrico de la radiacin.
Elcomponenteelctricodelaradiacinsepuedeexpresarcomo: E=AEsen(2t+ ) dondeEeselcampoelctricoparauntiempot,AEeslaamplitudmximadelcampo, esla frecuencia o nmero de oscilaciones por unidad de tiempo y es la fase de la onda. De manera anloga se define la componente magntica de la radiacin, utilizando la amplitud mximadelcampomagntico,enestecasoAB. 1.2.1.Elespectroelectromagntico De todas las propiedades inherentes a la radiacin electromagntica, las ms utilizadas para su clasificacin en Espectroscopia son la longitud de onda y sus magnitudesrelacionadasfrecuenciaynmerodeonda.Enelvaco,sedefine: {1}
{2}
siendo c la velocidad de la luz (2,998 x 108 m s1). Sin embargo, en el campo de la Espectroscopia Infrarroja se utiliza de forma generalizada la magnitud nmero de onda , cuya unidad es cm1. Esta magnitud se define como 1/. En la Figura 2 se indican las diferentes regiones en que se divide el espectro electromagntico, o conjunto continuo de radiaciones electromagnticas de diferente frecuencia. La intensidad de la radiacin es proporcionalalaamplitudmientrasquelaenergaloesa. La energa total de una molcula se define como suma de las energas de los distintosnivelesenergticosposibles: Etotal=Eelectrnica+Evibracional+Erotacional+Etraslacional Cada uno de estos trminos energticos se corresponde con transiciones de niveles de energa en los que estn implicados electrones, vibraciones, rotaciones y traslaciones de lamolcula. Enelcasodelastcnicasespectroscpicasvibracionales,entrelasqueencontramos la Espectroscopia IR, la absorcin de radiacin electromagntica provoca cambios en la vibracin de los diferentes tomos o grupos de tomos de la molcula respecto de la posicinmediadelosenlaces. Las diferentes tcnicas espectroscpicas se basan en la interaccin de la radiacin electromagntica con la materia. Un tomo o molcula se encuentra en un determinado estado energtico. Al interaccionar con la radiacin electromagntica, el estado de la molcula puede cambiar, de tal modo que se puede expresar la variacin de energa entre losdosestados Ecomo: E=h {4}
6
{3}
ecuacin que nos indica que el cambio de energa est cuantizado, es decir, que slo son posiblesunosdeterminadosvaloresdeenerga,siendohlaconstantedePlanck.
ENERGA Electrnicos Vibracionales Rotacionales Spin Nuclear Ondas de Microondas Lejano radio (FIR) Infrarrojo Medio (MIR) Cercano (NIR) Ultravioleta Visible Cercano Lejano Rayos X Rayos Nucleares
m nm cm-1 0.033 3.3
25
2.5
0.77 770 390 26000 200 50000 10 0.05
10 40 400
4000
13000
Figura 2. Regiones del espectro electromagntico. Se indica el tipo de niveles energticos asociados a cada una de las regiones y los lmites de stas (Hollas, 2004).
La interaccin de la radiacin electromagntica con la materia (para simplificar llamaremos a la materia M en el estado fundamental y M* en el estado excitado, considerndola como molcula) puede ocurrir a travs de tres procesos diferentes (Hollas, 2004): i) Absorcin inducida: M + h M*,dondeM representa la molcula enel estado energticofundamentalyM*lamismamolculaenelestadoexcitado. ii) Emisin espontnea: M* h + M, donde la molcula se desexcita emitiendo radiacinh. iii) Emisin estimulada: M* + h M + 2h, donde la absorcin de radiacin electromagnticaporlamolculaenelestadoexcitadoprovocaladesexcitacindestacon emisinderadiacin.
7
La absorcin inducida es el fenmeno bsico que explotan las tcnicas espectroscpicas vibracionales utilizadas en esta Tesis. A continuacin trataremos de los fundamentosespecficosdelaEspectroscopiaInfrarroja.
1.2.2.EspectroscopiaIR
La parte del espectro electromagntico que se corresponde con transiciones vibracionales, denominada infrarrojo (IR), se divide habitualmente en tres regiones como consecuencia de su diferente uso en aplicaciones prcticas, la instrumentacin que se requiere para su generacin y deteccin y la naturaleza de las transiciones vibracionales implicadas.Estastresregionesson:IRcercanoentre13000y4000cm1(NIR),denominadoas porque se encuentra a continuacin de la regin visible del espectro; IR medio entre 4000 y 400 cm1; e IR lejano (FIR) entre 400 y 10 cm1. Trataremos en primer lugar las generalidades delateoradelIRmedio(similarparaelFIR)ydespuslaspeculiaridadesdelNIR. Lafrecuenciaconlaquevibraunamolculadiatmicaesigualaladeunoscilador armnico,quesedefinesegnlaleydeHooke(Coates,2000)como:
= 1 k 2
{5}
donde k es la constante de fuerza y la masa reducida de la molcula diatmica [(m1

m2)/(m1+m2)].Deestamanera,laconstantekesunamedidadelafuerzadelenlaceentrelos
tomos 1 y 2 de la molcula.En consecuencia diferentes enlaces tendrn kdiferentes y, por tanto,sufrecuenciadevibracin serdistinta. De la Mecnica Cuntica (ecuacin de Schrdinger) se deduce el valor de la energa
para los niveles energticos del oscilador armnico, que se identifica para una mayor sencillezconlamolculadiatmica.Laexposicindetaldeduccin(Hollas,2004)sobrepasa los objetivos de esta Introduccin y por tanto obviaremos su desarrollo completo, as que la ecuacinresultanteseexpresacomo:
8
Ev=(v+)h0 donde Ev es la energa del nivel vibracional v de la molcula, v es el nmero cuntico vibracional,yoeslafrecuenciadevibracinenelestadofundamental,queseobtienedela expresinclsica{5}.Laabsorcinderadiacinelectromagnticadefrecuenciaigualaladel oscilador armnico produce un cambio en el estado energtico vibracional de la molcula. En otras palabras, la radiacin IR provoca cambios en la vibracin de las molculas. Es la absorcin de esta radiacin la que detectamos en la Espectroscopia IR. Por otra parte, la ecuacin{6}esunaaproximacinenlaqueseasumequelamolculadiatmicasecomporta comounosciladorarmnico.Enrealidad,existeunefectodeanarmonicidad,demaneraque intervienenmstrminosenlaexpresindeEv(Figura3). {6}
Energa Potencial
Energa de disociacin
v1
v3 v2
Figura 3. Curva de energa potencial para un oscilador armnico (curva discontinua) y para un oscilador anarmnico (curva continua), con sus niveles energticos, en funcin de la separacin entre los dos tomos oscilantes (r).
Modosdevibracin
Elnmerodevibracionesdiferentesquepuedepresentarunamolculadependede
los grados de libertad vibracionales de sta.Una molculano linealde Ntomos tiene 3N6 modos fundamentales de vibracin. Para una molcula lineal, los modos de vibracin son
3N5. Sin embargo, la sola existencia de modos de vibracin no es condicin suficiente para
que una molcula sea activa en el IR. Estrictamente, la vibracin ser activa cuando se produzca un cambio en el momento dipolar de la molcula como consecuencia del movimiento de vibracin (Figura 4), lo que constituye la regla de seleccin del IR. El momentodipolarescalar(noconfundirconmasareducida)sedefinecomo:
=qd
{7}
donde q es la carga elctrica total y d la distancia. De este modo, si la distancia d entre dos tomosvaratambinlohar y,enconsecuencia,talvibracinseractivaenelIR.
m1
m2
Campo elctrico
Figura 4. Esquema de la dependencia del momento dipolar de una molcula diatmica con la vibracin.
Los modos de vibracin de una molcula dependen, como hemos visto, de la estructuraespacialydelnmerodetomosdesta.Engeneral,puedenserdedostipos: tomos. ii) Vibraciones de deformacin, en las que se produce un cambio en los ngulos de i)Vibracionesdetensin,queproducenunavariacinenladistanciaqueseparalos
enlaceentrelosdiferentestomos.
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CaractersticasdelespectroIR
Como veremos a continuacin, pueden existir bandas que no se deban a vibraciones fundamentales. Dos frecuencias fundamentales pueden sumarse generando bandas de combinacin, y tambin pueden aparecer bandas debidas a mltiplos de las frecuencias fundamentales o sobretonos (Steele, 2000). En resumen, en un espectro IR aparecernmayoromenornmerodebandasdependiendode: a)Losmodosdevibracinposibles(3N63N5). b)Loscambiosenelmomentodipolar(regladeseleccin). c)Laaparicindebandasdecombinacin. d)Laexistenciadesobretonos. e) La regin en la que aparecen las frecuencias fundamentales (si estn fuera de 4000400cm1noaparecernenunespectrodeIRmedio). f)Laintensidaddelasbandasfundamentales. g)Lossolapamientosdebandasdefrecuenciasimilar. h)Ladegeneracindelosmodosdevibracin.
En la Figura 5, a modo de ejemplo, se indican las bandas ms caractersticas de algunos gruposfuncionalesimportantes.
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Alquenos Alquinos Aromticos OH C=O NH2NH CN NO2 SH S=O
m f d m f d
m d m f
f/d f f
f m m/d f d f f/m
Figura 5. Esquema de las regiones en las que aparecen bandas de absorcin para diferentes grupos funcionales y su intensidad relativa: f, fuerte; m, media; d, dbil (Silverstein, 1998).
Para cuantificar la absorcin de la radiacin, en Espectroscopia IR se utilizan de manera habitual dos magnitudes diferentes. stas se denominan Transmitancia (T) y Absorbancia(A).LasmedidasenTransmitanciasontilescuandosepretendeidentificarun compuesto correlacionando las bandas del espectro IR de un patrn con la muestra problema.LaTransmitanciasedefinecomo: T(%) = 100 donde T es la Transmitancia expresada en porcentaje, I es la intensidad de la radiacin tras atravesarlamuestraeI0eslaintensidadinicial.
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I I0
{8}
LamagnituddenominadaAbsorbanciasedefinecomo:
A = log
I0 I
{9}
MientrasquelaTransmitancianoestrelacionadalinealmenteconlaconcentracin
de un compuesto y por tanto no puede utilizarse con fines de anlisis cuantitativo, la Absorbanciasloestyademsesaditiva: A=aLC dondeLeselgrosordelaceldaquecontienelamuestraopasoptico,aeslaabsortividady
Ceslaconcentracindelasustanciaacuantificar.EstaecuacinseconocecomoLeyde Beer Lambert y es el fundamento de los mtodos de anlisis cuantitativos por espectrometra IR,
{10}
objetodelapresenteTesis.ComoilustralaFigura6,existendesviacionesdeestaleyacausa de: a)Elcambiodelndicederefraccindelmedioylasinteraccionesintermoleculares queseproducenparaconcentracioneselevadasdelanalito. b)Laformacindeenlacesdehidrgenoyequilibrioscidobase. c)Ladependenciadelaabsortividadrespectodelalongituddeonda,debidoaque lainstrumentacinnopermiteutilizarradiacinmonocromticapura. Como hemos visto a lo largo de esta seccin, existen bandas que no se corresponden con transiciones permitidas por la regla de seleccin. Aunque aparecen en toda la regin IR, es en el NIR donde adquieren mayor relevancia prctica. Por tanto, trataremoselorigendeestasbandasnopermitidascentrndonosenlareginNIR.Comoya se ha indicado anteriormente, sta se extiende entre los 4000 y 13300 cm1 y las bandas que aparecen en la misma se deben a sobretonos y bandas de combinacin de frecuencias fundamentales (Bugay, 2001). La ecuacin {6} se corresponde con los niveles de energa vibracionalesparaunamolculadiatmicaquesecomportacomounosciladorarmnico.
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A B S O R B A N C I A
ideal desviaciones
Pendiente= aL
Concentracin
Figura 6. Relacin ideal entre Absorbancia y concentracin y desviaciones de la misma.
Generalizandolaecuacin{6}paraunamolculapoliatmica:
3N6
E( v1, v 2 , v 3 ,...) =
(v
i =1
i+
1 )h 2
{11}
donde v1, v2, v3 son los niveles vibracionales y vi el nmero cuntico vibracional (0, 1, 2, 3,). Aqu la molcula es considerada como una serie de osciladores armnicos diatmicos independientes. La transicin de vi=0 a vi=1 es la permitida por la regla de seleccin y se denominavibracinfundamental.Silatransicinocurreentrevi=0yvi=2,3,...setratadeun sobretono. Por otro lado, si la transicin ocurre entre el estado fundamental y vi=1 y vj=1 simultneamente, entonces aparecen las bandas de combinacin. Estrictamente, estas transiciones no estn permitidas por la regla de seleccin. Sin embargo, sta se deriva de la suposicin de que los osciladores son armnicos. Esto no es ms que una aproximacin, ya que las molculas poliatmicas se comportan como osciladores anarmnicos debido a la interaccin entre los diferentes tomos (Hollas, 2004). Considerando la anarmonicidad del oscilador, la expresin para los niveles de energa que se obtiene despreciando los trminos deexponentemayorque2resultadelaforma: Ev=(v+)he(v+)2ee
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{12}
donde eeslafrecuenciavibracional(definidacomoenlaec.{5})y eeeslaconstantede anarmonicidad. Tal expresin justifica la presencia de los sobretonos en los espectros IR, especialmente en la regin NIR. Al ser transiciones no permitidas, su intensidad es entre 10 y 1000 veces menor que la de las vibraciones fundamentales. En el NIR, los sobretonos provienen de tensiones XH (OH, SH, CH, NH). Los sobretonos pueden combinarse con frecuencias fundamentales en lo que se denomina Resonancia de Fermi (Ciurczak, 2002). A estas bandas hay que aadir las bandas de combinacin, que tambin provienen de transicionesprohibidasyqueenconsecuenciapresentanunadbilintensidad.
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2.Instrumentacinymodosdemedida
El impulso definitivo a la Espectroscopia IR aplicada a la Qumica Analtica se ha producido a lo largo de la segunda mitad del siglo XX gracias al desarrollo de una tecnologa que permite la obtencin rpida y precisa de espectros IR. Hasta la dcada de 1980, la mayora de los espectrmetros IR eran dispersivos. Sin embargo, los modernos equipos de Transformada de Fourier (FT) presentan grandes ventajas frente a los dispersivos y,debidoalareduccindesucosteenlosltimosaos,handesplazadocasiporcompletoa estosltimos.
2.1.EspectrmetrosdeTransformadadeFourier
La obtencin del espectro IR con un equipo dispersivo implica la dispersin de un haz de radiacin procedente de una fuente mediante un prisma o una red de difraccin. La longitud de onda de la radiacin que atraviesa la muestra es seleccionada con un monocromador,quedejapasarunaestrechafranjaderadiacin.Paraobtenerunespectrode absorcin es necesario rotar el prisma o la red de difraccin, de tal modo que la muestra reciba un estrecho haz de radiacin de longitud de onda i i diferente para cada punto del espectro (que se corresponde con una posicin fija del elemento dispersor) hasta completarlo. Este barrido de se traduce en unos tiempos de medida del orden de minutos paralaadquisicindeunnicoespectroIR(Spraggs,2000a). Encambio,enunespectrmetrodeFTlaradiacindetodaslaslongitudesdeonda se mide simultneamente, objetivo que se consigue mediante el uso de un interfermetro y de la aplicacin de la FT. De esta manera se necesitan tiempos de barrido tan pequeos como 1 s, lo que supone una excelente eficacia en la obtencin de los espectros (Spraggs, 2000a). En la Figura 7 se describe el esquema bsico de los espectrmetros FT que utilizan el interfermetro de Michelson, que es el ms comn en estos equipos. La radiacin
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policromtica procedente de la fuente alcanza el beam splitter (divisor de haz) del interfermetro y es dividida en dos haces de igual intensidad: uno se refleja en el espejo fijo yelotroenelespejomvil,detalmaneraquealunirseamboshacesdenuevotrasatravesar por segunda vez el beam splitter, se produce el fenmeno de interferencias constructivas y destructivas.Alvariarlaposicindelespejomvilvaraladiferenciadecaminopticoentre losdoshacesderadiacinpolicromticayseobtieneelinterferograma.steeselregistrode lasealquellegaaldetectorfrentealadiferenciadecaminoptico(retardo).
Espejo mvil
Beam splitter Interfermetro Espejo colimador Espejo fijo
Detector del lser Fuente IR Lser de referencia
Detector IR
Muestra
Figura 7. Diseo ptico bsico de un espectrmetro FT con interfermetro de Michelson.
Una vez obtenido el interferograma, el equipo digitaliza los datos y realiza automticamente la Transformada de Fourier. El interferograma de una radiacin monocromtica es una funcin sinusoidal, que se puede expresar como coseno. El interferograma de una radiacin policromtica equivale a la suma de las funciones coseno de cada radiacin monocromtica que la compone. Mediante la FT se consigue convertir esta funcin sinusoidal de seal frente a camino ptico en otra funcin sinusoidal de seal
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frente a longitud de onda o frecuencia (Figura 8). El algoritmo matemtico FFT (Fast Fourier
Transform) fue desarrollado por Cooley y Turkey en 1965 y permite realizar la computacin
delaFTenunbrevsimolapsodetiempo(Spraggs,2000a).
Seal Interferograma Seal Espectro
FFT
Diferencia camino ptico x

+
Frecuencia v
+
B( ) =
I(x) cos 2xdx
I( x) =
B() cos 2xd
Figura 8. Esquema de la aplicacin de la Transformada de Fourier (FT) en la obtencin de un espectro (seal frente a frecuencia).
El intervalo de frecuencias que se pueden identificar a partir del interferograma depende de la longitud de ste, siendo necesarios al menos dos puntos por cada ciclo de la frecuencia mayor (criterio Nyquist). Si no se aplica este criterio no se pueden asignar los puntos inequvocamente a una nica frecuencia, es decir, que la seal obtenida para una frecuenciaesindistinguibledelaobtenidaparaotra(Curbelo,2000). Por otra parte, la resolucin del espectro depende del espaciado de las frecuencias proporcionado por la FT, que est determinado por el recorrido del interfermetro. Las frecuencias utilizadas en una FT son las que ajustan un nmero exacto de ciclos en la diferencia ptica mxima del interfermetro. La separacin de dos frecuencias es la inversa de la diferencia mxima de camino ptico expresada en cm. As pues, una resolucin de 1 cm1 requiere una diferencia de camino ptico de 1 cm, siendo adems constante en todo el espectro. No obstante, en la prctica, la resolucin efectiva es ligeramente diferente a causa
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de las pequeas desviaciones de los haces producidas al reflejarse en los espejos. Este problema se controla incorporando una apertura Jacquinot que reduce estas desviaciones hasta un valor mnimo (Spraggs, 2000a). A pesar de la disminucin de la energa que alcanza la muestra y el detector, inherente al uso de este dispositivo, para una resolucin determinada la intensidad de radiacin que alcanza el detector es mayor en un espectrmetro FT que en uno dispersivo con rendija rectangular como monocromador. Este hecho se conoce como ventaja Jacquinot y es el motivo de la mayor sensibilidad de los equiposFTfrentealosdispersivos. La escala del interferograma se establece mediante la seal producida por un lser HeNedeperfectamentedefinida(0.6328m)quesemideconunsegundodetector.Alser radiacin monocromtica produce una seal sinusoidal de periodo igual a la del lser, siendo la variable independiente el desplazamiento del espejo. En cada punto con seal=0 delinterferogramadeestelserdereferenciasemidelasealdelaradiacindelhazIR.As se escala el interferograma con una precisin mucho mayor que la conseguida con espectrmetrosdispersivos,loqueseconocecomoventajaConnes(Spraggs,2000a). Con el objetivo de mejorar la relacin seal/ruido, los espectrmetros FTIR promedian una serie de scans o barridos (N) obtenidos sucesivamente en las mismas condiciones. La relacin seal/ruido depende de N y, por tanto, se puede aumentar
incrementando el nmero de scans acumulados por cada espectro obtenido. Esta relacin seal/ruido es mayor para un espectrmetro FT que para uno dispersivo, lo que se conoce comoventajaFellgettmultiplex,debidoaqueseregistrantodaslasfrecuenciasdelespectroal mismotiempo(Gilbert,2000).Porotraparte,comoelespejomvildelinterfermetrorealiza elrecorridocompletoparacadascanytiene quevolveralaposicininicialantesdellevar a cabo el siguiente barrido en un tiempo no despreciable, es necesario realizar una correccin de fase para sumar adecuadamente los diferentes scans obtenidos, operacin que se realiza antes de la transformacin, aunque existen equipos ms sofisticados que solucionan este problemacondosdetectoresparalasealprocedentedellserdereferencia. Los espectrmetros FTNIR utilizan fuentes mucho ms intensas, detectores ms sensibles que los FTMIR y se aplican a muestras con absortividad mucho menor que en el
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MIR.Aspues,lasventajasdelosespectrmetrosdeFTcomolaFellgettmultiplexyJacquinot no son aplicables, en general, a los espectrmetros FTNIR (Ciurczak, 2002). El exceso de radiacin de la fuente puede incluso quemar la muestra. La principal ventaja de los FTNIR es su excelente resolucin, que permite resolver con mayor detalle las bandas caractersticas deestareginque,enmuchasocasiones,presentanunelevadogradodesolapamiento.Este hecho es de gran importancia en la regin NIR a causa del limitado nmero de bandas caractersticas de algunos de los compuestos ms analizados por espectrometra NIR: los principios activos de preparados farmacuticos. En la Figura 9 se representa el esquema del espectrmetro MPA (Multi Purpose AnalyzerTM) de Bruker, utilizado en el trabajo FTNIR queseincluyeenestaTesis. El algoritmo FFT requiere que el nmero de puntos que son transformados sea iguala2n.Sinembargo,paraunaresolucindeterminada,elnmerodepuntosnotienepor qucoincidircon2n.Parasolucionaresteproblema,seaadentantospuntosconvalorigual a cero como sea necesario para que el total sea igual a 2n. Este proceso se denomina zero
fillingy,aunquenocambialaresolucin,mejoraelaspectodelespectro.
Por otra parte, la seal sinusoidal del interferograma es finita, al ser finito el recorrido del espejo mvil del interfermetro. Esto implica que la funcin generada por FT tenga una forma peculiar (Figura 10). Para mejorar su aspecto, se aplica la denominada
apodizacin (Spraggs, 2000a), que consiste en multiplicar el interferograma por una funcin
especial, cuyo efecto es el de alisar la funcin generada. Existen diversas funciones de apodizacin(Triangular,Boxcar,BlackmannHarris,HappGenzel,). Un espectrmetro de Transformada de Fourier requiere elementos diferentes dependiendo de la regin del IR en la que deba operar. En la Tabla 1 se resumen los principales tipos de fuentes de radiacin, detectores y beam splitters utilizados en estos instrumentos.
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E C
Figura 9. Esquema del diseo ptico del espectrmetro MPA de Bruker, para una configuracin de medidas de Transmitancia en el compartimento de muestra. A: fuente; B: filtro; C: interfermetro; D: cubeta o vial de muestra; E: detector.
A
Seal
cm-1
cm-1
Figura 10. Efecto de la apodizacin en la funcin generada mediante la transformacin de Fourier. A: funcin original generada por FT; B: funcin obtenida tras la apodizacin.
Un espectrmetro FTMIR tpico tiene un beam splitter de Ge/KBr con una resolucin mxima de trabajo del orden de 1 cm1 y un detector de sulfato de triglicina deuterada (DTGS). ste es un detector trmico, que convierte en una seal elctrica el cambio de temperatura que sufre el elemento sensible al incidir sobre l la radiacin IR. Funciona a temperatura cercana a la ambiente. Tiene tiempos de respuesta < 1 ms, permitiendo trabajar perfectamente con tiempos de barrido de 1 s para una resolucin de 4
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cm1.HasidoeldetectorutilizadoenlamayoradelostrabajospresentadosenestaTesis.En cuanto al beam splitter, el Ge/KBr es el ms comn, teniendo una ventana espectral amplia quecubretodalazonadelMIR(4000400cm1).
Regin NIR Intervalo cm-1 15000-4000 Fuente Tungstenohalgeno Beam splitter CaF2, cuarzo Detector DTGS PbS InGaAs InSb MIR 7000-400 Cermica (Nerst) Nicromo SiC (Globar) KBr, ZnSe DTGS LiTa MCT InSb FIR 400-20 Cermica Nicromo Lmpara de mercurio Mylar, CsI DTGS Si
Tabla 1. Principales tipos de fuentes de radiacin, beam splitters y detectores utilizados en los espectrmetros FT-IR.
En cuanto a los espectrmetros FTNIR, el beam splitter suele ser de cuarzo o de CaF2, con detector fotoconductor de PbS o de arseniuro de Indio y Galio (InGaAs), cuya conductividadvaracuandoincideradiacinelectromagnticasobrel(Schuermeyer,1999). En el trabajo presentado en esta Tesis se ha utilizado una configuracin basada en un beam
splitterdecuarzoyundetectorInGaAs.
2.2.Materialesdelaceldademedida
LosmaterialesutilizadoshabitualmenteparalasceldasdemedidaporTransmisin en elIR aparecen en la Tabla2. Enelcaso del MIR suelenemplearse celdas con ventanas de KBr y NaCl que permiten aplicaciones en la zona de la huella dactilar. Otros materiales como el ZnSey CaF2 ofrecenuna mayor resistencia pero limitan las posibilidades de trabajo en la zona demenores nmeros de onda. Se utiliza un tipo de material uotro en funcin de
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las caractersticas qumicas de la muestra y la zona del IR que se pretende utilizar en el anlisis. Las disoluciones acuosas son incompatibles con las celdas de cristales higroscpicososolublesenagua,comoelNaCloKBr.Loscidosfuertessonespecialmente incompatibles con el ZnSe, puesto que reaccionan formando seleniuro de hidrgeno compuesto muy txico y provocan la destruccin fsica de la celda. Las ventanas de las celdas que se han utilizado en los trabajos de FTMIR que componen esta Tesis han sido de NaCl,CaF2yZnSe.
Material CaF2 Intervalo cm-1 66000-1200 n 1.40 % 2.8 k 158 Propiedades qumicas Insol. en H2O, resiste cidos y bases Soluble en sales de amonio BaF2 50000-900 1.45 3.3 82 Baja solubilidad en H2O Sol. en cidos y NH4Cl Ge 5000-600 4.01 36 550 Insol. en H2O Sol. en H2SO4 caliente y agua regia NaCl 28000-700 1.52 4.5 15 Higroscpico Ligeramente soluble en alcohol y NH3 ZnSe 20000-500 2.43 17 150 Sol. en cidos fuertes
KBr
33000-400
1.54
4.5
Sol. en H2O, alcohol y glicerina Higroscpico
CsI
33000-150
1.74
7.3
20
Sol. en H2O y alcohol. Higroscpico
Diamante
45000-10
2.40
17
7000
Insol. en H2O, cidos y bases
Tabla 2. Caractersticas de algunos materiales utilizados habitualmente en la construccin de las celdas de medida en el IR (Guide for Infrared Analysis, Bruker Optics). n: ndice de refraccin a 2000 cm-1, %: Prdida de Reflectancia por superficie en porcentaje, k: Dureza Knoop.
Por lo que respecta a las medidas de Reflectancia total atenuada (ATR) el tipo de material utilizado para el elemento ptico ha sido ZnSe y el diamante. ste destaca entre
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todos los materiales por su extraordinaria resistencia qumica y dureza, lo que le dota de una gran utilidad en la construccin de elementos pticos y accesorios, alguno de los cuales severncondetallemstarde.
2.3.Modosdemedida
La Espectroscopia IR permite la obtencin de espectros de una gran variedad de materiales. En ocasiones es necesario obtener el espectro del material en su forma original, yasealquido,slidoogas,simpleocomplejo,qumicamenteinerteomuyreactivo.Existen varias opciones para conseguir espectros tiles de una muestra en su forma original. Podemosconsiderarlossiguientesmodosdemedida: i)MedidasporTransmisin. ii)MedidasporReflectancia. iii)MedidasporFotoacstica. A continuacin expondremos brevemente las caractersticas de las medidas por Transmitancia y Reflectancia, que se han utilizado en los trabajos que forman parte de esta Tesis,ylasimplicacionesquestastienenenlaconfiguracindelosequiposFTIR.
2.3.1.MedidasporTransmisin
En las medidas por Transmisin, el haz de radiacin IR atraviesa la muestra y alcanza el detector. Parte de la radiacin es absorbida por la muestra, de tal modo que el detectorrecibeunaintensidadderadiacinmenorquelainicial(verec.8).Paralaobtencin de los espectros de esta forma a partir de la muestra directa, los slidos se dispersan en un lquido (fluorolube, aceite de Nujol) que se coloca entre las dos ventanas de la celda. Otra opcinconsisteenfabricarundiscoopastilladeKBrmedianteunaprensa.Entalcaso,unos pocos mg de muestra slida se mezclan de manera homognea con unos 350 mg de KBr perfectamente seco. Esta mezcla se introduce en un molde adecuado, se coloca en una prensa y es sometida a una presin de 12000 psidurante 12 min. Asse consigue un disco
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que se coloca en un portamuestras. La obtencin de espectros de gases, al ser muy baja su concentracin, requiere celdas con paso ptico mucho mayor, de varios centmetros. Para el anlisis de gases a nivel de traza, se utilizan celdas de mltiples reflexiones, que aumentan considerablementeelpasopticosinaumentareltamaodelacelday,portanto,reducenel volumendemuestrarequeridoparaobtenermedidasadecuadas.
Celdasdelquidos
Para obtener un espectro de un lquido por medidas de Transmitancia se dispone de varias opciones. Con lquidos novoltiles puede extenderse una gota sobre una pelcula de un polmero inerte como el PTFE o el polietileno. Tambin se puede colocar una gota entredosventanasdeunmaterialadecuado.Lasceldasdelquidospuedenserdeespaciado fijo (distancia entre las ventanas que define el camino ptico) o desmontable. Este tipo de celdas se llenan manualmente con una jeringa. Sin embargo, en la metodologa de anlisis cuantitativo en la que se enmarca esta Tesis, se utilizan habitualmente microceldas de flujo (Figura11). En stas, el camino ptico es determinado por un espaciador de Pb o PTFE. La disolucin entra por la parte inferior de la celda y sale por la superior con ayuda de una bombaperistlticaodispositivosimilar.Comoveremosmsadelante,permitelarealizacin de medidas en modo continuo o en modo batch sin que se requiera manipular la celda. Este tipo de celdas de flujo pueden rellenarse y limpiarse en lnea, de tal manera que se reducen los posibles errores derivados del efecto memoria, difciles de eliminar con celdas de rellenadomanual,seaumentalarepetibilidadyseevitalamanipulacindelasdisoluciones, muchasvecestxicas(Garrigues,2000a).
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2.3.2.MedidasporReflectancia
Las medidas por Reflectancia se clasifican en dos modos: de reflexin interna y de reflexinexterna(Spraggs,2000b).Lastcnicasdereflexininternasebasanenlaformacin deunaondaevanescenteenellmiteentredossuperficiescondiferentendicederefraccin (n). Si el haz de radiacin incide en el material con un ngulo mayor que un valor crtico, la radiacin electromagntica no puede atravesar el medio de menor ndice de refraccin. As pues, el haz se refleja totalmente en la cara interna del cristal (ZnSe, Ge, diamante). Sin embargo, la onda evanescente creada penetra ligeramente en el otro medio, tpicamente unos pocos m, interaccionando con la muestra y dando lugar a la absorcin por sta de la radiacin. El haz se puede reflejar varias veces en las caras internas del cristal (y por ende penetrando de forma repetida en la muestra), aumentado as la sensibilidad de la medida (Figura 12). Este tipo de espectro se denomina de Reflectancia total atenuada (ATR). El ndicederefraccindelmaterialdelcristaldeterminalapenetracindelaondaevanescente en la muestra: a mayor n menor penetracin y, consecuentemente, la absorcin es menor, obtenindoseespectrosmenosintensos.UncristaldeGeconn=4.0producirespectrosATR ms dbiles que un cristal de ZnSe con n= 2.3. Por otra parte, la profundidad de la onda evanescente es proporcional a la del haz incidente, lo que se traduce en un aumento de la absorcin respecto a un espectro de Transmisin para nmeros de onda menores considerandounmismopasopticoaparente. En general, se utilizan dispositivos ATR horizontales en los que la muestra lquida o slida se coloca sobre el cristal, generalmente de ZnSe (Figura 13). Estos accesorios se acoplan en los equipos FTIR de manera sencilla. Para las muestras lquidas, basta colocar una cantidad suficiente para que moje completamente el cristal de la celda, prestando especialatencinaquenoseformenburbujassobrelasuperficiedelmismo,loqueafectara enormemente a la repetibilidad de las medidas. Si la muestra es slida, hay que garantizar que el contacto entre muestra y cristal sea completo. Esto se consigue ejerciendo sobre la muestraunapresincontroladaydisponiendodeuntamaodepartculapequeoyloms uniformeposible.
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A
Retn Espaciador Retn
Placa frontal
Salida
Ventana Placa posterior
Ventana perforada
Entrada
Figura 11. Celdas de flujo desmontables. A: partes de una celda de flujo. B: celda de microflujo Graseby Specac lista para su uso.
Una variante de la tcnica ATR es la que utiliza un cristal de diamante. De esta manera se pueden producir grandes presiones sobre el cristal, lo que facilita especialmente el anlisis de slidos al asegurar un contacto ms efectivo y reproducible. En el caso de los lquidos o disoluciones basta con depositar un pequeo volumen sobre el cristal sin preocuparse por su reactividad qumica. Por otra parte, existe la variante de celdas ATR de flujo,quetrataremosmsadelante,yaquesehautilizadoenuntrabajodelapresenteTesis. Para este tipo de medidas tambin se pueden utilizar sondas ATR que se introducen directamenteenlamuestraycombinanprismasyfibraptica.
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n2 n1 A n2 n1 Amplitud del campo elctrico
> c
Figura 12. Esquema descriptivo de la reflexin total interna. A: reflexin total, ngulo de incidencia > C, siendo C el ngulo crtico; n1 > n2, siendo n1 el ndice de refraccin del cristal; B: Onda evanescente formada en el lmite entre los dos medios. La lnea horizontal gruesa indica la interfase de separacin entre los dos medios.
Reborde metlico
muestra cristal
Haz de radiacin IR de la fuente
(Al detector)
Figura 13. Esquema de un accesorio ATR horizontal con la configuracin de cubeta para lquidos.
LaReflectanciaexternadesuperficieydifusatieneunaconsideracindiferenteala Reflectanciainterna.Esnecesariountratamientomatemtico(transformacinKramersKronig) para obtener el espectro de absorbancia. Se utilizan estas tcnicas para el anlisis de superficiesyslidosenformadepolvo.
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3.Aspectosoperativosdelosmtodosdeanlisiscuantitativo.
3.1.Tiposdeoperacionesanalticasycaractersticasdelosmtodos
Como indica su ttulo, esta Tesis se centra el desarrollo de mtodos de anlisis FT IR. Por tanto, es necesario sealar los aspectos ms importantes de lo que se entiende como mtodo de anlisis, haciendo especial hincapi en el diseo de los montajes experimentales y su acoplamiento con los equipos de medida. Definiremos ahora los conceptos bsicos que nosayudarnaintroducirestetema. Un mtodo de anlisis cuantitativo comprende una serie de operaciones analticas individuales. Entre stas encontramos el tratamiento previo y dilucin de la muestra, la mezcla con reactivos, la adicin de un estndar, el proceso de medida, etc. As se debe distinguirentreestasoperacionesylosmtodosdeanlisiscomoconjuntodeaqullas.Cada una de estas operaciones puede realizarse, aunque no siempre, de dos maneras diferentes: deformadiscontinuaydeformacontinua.Engeneral,nosreferiremosalprocesodemedida como discontinuo o continuo, aunque tambin podamos hablar de mtodos de anlisis discontinuosycontinuos. Segn este criterio, las medidas instrumentales pueden realizarse en modo discontinuo o en modo continuo. En el modo discontinuo, se mide la seal analtica de una muestra discreta, y la informacin se obtiene de manera puntual. En el caso de las medidas en modo continuo, el instrumento registra la seal analtica continuamente con el tiempo, pudindose monitorizar la respuesta. Sobre este punto profundizaremos en la seccin 3.1.2. Generalizando para cualquier operacin analtica, sta es discontinua (o en batch) cuando se produce un cambio qumico o fsico de manera brusca, como pueda ser el tomar un volumen de muestra con una pipeta, introducirlo en un matraz y completar el volumen con disolvente. Cada paso se realiza de manera discreta, es decir, a saltos. En cambio, una operacin realizada en continuo supone un cambio progresivo, como ocurre en la inyeccin continuademuestraenunacorrientedeportadorenunsistemadeflujo.Elqueunmtodo
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de anlisis utilice medidas en modo discontinuo o continuo depender de las ventajas e inconvenientes que tenga cada tipo de medida, en el contexto del problema analtico a resolver. Los objetivos y logros de esta Tesis, como veremos ms adelante, se centran tanto en el tratamiento previo de la muestra como en el proceso de medida. Por tanto, describiremos a continuacin las tcnicas fsicoqumicas de extraccin de la muestra que se hanempleadoenalgunosdelosmtodosdesarrolladosenestaTesis.Despus,explicaremos las caractersticas del proceso de medida desde el punto de vista de los mtodos discontinuos y continuos. Finalmente, introduciremos el concepto de multiconmutacin, que ha tenido un papel central en el desarrollo de varios de los mtodos de anlisis aqu presentados.
3.1.1.Tratamientodelamuestra:tcnicasdeextraccin
Tres de los artculos que forman parte de esta Tesis estn relacionados con tcnicas deextraccin.Enunodeellos,laextraccinserealizaenlneaypresentapeculiaridadesque comentaremos en el resumen de resultados; sin embargo ese trabajo se enmarca dentro de los mtodos de anlisis en continuo sin que el proceso de extraccin requiera dispositivos adicionales. Es en los trabajos con extraccin en fase slida (SPE) y de extraccin presurizada con disolvente (PSE) donde se utilizan tcnicas y equipos especficos de extraccinquetrataremosacontinuacin.
Extraccinenfaseslida(SPE)
La extraccin en fase slida se refiere a la separacin de algn constituyente qumico de una muestra lquida fluyente en estado de noequilibrio a travs de la retencin en un slido y la posterior recuperacin de los constituyentes seleccionados mediante la elucin con un disolvente adecuado (Wells, 2003). Esta tcnica de extraccin apareci como alternativa a la extraccin lquidolquido (LLE), que es una tcnica de equilibrio. En la
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prctica, existe una gran variedad de adsorbentes que retienen un gran nmero de analitos orgnicos,comopuedanserpesticidas,drogasohidrocarburos. En la Figura 14 se expone un esquema general de la metodologa bsica de la SPE. Cabe destacar que todos los procesos pueden realizarse en lnea. En primer lugar, se acondiciona la columna pasando un volumen determinado de un disolvente adecuado, que activa la fase slida y permite que sta retenga el analito. Despus se hace circular la muestra a travs de la fase slida con un caudal adecuado para que se retenga cuantitativamente el analito. A continuacin se puede realizar un lavado para eliminar compuestosnodeseadosyfinalmenteseeluyeelanalitoconeldisolventeoportuno. En general, se dispone de columnas o cartuchos rellenados con la fase slida dispositivos que han sido utilizados en esta Tesis con un tamao de partcula entre 50 y 60 m, dispuestaentre fritadosde material inerte. Tambinse pueden utilizar discos filtrantes quecontienenlafaseslida,adecuadosparavolmenesmuypequeosdemuestra,ybarras magnticas recubiertas de fase slida, que se introducen directamente en la muestra y retienenelanalitomientrasagitanellquido. UnadelasprincipalesventajasdelaSPEesquelosprocesosderetencinyelucin pueden realizarse en lnea. De esta manera se evitan engorrosas manipulaciones de la muestra que, en el caso de la LLE, son inevitables dado el carcter de noequilibrio de la tcnica.Engeneral,lasventajasdelaSPEfrentealaLLEsonlassiguientes: Evitalaformacindeemulsiones. Disminuyeelconsumodedisolventes. Retencinyelucinenlnea:posibilidaddeautomatizacinsencilla. Posibilidadderealizarunaelucinselectivaysecuencial. Elevadapreconcentracindelanalito. Esta ltima caracterstica de la SPE la hace especialmente til cuando se emplea conjuntamenteconlaespectrometraFTIRparallevaracabolacuantificacindeanalitosen
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muestras con niveles de concentracin muy bajos, del orden de ppm, que habitualmente se encuentran fuera de la sensibilidad de las tcnicas vibracionales cuando se llevan a cabo medidas directas. Es ste el caso de la determinacin de pesticidas en aguas (methidathion y
tricyclazole)queformapartedelapresenteTesis.
1) 2)
3)
4)
Compuesto no deseado Analito Compuesto no deseado
Figura 14. Etapas de la SPE. 1) Acondicionamiento de la fase slida. 2) Retencin. 3) Lavado. 4) Elucin.
De entre los distintos tipos de fases slidas de las que se puede disponer (de tipo polar, apolar, de intercambio inico, etc) en los trabajos incluidos en esta Tesis se han utilizadobsicamentelasdetipoC8yC18.
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Extraccinpresurizadacondisolvente(PSE)
Esta tcnica, que se conoce tambin como ASE (accelerated solvent extraction), PFE (pressurized fluid extraction) y PLE (pressurized liquid extraction), utiliza disolventes a elevada temperatura ( 100 C) y presin ( 1500 psi) para extraer cuantitativamente los analitos de la matriz en la que se encuentran. Esta tcnica, que fue desarrollada como alternativa a la extraccin con fluidos supercrticos (SFE), ha demostrado en los ltimos aos una gran utilidad,pasandoaformarpartedeunbuen nmerodelosmtodosestndarquepropone laEnvironmetalProtectionAgency(EPA)(Kou,2003). La elevada presin y temperatura afectan al disolvente, a la muestra y a sus interacciones. La temperatura de ebullicin del disolvente se incrementa bajo alta presin, porloquelaextraccinsepuedellevaracaboatemperaturasmselevadas.Estosetraduce en un aumento de la solubilidad del analito y de la velocidad de transferencia de masa, adems de debilitar la unin matrizsoluto debida a las interacciones de van der Waals, enlaces de hidrgeno y atracciones dipolodipolo. La viscosidad y tensin superficial del disolvente se reducen al incrementar la temperatura, lo que facilita la penetracin de ste al interior de la matriz. El efecto de la elevada presin tambin contribuye a tal resultado, mejorandolaextraccindelanalitoqueseencuentraretenidoenlosporosdelmaterialdela matriz(Kou,2003). Un equipo PSE consta bsicamente de un depsito de disolvente, una bomba, una celda de extraccin, un horno, un vial colector y un depsito de nitrgeno (Figura 15). La celda de extraccin es un tubo de acero inoxidable de paredes gruesas, que resiste las elevadas temperaturas y presiones desarrolladas en el proceso (Figura 16). Estas celdas se rellenan y limpian manualmente y de forma sencilla. El equipo PSE utilizado en esta Tesis tiene un carrusel de 6 celdas que permite realizar la extraccin simultnea de 6 muestras, lo que es muy adecuado para el anlisis de rutina o cuando se tiene que procesar un elevado nmerodemuestras.
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La celda se rellena con la muestra mezclada con un material inerte (Ottawa sand o similar)paraevitarunaposiblecompactacindelamuestraquepudieraobturarlasalida. Todo el sistema est automatizado. Una vez que se colocan las celdas llenas de muestra en el carrusel, stas quedan hermticamente selladas mediante mecanismos mecnicos.Eldisolventeseinyectahastaconseguirlapresinseleccionada,siendonecesario unlapsodetiempodeprecalentamiento,tpicamentedeunos510min,enelquelasceldas soncalentadashastaquealcanzanatemperaturaseleccionada.
4 1 5
3 6
Figura 15. Esquema de un equipo PSE: 1, depsitos de disolvente; 2, bomba; 3, depsito de N2; 4, horno; 5, celda de extraccin; 6, vial colector.
La extraccin puede ser: i) esttica, en la que se inyecta el disolvente, se mantiene enlaceldaduranteeltiempoprogramadoydespussevacalaceldarecogiendoelextracto en un vial mediante una corriente de N2, repitiendo este proceso cuantasvecesse programe o, ii) dinmica, en la que en cada ciclo se aade ms disolvente fresco, sin vaciar la celda hasta el final del proceso de extraccin. En el trabajo realizado sobre la determinacin de grasaenlecheenpolvosehautilizadoextraccinesttica.
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3 2 1 7
Figura 16. Celda de un equipo PSE preparada para la extraccin. 1, rosca; 2, fritado metlico; 3, filtro de papel; 4, muestra mezclada con material inerte; 5, material inerte; 6, boquilla de entrada; 7, boquilla de salida.
3.2.Mtodosdeanlisis:modosdemedidaydiseodemontajesexperimentales
Como ya hemos comentado, un mtodo de anlisis comprende una serie de
operaciones. Estas operaciones pueden llevarse a cabo manualmente o mediante montajes experimentales (que en lo sucesivo denominaremos sistemas). Estos sistemas reproducen todo lo que realizara un operador humano, como diluir una muestra, de manera discreta o en modo continuo, tanto fuera de lnea (offline) como en lnea (online). El significado de estosconceptosaplicadosaunmtododeanlisisnosiempreesevidente. Puestoquelaclasificacindelosmtodosysistemassobrepasaelpropsitodeesta introduccin, no profundizaremos ms en las diferencias entre ellos a nivel conceptual, aunque se debe tener encuenta que una cosa esobtener medidas en modo discontinuoo en continuoyotraesrealizarunadilucinounaextraccinfueradelneaoenlnea.Conelfin de una mayor claridad, en adelante hablaremos de mtodos discontinuos cuando las medidas sean en modo discontinuo, y de mtodos continuos cuando las medidas sean en modo continuo. Respecto al proceso de medida debemos tener en cuenta que en esta Tesis
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las medidas se han realizado siempre sobre disoluciones o muestras lquidas y que a esta situacinnosreferiremosenlosucesivo.
3.2.1.Medidasenmododiscontinuo
Como se ha indicado, si las medidas se realizan en modo batch, se obtienen seales puntuales.EnelcasodequeseempleelaespectrometraFTIR(aunquepuedegeneralizarse al empleo de otras tcnicas instrumentales) la medida de una disolucin en batch debe ser invariable con el tiempo (es decir, mientras se registra el espectro) de tal modo que el resultado final consista en un nico espectro que sea promedio de un nmero determinado descansobtenidosconsecutivamentedela mismadisolucin.Elespectroobtenidoseutiliza para cuantificar el analito en la muestra mediante la comparacin con un calibrado preparadoenlasmismascondiciones. Esta estrategia de anlisis es la que inicialmente requiere una menor complejidad tcnica. En este modo de medida, el tipo de transporte de la muestra hasta la celda de medidaeselquepermitemejorarlaeficienciaanalticaothroughput.Eltransportepuedeser manual, mediante dispositivos accionados por un operador humano o mediante equipos robotizados. Estos ltimos son los que permiten la automatizacin de los mtodos en batch (Fifield, 2000). Las operaciones necesarias para llevar a cabo la medida en uno de estos mtodos en batch pueden ser tan simples como rellenar manualmente un vial o colocar una gota de muestra en un cristal de ATR, y tan complejas como las que se realizan automticamenteenlosautoanalizadoresclnicos. Los mtodos con medidas FTIR en batch que implican disoluciones suelen utilizar microceldas de flujo (Figura 17), de manera que una bomba peristltica o dispositivo equivalente introduce la muestra en la celda. Si la medida se realiza con el flujo parado (stoppedflow) es posible acumular un elevado nmero de barridos por espectro y, de esa manera,aumentarlarelacinseal/ruido,mejorandolaprecisin.
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Figura 17. Celda ATR horizontal de flujo de Graseby-Specac. La disolucin circula por un espacio mnimo entre el cristal de ZnSe y la placa metlica superior.
Cuandoseutilizaelmododestoppedflow,elprocesodemedidaeselmismoquesi se realizara el rellenado de la celda manualmente, pero de una forma ms prctica y eficaz. Bsicamente el proceso consiste en introducir disolvente fresco manteniendo el flujo, y tras un tiempo necesario para llenar la celda, se detiene el flujo con el fin de obtener el
background del disolvente. A continuacin se introduce la muestra hasta que sta desplaza
completamentealdisolventedelacelda,sedetieneelflujoysemide.Esteprocesosepuede repetir en un tiempo razonable tantas vecescomo requiera el anlisis. Adems, la velocidad de transporte se puede aumentar incrementando el flujo. Esta estrategia de transporte de la muestra hasta el instrumento FTIR permite reducir el consumo de muestra y disolvente, adems de minimizar las contaminaciones cruzadas al llevar a cabo la limpieza en lnea de la celda y evitar la manipulacin por parte del operador de las muestras y disolventes, muchas veces txicos. La aspiracin a travs de la celda favorece un menor consumo y suponeunmenorefectomemoria.Adems,lautilizacindemicroceldassuponeunmenor volumendemuestraydisolventeconsumidoyderesiduosgeneradosduranteelanlisis. Mtodos con medidas en modo discontinuo son los que se han utilizado en los trabajos de determinacin de grasa en leches en polvo, en el de ATR con celda de diamante y en el de determinacin de tensioactivos en detergentes por ATRmulticonmutacin en
stoppedflow.

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3.2.2.Medidasencontinuo
En los mtodos que utilizan medidas en modo continuo, la concentracin del analitosemidesininterrumpirunflujodelquido(ogas).Existenmuchostiposdemtodos continuos de anlisis; los dos ms importantes son los FIA, flow injection analysis, y SIA,
sequential injection analysis. Las diferencias entre ambos son diversas y no profundizaremos
ms en stas, puesto que en esta Tesis se han utilizado mtodos FIA o variantes ms o menoscercanasalaideadelFIA. Segn la definicin de Rika y Hansen (Rika, 1981) un mtodo FIA est basado en la inyeccin de una muestra lquida en una corriente de flujo no segmentado de un lquido adecuado. La muestra inyectada forma una zona, que es transportada hacia un detector que registra continuamente la absorbancia, potencial de electrodo, o cualquier otro parmetro fsico, mientras se modifica continuamente como resultado del paso del material de la muestra a travs de la celda de flujo. La tcnica se basa en una combinacin de inyeccin de muestra, dispersin controlada y cronometraje. En una revisin ms moderna, Fang define el FIA como una tcnica no cromatogrfica de anlisis cuantitativo en flujo, llevada a cabo mediante la manipulacin reproducible de las zonas de muestra y reactivos enunacorrientedeflujobajocondicionesdenoequilibriotermodinmico(Fang,1993).Esta definicin referida al equilibrio nos lleva a tratar, de manera ms general, los mtodos de anlisis en flujo (FA). Este tipo, que engloba todos los mtodos continuos, implica el uso de unportadorocarrierquellevalamuestrahastaeldetector(Figura18). A las ventajas de los mtodos de stoppedflow frente a los mtodos en batch manuales cabe aadir para los de anlisis en flujo una mayor versatilidad, tiempos de transportereducidosyunconsumominimizadodemuestrayreactivos.
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M C
A R D
Figura 18. Esquema del montaje FA ms simple. B: Bomba peristltica; A: disolvente portador o carrier; R: reactivo (puede no ser necesario); M: inyector de la muestra; C: coil de reaccin o mezcla; D: detector; W: desechos.
3.2.3.Multiconmutacin
Como ya hemos mencionado en la seccin anterior, un sistema de anlisis en flujo configurado con una vlvula entendiendo configuracin como la disposicin fsica de los elementos del montaje experimental tiene dos estados posibles en los que el flujo se conduceporuncaminouotro(conmutacin)dependiendodelprocesoquerequieraencada momento el mtodo de anlisis (insercin de muestra o patrn, mezcla con reactivos, etc...). EnlaFigura19sedescribedemanerasimpleunsistemadeestetipo.
a) IN1 IN2 OUT
b) OUT1 IN OUT2
Figura 19. Representacin de las configuraciones posibles para sistemas con una nica vlvula (conmutacin): a) sistema con dos entradas alternativas (IN1, IN2) y una salida (OUT); b) sistema con una entrada (IN) y dos salidas alternativas (OUT1, OUT2). Las entradas o salidas pueden ser individuales pero no simultneas.
Enelcasodelossistemasdeanlisisenflujoconvencionaleselcambiodeestadoes puntual,estoes,cadavlvulaesaccionadaunasolavezencadaetapadelprocesoanaltico. Esta caracterstica limita las posibilidades operativas de estos sistemas, porque no se puede
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reconfigurar el sistema sin modificarlo fsicamente, o lo que es lo mismo, hay que quitar o aadir elementos o cambiar la conectividad entre ellos. Sin embargo, el uso de vlvulas controladas electrnicamente mediante un software especfico, con tiempos de respuesta muy pequeos (ms) y con gran precisin, permite la reconfiguracin del sistema en tiempo real. Si cada vlvula origina dos estados diferentes, n vlvulas dan lugar a 2n estados, propiedad del sistema que se denomina multiconmutacin (Rocha, 2002). sta ha sido definida como una red analtica que implica la actuacin sobre la muestra de n dispositivos activos (o n operaciones con un nico dispositivo), originando 2n estados. La multiconmutacin es una propiedad inherente a los sistemas de anlisis en flujo que presentan muchos estados. La aplicacin del concepto de multiconmutacin a los mtodos deanlisissehadesarrolladoprincipalmenteenBrasil,delamanodelosprofesoresF.P.B. RochayB.F.ReisdelaUniversidaddeSaoPaulo(Rocha,2002). La diferencia entre un sistema de anlisis en flujo y uno con multiconmutacin es muchas veces muy sutil, y no se refiere tanto a la utilizacin de varias vlvulas como a la capacidad del sistema para realizar gran cantidad de procesos propios de los mtodos analticos como puedan ser: diluciones, adiciones de patrn o reactivos sin necesidad de desmontar el sistema para reconfigurarlo de nuevo manualmente. Por esta razn, un sistema que disponga de muchas vlvulas puede que no implique multiconmutacin mientras que otro con una nica vlvula s puede hacerlo, cuando sta se utilice para realizarvariasoperacionesdiferentes. Consideremos a modo de ejemplo el sistema descrito en la Figura 19. Existen dos estados posibles: un estado en el que la entrada de flujo se produce por la va IN1 y un estado en el que la entrada de flujo se produce por la va IN2. En un sistema de anlisis en flujo convencional, la activacin de la vlvula mantiene uno de los estados (p. ej, la entrada IN1 abierta) durante un tiempo dilatado; en cambio en un sistema con multiconmutacin se puede cambiar de estado rpidamente: podemos activar la vlvula durante dos segundos,
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desactivarla durante medio segundo, repetir el proceso cuantas veces sea necesario y cambiarlostiemposdeactivacindelavlvulasintocarelsistema. De esta manera, una muestra puede ser sometida a diversas operaciones, como puedanserelmezcladoconunreactivoounestndarounadilucincon disolvente,siendo la vlvula solenoide de tres vas (Figura 20) el dispositivo fundamental ms utilizado con este fin, aunque tambin se puede disponer de otros elementos vlidos como son las microbombasyvlvulasdeotrostipos.
Figura 20. Vlvula solenoide de 3 vas.
En la vlvula de tres vas, que es la que se ha utilizado en esta Tesis, el flujo es conducido por una salida u otra dependiendo de si existe o no paso de corriente elctrica a travs de un solenoide (Figura 21). ste acta atrayendo un pistn que cierra una de las salidas mientras abre la otra. Cuando hay paso de corriente se dice que la vlvula se encuentraenergizada,ysinolohaysedicequeestdesenergizada. La vlvula solenoide se controla desde un PC mediante el software adecuado, habitualmente programado en lenguaje Basic. El PC se conecta a una placa electrnica que contieneloselementosnecesariosparaconvertirlaintensidadyvoltajedelacorrienteenlos adecuados para que se activen las vlvulas solenoides conectadas a la misma al recibir la seal elctrica procedente del PC (Figura 22). La conexin entre el PC y la placa se realiza a travs de un puerto, p. ej. el de la impresora. A la vlvula desenergizada le corresponde el
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valordebit0,yalavlvulaenergizada,elvalordebit1.EnelApndiceIsetrataconmayor profundidad el software utilizado en los trabajos de multiconmutacin desarrollados en esta Tesis. Como se ha mencionado anteriormente, las vlvulas solenoides de tres vas tienen tiemposderespuestadems,loquepermitelamodificacindelestadodelsistemaentiempo real. En cuanto a la precisin en su funcionamiento, se pueden programar tiempos de insercin tan pequeos como 0.1 s sin encontrar problemas de repetibilidad, tiempos que suponen, considerando la posibilidad de utilizar caudales muy bajos, volmenes de insercindelordendeL.
A)
p e
f0
B)
f1
Figura 21. Esquema del funcionamiento de la vlvula solenoide de 3 vas configurada como una entrada fija y dos posibles salidas. A) Vlvula desenergizada o de bit 0, donde r es la entrada de corriente; s el solenoide; p el pistn de cierre; e la entrada del flujo; f0 la salida para bit 0. B) Vlvula energizada o de bit 1, siendo f1 la salida del flujo en este estado.
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3 5 2 1 4
Figura 22. Placa de un sistema de multiconmutacin que permite controlar hasta seis vlvulas solenoides. 1: entrada de corriente de 12 V proveniente de la fuente de alimentacin; 2: resistencias; 3: chip; 4: leds indicadores; 5: conexin de las vlvulas (dos en este caso); 6: cable conectado al puerto de impresora.
A continuacin veremos el fundamento de las operaciones que permiten llevar a cabo los sistemas con multiconmutacin. En la Figura 23 se describe el esquema de un sistema que permite la dilucin en lnea de la muestra con una nica vlvula solenoide. Si activamos la vlvula (bit 1) durante un tiempo determinado (tm), la muestra es insertada en el sistema y su volumen ser proporcional a ste. Como en el estado en el que la vlvula se encuentra desenergizada (bit 0) es el portador el que circula por el sistema, el volumen de muestra ser insertado entre dos volmenes de portador. Estos pequeos volmenes se denominan slugs. Si se repite el proceso de insercin de slugs de muestra entre slugs de portador, se consigue la mezcla de la muestra con ste. La causa de la mezcla es la dispersinaxial.staseproducealolargodetodoelsistemaysuefectoesgarantizadopor el coil de longitud adecuada para conseguir una mezcla completa. El resultado de este proceso en tndem es la dilucin de la muestra con el carrier. Sin embargo, la concentracin delamuestraservariablealolargodelsistemaenuntiempodeterminado,loqueserefleja enelregistrodelasealfrentealtiempo.
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Captulo I: Introduccin M
A
V
B D R C W
tm tc1 tc2
R3
R2
R1
E
seal
R1
R2
R3
tiempo
Figura 23. Dilucin en lnea mediante un sistema con multiconmutacin. A) Montaje: M, muestra; C, carrier; V, vlvula solenoide de tres vas; B, bomba peristltica; R, coil; D, detector; W, desechos. B) Esquema de los tiempos de insercin de muestra tm (azul) y carrier tc1; tc2 se refiere al tiempo de carrier entre cada una de las tres rplicas, consistiendo cada rplica en un nmero igual de slugs con idnticos tiempos de insercin. La flecha indica la direccin del flujo. C) Perfil de slugs correspondiente a las tres rplicas. D) Representacin de la distribucin de la muestra cuando la mezcla es completa para cada rplica. E) Registro de la seal frente al tiempo correspondiente a las tres rplicas.
El mezclado ser ms eficaz cuanto mayor sea el nmero de slugs (n) y cuanto ms pequeos sean stos, puesto que existen 2n1 superficies de contacto entre los slugs que facilitarn la mezcla. La ventaja respecto a otros sistemas de flujo sin multiconmutacin
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reside en que el mezclado se inicia desde el primer paso, sin que afecte a la eficiencia del anlisis (Rocha, 2002).Estaestrategia de dilucin en lnease ha utilizadoen los tres trabajos demulticonmutacinincluidosenlapresenteTesis.Conesteprincipiodemezclaentndem se puede plantear un calibrado externo o una adicin estndar en lnea utilizando dos vlvulasdetresvas,conunanicadisolucinstockdepatrn,muestraoriginalycarrier.Las ventajas en cuanto al ahorro de tiempo, manipulaciones y contaminacin, adems de la sensiblemejoradelarepetibilidadyreproducibilidadsonevidentes.
3.3.Acoplamientoconlastcnicasvibracionales
Como ya hemos visto anteriormente, las tcnicas vibracionales de FTMIR y FT NIR presentan algunos problemas a la hora de la obtencin de las medidas, en funcin de las caractersticas fsicas de la muestra utilizada y la forma de transportar sta al espectrmetro de FT. Veremos a continuacin cules son estos problemas y cmo pueden solucionarse. En el caso ms simple de medidas por Transmitancia, que es el de los trabajos de estaTesisquehanempleadomedidasenstoppedflow,losinconvenientesserefierena: i)laintegridaddelcaminoptico,esdecir,quelaceldaselleneynohayaburbujas cuandoserealicelamedidaenflujoparadoy, ii) las distorsiones del espectro causadas por las diferencias en el ndice de refraccindelasdisolucionesqueatraviesanlacelda. Ambos problemas se solucionan apropiadamente teniendo la precaucin de llenar la celda desde la parte inferior y seleccionando el material de las ventanas de la celda y el
carrier.
En el caso de las medidas por Transmisin en la regin del NIR, adems de los problemas citados arriba hay que tener especial cuidado con los cambios de temperatura. Las bandas de absorcin pueden aumentar o disminuir de intensidad de manera
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considerable en funcin de la temperatura (Kemeny, 1992). Los equipos FTNIR suelen incluirunportamuestrastermostatizadoconobjetodeevitarlasvariacionesdetemperatura entre muestras y patrones cuando se realizan las medidas. Si el sistema es de flujo y se realizan medidas en continuo, es recomendable termostatizar todo el sistema o, en su defecto,asegurarsedequenoseproducencambiosdetemperaturaalolargodeste. Respecto de los mtodos con medidas en continuo por Transmisin, si bien el acoplamiento con la espectrometra FTIR no resulta excesivamente complejo, no est exento de limitaciones que exigen tomar una serie de precauciones. Primero, por la baja sensibilidad de la tcnica en s misma. Cada punto del registro de la seal frente al tiempo debe ser obtenido como promedio de varios scans. Una mayor resolucin temporal implica un menor nmero de scans acumulados, con lo que la relacin seal/ruido empeora. En segundolugar,porelefectonegativoqueproducecualquierburbujaqueatravieselamicro celda de flujo. Estos problemas se minimizan escogiendo bandas de absorcin del analito que sean muy intensas y corregidas con una lnea base adecuada, y utilizando caudalesque noproduzcansobrepresionesenelsistema.Enlaprctica,esdifcilaplicarambassoluciones satisfactoriamente.Esenesteaspectoenelquedebeincidireldiseoypuestaapuntodelos mtodosdeanlisisenflujocomolosquehansidodesarrolladosenestaTesis. Por otra parte, las medidas por ATR en modo discontinuo sufren de los mismos problemas de sensibilidad que las medidas por Transmisin. Adems, en este caso hay que utilizar disolventes que no sean muy voltiles o controlar su evaporacin para que no vare la concentracin de analito en la superficie del cristal mientras se estn realizando las medidas. Este problema se solventa con el uso de celdas ATR de flujo y con la medida en modo stoppedflow o, en el caso de los accesorios ATR de diamante, mediante anillos metlicos que mantienen la integridad de la gota de lquido analizado gracias a la tensin superficial de ste. Tambin hay que controlar los cambios de temperatura por la variacin deintensidaddelasbandasdeabsorcin. Respecto a los dispositivos utilizados para conseguir el flujo de lquido, ya sea en mtodosdestoppedflowcomoenlosdeFIAymulticonmutacin,enlapresenteTesissehan
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utilizado bombas peristlticas como la que puede verse en la Figura 24. Proporcionan caudalesaproximadamenteconstantesenunampliointervalodevalores,tpicamentede0.1 a 10 mL min1. Se pueden utilizar para impulsar el lquido o para succionarlo, siendo preferida la segunda modalidad pues reduce la presencia de burbujas en el sistema y requiere un menor volumen de disolucin en el caso de realizar las medidas en modo
stoppedflow.Labombaactamediantelapresinqueejercenunoscilindrosrotatoriossobre
un tubo elstico; este movimiento peristltico produce la aspiracin o impulsin del lquido a travs del tubo. Con disoluciones acuosas pueden utilizarse tubos de PVC. Si el portador es un disolvente orgnico como el cloroformo, hay que tener la precaucin de utilizartubosespeciales(Viton),pueslostubosdePVCsonatacadosporeldisolvente.
Figura 24. Bomba peristltica Minipuls 2 de Gilson.
El acoplamiento de las tcnicas FTMIR y FTNIR con sistemas en flujo permite la realizacin de adiciones estndar y extracciones en lnea. Una adicin estndar en lnea se consigue adicionando pequeos volmenes de disolucin patrn a un flujo de muestra constante.Deestamanerasereduceconsiderablementeeltiempodeanlisis.Porotraparte, laextraccinenlneasellevaacabohaciendocircularcclicamenteatravsdelamuestraun volumen determinado del disolvente adecuado. Si la disolucin pasa por la celda de medida, puede seguirse el proceso de extraccin registrando la seal correspondiente al analito. As se evita la manipulacin offline de la muestra que suele ser causa de contaminacionesyerrores.
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Desde el trabajo pionero de Curran y Collier en el que se utilizaba un espectrmetro dispersivo acoplado a un sistema FIA para la determinacin de fenil isocianato a 2270 cm1 utilizando CCl4 como carrier (Curran, 1985), el empleo del anlisis en flujo y la espectrometra IR como tcnica de deteccin ha ido en aumento. En el mismo ao en que apareci el trabajo mencionado, Morgan et al publicaron un artculo sobre la determinacin del octil sulfocianato utilizando una mezcla de etanol y agua como portador (Morgan,1985). ElprimertrabajoenelqueserecurriaunequipoFTIRacopladoaunsistemaFIA secentrabaenelestudiocualitativodeladescomposicindelxidodealildiidopropilamina en un capilar, con la peculiaridad de que el portador era un fluido supercrtico (Olesik, 1986). Un par de aos despus, Miller et al determinaron succinilcolina en disoluciones acuosasdeproductosfarmacuticos(Miller,1988).EltrabajodeGuzmnetalsobremezclas sintticas de etanol, acetona y tetrahidrofurano, en el que se introduca la regresin por mnimos cuadrados parciales (PLS) como estrategia de calibracin, abri nuevas posibilidades al acoplamiento FIAFTIR aplicado al anlisis multicomponente (Guzmn, 1991). El primer trabajo conocido en el que se aplic el FIAFTIR al anlisis de muestras reales propona la determinacin de oxileno en xilol utilizando hexano como carrier (de la Guardia, 1992). Este mismo grupo de investigacin de la Universidad de Valencia continu ampliando con xito las aplicaciones de la tcnica FIAFTIR para la determinacin de diversos analitos en matrices muy variadas dedicacin que se mantiene a da de hoy, como disolventes (Garrigues, 1992), gasolina (de la Guardia, 1993; Gallignani, 1993; Gallignani, 1994a; Gallignani, 1994b), especialidades farmacuticas (Garrigues, 1993a; Garrigues,1993b;Bouhsain,1996),bebidasalcohlicas(Gallignani,1994c;Gallignani,1994d) yrefrescos(Daughbouche,1997,Bouhsain,1999). Por otra parte, desde mediados de los aos 90 un grupo de investigacin perteneciente a la Universidad de Viena ha promovido el desarrollo de nuevas aplicaciones yvariantesdelFIAFTIR,principalmenteorientadohaciaproblemasdecarcterbioqumico,
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como la determinacin enzimtica de sacarosa (Lendl, 1995), el uso de un lser de cascada como fuente de radiacin en el MIR (Lendl, 2000), la cuantificacin de iones metlicos en muestras acuosas (PrezPonce, 2000), el uso de sensores en flujo (Lendl, 1999), aplicaciones clnicas (Rosemberg, 1994; Lendl, 1998; Krieg, 1996), medida de actividades enzimticas (Lendl, 1998; Krieg, 1996; Vonach, 1998; Schindler, 1999; Schindler, 1997; Schindler, 1998; Schindler, 1998b), determinacin de azcares (Schindler, 1998; Schindler, 1998b; Le Thannh, 2000;AyoraCaada,2000;Schindler,1998c;Lendl,1997;Kellner,1997;Schindler,1998d)yel acoplamientoHPLCFTIR(Vonach,1998b;Vonach,1997),entreotros. Un ejemplo ilustrativo de las posibilidades que plantea el acoplamiento del anlisis en flujo con la espectrometra FTIR como tcnica de deteccin es el trabajo de Vonach et al sobre la determinacin directa de fosfato en bebidas. Dos alcuotas de la muestra se mezclan con dos tampones de pH diferente y se obtienen los espectros correspondientes. La diferencia de los espectros obtenidos a los dos pH permite la cuantificacindelfosfatoenlamuestra(Vonach,1997b). El empleo de fases vapor para su anlisis por espectrometra IR ha supuesto tambin un importante desarrollo del anlisis FIAFTIR. Ejemplos de aplicaciones con generacin de fase gas (FIAVPGFTIR) son la determinacin de etanol en cloroformo comercial (LpezAnreus, 1995) y la generacin de hidruros (FIAHGFTIR) (Gallignani, 2002),quedemuestranlagranversatilidaddelaespectrometraFTIR. En los dos ltimos aos han sido publicados diversos trabajos orientados hacia el acoplamiento FAFTIR y otras estrategias encaminadas hacia la automatizacin del anlisis porespectrometraFTIR,tantoenfasegascomoenfaselquida.EneltrabajodeCoelhoetal (Coelho, 2006), se determina el nitrgeno en formulaciones de protenas hidrolizadas mediante la tcnica VGFTIR. Otro trabajo interesante es el de Cankur et al (Cankur, 2005), en el que los autores desarrollan un nuevo mtodo para la determinacin de Pb mediante FIAHGFTIR.Gallignanietalhanlogradoladeterminacindeetanolenbebidasalcohlicas mediante FIAFTIR. En este caso, el mtodo implica una extraccin en lnea lquidolquido con cloroformo, empleando una celda del tipo sandwich con una membrana de PTFE
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(Gallignani, 2005). Wei y Yang (Wei, 2005) proponen un mtodo para la deteccin de compuestos orgnicos voltiles en disolucin acuosa que requiere la separacin de stos en una fibra hueca porosa de polipropileno, en contracorriente. En el trabajo de AlAlawi et al se propone un mtodo automatizado para la determinacin de cidos grasos libres y humedad en aceites (AlAlawi, 2006). Por otra parte, se ha continuado con la lnea de investigacin de nuestro grupo relativa al desarrollo de mtodos de anlisis automatizados. Ejemplos de este esfuerzo son los trabajos publicados sobre la determinacn de buprofezin en formulaciones de pesticidas (Armenta, 2005a), en el que se utiliza acetonitrilo como disolvente, y sobre la determinacin de diuron (Armenta, 2005b), con cloroformo como disolvente. EnelcasodeldesarrollodemtodosATRFTIR,recientementehansidopublicados algunos artculos como el de Lucena et al (Lucena, 2006), en el que se propone un mtodo SIAATRFTIR para la monitorizacin de los niveles de surfactante y grasa en los baos desengrasantesutilizadosenlaindustriametalrgica. Aspues,labsquedademtodosanalticosbasadosenlaespectrometraFTIRpor transmisin y ATRFTIR, acoplados con sistemas de flujo o en lnea que pueden permitir unaautomatizacinsencilla,siguesiendonecesariaenelcampodelanlisiscuantitativo.
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4.Elpapeldelaespectrometravibracionalenelcontroldecalidad
El proceso de fabricacin de un producto est sujeto a la posibilidad de errores o modificaciones fraudulentas de su composicin. Por este motivo, se hace necesario comprobar antes de su comercializacin la calidad del producto fabricado. Y es en este punto donde se recurre a mtodos de anlisis qumico que tienen como fin determinar si el productocumpleconlasespecificacionestcnicascorrespondientes. Las caractersticas deseables en un mtodo de anlisis cuyo objetivo sea el control decalidadsonlassiguientes: 1.Sensibilidadyprecisinconformelosrequisitosdelproducto. 2.Rapidez. 3.Bajocoste. 4.Fcilautomatizacin. 5.Mnimoconsumodemuestraygeneracinderesiduos. La espectrometra FTIR es una tcnica de anlisis que presenta ventajas y desventajasrespectodesuusoenelcontroldecalidadfrenteaotrastcnicas.Porunlado,es una tcnica poco sensible, loque la convierte en poco adecuada para el anlisis de muestras con contenidos de analito a nivel de traza. Sin embargo, no suele ser la situacin de los principios activos de gran nmero de productos. Ejemplos de este hecho son los analitos determinados en los trabajos de esta Tesis: tensioactivos en formulaciones de productos de limpieza, un pesticida en una formulacin fitosanitaria, benceno en gasolina, un principio activo en una especialidad farmacutica, grasa en leche en polvo. Todos estos analitos se encuentran en concentraciones del orden de porcentaje, de manera que la escasa sensibilidad de la tcnica vibracional no representa un problema. Incluso esta baja sensibilidad no es un obstculo insalvable a la hora de determinar analitos como pesticidas enaguas(methidathion,tricyclazole),puestoquesepuedepreconcentrarelanalitofcilmente, comohemosdemostradoenlostrabajoscorrespondientes.
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La precisin de los resultados obtenidos por la espectrometra FTIR puede ser perfectamente aceptable en este campo de aplicacin. En cuanto a la rapidez en el anlisis, yasehacomentadoqueunscanpuedeobtenerseen1s,loquesuponeaproximadamente0.5 min para un espectro tpico de 8 cm1 de resolucin obtenido acumulando 25 scans. Si comparamos estos valores con el tiempo necesario para obtener un cromatograma (del orden de 510 min), la etapa de medida resulta muy rpida en un mtodo FTIR. Por otra parte, un equipo FTIR resulta econmico puesto que apenas tiene mantenimiento en comparacinconunequipodeHPLC. En cuanto a la automatizacin, los sistemas de anlisis en continuo, especialmente los que explotan la multiconmutacin, pueden ser acoplados con la espectrometra FTIR y permiten desarrollar procesos automatizados de manera muy sencilla, aunque esta ventaja no es exclusiva de esta tcnica. Estas mismas estrategias de anlisis en flujo consiguen reducir el consumo de muestra y reactivos y consecuentemente, minimizan la generacin de residuos cuando no los eliminan completamente, como son los casos de anlisis directo de muestras mediante ATR y NIR (en vial), que presentan la potencialidad de ser tcnicas nodestructivas. Noobstante,laespectrometraFTIRaplicadaalcontroldecalidadtieneunaventaja insoslayable: la naturaleza del fenmeno vibracional de la absorcin de la radiacin que proporciona una gran cantidad de informacin sobre las caractersticas qumicas de la muestra, caracterstica de la que carecen la mayor parte de las tcnicas de anlisis que pueden aplicarse al control de calidad. Esta ventaja se utiliza en la prediccin de propiedadesdeproductosdelaindustriapetroqumica,porejemplo(Macho,2002).
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5.Anlisismedioambientalmentesostenible
La tendencia hacia el desarrollo de procesos y actitudes compatibles con el respeto al medio ambiente en el mbito de la Qumica Analtica ha sido constante en los ltimos aos, dentro del concepto denominado qumica verde o Green Chemistry. Con esta denominacinseabarcaunaseriedeprcticasallevaracaboenlosprocesosfsicoqumicos engeneral,quelaEPAresumeen12principiosbsicos(EPA,principles): 1.Minimizarresiduos. 2.Disearcompuestosyproductossegurosparaelmedioambiente. 3.Disearsntesisqumicasmenospeligrosas. 4.Utilizarmateriasprimasrenovables. 5.Utilizarcatalizadoresynoreactivosestequiomtricos. 6.Impedirlaformacindederivados. 7.Minimizarelgastodereactivos. 8.Utilizardisolventesinocuosycondicionesdereaccinmssuaves. 9.Incrementarlaeficienciaenergtica. 10.Disearproductosycompuestosqumicosdegradablestrassuuso. 11.Anlisisentiemporealparaevitarcontaminaciones. 12.Minimizarelpotencialdeprovocaraccidentesdelosprocesosqumicos. En este mbito tambin se emplea el trmino medioambientalmente sostenible aplicadoalanlisisqumico,enelsentidodequelaprcticadelprocesoqumicoofsicosea asumible por el entorno sin sufrir perjuicios insalvables. En cualquier caso, ambos trminos estn estrechamente relacionados, siendo ms radical el de Green Chemistry. Podemos decir que el mtodo de anlisis ideal debera ser limpio, sin producir desechos ni consumir reactivos o disolventes txicos o nocivos.En la prctica, resulta muy difcil cumplir siquiera una nica recomendacin de la EPA. Existen tcnicas que permiten el anlisis directo o no destructivo, pero que requieren gran energa o producen radiaciones ionizantes mientras que otras utilizan grandes cantidades de disolventes y generan muchos residuos. La
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generacin de residuos en el anlisis qumico tiene mayor importancia de lo que pudiera parecer en un principio. Los procesos ms especficos, como el anlisis qumico, producen mayor cantidad de residuos proporcionalmente, que las industrias tradicionalmente consideradasmscontaminantes(Tabla4).
Industria Petroqumica Productos qumicos Qumica fina Farmacutica Residuos (toneladas) 106-108 104-106 102-104 10-103 Ratio kg subproductos/ kg producto <0.1 1-5 5-50 25-100
Tabla 4. Residuos generados en las actividades de la industria qumica (Sheldon, 1997).
El principal desafo de la espectrometra FTIR en el campo de la Green Chemistry es la reduccin o eliminacin de los disolventes tradicionalmente empleados en las medidas por Transmitancia. stos sondisolventes orgnicos, con frecuencia txicos y nocivos para el medio ambiente. Destacan el disulfuro de carbono CS2, el cloroformo CHCl3, diclorometano CH2Cl2 y el tetracloruro de carbono CCl4. Los halocarbonados se encuentran entre los compuestos orgnicos que contribuyen a la degradacin de la capa de ozono, por lo que el Convenio de Viena para la Proteccin de la Capa de Ozono y el Protocolo de Montreal los incluyen dentro de las sustancias cuyo consumo tiene que eliminarse o ser reducido hasta nivelesmnimos(ProtocoloMontreal,2000). A la dificultad de encontrar un disolvente adecuado para una sustancia determinadaseaadeportantolanecesidaddeevitarelusodesustanciaspeligrosasparael medio ambiente, incluido el analista. En el caso del CCl4 y CS2, su gran toxicidad recomienda su eliminacin de los mtodos de anlisis FTIR. Disolventes menos peligrosos como el CHCl2 y CHCl3 deberan ser utilizados en cantidades mnimas. Esto se puede conseguirmediantelaaplicacindelasestrategiasdeanlisisencontinuoyamencionadasy
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el reciclaje de los disolventes. Por otra parte, el uso de las tcnicas FTIR que permiten el anlisisdirectodemuestrasacuosaspormedidasATRresultaespecialmentecompatiblecon laideadeanlisismedioambientalmentesostenible.
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6.AntecedentesdelaTesis
La espectrometra FTIR ha experimentado un importante desarrollo en los ltimos aos. En la Figura 25 se puede observar la tendencia entre los aos 19922005 para el nmero de artculos publicados sobre esta tcnica de anlisis. La bsqueda se ha realizado mediante la base de datos ERL WebSpirs 5, introduciendo en cada caso como criterio de bsqueda ((FTIR in AB)) and (PY: ANAB= ao). Esta bsqueda, aunque no sea completa ni muy precisa, es representativa del volumen total de trabajos que utilizan la espectrometra vibracional por Transformada de Fourier como tcnica de anlisis cuantitativo. En este sentido,puedesertilparaconocerelestadoactualylasperspectivasdedesarrollodeestas tcnicasdurantelosprximosaos,enelcampodelanlisisqumico. ElnmerodeartculospublicadosqueaparecenutilizandoFTIRcomocriteriode bsqueda pas de 149 trabajos en el ao 1992, a un mximo en el ao 1999 (231 trabajos), principalmente debido a la comercializacin de nuevos equipos FTIR ms econmicos. A partir de ese ao, la produccin parece haber disminuido de manera importante, posiblemente por los problemas intrnsecos de la espectrometra FTIR como tcnica de anlisis, es decir, las dificultades de encontrar disolventes adecuados y su baja sensibilidad. Es en este punto donde se hace evidente la importancia de los trabajos presentados en la presente Tesis,que tiene entre sus objetivos la ampliacin de las aplicaciones de las tcnicas vibracionales en el anlisis cuantitativo. En este sentido cabe destacar la contribucin de nuestro grupo de investigacin, que en el periodo (19962005) ha publicado ms de 51 trabajosenestecampo. En el caso de los mtodos FTNIR, el nmero de trabajos publicados pas de 6 en 1997 a 9 en 2005, que hacen un total de 59 trabajos encontrados en este periodo bajo el criterio de bsqueda ((FTNIR in AB)) and (PY:ANAB= ao). Sin embargo, el nmero de trabajos que aparecen bajo el criterio de bsqueda ((NIR in AB)) and (PY:ANAB= ao) es de 1345, siendo 20 veces mayor que el obtenido con el otro criterio de bsqueda,
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probablemente debido a que el uso de equipos de Transformada de Fourier no representa grandesventajasenlamayoradeaplicacionesenlaregindelNIR.

FTIR
250
artculos publicados
200
150
100
50
0
1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
aos
Figura 25. Evolucin del nmero de artculos publicados, segn los datos obtenidos de la base de datos WebSpirs, utilizando en el criterio de bsqueda (Concept): FTIR.
Finalmente, slo aparecen 42 trabajos en el periodo 19922005 para el criterio de bsqueda ((ATRFTIR in AB)) and (PY:ANAB= ao), frente a un total de 419 trabajos sobre tcnicas de ATR en general, que responde a la bsqueda ((ATR in AB)) and (PY:ANAB=
ao).
Comosededucedeestosdatos,existeunvacoimportanteencuantoaaplicaciones FTNIR y ATRFTIR en el anlisis qumico. En este contexto se enmarcan los trabajos que formanpartedeestaTesisDoctoral.
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Captulo II: Objetivos
II.Objetivos
La Espectrometra FTlR, tradicionalmente empleada en el anlisis cualitativo, se ha convertidoenunatcnicadeenormeutilidadenelanlisiscuantitativodebidoalempleode celdas de lquidos, al acoplamiento de anlisis en flujo y el empleo de mezclas de disolventes lo cual ha ampliado el nmero de especies solubles, la determinacin simultnea de varios componentes y la generacin de fases vapor. A este desarrollo ha contribuido en buena medida nuestro grupo de investigacin dentro del Departamento de QumicaAnalticadelaUniversitatdeValncia. El desarrollo de mtodos de anlisislimpios o medioambientalmente sostenibles tambin ha sido una preocupacin en este grupo de investigacin, con la puesta a punto de metodologasanalticasquereducenelempleodereactivosoloseliminancompletamente. El presente proyecto de Tesis supone aunar ambas lneas de actuacin: mejorando y ampliando las aplicaciones analticas de la Espectrometra vibracional en el anlisis cuantitativo, y contribuyendo a reducir los riesgos y efectos nocivos que sta genera como consecuencia de su mayor utilizacin, mediante el desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles. Por otra parte, la necesidad de mtodos de anlisis rpidos y de bajo coste aplicables al control de calidad de productos industriales sugiere la puesta a punto o adaptacin de los mtodos FTIR ya existentes con la finalidad de su utilizacinenelanlisisderutina. ElobjetivoprincipaldelproyectodeestaTesisDoctoraleseldesarrollodemtodos de anlisis por espectrometra vibracional (FTMIR y FTNIR) orientados hacia el control de calidad, esencialmente de un nico analito para cada tipo de producto, que impliquen un consumomnimodedisolventesnocivos,queresultenrpidosyquepuedanautomatizarse fcilmente.Esteobjetivosepretendelograratravsde: 60
i)Lareduccindedisolventeconsumido,mediante: a) Anlisis directos por tcnicas de reflectancia (ATR) que eviten la manipulacindelamuestra. b)Lautilizacindesistemasdeextraccin/preconcentracinenlnea. c) El uso de estrategias de anlisis como el anlisis en flujo y la multiconmutacin. ii) El empleo de fases acuosas en sustitucin de los disolventes orgnicos tradicionalesdetipocloradoyelanlisisdirectodemuestrasacuosasporATR. iii)Labsquedadedisolventesalternativos. iv)Desarrollodeestrategiasparaeltratamientoenlneadelasmuestras. Esta Tesis se divide en cuatro partes, de acuerdo con las caractersticas de los trabajosrealizadosyquesehanincluidoenestamemoria: 1. Anlisis directo por ATRFTMIR con celda de diamante: determinacin de nitriloacetatosdicoendetergenteslquidosdepHelevado. 2. Mtodos de anlisis por espectrometra vibracional empleando
multiconmutacin: 2.1.Determinacindeolefinsulfonatosdicoendetergenteslquidospor ATRFTMIR. 2.2.DeterminacinFTMIRdebencenoengasolina. 2.3.DeterminacinFTNIRdehexythiazoxenformulacionesfitosanitarias. 61
Captulo II: Objetivos
3.MtodosFTMIRconextraccinpreviadelanalito: 3.1. Determinacin de methidathion y tricyclazole en aguas con preconcentracinmedianteSPEyposteriorelucinenlnea. 3.2. Determinacin de grasa en leche en polvo, empleando la extraccin PSE. 4.MtododeanlisisFTMIRconextraccinenlnea:determinacindesuccinato dedoxilaminaenespecialidadesfarmacuticasconextraccinenlnea. 62
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Captulo III: Resumen
III.Resumendelostrabajosydiscusinderesultados
En esta seccin trataremos cada uno de los cinco artculos ya publicados y los dos artculospendientesdepublicacinqueformanlapartecentraldeestaTesis.
1. Anlisis directo por ATRFTIR con celda de diamante: determinacindeNTAendetergentes

INTRODUCCIN La comercializacin de accesorios ATR de diamante ha supuesto un paso importante en el anlisis directo de muestras por espectrometra FTIR (Coates, 2000). Esta tcnica FTIRATR con celda de diamante se ha aplicado con xito a diversos tipos de analitos en matrices varias, como puedan ser la determinacin de glucosa y cido poli beta hidroxibutrico en Escherichia coli (Jarute, 2004), pesticidas en aguas (Colume, 2004), discriminacin espectroscpica de bacterias (Winder, 2004), determinacin de alcaloides en productos vegetales (Schulz, 2004), glucosa en micromuestras evaporadas (Diessel, 2004), estudio de intermedios metablicos (Nakanishi, 2003), y la determinacin de carbohidratos, alcoholes y cidos carboxlicos en vino, tras su separacin mediante HPLC (Edelmann, 2003).Sinembargo,todosestostiposdemuestras,aunsiendomuydiversos,norepresentan mediosagresivosparalasceldasATRclsicas. La idea germen de nuestro trabajo era conseguir la determinacin de un principio activo en formulaciones de detergentes industriales con pH elevados (11) cuya medida fuese incompatibleconlasceldasATRdeZnSe,de maneraquelaprincipalventaja delATR de diamante su extraordinaria resistencia qumica fuese plenamente explotada. El analito es el nitrilotriacetato sdico (NTA), una sustancia empleada como agente quelante en
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productos de limpieza industrial (Knepper, 2003). Esta sal est considerada como potencialmente cancergena y es altamente nociva para los organismos acuticos. El principal inters en el control de esta sustancia en las formulaciones analizadas se debe tantoasupapelactivoenlalimpiezacomoasutoxicidad. Los mtodos para la determinacin del NTA encontrados en las bases de datos incluyen la polarografa (Esser, 2000) y la electroforesis capilar (Owens, 2000), pero en estos trabajos slo se determina en forma de quelantes totales. Para la determinacin directa se hanpropuestomtodoscomolavoltametraderedisolucinandica(Voulgaropoulos,1992; Schoen, 1997) y la cromatografa lquida HPLC (Geshke, 1997). No obstante, estos mtodos resultan poco prcticos para el anlisis aplicado al control de calidad, por su bajo rendimiento analtico (frecuencia de anlisis) y la complejidad de las tcnicas y procedimientosexperimentales.Portanto,seconsidereldesarrollodeunmtodoATRcon celda de diamanteFTIR para el anlisis directo de las formulaciones de limpieza industrial, lomssimpleyprcticoquefueseposible. RESUMENYDISCUSIN Explicaremos en primer lugar cmo se pone a punto un mtodo de anlisis por espectrometra vibracional o la estrategia general de trabajo y despus pasaremos a comentarlosresultadosdeesteartculoenconcreto. Elprimerpasoeneldesarrollodelmtodoconsisteenlaobtencindelosespectros FTIR de las muestras disponibles y de un patrn del analito que se quiere determinar. Por comparacin entre el espectro correspondiente al patrn y los espectros de las muestras se puede inferir qu bandas son susceptibles de ser utilizadas para la determinacin cuantitativa. La absorbancia de la banda en cuestin ha de ser proporcional a la concentracindelanalitoenlamuestra. En el caso de la espectrometra FTIR, la eleccin del disolvente y del material de la celda o cristal ATR es un paso previo al estudio de las condiciones experimentales. Por un 65
lado,laabsorcindebidaaldisolventedacomoresultadounbackgroundconmuchoruidoen las regiones en las que aqul es menos transparente a la radiacin. De esta manera, las regiones con un background muy elevado no pueden utilizarse para la cuantificacin del analito. Por otra parte, el disolvente deber ser compatible con el material de la celda o del cristal ATR. Si la determinacin del analito se hace directamente sobre la muestra sin pretratamiento ni extraccin de ningn tipo, entonces el disolvente deber ser el mismo en la muestra y en los patrones. Tambin es necesario comprobar el pH de todo lo que se va a mediryasverificarsucompatibilidadconelmaterialdelaceldaodelcristalATR. Si la determinacin del analito no es directa, entonces deben seleccionarse las condicionesqueasegurenlaextraccincuantitativadelanalitoo,ensudefecto,garanticenla repetibilidad de la extraccin parcial para su utilizacin con fines cuantitativos mediante la correccin correspondiente. Esto se consigue mediante la realizacin de estudios de extraccin con el objetivo de crear un protocolo que permita la determinacin cuantitativa del analito en el extracto (tipo de disolvente, volumen o masa de disolvente, tiempo de extraccin). Una vez que todos los estudios preliminares han permitido disponer de muestras (o los extractos equivalentes) y patrones preparados en el disolvente adecuado, se debe deducir qu bandas del espectro de la muestra son debidas al analito, y cules entre ellas son las ms adecuadas para la cuantificacin del mismo. Se estudian, por tanto, los parmetros que definen el criterio de medida que se va a utilizar como variable analtica (rea o altura de banda, lnea base). Dependiendo de la exactitud y precisin que tenga que cumplir el mtodo y las caractersticas espectrales del disolvente utilizado, se selecciona el criterio de medida ms adecuado. En general se selecciona un criterio para el que el coeficiente de correlacin R2 sea mayor o igual a 0.999, con el fin de asegurar una buena correlacin entre la variable medida (y) y la concentracin de analito (x) a travs de una ecuacin del tipo y= ax+b. En el caso de que existan interferencias de alguna clase, debe seleccionarse un criterio de medida que minimice los efectos de stas en los resultados, cuando no los elimine completamente. En ese caso se pueden utilizar muestras de
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concentracin conocida con el fin de ajustar el criterio de medida a los resultados ms exactosyprecisos. Una vez seleccionado el criterio de medida es necesario escoger los parmetros correspondientes al proceso de adquisicin de los espectros FTIR. Los parmetros pticos (apertura, ganancia) suelen fijarse de antemano en funcin de las caractersticas de la celda demedidaquesevaautilizar. Los parmetros ms importantes para cuya seleccin es necesaria la realizacin de los estudios correspondientes son: i) el nmero de scans acumulados por espectro y ii) la resolucin nominal. Aunque puede aplicarse un diseo experimental multivariante para ello, la prctica habitual consiste en fijar uno de los dos parmetros, es decir, resolucin o nmero de scans, y ver cmo vara la precisin y la relacin seal/ruido al variar el otro parmetro. Se debe seleccionar un valor del parmetro que d como resultado una relacin seal/ruidoyprecisinmximas,alavezquerequierauntiempodemedidaquesealoms pequeo posible. Con frecuencia, la tendencia de la variacin no es coincidente para la relacin seal/ruido, la precisin y el tiempo de medida y por tanto se debe seleccionar un valor del parmetro que represente un compromiso entre todas las caractersticas deseables delamedida(esdecir,queseaprecisa,sensibleyrpida).Habitualmente,unmayornmero descansacumuladosmejoralaprecisinylarelacinseal/ruido,peroincrementaeltiempo de medida. Por el contrario, una mayor resolucin nominal implica un mayor tiempo de medida, mientras que una menor resolucin permite obtener un espectro ms rpidamente pero se pierde informacin. En el caso de bandas muy anchas, puede ser til disminuir la resolucin para aumentar la rapidez del anlisis. Sin embargo, si las bandas son muy estrechas, sern necesarias resoluciones mayores para resolverlas y por tanto el tiempo de anlisisseincrementar.Quresolucinynmerodescanssonlosmsadecuadossedecide enfuncindelascaractersticasdelmtodoquesepretendedesarrollar. Llegadosaestepunto,deberealizarseelanlisisdelasmuestrasenlascondiciones seleccionadas, determinando el analito por interpolacin directa en la curva de calibrado obtenida para los patrones, medidos como las muestras. En el caso de que sea necesario realizar una adicin estndar, la concentracin de analito se obtiene por extrapolacin en la 67
curva correspondiente. sta se obtiene midiendo los patrones preparados por adicin de cantidades crecientes de analito a diversas alcuotas de la muestra. Si los resultados obtenidos por la modalidad de anlisis pertinente (directa o por adicin estndar) concuerdan con los obtenidos mediante un mtodo de referencia, o con los valores reales si son muestras de concentracin perfectamente conocida, entonces se considera viable la aplicacin del mtodo desarrollado. A veces puede ser necesaria la realizacin de estudios deinterferenciasenlosqueseinvestigaelefectoquetienelapresenciadeinterferentesenla determinacindelanalito. Finalmente, la exactitud del mtodo se comprueba mediante estudios de recuperacin, en los que se analizan muestras a las que se les ha adicionado cantidades conocidas del analito. Si la cantidad de analito encontrado en cada muestra adicionada es aproximadamente igual al 100 % del analito realmente adicionado, entonces se considera queelmtodoesexactoysedaporvlidasuaplicacin. En este trabajo se presenta un mtodo para la determinacin directa del agente complejante nitrilotriacetato sdico(NTA)endetergenteslquidosalcalinos. Las medidas se llevan a cabo en modo discontinuo en la regin del MIR (4000600 cm1), empleando un accesorio ATR de diamante. En este dispositivo, se coloca una gota de muestra o patrn sobreelcristaldediamanteyseregistraelespectrocorrespondiente. La muestra es acuosa y por tanto los patrones tambin lo son, realizndose la determinacin directa del NTA gracias a que el espectro ATRFTIR del agua, al contrario queelespectroFTIRobtenidoporTransmisin,presentaunbackgroundadecuadoenlazona en que aparece la banda de absorcin del grupo carbonilo del NTA (entre 1604.5 y 1546.6 cm1). Asimismo, en este trabajo se utiliza un cristal ATR de diamante porque las muestras son muy alcalinas y cualquier otro material disponible (Ge, ZnSe) resultara atacadoconlaconsecuenciadeladestruccindeloselementospticosdelaccesorioATR. 68
Como es habitual en el desarrollo de un nuevo mtodo de anlisis por espectrometra FTIR, se realiz un estudio preliminar de los espectros correspondientes de una muestra de cada formulacin disponible y de un patrn de NTA (Figura 26). Cada formulacin presenta una composicin diferente, oscilando la concentracin de NTA entre el 6.2 y el 9.25 % (m/m). De la formulacin F1 se dispona de dos muestras reales procedentes de la fbrica (batch), tres de F2, dos de F3, dos de F4 y tres de F5. Adems, de cada formulacin se prepar una muestra de referencia a escala de laboratorio (por ello denominadamuestradelaboratorio). En la Figura 26 puede observarse la similitud entre los espectros de las diferentes muestras acuosas y el espectro del patrn acuoso de NTA. La banda ms evidente del NTA se corresponde con la absorcin del grupo carboxilato alrededor de 1600 cm1. Se encuentra en una regin del espectro ATRFTIR en la que el background del agua es pequeo y por tanto se dedujo que podra utilizarse esta banda como punto de partida para el desarrollo delmtododeanlisis.
F1
A B S O R B A N C I
F2
F3
F4
F5
Patrn 7.81 % (m/v) A
3500
3000
2500 Nmero de onda (cm-1)
2000
1600
1000
Figura 26. Espectros ATR-FTIR de las diferentes formulaciones (F1, F2, F3, F4, F5) de detergente lquido y de un patrn de NTA al 7.81 % (m/v). Condiciones de medida: 50 scans acumulados, 8 cm-1 de resolucin nominal.
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Lascondicionesexperimentalesde medidaquese estudianenestetrabajo son: i) el nmerodescansacumulados,ii)laresolucinnominal,iii)eltiempoderesidenciadelagota sobreelcristalATRconysinanilloprotector. Respecto al nmero de scans acumulados, el estudio para muestras y patrones indicquecon50scansseobtenanresultadosquerepresentabanunbuencompromisoentre precisin y relacin seal/ruido y por tanto fue seleccionado como el ms adecuado. La precisin obtenida con 50 scans acumuladoseramenor del0.4% yla medidarequera23.5 s detiempoparaunaresolucinnominalde8cm1. Por otra parte, el estudio del efecto de la resolucin nominal en la sensibilidad y precisin de las medidas nos condujo a la conclusin de que 8 cm1 era la resolucin ms adecuada en este caso. Resoluciones mayores alargaban considerablemente el proceso de medidayresolucionesmenoresprovocabanimportantesdistorsionesenlosespectros. La determinacin directa de disoluciones por la tcnica ATR de diamante FTIR requiere depositar una gota de la disolucin de la que se pretende obtener el espectro sobre el cristal de diamante. Esta gota est en contacto con el aire y por tanto puede sufrir una evaporacin parcial durante el tiempo que se necesita para obtener el espectro. La tasa de evaporacin depende fundamentalmente de: i) la volatilidad del disolvente, ii) la superficie de la gota, iii) la temperatura. Si se produce evaporacin significativa, entonces la concentracin del analito aumenta en la disolucin y la absorcin debida a ste aumentar deintensidad.Siesteprocesoafectaenproporcindiferenteamuestrasypatronesysiseve modificado de manera importante por las condiciones ambientales en el momento de la obtencindelosespectros,elefectoproducidoserunaprdidadeexactitudyprecisindel mtodo. As pues, resulta necesario un estudio previo de la variacin de la banda correspondientealanalitoenfuncindeltiempodemedida,paraasegurarsedequedurante la obtencin del espectro en el proceso de anlisis no se vayan a producir variaciones significativasdelaconcentracindeanalito.
70
Enelcasoqueaqunosocupa,tantolasmuestrascomolospatroneseranacuososy caba esperar poca evaporacin en las condiciones ambientales en las que se realizaban las medidas. Sin embargo, la naturaleza de las muestras detergentes lquidos implicaba la presencia de tensioactivos. Estas sustancias tienen la propiedad de disminuir la tensin superficial de las disoluciones, por lo que una gota que las contenga tender a extenderse sobreelcristalaumentandolasuperficieyporende,laevaporacin. Para evitar este problema, el accesorio ATR empleado dispone de un anillo metlicoquesecolocasobrelaceldayenelquesedepositalagotaamedir,detalmodoque stanopuedeextendersemsalldellmitedelanillo.Sinembargo,elusodelanilloacarrea un grave inconveniente: se debe limpiar perfectamente antes de ser utilizado para una muestra diferente. Mientras que el cristal se limpia rpidamente con agua desionizada y papel puesto que el diamante no se raya, la limpieza del anillo requiere mucho ms tiempo, alargando el anlisis. Por tanto es preferible no utilizar el anillo mientras sea posible. Para evitar sorpresas y asegurar la robustez de la medida directa sin anillo, se realiz el estudio del efecto del tiempo que est la gota sobre el cristal frente a la seal correspondientealanalito. Este estudio demostr, tanto para muestras como para patrones, que tiempos de residenciasobreelcristalATRpordebajode1minnosuponanvariacionessignificativasde la seal por evaporacin del lquido. Puesto que los 50 scans acumulados suponan tan solo 23.5 s de medida, se decidi finalmente realizar las medidas sin ningn accesorio protector (anillometlico). Una vez seleccionadas las condiciones experimentales ms adecuadas a travs de los estudios ya comentados, se pas a la seleccin del criterio de medida. Para ello se evaluaron diferentes criterios de medida para la determinacin directa del NTA en las muestras (alturas y reas de pico corregidas con diferentes lneas base). Aunque tanto la precisin como la correlacin obtenidas para cada uno de los criterios evaluados fueron excelentes, fue necesario recurrir al anlisis de las muestras de referencia (muestras de laboratorio) para seleccionar el criterio de medida que evitaba el efecto de las interferencias 71
producidas por los otros componentes de las formulaciones. El criterio de medida seleccionado fue el rea de pico entre 1604.5 y 1546.6 cm1, corregida con una lnea base establecidaentre1743.3y1365.3cm1. Por otra parte, se descubri que la protonacin del grupo carboxilato afectaba drsticamente a la posicin e intensidad de la banda de absorcin ATRFTIR correspondiente. La Figura 27 muestra el efecto de la protonacin del carboxilato en el rea de pico seleccionada. Sin embargo, todas las muestras analizadas y patrones se encontraban dentrodelintervalodepHentre11y12,zonaenlaquenoseproducaningunavariacinen el rea de pico seleccionada, lo que permiti la determinacin directa del NTA en las muestrassinrealizarajustesdepH. Llegados a este punto se analizaron todas las muestras disponibles, tanto las de referencia como las muestras batch procedentes de la fbrica. En la Tabla 5 se muestran los resultados obtenidoseneste anlisisdirecto. Comosepuedeobservar,elerroresmenor del 1 % para las formulaciones F1, F2 y F4. Para la formulacin F3 se obtiene un error algo mayor (1.8 %),pero incluso enel casodeF5,con unerrordel3.6%, es posiblelaaplicacin del mtodo desarrollado, pues el error entra dentro del nivel de exactitud exigible en un control de calidad de este tipo de producto. El CV vara entre el 0.5 y 2 %. La exactitud del mtodo desarrollado se verific mediante estudios de recuperacin, encontrndose valores entornoal100%entodosloscasos. Se evalu el anlisis por adicin estndar para la formulacin F5, que presentaba un blanco de Youden claramente no nulo que sugera la presencia de efecto matriz en esta formulacin. Mediante la adicin estndar se obtuvo un error del 1.9 % respecto del contenido de la muestra de referencia preparada en el laboratorio. Por tanto, se recomienda finalmente la aplicacin del anlisis por adicin estndar a la formulacin F5, mientras que paralasotrasformulacionesserecomiendaelanlisisdirecto.
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6 5 4 3 2 1 0 2 4 6 8 pH 10 12 14
Peak Area
Figura 27. Efecto del pH en los valores de rea de pico entre 1604.5 y 1546.6 cm-1 (corregidos con una lnea base establecida entre 1743.3 y 1365.4 cm-1) para un patrn al 10% de NTA (m/v). Condiciones de medida: 50 scans acumulados, 8 cm-1 de resolucin nominal. Se indica con una elipse el conjunto de los valores correspondientes a las muestras analizadas en este trabajo.
Muestra F1 batch 1 F1 batch 2 F1 laboratorio F2 batch 1 F2 batch 2 F2 batch 3 F2 laboratorio F3 batch 1 F3 batch 2 F3 laboratorio F4 batch1 F4 batch2 F4 laboratorio F5 batch 1 F5 batch 2 F5 batch 3 F5 laboratorio
% NTA (m/m) Valor de referencia 7.95 7.95 7.95 9.25 9.25 9.25 9.25 7.07 7.07 7.07 6.80 6.80 6.80 6.22 6.22 6.22 6.22 ATR-FTIR 7.90 0.03 8.124 0.014 7.95 0.03 9.37 0.03 9.38 0.05 9.45 0.03 9.332 0.013 7.24 0.03 7.30 0.02 7.20 0.05 6.99 0.08 6.800 0.004 6.867 0.015 6.087 0.017 5.990 0.018 6.08 0.03 5.994 0.012
Error % -0.7 2.2 0.0 1.3 1.4 2.1 0.9 2.4 3.2 1.8 2.8 0.0 1.0 -2.1 -3.7 -2.1 -3.6
Tabla 5. Resultados obtenidos mediante el mtodo desarrollado para muestras de detergentes lquidos comerciales (Fn batch) y para las muestras de control preparadas en el laboratorio (Fn laboratorio).
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CONCLUSIONES Este trabajo presenta un nuevo mtodo de anlisis directo por ATRFTIR con celda de diamante de NTA en detergentes lquidos fuertemente alcalinos. El desarrollo del mtodo ha implicado una serie de estudios de los parmetros FTIR y de las caractersticas analticas ms importantes. El mtodo desarrollado presenta una excelente frecuencia de anlisis de 50 determinaciones independientes por hora y cada medida requiere tan slo 0.2 mLdemuestraopatrn.
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2.Desarrollodemtodosdeanlisisporespectrometravibracional conmulticonmutacin
En este rea se han realizado tres trabajos. En cada uno de ellos se explota una caracterstica diferente de la multiconmutacin acoplada ala espectrometra vibracionalpor medidasdeTransmisin(FTMIR,FTNIR)yReflectancia(ATRFTIR). 2.1. Determinacin ATRFTIR de olefinsulfonato sdico: sistemas con
multiconmutacinymedidasenmodostoppedflow INTRODUCCIN Como hemos comentado en la seccin 1.1, las tcnicas de ATR permiten la medida directa de muestras acuosas, siempre que sean compatibles con el material de la celda. En estecaso,disponamosdeunaceldaATRhorizontalconuncristaldeZnSe.Portanto,elpH de las muestras a medir no poda ser muy diferente de 7, debido a que la degradacin del cristalseproduceapHmselevados. Esta tcnica haba sido aplicada con resultados prometedores al control de calidad de materias primas y productos industriales (Garrigues, 2000b; Mossoba, 2001). Aprovechando que se nos haba presentado un problema analtico determinacin en detergentes industriales de pH neutro del surfactante aninico olefinsulfonato sdico se investiglas posibilidadesdelempleo del MIR paralacuantificacindelprincipioactivoen lasmuestrasacuosas. Por otro lado, el acoplamiento FTIR FA estaba proporcionando nuevas perspectivas alanlisis FTIR (Cadet, 2000;Garrigues,2000a), aun implicandoelconsumode cantidades relativamente elevadas de muestra y disolventes. La experiencia previa en el desarrollo de sistemas con multiconmutacin (VenturaGayete, 2004) sugera un 75
acoplamiento entre sta y la espectrometra ATRFTIR, que hasta entonces no tena ningn antecedente, en vista a realizar el proceso de medida en stoppedflow e incrementar as la sensibilidaddelmtodo(Arajo, 1995). As pues,seprocediadesarrollarun mtodo ATR FTIR con multiconmutacin y medidas en stoppedflow para la determinacin de olefinsulfonatosdicoendetergentesacuosos. RESUMENYDISCUSIN EnestetrabajosobreladeterminacinATRFTIRdeolefinsulfonatosdico(AOS) en muestras de detergentes lquidos de uso industrial, las medidas se realizan en stopped flow utilizando un sistema con multiconmutacin, en vistas a la posible automatizacin del mtodo.Enestecasoseaprovechalaestrategiademulticonmutacincomovaparaevitarla manipulacindelaceldaATRparasulimpiezayllenado. De manera previa al diseo del sistema con multiconmutacin se estudiaron los parmetros propios de la espectrometra ATRFTIR. En primer lugar se estudiaron las caractersticas de los espectros ATRFTIR tanto de las muestras como de los patrones acuososconelobjetivodeevaluarlaviabilidaddelmtodoquesepretendadesarrollar.Las muestras y patrones se introducan por succin en la celda ATR de flujo mediante una bomba peristltica y los espectros se obtenan en modo stoppedflow, es decir, con el flujo detenido. En la Figura 28 se muestran los espectros de una muestra y varios patrones de AOS en la regin espectral de inters, pues fuera de esta zona no se observaba una correspondencia clara entre las bandas del AOS y las de la muestra. La banda alrededor de 1040 cm1 era la nica que permita la determinacin directa del AOS sin que hubiese interferenciasimportantes. En consecuencia, se evaluaron de forma exhaustiva diferentes criterios de medida basados en la banda a 1040 cm1. Finalmente se opt por utilizar el rea de pico entre 1049.1 y 1034.6 cm1 corregida con una lnea base establecida entre 1020.2 y 995.1 cm1. Este criterio demedidaeraelqueproporcionabalosresultadosmsexactosyprecisos. 76
0.20
0.10
B
0.00
A
-0.10 1400 1200
Nmero de onda (cm-1)
1000
Figura 28. Regin del espectro ATR-FTIR en el que aparecen las bandas ms significativas del AOS. A: espectros de los patrones de AOS en agua; B: espectro de una formulacin de detergente lquido. Los espectros de los patrones estn desplazados sobre el eje y para una mayor claridad. Las condiciones de medida son: 100 scans acumulados, 8 cm-1 de resolucin nominal.
Acontinuacinseseleccionaronlosparmetrosi)nmerodescansacumuladospor espectro y ii) la resolucin nominal, buscando un compromiso entre sensibilidad, precisin y rapidez de las medidas. De esta manera se seleccionaron 100 scans acumulados y una resolucin nominal de 8 cm1 como parmetros ms adecuados para la determinacin del AOSendetergentesenmodostoppedflow. Unavezseleccionadaslascondicionesdemedidamsadecuadas,sepasaldiseo de un sistema con multiconmutacin que permitiera la obtencin de los espectros en modo stoppedflow a la vez que se facilitara y acelerara el proceso de limpieza de la celda. Tras diversos ensayos, se construy un montaje con 4 vlvulas solenoides controladas desde un PC mediante un programa en Qbasic creado ad hoc. Un esquema de este montaje se puede verenlaFigura29. LavlvulaV3tienecomomisininsertarburbujasdeaireenelsistemaquefacilitan la limpieza de la celda. A travs de la vlvula V2 se puede insertar un patrn o una disolucin de limpieza, segn el tipo de muestra que se vaya a medir (como veremos ms 77
tarde, el sistema puesto a punto permita la obtencin de los espectros ARTFTIR en modo stoppedflow de diferentes tipos de muestras y no slo de detergentes lquidos). La muestra se introduce en la celda ATR de flujo mediante la vlvula V1. Para realizar las medidas en modo stoppedflow, el flujo a travs de la celda se detiene accionando la vlvula V4, que desva el carrier hacia un bypass. La bomba est situada al final del sistema precisamente para lograr el bypass del carrier y evitar la presencia de burbujas en la celda cuando se midenlasmuestrasopatrones. Una vez diseado el sistema, se seleccionaron los parmetros propios de la multiconmutacin,quefueron:i)caudal,ii)tiempodemuestreo(samplingtime)yiii)tiempo delimpieza(cleaningtime).
Figura 29. Montaje de multiconmutacin empleado en la determinacin ATR-FTIR de -olefinsulfonato sdico.
El caudal fue fijado en 1.92 mL min1 para evitar la formacin de espuma y realizar el anlisis en el menor tempo posible. El tiempo de muestreo se refiere al tiempo que se acciona la vlvula V1, durante el que la muestra es transportada hacia la celda de flujo. El quelaceldasellenecompletamentedemuestraystadesplacealcarrierpreexistenteensta depender del tiempo de muestreo programado. En consecuencia, la seal observada (rea de pico entre 1049.1 y 1034.6 cm1 corregida con una lnea base establecida entre 1020.2 y 995.1 cm1) debe alcanzar un valor constantepara un determinado tiempo. Como se observa en la Figura 30, son suficientes 30 s de tiempo de muestreo para conseguir una seal mxima, y por tanto este valor fue seleccionado para el procedimiento experimental recomendadoenestenuevomtododeanlisis.
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Por otra parte, el sistema deba funcionar de tal manera que no existiese efecto memoria o contaminaciones entre muestras diferentes analizadas sucesivamente. Para asegurar la limpieza total de la celda se estudi el tiempo que deba estar circulando el carrieratravsdelsistemaentrelaobtencindelosespectrosdecadaunadelasmuestrasen modo stoppedflow. Se observ que 50 s era suficiente para conseguir una limpieza eficiente, asqueseseleccionestevalorparaelprocedimientoexperimentalrecomendado.
rea de pico 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 tiem po de m uestreo (s)
Figura 30. Efecto del tiempo de muestreo en el rea de pico entre 1049.1 y 1034.6 cm-1 corregida con una lnea base establecida entre 1020.2 y 995.1 cm-1 de una muestra de detergente lquido conteniendo un 8.52 % (m/m) de AOS. Las condiciones de medida son: 100 scans acumulados, 8 cm-1 de resolucin nominal. Los resultados estn expresados como la media s (desviacin estndar) de tres rplicas independientes.
Unavezseleccionadastodaslascondicionesexperimentalesrelativasalsistemacon multiconmutacin diseado, se pas a la validacin del mtodo propuesto. Se analizaron con este fin muestras de concentracin conocida que permitieron verificar la aplicabilidad del mtodo, al encontrarse los errores obtenidos por debajo de un 5 %. Las concentraciones de las muestras analizadas estaban dentro del intervalo 7.59.5 % (m/m) de AOS. La exactitud del mtodo se evalu mediante los correspondientes estudios de recuperacin, que dieron como resultado valores prximos al 100 % en todos los casos. As pues, se dio por vlido el mtodo desarrollado. Las caractersticas analticas se resumen en la Tabla 6. En esta tabla se compara el mtodo con multiconmutacin desarrollado y el mtodo 79
equivalente en modo manual (no en stoppedflow, puesto que no se utiliza celda de flujo). Como puede verse, la eficiencia aumenta considerablemente para el mtodo con multiconmutacin.
Parmetro Frecuencia de anlisis h-1 Volumen muestra mL / 100 determinaciones Residuos mL h-1 LOD % (m/m) CV % Mtodo Multiconmutacin 23 96 115 1.2 1.3 Mtodo Manual 15 100 250 -
Tabla 6. Caractersticas analticas ms importantes del mtodo desarrollado para la determinacin ATR-FTIR de olefinsulfonato sdico en detergentes lquidos de uso industrial.
De modo paralelo al desarrollo del mtodo de anlisis del AOS en detergentes lquidos se evalu la aplicabilidad del sistema acoplado multiconmutacin celda ATR de flujo para la obtencin de espectros en stoppedflow de muestras de composicin muy diferente:cerveza,disolucinacuosadelecheenpolvo,zumodenaranjayaceitedeoliva.El sistema de limpieza en lnea de la muestra que se puso a punto, basado en la insercin alternativa de burbujas de aire, carrier y disolucin limpiadora posibilit en el caso ms extremo muestra ms difcil de limpiar la medida de 12 muestras de aceite de oliva diferentes en una hora generando tan slo 458 mL de residuos. Por tanto se demostr la utilidad del sistema con multiconmutacin orientado hacia la obtencin de espectros ATR FTIRenmodostoppedflowdemuestrasdifcilesdelimpiar. CONCLUSIONES El mtodo desarrollado para la determinacin de AOS en detergentes lquidos permite el anlisis de 23 muestras en una hora, con una precisin y exactitud adecuadas para el control de calidad de las formulaciones. Por otra parte, el sistema con
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multiconmutacin se puede aprovechar para la obtencin de los espectros de muestras diversasdeunamaneracmodaylimpia. 2.2. Determinacin FTIR de benceno en gasolina: uso de la multiconmutacin como estrategiaalternativaalFIA INTRODUCCIN El benceno se encuentra entre los mltiples compuestos que permanecen en los productos intermedios obtenidos durante el proceso de preparacin de las gasolinas, de manera que en stas suele encontrarse en cantidades del orden del porcentaje, si no se evita de algn modo. Es cancergeno y por tanto la legislacin especfica estableca unos valores de contenido de benceno en la gasolina menores del 5% (actualmente < 1 % en la UE). Antecedentes del uso de la espectrometra FTIR para la determinacin del benceno son los basados en la dilucin en lnea con hexano (Gallignani, 1993), el uso de derivadas (Gallignani,1994b)ylageneracindefasevapor(LpezAnreus,1996). Laposibilidaddeutilizarunsistemaconmulticonmutacinparalograrunamejora de las caractersticas analticas de los mtodos de anlisis en flujo (Reis, 1999) y el hecho de noexistirantecedentealgunodeacoplamientomulticonmutacinFTIR,noscondujohaciala puestaenprcticadeunnuevaaproximacinaesteproblemaanaltico,conlarealizacinde las medidas en continuo y aprovechando el potencial que ofrece la multiconmutacin para llevaracabounadilucindelamuestraounaadicinestndarencontinuo(online). RESUMENYDISCUSIN En este trabajo se disea y aplica a muestras reales un nuevo mtodo de anlisis FTIR con multiconmutacin con medidas en continuo para la determinacin de benceno en gasolina.SecomparaestemtodoconelantecedenteFIAmsprximo(Gallignani,1993).
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Puesto que el mtodo que se pretenda desarrollar era una adaptacin de un mtodo FIA preexistente, no fue necesario seleccionar las condiciones ni el criterio de medida ms all de lo que la propia multiconmutacin requera. Como disolvente se utiliz hexano, que es bastante transparente en la regin espectral de inters (900600 cm1). El material de las ventanas de la celda de medida deba ser un haluro alcalino (NaCl), que absorbe poco en esa zona. Al ser ste muy higroscpico, se tuvo que habilitar un desecador para guardar la celda cada vez que se terminaba una serie de medidas. A pesar de tomar estas precauciones, se observ un deterioro de las ventanas de NaCl al finalizar la investigacin.EnlaFigura31 se muestran los espectros deunamuestrade gasolina ydeun patrn de benceno en hexano. Como puede verse, el benceno tiene una banda bien definida a 675 cm1 que se identifica claramente en la muestra de gasolina. El criterio de medida, extrado del mtodo FIA preexistente, fue el de altura de pico a 675 cm1 corregida con una lneabaseestablecidaentre712y650cm1.
Figura 31. Espectros FTIR correspondientes a (1) una muestra de gasolina conteniendo un 2.74 % (v/v) de benceno y (2) un patrn del 3.75 % (v/v) de benceno en hexano.
Por tanto, se prosigui con la etapa del diseo y montaje de un sistema con muticonmutacin que permitiera la determinacin de benceno en gasolina de forma ms 82
eficiente que la conseguida con en el mtodo FIA preexistente utilizado como punto de partida(Gallignani, 1993). Conestefinsedispuso unmontajecon 3vlvulas solenoidesque permita tanto la dilucin de la muestra como la realizacin de adiciones estndar en lnea. LaFigura32muestraelesquemadelsistemaconmulticonmutacindiseado. La muestra se introduce a travs de la vlvula V1, mientras que el benceno es introducidoatravsdelavlvulaV2.Ladisposicindelastresvlvulasenlaformadescrita en la Figura 32 permite la realizacin de la dilucin en lnea de la muestra y la adicin estndartambinenlnea,mediantelainsercinalternadadeslugsdemuestraycarriery de muestra, carrier y patrn, respectivamente. La funcin del coil es garantizar el perfecto mezcladodelosslugsantesdealcanzarlaceldademedida.
Hexano
V2 0
Bomba
residuos
Benceno
1 0
V3
Micro-celda de flujo
Hexano
V1 0 1
coil
Gasolina
Figura 32. Montaje experimental empleado para la determinacin de benceno mediante espectrometra FTIR con multiconmutacin. V1, V2 y V3 son las vlvulas solenoides de tres vas. La va abierta al activar cada vlvula est indicada con un 1 (bit 1), y la va abierta cuando la vlvula est desactivada se indica con un 0 (bit 0). El coil tiene una longitud de 239 cm, con un dimetro interno de 0.5 mm.
Los parmetros propios de la multiconmutacin estudiados en este trabajo fueron: i) el dimetro interno de los tubos del montaje, ii) la longitud del coil, iii) el caudal, iv) el tiempodeinsercindemuestra,debencenoydecarrier(pararealizarelcalibradoexternoy las adiciones estndar). En este caso las medidas se realizan en continuo y, por tanto, el estudio de estos parmetros tiene un sentido diferente que en el caso del trabajo sobre la determinacindeAOSendetergenteslquidosenmodostoppedflow.Eneltrabajoqueahora nos ocupa se investig cmo es afectado el registro de la seal (altura de pico a 675 cm1 83
corregida con una lnea base establecida entre 712 y 650 cm1) frente al tiempo cuando se varan los parmetros del caudal, tiempos de insercin, etc. Los estudios correspondientes indicaron que los mejores resultados en cuanto a la precisin y sensibilidad de las medidas en continuo se obtenan para un dimetro interno del coil de 0.5 mm con una longitud de 239 cm y un caudal de 3.2 mL min1. As pues el montaje recomendado se dispuso con tales caractersticas. A continuacin se seleccionaron los parmetros de tiempo de insercin de muestra mediante los estudios correspondientes. Como se observa en la Figura 33, son suficientes 12.5 s de insercin de gasolina a travs de la vlvula V1 para conseguir una seal mxima. Este tiempo de insercin se corresponde con un volumen de 666.7 L de muestra. Por otra parte, se evalu el efecto del tiempo de insercin de hexano, con el fin de asegurar una correcta separacin entre los picos del registro de la seal frente al tiempo. En este caso, se observ que 30.0 s de hexano permitan una separacin suficiente entre los picos correspondientes a cada rplica de muestra o patrn. De esta manera se fijaron ambos parmetrosconelfindeaplicarelmtodoalanlisisdemuestrasdegasolinaycompararlos resultadosconelmtodoFIApreexistenteutilizadocomoreferencia.
Tiempo (s)
Figura 33. Efecto del tiempo de aspiracin de una muestra de gasolina conteniendo un 2.74 % de benceno (v/v) a travs de la vlvula solenoide V1, para un tiempo de aspiracin de 30 s de carrier (hexano) entre cada rplica. Se indica el valor medio s para tres rplicas independientes.
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Una vez desarrollado el nuevo mtodo de anlisis FTIR con multconmutacin del benceno en gasolina, se analizaron por este mtodo y por el mtodo de referencia (Gallignani,1993)todaslasmuestrasdelasquesedispona,tantopordeterminacindirecta como por adicin estndar. La comparacin de las pendientes de las rectas de regresin demostrenamboscasoslaausenciadeefectomatriz. La regresin de los resultados obtenidos por el mtodo desarrollado y el mtodo FIA proporcionan una recta y= (0.1 0.2) +(0.98 0.08)x, con R= 0.967.El test de t apareado indica que no existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos entre ambos mtodos para un nivel de confianza del 95 %. El test F demuestra que la precisin obtenida con ambos mtodos tambin es estadsticamente comparable. As se verific la validez del mtododeanlisisporespectrometraFTIRencontinuoconmulticonmutacindesarrollado enestetrabajo. La Tabla 7 incluye las caractersticas analticas ms importantes de este nuevo mtodoyelmtodoFIAutilizadocomoreferencia. El nuevo mtodo mejora considerablemente el lmite de deteccin respecto del mtodo FIA. Por otra parte, permite el anlisis de casi el doble de muestras en el mismo tiempo. Tambin reduce el consumo de muestra y hexano. En el trabajo se comparan tambin los mtodos encontrados en la bibliografa, encontrndose una sensible mejora respectodeaqullos. El mtodo FTIR desarrollado permite 81 determinaciones por hora, frente a las 45 determinaciones posibles en el caso del mtodo FIAFTIR de referencia. Adems se generan tan slo 105.6 mL de residuos por hora de trabajo frente a los 219.0 mL generados con el mtodo de referencia. La mejora es todava mayor para el consumo de muestra, pasando de 50.0 mL necesarios para 100 anlisis en el caso del mtodo de referencia frente a los 7.9 mL delnuevomtododesarrollado.
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Mtodo FIA Caractersticas Calibrado externo 0.01 1.4 0.1-0.6 Altura 675 cm-1 Lnea base 712-650 cm-1
Y= (0.076 0.001)x (0.0042 0.0005)
Mtodo multiconmutacin Adicin estndar 1.4 dem Calibrado externo 0.004 1.2 0.91-3.75 dem Adicin estndar 1.2 dem
% (v/v) LODa % RSDb % intervalo de linealidad Criterio de medida Regresin
Y= (0.0720 0.0008)x (0.0016 0.0003)
Y= (0.0410 0.0006)x (0.006 0.002)
Y= (0.0416 0.0009)x (0.032 0.002)
R mL gasolinac mL hexanoc mL residuos

d
0.9998 50.0 471.4 219.0 45
0.9997 50.0 471.4 250.3 45
0.998 7.9 117.9 105.6 81
0.9998 11.0 192.5 158.7 81
Frecuencia de anlisis h-1
Tabla 7. Caractersticas analticas del mtodo desarrollado y el mtodo FIA utilizado como referencia.
a b c d
Lmite de deteccin para k= 3. Desviacin estndar relativa para un disolucin patrn. Consumo de muestra y carrier para 100 anlisis. Residuos generados para 1 hora de trabajo.
CONCLUSIONES La adaptacin del mtodo FIAFTIR preexistente, mediante el diseo y puesta a punto de un sistema con multiconmutacin, ha supuesto una mejora importante en la eficencia y comodidad del anlisis. As pues, se ha dado un paso ms en la automatizacin delprocesodedeterminacindelbencenoengasolinaporespectrometraFTIR. 86
2.3. Determinacin de hexythiazox en formulaciones fitosanitarias: aplicacin de la multiconmutacinacopladaalaespectrometraFTNIR INTRODUCCIN El anlisis con fines de control de calidad de formulaciones de productos fitosanitarios ha sido una preocupacin constante en los ltimos aos en el grupo de investigacin en el que se inscribe esta Tesis (Armenta, 2005c). La Unin Europea consumi 19384 toneladas de pesticidas en 1999 (Eurostat, 2002), lo que justifica la puesta a punto de nuevosmtodosdeanlisisanivelindustrial,rpidosydeautomatizacinsencilla. Nos encontramos con un acaricida hexythiazox cuya disolucin en acetonitrilo presentaba un espectro en el NIR que sugera su determinacin por espectrometra FTNIR directa. El hexythiazox es empleado en el tratamiento de los ctricos y por tanto su utilizacin es comn en nuestro pas. Este producto suele presentarse como nico principio activoenlasformulacionesquelocontienen(Lin,2000),loquesimplificaengranmedida su tratamiento como problema analtico. Por lo tanto, resultaba atractiva la posibilidad de desarrollar un mtodo de anlisis para el control de calidad de formulaciones que lo incluyeran. Los mtodos de anlisis utilizados previamente para la determinacin del hexythiazox se orientaban hacia el anlisis a nivel de traza y no resultaban apropiados para elcontroldecalidad,yaqueexigenuntratamientodelasmuestrasqueimplicaunaelevada dilucin, con el consiguiente consumo de disolvente. Entre stos se encuentran mtodos de cromatografa lquidaUV (Gilberto, 1991; Kaihara, 2000), espectrometra de masas (MS) con ionizacin por electrospray (Hetherton, 2004; GarridoFrenich, 2004; Ortelli, 2004; Sannino, 2004) o ionizacin qumica (Valenzuela, 2001; Blasco, 2002; Blasco, 2002b; Blasco, 2004), MS consondadirecta(McGhie,1990)yvoltametra(Gu,2003). 87
En este punto se decidi aprovechar la estrategia de multiconmutacinFTIR en el diseo de un mtodo de anlisis especfico, pero en esta ocasin realizando medidas en continuo en la regin del NIR, acoplamiento para el que no exista precedente alguno en la bibliografadisponible. RESUMENYDISCUSIN En este trabajo de multiconmutacin se expone un nuevo mtodo FTNIR para la determinacin de hexythiazox en formulaciones de pesticidas que utiliza un montaje muy sencillo con dos vlvulas solenoides. As se consigue realizar la dilucin en lnea de la muestraylaadicinestndarutilizandoslounadisolucinpatrn. El procesoseguido para poner a punto elnuevo mtodofueel siguiente:enprimer lugar se desarroll un mtodo FTNIR en modo batch o discontinuo seleccionando los parmetrosadecuadosencuantoacondicionesexperimentalesydemedida.Estemtodose validmedianteelmtodocromatogrficoutilizadocomoreferencia.Finalmente,elmtodo en modo batch fue adaptado al modo continuo con una estrategia de multiconmutacin, diseando un sistema de flujo y seleccionando los parmetros experimentales ms adecuados. Este mtodo tambin se valid mediante el mtodo de referencia. Veremos a continuacin cmo se llev a cabo todo este proceso de desarrollo del nuevo mtodo de anlisis. Los ensayos preliminares realizados mostraban que el hexythiazox era soluble en acetonitrilo, disolvente adecuado para el anlisis FTNIR debido a su gran transparencia en esta regin del IR. Por otra parte, se comprob que el acetonitrilo extraa fcilmente el hexythiazox de los pesticidas en polvo de los que disponamos. Por tanto se decidi utilizar el acetonitrilo como agente extractante. En la Figura 34 se muestran los espectros de un extractodemuestrayunpatrndehexythiazoxenacetonitrilo.Comopuedeobservarsecon claridad, el hexythiazox presenta una banda bien definida hacia 4850 cm1, perfectamente identificable en el extracto de muestra. Esto sugera la posibilidad de desarrollar un mtodo FTNIR en modo batch para la determinacin del hexythiazox en formulaciones de 88
pesticidas en polvo y por tanto se pudo continuar con la seleccin de los parmetros experimentales. La medida en modo batch con el equipo FTNIR se llevaba a cabo introduciendo el extractodelamuestraoelpatrnenunvialdecuarzo.Debidoaalefectodelatemperatura en los espectros FTNIR, se fijaba la temperatura del portavial del equipo a 30 C. Las medidas se realizaban un par de minutos despus de introducir el vial en el equipo, para asegurarelequilibriotrmico.
0.12
0.10
0.08
A
0.06
0.04
0.02
B
0.00
-0.02
-0.04 5000 4500
Nmero de onda (cm-1)

Figura 34. Espectros FT-NIR de un extracto en acetonitrilo de una muestra en forma de polvo mojable (A), un patrn conteniendo 6.8 mg mL-1 de hexythiazox en acetonitrilo (B), y (C) un blanco de acetonitrilo. La regin espectral oculta se debe al elevado background del disolvente. Las condiciones de medida son: 15 scans acumulados, 8 cm-1 de resolucin nominal.
Una vez solucionado el problema de la temperatura, se prosigui con la seleccin de los parmetros correspondientes a las condiciones experimentales y de medida en modo batch.Enprimerlugarseevaluarondiferentescriteriosdemedidaenfuncindelaprecisin 89
y sensibilidad, seleccionando el rea de pico entre 4948.6 y 4767.3 cm1 corregida con una lnea base horizontal establecida a 4765 cm1 como criterio de medida ms adecuado para la determinacindelhexythiazoxenlasformulacionesutilizadas. LasiguienteetapaeneldesarrollodelmtodoFTNIRenmodobatchconsistienla seleccin de las condiciones de extraccin (efecto de masa de muestra y de acetonitrilo). En la Figura 35 se muestra el efecto de la masa de acetonitrilo en la extraccin del hexythiazox. Como puede observarse, para una masa de 0.1 g de muestra es suficiente 1.0 g de acetonitrilo para conseguir la extraccin completa del hexythiazox. Por otra parte, se comprob que una agitacin ligera bastaba para que la extraccin fuese completa. As pues, semantuvieronenlosucesivoestascondicionesdeextraccin. Por otra parte, se realizaron los estudios correspondientes para la seleccin del nmero de scans acumulados por espectro y la resolucin nominal. Se seleccionaron como msadecuados15scansacumuladosy8cm1deresolucinnominal.
11 10 % m/m 9 8 7 6 5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 m AcCN (g)
Figura 35. Efecto en la extraccin del hexythiazox de la masa de acetonitrilo (AcCN) aadido a 0.1 g de muestra conteniendo un 10 % (m/m) del analito. Los valores se corresponden con la media s de tres medidas independientes.
Una vez llegados a este punto, el nuevo mtodo FTNIR en modo batch desarrollado se aplic al anlisis de muestras. Se compararon los resultados obtenidos mediante este mtodo con los obtenidos mediante el mtodo HPLC de referencia, y se 90
verific que ambos eran comparables. Los estudios de recuperacin mostraron la exactitud delmtodoalencontrarvaloresprximosal100%derecuperacinentodosloscasos.Porlo tanto se decidi adaptar el mtodo en modo batch al modo en continuo mediante el uso de estrategiasdemulticonmutacin. El sistema que se emple para la determinacin del hexythiazox por FTNIR con multiconmutacin se describe en la Figura 36. Dos vlvulas solenoides se utilizan para introducir el carrier y la muestra (V1) y el patrn (V2). El coil tiene como funcin asegurar el perfectomezcladoentrelosslugsinsertadosenelsistema. Con este sistema se intentaba conseguir la dilucin en lnea de la muestra para determinar su contenido en hexythiazox mediante interpolacin entre dos puntos, uno correspondiente a un patrn de concentracin mayor que el valor esperado para la muestra y otro punto por debajo de este valor; como variable dependiente podra utilizarse la altura del pico obtenido en el registro continuo de la seal. A su vez, estos dos puntos se obtendran por dilucin en lnea de una nica disolucin patrn original. De esta manera se pretenda reducir el tiempo de anlisis, factor muy importante en un mtodo que pretende aplicarsealcontroldecalidad.
patrn muestra
Bomba
Residuos
carrier Celda de flujo
Figura 36. Montaje empleado para la determinacin del hexythiazox por FT-NIR con multiconmutacin. La bomba peristltica aspira las disoluciones a travs de la celda de flujo. Todas las lneas son de PTFE y de 0.8 mm de dimetro interno. La va abierta al activar cada vlvula est indicada con un 1 (bit 1), y la va abierta cuando la vlvula est desactivada se indica con un 0 (bit 0).
91
Laotraposibilidaderarealizarunaadicinestndarenlnea,mediantelainsercin consecutiva y repetida de pequeos slugs de muestra, patrn y acetonitrilo. A pesar de que se investig la adicin estndar en el mtodo FTNIR en modo batch y se lleg a la conclusin de que no era necesaria, se pens que la adicin estndar podra ser til en el caso del mtodo en continuo, al minimizar los posibles efectos de los cambios de temperatura en la seal medida. Como veremos a continuacin, se probaron ambas opciones. Una vez diseado el sistema se estudiaron los parmetros experimentales propios de la multiconmutacin y medidas en continuo, que fueron: i) el nmero de scans acumulados por cada punto del registro continuo de la seal (rea de pico entre 4948.6 y 4767.3cm1corregidaconunalneabaseaunpuntoestablecidaa4765cm1)frentealtiempo, ii)elcaudal,iii)lalongituddelcoil,iv)elnmerodeciclosdeinsercinalternadade0.5sde muestray0.5sdecarrier,v)eltiempodeinsercindeacetonitriloentrecadarplica. En el caso del nmero de scans y caudal se decidi fijar ambos parmetros conjuntamente, puesto que son interdependientes. Si el caudal aumenta, entonces es necesario un mayor nmero de puntos en el registro de la seal frente al tiempo para mantener la misma informacin, lo que implica acumular un menor nmero de scans por punto. Las condiciones experimentales de 4 scans acumulados y un caudal de 1 mL min1 fueronseleccionadasparaladeterminacindelhexythiazoxenelmtodocontinuodebidoa las adecuadas sensibilidad y repetibilidad, ambas referidas a la altura de pico del registro continuo,obtenidasentalescondiciones. Por otra parte, se encontr que era necesario un coil de 100 cm para asegurar el mezclado completo de los slugs de muestra, patrn y carrier insertados. El nmero de ciclos de insercin de muestra (tiempo de insercin 0.5 s) y de carrier (tiempo de insercin 0.5 s) que garantizaba una seal mxima se seleccion mediante el estudio correspondiente, encontrndoseelvalorde30cicloscomoelmsadecuado.Encuantoaltiempodeinsercin
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de acetonitrilo necesario para obtener una buena separacin entre las diferentes rplicas, se comprobque45seraeltiempomsadecuado. Una vez seleccionados todos los parmetros experimentales, se aplic el mtodo desarrolladoalanlisisde lasmuestras, por la modalidad deinterpolacinentredospuntos y por la modalidad de adicin estndar. En la Figura 37 se muestra un ejemplo del registro obtenidodeunanlisisporadicinestndar.Conelfindevalidarelmtodosecompararon los resultados obtenidos por ambas modalidades con los obtenidos mediante el mtodo en modo batch y por el mtodo HPLC de referencia. Los resultados fueron satisfactorios, indicandolavalidezdelnuevomtodoFTNIRconmulticonmutacin.
0.035
0.025 R E A 0.015
0.005 5 10 15 Tiempo (min) 20 25 30
Figura 37. Registro de la seal frente al tiempo correspondiente a una adicin estndar realizada mediante el mtodo FT-NIR con multiconmutacin desarrollado. La recta de calibrado es y (altura de pico)= 0.01782 +0.00358 C, con R2= 0.998, siendo C la concentracin aadida de hexythiazox en mg mL-1.
La Tabla 8 resume las caractersticas analticas ms importantes del mtodo desarrollado. Como era previsible, es especialmente destacable la mejora conseguida en la eficiencia del anlisis, pasando de 7 determinaciones por hora en el caso del mtodo de referencia a30 determinaciones en el casodel mtodoFTNIR enmodobatch y52 enel caso del mtodo FTNIR con multiconmutacin. El volumen de residuos generado tambin se reduce enormemente para los dos nuevos mtodos FTNIR desarrollados en este trabajo, pasando de un total de 800 mL para el mtodo HPLC a tan slo 100 mL en los mtodos FT NIR.
93
Slo en el aspecto de la sensibilidad no pueden competir los mtodos FTNIR desarrollados con el mtodo de referencia; en ste el lmite de deteccin es del orden de mil veces menor que para los mtodos FTNIR. Sin embargo, como ya hemos comentado, en el caso que nos ocupa, el analito se encuentra en concentraciones del orden del tanto por cien en la muestra, y en consecuencia la limitada sensibilidad de la tcnica no representa ningn problema.
Parmetro % (v/v) LODa % RSDb mL residuos
c
NIR-batch Calibrado externo 0.2 mg mL-1 0.2 100 30
NIRmulticonmutacin Calibrado externo 0.1 mg mL-1 0.8 100 52
HPLC referencia 0.14 g mL-1 0.05 800 7
Tabla 8. Resumen de las principales caractersticas analiticas del mtodo desarrollado y el mtodo de referencia.
a b c
Lmite de deteccin para k=3. Desviacin estndar relativa de una disolucin patrn para n= 3. Residuos para 100 anlisis.
CONCLUSIONES En este trabajo se han puesto a punto dos mtodos de anlisis por espectrometra vibracionalFTNIR para ladeterminacin de hexythiazoxenformulaciones depesticidasen forma de polvo mojable, uno de ellos con medidas en modo batch y el otro con medidas en continuo utilizando la multiconmutacin como estrategia. El trabajo muestra el proceso de desarrollo del mtodo en modo batch y su posterior adaptacin al modo continuo. La comparacin con el mtodo HPLC de referencia ha permitido verificar la validez de los mtodosFTNIRdesarrolladosy,porotrolado,hapuestodemanifiestolasventajasdeluso delamulticonmutacincomoestrategiaexperimental. 94
3. Desarrollo de mtodos de anlisis FTMIR con extraccin previa delanalito
En esta seccin se han incluido dos trabajos en los que se lleva a cabo la extraccin
delanalitopreviamenteasudeterminacin.Enelprimeroseaprovechalaextraccinenfase slida (SPE) para preconcentrar en lnea el analito (methidathion o tricyclazole) y realizar a continuacin la elucin y determinacin en lnea por espectrometra FTIR. El segundo trabajo hace uso de la extraccin presurizada con disolvente (PSE) para lograr la extraccin rpida y sencilla de la grasa de la leche en polvo, y posteriormente su determinacin por espectrometraFTIR.
3.1.
Determinacin de methidathion y tricyclazole en aguas con
preconcentracinmedianteSPEyelucinenlnea
INTRODUCCIN La espectrometra FTIR ha sido aplicada en los ltimos aos a la determinacin de pesticidas en formulaciones fitosanitarias, con fines de control de calidad (Armenta, 2004). Sin embargo, los problemas asociados a esta tcnica vibracional, como son la baja sensibilidad y el reducido nmero de disolventes disponibles, se ha traducido en una ausencia evidente de mtodos FTIR para el anlisis de pesticidas a nivel de traza. Se ha de tener en cuenta que la mayora de los pesticidas controlados en aguas estn presentes en nivelesdemgL1 gL1yportantoexigenlautilizacindetcnicasmuysensibles.Porotra parte, es necesaria una separacin previa de los analitos para incrementar la selectividad; adems esta etapa puede aprovecharse para preconcentrar el analito aumentando as la sensibilidaddelanlisis.Aspues,laadaptacindelaespectrometraFTIRalanlisiseneste contexto debe realizarse a travs de: i) la mejora de la sensibilidad y ii)lapuesta a punto de procedimientos de preconcentracin sencillos y cmodos que impliquen el empleo de disolventesadecuados.
95
La extraccin en fase slida (SPE) es una alternativa a la extraccin lquidolquido que tradicionalmente ha sido empleada para la preconcentracin de analitos. Su utilizacin acoplada a la espectrometra FTIR permite ampliar las posibilidades de esta tcnica de anlisis, especialmente en lo que se refiere a la mejora de la sensibilidad. Por otra parte, la espectrometra FTIR empleando el modo de medida en continuo presenta ventajas en cuanto a la frecuencia de anlisis y a la manipulacin de las muestras. A pesar de ello, un mtodo con medidas en continuo no siempre es ms prctico y rpido que un mtodo en modo batch; por lo tanto, es preciso evaluar en cada caso la conveniencia de utilizar una u otraestrategia. El methidathion es un insecticida organofosforado no sistmico ampliamente utilizadoeneltratamientodefrutalesperoqueresultaaltamentetxicoparalosorganismos acuticos (Extoxnet, htm). Por su parte, el tricylazole es un fungicida sistmico utilizado en el cultivo del arroz (Kawai, 1989). Ambos pesticidas son muy utilizados hoy en da en nuestro pas; adems, a partir de nuestros estudios previos se haba demostrado que sus caractersticasespectralesenel IRlosconvertan enbuenoscandidatos para llevar acabo su determinacinenmuestrasacuosasabajosnivelesdeconcentracin. La mayora de los mtodos desarrollados recientemente para el anlisis de pesticidas en aguas estn orientados hacia el anlisis multicomponente, sobre todo los que utilizantcnicascromatogrficasacopladasalaespectrometrademasas(Petrovic,2003).De hecho, tan slo hay unos pocos precedentes directos sobre la determinacin en lnea de pesticidas por espectrometra FTIR (Daghbouche, 1995; Daghbouche, 1997). Por tanto, cabe preguntarsesilasdesventajaspropiasdelaespectrometraFTIRenestecampodeaplicacin justifican la ausencia de mtodos propuestos. En este sentido, en este trabajo se desarrollan paso a paso dos mtodos FTIR similares, uno para la determinacin de methidathion y otro para el tricyclazole, a nivel de mg L1 en aguas, estudiando en profundidad los parmetros propios de la preconcentracin en fase slida, y comparando la elucin y determinacin en lneaconlaelucinydeterminacinenbatchdecadaanalito. 96
RESUMENYDISCUSIN En este trabajo se proponen dos mtodos deanlisis, uno para la determinacin de methidathion y otro para la determinacin de tricyclazole en aguas, mediante el empleo de la extraccin en fase slida, la elucin en lnea y medidas por espectrometra FTIR en modo continuo. Ensayos previos haban mostrado que el methidathion en solucin acuosa era fuertementeretenidoporunafaseslidadeltipoC18,mientrasqueeltricyclazoleloerapor la fase C8. Adems, ambos analitos podan eluirse fcilmente empleando cloroformo. En este sentido, uno de los objetivos del trabajo era comprobar el comportamiento de dos analitosqumicamentediferentesydedosfasesslidasdediferentepolaridadenunmtodo SPEenlnea. En una primera etapa se seleccionaron los parmetros correspondientes a las medidas en batch (criterios de medida, resolucin, nmero de scans), para pasar despus al estudio de los parmetros referentes a la extraccin en fase slida en lnea. Finalmente se compararon los resultados obtenidos mediante el procedimiento que utiliza la elucin y medida en batch de los extractos conlos resultados obtenidos medianteelucin y medidaen continuo. Comosehaindicado,seestudiaronlascaractersticasespectralesenelIRmediode ambos pesticidas. Como puede verse en la Figura 38, el methidathion en disolucin de cloroformo presenta una banda de absorcin intensa debido al grupo carbonilo (1696 cm1), entre otras. Sin embargo, la presencia de agua interfiere en la zona cerca de 1600 cm1, desaconsejando su uso para la determinacin del analito. La banda a 1022 cm1 correspondiente al grupo ter result ser la ms adecuada para la determinacin del methidathion. Se evaluaron diversos criterios de medida, seleccionando finalmente el rea de pico entre 1038 y 996 cm1 corregida con una lnea base establecida entre 1105 y 884 cm1. Por otra parte, el tricyclazole (Figura 39) presenta slo una banda susceptible de ser utilizada para su cuantificacin, a 1495.1 cm1. El estudio de diferentes criterios de medida condujo a seleccionar el rea de pico entre 1511 y 1482 cm1 corregida con una lnea base
97
establecida entre 1526 y 1534 cm1 como criterio ms adecuado para la cuantificacin de tricyclazole. La seleccin de los parmetros resolucin nominal y nmero de scans acumulados porespectroselleva cabo mediantelos estudios correspondientes,siendo 8cm1 y 50scans los valores seleccionados para ambos analitos.Porotra parte,result sernecesarioelsecado de los cartuchos SPE con una corriente de nitrgeno durante hora y media para evitar la interferenciadelaguaenlaetapademedidadespusdelaelucin.
0,12
0.12 0.10 A B 0.08 S O 0.06 R B A 0.04 N C 0.02 I A 0.00
0,10 0,08 A B S
0,06 0,04
0,02 0,00 1150 1100 1050 1000 950 900 850 Nmero de onda (cm-1)
B C 3500 3000 2500 2000 1500 1000 -1 Nmero de onda (cm )
Figura 38. Espectros FTIR de A) un patrn de 0.63 mg g-1 de methidathion en cloroformo, B) eluato obtenido tras la preconcentracin en un cartucho de C18 de100 mL de una muestra acuosa conteniendo 7.95 mg L-1 de methidathion eludo con 2 mL de cloroformo y C) blanco de cloroformo. Condiciones de medida: 50 scans acumulados y 8 cm-1de resolucin nominal. Inset: detalle de la regin espectral utilizada para la cuantificacin del methidathion.
UnavezestablecidaslascondicionesmsadecuadasparalamedidaenelIRmedio se estudiaron los parmetros propios del porceso de extraccin y preconcentracin en fase slida. Se seleccionaron los valores de masa de fase slida (C18 para el methidathion y C8 para el tricyclazole), efecto de la fuerza inica, masa de analito retenida y caudal de muestreo, empleando para ello disoluciones acuosas conteniendo los pesticidas considerados.
98
0.10 A 0.08 B S O 0.06 R B A 0.04 N C I 0.02 A 0.00 1800 1600
C 1400 1200 1000 -1 Nmero de onda (cm )
Figura 39. Espectros FTIR de A) un patrn de 0.65 mg g-1 de tricyclazole en cloroformo, B) eluato obtenido de la preconcentracin en un cartucho de C8 de100 mL de una muestra de agua conteniendo 6.09 mg L-1 de tricyclazole eludo con 2 mL de cloroformo y C) blanco de cloroformo. Las condiciones de medida son las mismas que en la Figura 40.
El procedimiento de retencin en lnea, para ambos analitos, consiste en hacer pasar con un caudal determinado un volumen de la muestra a travs de un cartucho cargado con la fase slida correspondiente. Para ello se utiliza una bomba peristltica de modo que la carga de la muestra acuosa se realiza con caudal constante. La elucin en batch se realiza haciendo pasar un volumen de 2 mL de cloroformo a travs del cartucho, previamente secado con una corriente de nitrgeno, mediante una jeringa. La masa de C18 seleccionada fue de 100 mg, mientras que de C8 fue 200 mg. Para ambos analitos se verific quelafuerzainicadelamuestranoafectabaalaretencindelanalito,utilizandomuestras alasquesehabaadicionadoclorurosdicoonitratopotsicoanivelesentre0.57%(m/m). El valor de saturacin encontrado fue de 2.94 mg de methidathion por 100 mg de C18 y 2.3 mg de tricyclazole por cada 200 mg de C8. Para ambos analitos se fij un volumen de muestra para preconcentrar igual a 100 mL. En cuanto al caudal de muestreo, se seleccion un caudal de 10 mL min1 en el caso del methidathion y de 2.1 mL min1 en el caso del tricyclazole.
99
Por el procedimento desarrollado basado en la retencin en fase slida y elucin y medida en batch, se analizaron una serie de muestras acuosas contaminadas con methidathion a niveles de 3.158.28 mg L1, siendo los resultados plenamente satisfactorios. Tambin se realiz un estudio similar para el tricyclazole, obteniendo resultados vlidos. A continuacin se decidi poner a punto un procedimento de elucin y medida en lnea para ambosanalitosconlafinalidaddecomprobarsimejorabanlascaractersticasanalticas. En la Figura 40 se presenta el montaje experimental utilizado para la elucin y medida en lnea de los pesticidas. Consta de una bomba peristltica que impulsa el disolvente y de dos vlvulas direccionales de tres vas que posibilitan que el cloroformo circule directamente hacia la celda de medida o que atraviese el cartucho en el que est concentrado el correspondiente pesticida. Para obtener el background se hace pasar el disolventeporelbypassentrelasvlvulas1y2hacialaceldademedida.Deestamanerase llena el loop de 2 mL. Una vez registrado el background se invierte el sentido de la bomba y se coloca la vlvula 2 en la posicin que conduce el flujo hacia el cartucho, llenndose ste con el disolvente contenido en el loop. Finalmente se invierte el sentido del flujo de nuevo y secambiade posicin la vlvula 1, de maneraqueporla parte inferiordelcartuchoeluyeel analitohacialaceldaFTIRmientrasqueporlapartesuperiorentradisolventefresco. En estas condiciones se registran de manera continua los espectros FTIR, procesndolos con el criterio de medida de cada analito que previamente se haba establecidoenlosprocedimientosenbatch. Como se ha sealado, el cartucho se llena desde la parte inferior para que as se desplace el aire presente en los intersticios de la fase slida, minimizando la presencia de burbujas en el eluato durante la etapa de medida en funcin del tiempo. Para ambos pesticidas se seleccion un caudal de llenado de 0.43 mL min1 como el ms adecuado, y las medidas en continuo se realizaron acumulando 10 scans por espectro, como compromiso entreunabuenarelacinsealruidoyunaadecuadaresolucintemporal.
100
Vlvula 1
Bomba peristltica
cartucho Cloroformo
2 mL loop
Residuos Micro-celda de flujo FTIR
Vlvula 2
Figura 40. Montaje experimental utilizado en la elucin y determinacin en lnea de methidathion y de tricyclazole.
Seestudielcaudaldeelucinparaambosanalitos,encontrandouncaudalde0.66 mL min1 como el ms adecuado para la elucin del methidathion y un valor de 0.75 mL min1 para la elucin del tricyclazole. Estas diferencias se producen probablemente por la diferente masa de fase slida utilizada en cada caso (100 mg de C18 y 200 mg de C8, respectivamente) y en la naturaleza de las interacciones analitofase slida, debido a las diferenciasdepolaridadexistentesentrelosanalitosylasfasesutilizadas. Finalmente se analizaron varias muestras segn los procedimientos desarrollados para ambosanalitosconelucin ymedidaen lnea. En el casodelmethidathion,ellmite de deteccin conseguido fue de 0.3 mg L1, superior a los lmites mximos tolerados por la legislacinespaola(RealDecreto,1986),mientrasqueparaeltricyclazolefuede0.1mgL1. Tanto para el methidathion como para el tricyclazole se utiliz como variable dependiente del calibrado el rea de pico de elucin correspondiente al registro de la seal frente al tiempo.Unamuestraconteniendo7.67mgL1demethidathion,diocomoresultado7.50.7 mg L1, y otra muestra conteniendo 7.70 mg L1, dio un contenido de 8.0 0.7 mg L1. As se obtuvieron errores relativos del 2.2 y del 3.9 % respectivamente. Por otra parte, una muestra con 6.09 mg L1 de tricyclazole dio como resultado 6.1 0.3 mg L1 que supone un errordel0.2%.Estosresultadosindicaronquelosmtodos,aunsiendomuymejorables,son
101
vlidos para muestras con importantes contenidos de estos pesticidas pero que, a pesar de ello, no podran ser analizadas de forma directa por espectrometra FTIR (por ejemplo, mediantemedidadereflectanciatotalatenuada). Puesto que el principal objetivo de este trabajo era la evaluacin de las posibilidades del acoplamiento SPEespectrometra FTIR para el anlisis de pesticidas a nivel de traza y los problemas asociados a su aplicacin y adaptacin al anlisis en lnea, se compararon las caractersticas analticas de los mtodos en batch y en lnea desarrollados en el trabajo. En la Tabla 9 se resumen estas caractersticas. Y, aunque los procedimientos en lnea permiten reducir la manipulacin de las muestras, evitan la contaminacin cruzada y reducen la exposicin a los reactivos txicos por parte del analista, en este caso resultan menosprcticosquelosprocedimientosenbatch.Considerandoqueelvolumenderesiduos generadosyeltiempodeanlisisseincrementannotablemente,resultamsventajosoeluso delosmtodosenbatch. Por otra parte, la utilizacin de la espectrometra FTIR acoplada a la SPE no representa en este campo de aplicacin ninguna alternativa a los mtodos clsicos cromatogrficos. Las limitaciones derivadas de la baja sensibilidad de la tcnica, las dificultades que presentaran muestras reales con abundante contenido de materia orgnica (en trminos de interferencias espectrales) ylas limitaciones para determinar varios analitos almismotiempo,justificanlacarenciaobservadademtodosFTIRenestetipodeanlisis. CONCLUSIONES En este trabajo se han propuesto dos mtodos de anlisis para la determinacin en aguasdemethidathionydetricyclazolemediantelapreconcentracinenfaseslida,elucin y medida en lnea por espectrometra FTIR. Se han evaluado los parmetros experimentales y se han analizado muestras sintticas. Aunque los resultados han sido satisfactorios en trminos de exactitud y precisin, la elucin y medida en lnea resulta incmoda y poco prctica frente a la elucin y medida en modo batch. Por otra parte, las limitaciones
102
intrnsecasalatcnicaFTIRsugierenunusomuyespecficodelosmtodosdesarrolladosen elcampodelcontroldecalidad.
Mtodo FT-IR batch Parmetro Methidathion Y= (0.024 0.007) Calibrado + (3.592 0.013)CM (mg g-1) R2 0.9997 Tricyclazole Y= (0.062 0.012) + (2.34 0.03)CT (mg g-1) 0.997 Methidathion Y= (0.18 0.07) + (0.393 0.010)CM (mg L-1) 0.992 Tricyclazole Y= (0.09 0.04) + (4.88 0.08)CT (mg L-1) 0.997 Mtodo FT-IR en lnea
RSD %
0.04
0.15
2.8
3.3
LOD
0.07
0.2
0.3
0.1

c
12
12
Residuos
mL
200
200
700
700
Tabla 9. Caractersticas analticas para los mtodos FTIR en batch y en lnea desarrollados en este trabajo.
a b c
Desviacin estndar relativa para n=3. Lmite de deteccin para k=10, en mg L-1. Volumen calculado para100 rplicas.
3.2.Determinacindegrasaenlecheenpolvoconextraccinpresurizadacondisolvente
INTRODUCCIN El contenido de grasa tiene un importante papel en los aspectos nutricionales de la lechey, consecuentemente,ensu calidad.Elefectodelconsumo degrasasse harelacionado con las enfermedades coronarias. Por otra parte, la posibilidad de la adulteracin de los alimentoscongrasasdenaturalezadiferentealaesperadarequieremtodosdeanlisispara su prevencin y control. Los mtodos tradicionales para la determinacin de grasa en leche
103
se basan en i) extraccin y medida gravimtrica, ii) otros ensayos fsicos, iii) turbidimetra, iv)espectrometra.
Los mtodos clsicos gravimtricos como el de RseGottlieb o el Mojonnier son complicados y requieren mucho tiempo, con un consumo de reactivos importante y una generacin de residuos elevada, ya que requieren una hidrlisis para separar la grasa del resto de componentes y de posteriores extracciones sucesivas con disolventes orgnicos. Modificaciones de los mtodos gravimtricos son los que incluyen extraccin con fluidos supercrticos (LaCroix, 2003), extraccin asistida con microondas (RuizJimnez, 2004) y extraccin acelerada o presurizada con disolvente (Dionex, 2000; Richardson, 2001). Estos ltimosmtodoseliminanlaetapapreviadehidrlisisyacortaneltiempodeanlisis. La espectrometra FTIR se ha aplicado a la determinacin de grasas y aceites en diversas matrices (Daghbouche, 1997b). Esta tcnica instrumental ofrece ventajas respecto a la gravimetra puesto que reduce extraordinariamente el tiempo de anlisis y lo simplifica. Por otra parte, la extraccin presurizada con disolvente (PSE, ASE) representa una buena alternativa a las tcnicas clsicas de extraccin, como la de Soxhlet, que requieren tiempos de extraccin de varias horas. En el caso de los mtodos PSE, los tiempos de extraccin tpicos son del orden de 15 min. Las ventajas en estas aplicaciones son evidentes, por tanto, en trminos de velocidad de anlisis. Mtodos ASE o PSE se han aplicado con xito a la determinacin de lpidos en carne (Toschi, 2003), oxiesteroles en alimentos derivados del huevo (Boselli, 2001), gestgenos en grasa de hgado (Hooijverink, 2003) y otros como pesticidasenpiensos(Chen,2003),mostrandolagranversatilidaddeestatcnica. El objetivodeeste trabajo esmostrar las ventajasdel acoplamientode laPSEconla espectrometra FTIR para la determinacin de grasa en leches en polvo, con el fin de aumentar la velocidad de anlisis y reducir los residuos generados, en relacin con los mtodos gravimtricos clsicos. Tambin se investiga la posibilidad de discriminar diferentestiposdegrasassegnsuorigenatravsdelestudiodesuespectroFTIR. 104
RESUMENYDISCUSIN En este trabajo se desarrolla un mtodo PSEFTIR para la determinacin de grasa en leche en polvo. Adems se aplica a otros tipos de muestras para comprobar si es posible llevar a cabo una diferenciacin en funcin de la naturaleza de la grasa presente. Con el fin de evaluar la versatilidad del procedimiento propuesto, se incluye el estudio del contenido de grasa en chocolates con diferente porcentaje de cacao, a travs de la determinacin de la grasamedianteunmtodoPSEFTIRespecfico. En primer lugar se estudian los parmetros relativos al procedimiento de la extraccin,estoes,lamasademuestra,tipodedisolvente,elnmerodeciclosdeextraccin y la duracin de los mismos. Como extractante se utiliza una mezcla de hexano, diclorometano y metanol en proporcin 3:2:1 en volumen, mezcla que permite la extraccin selectivadelagrasasinrecurriralahidrlisisprevia,debidoalanaturalezaapolarpolarde los disolventes. Se seleccion una masa de muestra de 1.75 g y 3 ciclos de extraccin de 1 min como las condiciones ms adecuadas para llevar a cabo el proceso, siguiendo el criterio decompromisoentrerapidez,cuantitatividadyprecisindelanlisis. Unavezaseguradalaextraccintotaldelagrasadelasmuestrasdelecheenpolvo, sepasafijarlascondicionesdemedidaenelIRmediantelosestudioscorrespondientes.En la Figura 41 semuestra el espectro FTIR deun extracto, obtenido empleando una mezcla de hexano, diclorometano y metanol en proporcin 3:2:1 como extractante y como disolvente de medida en el IR medio. Como puede observarse, aparece una banda intensa a 1750 cm1 correspondiente al carbonilo del enlace ster. Por otra parte, el disolvente absorbe fuertemente en la regin de las tensiones alifticas (28503025 cm1) y por tanto esta regin queda excluida para su empleo en la determinacin de grasa. Se aprecia una interferencia importante en la regin alrededor de 1640 cm1, correspondiente a la absorcin del grupo amida de las protenas extradas junto a la grasa que, como se ver ms tarde, sea posiblemente la causa de los errores encontrados en la determinacin de la grasa en leches enpolvodesnatadas.Seevaluarondiferentescriteriosdemedidacomoalturaoreadepico, corregidas con distintas lneas base. Finalmente se seleccion el rea de pico entre 1774.2 y 105
1712.5cm1corregidaconunalneabaseestablecidaentre1805.0y1581.3cm1.Estaseleccin de la lnea base permite reducir en gran parte el efecto interferente de la banda amida, aunquenopudoeliminarseporcompleto.
0.4
0.3 A B S O R B A N C I A
0.2
C 0.1 B 0.0 A 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
-1 Nmero de onda (cm )
Figura 41. Espectros FTIR de extractos obtenidos mediante PSE correspondientes a: A) blanco de disolvente (mezcla de hexano, diclorometano y metanol en proporcin 3:2:1, B) 2.00 g de una muestra de leche desnatada en polvo con < 1 % (m/m) de materia grasa y C) 1.75 g de una muestra de leche entera en polvo con un 26.48 % (m/m) de materia grasa. Las condiciones de medida son 50 scans acumulados, resolucin nominal de 8 cm-1.
A continuacin se aplic el mtodo desarrollado a diferentes tipos de alimentos slidos, como leches en polvo enteras y desnatadas, leches infantiles en polvo, salmn liofilizado, avellanas, nueces, piel de pollo y tocinodecerdo. El objetivo delestudio de este conjunto amplio de muestras era la clasificacin rpida de las grasas a travs de la comparacin de los espectros FTIR correspondientes. En este sentido se observaron diferencias notables entre las grasas de diferente origen (animal o vegetal). Las regiones espectrales utilizadas en la comparacin son aquellas que presentan ms informacin, es decir, entre 1797.6 y 1511.6 cm1, entre 1399.3 y 1282.9 cm1, entre 1227.1 y 1072 cm1 y entre 1003.0 y 847.9 cm1. La fuerte absorcin del disolvente impide el uso de las regiones entre 1400y1500cm1,1300y1225cm1yentre1070y1000cm1.
106
Con el fin de estudiar si existen diferencias entre los espectros FTIR del extracto graso procedente de distintos alimentos se procedi al anlisis de diferentes muestras de naturaleza variada. Tomando como referencia el espectro de la fraccin grasa de la leche en polvo se cre una biblioteca de espectros y, tomando los espectros del resto de muestras, se sometieron a un proceso de identificacin con el fin de establecer el ndice de correspondencia y evaluar si un programa genrico de gestin de biblioteca de espectros, habitual en los paquetes de software que acompaan a la instrumentacin actual, permita la clasificacindelosespectrosenfuncindelorigendelagrasaydeesemododiscernirentre diferentesclasesdelamisma. La clasificacin realizada con la biblioteca de espectros mostr que los espectros con menor similitud con los de las leches enteras eran los de las leches desnatadas, posiblemente debido a la menor cantidad de grasa y a la interferencia espectral que supone en estas condiciones la presencia la banda amida. El extracto de tocino de cerdo present una similitud con los otros espectros por debajo del 99 % de correspondencia. Sin embargo, elespectrodegrasadepollospresentcorrespondenciasporencimadel99%parauntotal de 17 espectros de muestras diferentes. Esto supone que este tipo de grasa resulta difcil de discriminar del resto de grasas estudiadas. El extracto de salmn tampoco present similitudes mayores del 99 % con ningn otro espectro. Por el contrario, los espectros FTIR del extracto de la avellana y de la nuez presentan grandes similitudes entre ellos y el de la avellana todava presenta correspondencias superiores al 99 % con ocho espectros de extractos de diferente origen. As pues, queda constatado el hecho de que la discriminacin de las grasas es posible sin recurrir a mtodos quimiomtricos complejos, en primera aproximacin, aunque se observan problemas de identificacin entre extractos que tienen caractersticasespectralesmuysimilares. Se analiz un conjunto de muestras de leche en polvo por el mtodo propuesto basadoenlaextraccinpresurizadacondisolventeymedidaFTIR.Elcalibradoseconstruy a partir del extracto graso obtenido de muestras de leche. Las mismas muestras tambin fueron analizadas por un mtodo de referencia gravimtrico basado en la extraccin slido lquido convencional. Finalmente tambin se consider la determinacin gravimtrica de la 107
grasaapartirdelextractoobtenidomedianteelmismoprocedimientoPSEempleadoparala determinacin FTIR. En la Tabla 10 aparecen los resultados obtenidos y como puede verse, paralasmuestrasdelecheenteralosresultadossonsatisfactoriosmientrasqueenelcasode la leche desnatada el mtodo propuesto presenta errores elevados, posiblemente debido a interferenciasdetipoespectralcomoconsecuenciadelabajasealdelagrasa.
Muestra PSE-FTIR Mtodo de referencia gravimtrico 27.48 0.03 PSE gravimtrico 27.27 % Diferencia (FTIR-PSE gravimtrico) 0.78 % Diferencia (FTIR-mtodo referencia) 0.00
27.48 0.06
26.49 0.09
26.08 0.11
25.81
2.64
1.59
26.69 0.05
26.40 0.04
26.11
2.19
1.10
0.36 0.03
0.86 0.02
0.36
-0.19
-58.58
0.000 0.019
0.77 0.03
0.22
-100.23
-100.10
0.411 0.003
0.613 0.009
0.56
-26.07
-32.96
Tabla 10. Resultados obtenidos para la determinacin de materia grasa en leches en polvo enteras (1-3) y en desnatadas (4-6), mediante el mtodo PSE-FTIR desarrollado, el mtodo de referencia gravimtrico y el mtodo PSE gravimtrico.
El mtodo desarrollado tiene un lmite de deteccin del 0.004 % (m/m). Las principalesventajasquepresentasonelincrementoconsiderabledelafrecuenciadeanlisis (12 h1 frente a 4 h1) al eliminar las extracciones sucesivas y las lentas extraccin y determinacin gravimtricas tpicas de los mtodos de referencia. Adems reduce el volumen de residuos generados (12 mL frente a 131.25 mL por cada rplica) y minimiza la manipulacindelamuestraydedisolventestxicosporpartedeloperador. Empleando el calibrado obtenido a partir de la grasa de la leche se procedi a determinarelcontenidode grasa en los alimentos estudiadosen laclasificacinespectral ya comentada, adems de en distintos tipos de quesos. Los resultados no fueron satisfactorios 108
en trminos de exactitud, debido fundamentalmente a dos razones: i) el calibrado utilizado no es vlido por ser representativo slo de la grasa de leche y ii) las condiciones de extraccinnoestnoptimizadasyportantopuedenextraerseotrassustanciasquedanlugar a interferenciasde tipo espectral. Por tanto se concluy quecadatipo demuestranecesitaba mtodos especficos de anlisis, conclusin un tanto previsible considerando la naturaleza de la grasa de cada alimento, as como el estado en el que se encuentran, que supone en ocasioneslanecesidaddetratamientosespecficosquepermitenliberarlagrasadelamatriz y su posterior extraccin con el disolvente adecuado. Finalmente se trat de evaluar la capacidad del acoplamiento PSEFTIR para resolver un problema, el de la correlacin entre porcentaje de cacao y contenido en materia grasa de los chocolates. Para ello se desarroll un procediminto especfico para el anlisis de chocolates, basado en mtodos PSE gravimtricos preexistentes, adaptndolos a la cuantificacin por espectrometra FTIR. Se analizaron 10 muestras diferentes encontrando una relacin lineal entre las variables contenido de cacao y contenido de grasa. El calibrado utilizado para la determinacin FTIR fuepreparadoapartirdeextractosdechocolatede99%decontenidoencacao.Sinembargo tambin se encontraron diferencias importantes entre los resultados obtenidos mediante la extraccin PSE y determinacin gravimtrica (de referencia) y los obtenidos por espectrometraFTIR. CONCLUSIONES En este trabajo se ha desarrollado un mtodo PSEFTIR para la determinacin de grasa en leches en polvo, siendo comparado con el mtodo de referencia gravimtrico. Los resultados obtenidos para leches enteras son adecuados en trminos de exactitud y precisin, no siendo as para las leches desnatadas. Los errores encontrados en stas se deben probablemente al tipo de calibracin utilizado. El mtodo resulta claramente ventajoso frente al mtodo de referencia si se aplica a leche en polvo entera, al reducir el volumen de residuos generados y aumentando considerablemente la frecuencia de anlisis. Por otra parte, se han estudiado las similitudes y diferencias entre extractos de grasa de diverso origen con el fin de disponer de una estrategia rpida para la discriminacin de las grasas.Cuandoelmtodo propuestoparaelanlisisdelechesehaaplicado aotrostipos de 109
alimentos los resultados obtenidos por medida FTIR difieren de los encontrados por determinacin gravimtrica a pesar de que la estrategia de extraccin es idntica. Esto hace suponer que la causa de los errores encontrados se debe, fundamentalmente, a la estrategia decalibracinempleada.Unestudiofinalquerelacionaelcontenidodegrasayelcontenido de cacao en chocolates completa el trabajo mostrando las posibilidades de la espectrometra IRparasuaplicacinenelcampodelanlisisdecontroldecalidadenalimentos.
110
4. Tratamiento en lnea de la muestra: determinacin de succinato dedoxilaminaenespecialidadesfarmacuticas
INTRODUCCIN Una de las lneas de investigacin seguidas en nuestro grupo se ha orientado hacia la determinacin de principios activos en especialidades farmacuticas. Disponamos de especialidades en presentacin de pastillas con succinato de doxilamina en su composicin, sustancia antihistamnica y sedante utilizada en productos de amplio consumo entre la poblacin, como es el caso de la especialidad farmacutica comercializada bajo la denominacinde Dormidina. No exista ningn mtodo FTIR para la determinacin de este frmacoylosestudiospreviossugeranunadeterminacinsencillaenelMIRaprovechando susolubilidadencloroformo,disolventemuytransparenteenestaregindelIR. Por otro lado, la disminucin o eliminacin de los disolventes clorados en el anlisis por espectrometra FTIR es una exigencia del trabajo en nuestro grupo que se enmarca dentro delasdirectrices establecidasporelProtocolodeMontreal. En estesentido, los mtodos de anlisis en flujo FTIR (Curran, 1985; de la Guardia, 1992; Daghbouche, 1997; Bouhsain,1999)suponen unmenorconsumodedisolventequelosmtodosenmodobatch, entre otros rasgos ventajosos. En los ltimos aos se han introducido mtodos de anlisis FTIR en flujo para la determinacin de principios activos de compuestos farmacuticos, como es el caso del octil succinato (Morgan, 1985), ibuprofeno (Garrigues, 1993b), dimenhidrinato (Bouhsain, 1995), ketoprofeno (SnchezDas, 1998), paracetamol (Ramos, 1995; Bouhsain, 1996; Ramos, 1998) y cafena y cido acetilsaliclico (Garrigues, 1993a). La experiencia previa de extraccin en lnea (Bouhsain, 1999) nos sugiri la puesta a punto de un mtodo de extraccin y anlisis en lnea que utilizara una cantidad mnima de cloroformo con el fin de aplicarlo al anlisis de frmacos. De esta manera se superaran los inconvenientes complejidad tcnica, lentitud, difcil automatizacin de los mtodos preexistentes para la determinacin del succinato de doxilamina, a saber, cromatogrficos
111
(Hansen,1985;Argekar,1999; Argekar,1999b),MS(Josephs,1995),conelectroforesiscapilar (Tang,2000)yconespectrometraUVenmediomicelar(MonferrerPons,1996). Como se ver, el procedimiento desarrollado no slo permite el tratamiento en lnea de la muestra, sino que tambin ofrece la posibilidad de llevar a cabo una adicin en lnea de un estndar. Se propone tambin la coadicin de espectros en el tiempo como estrategia para la obtencin de seales estables sin necesidad de esperar a que se alcance el estado estacionario, teniendo en cuenta la dilucin y homogeneizacin de las disoluciones dentrodelsistema. RESUMENYDISCUSIN EnestetrabajoseproponeunnuevomtododeanlisisFTIRparaladeterminacin del principio activo succinato de doxilamina en preparados farmacuticos. La peculiaridad del mtodo reside en la extraccin en lnea del analito, proceso del que se realiza un seguimiento en continuo. En primer lugar se desarrolla el mtodo FTIR en modo batch y a continuacin se adapta al modo continuo incluyendo la extraccin en lnea del succinato de doxilamina. A continuacin consideraremos brevemente los aspectos ms importantes del desarrollodelmtodoFTIRpropuestoenestetrabajo. Los ensayos preliminares mostraron que el succinato de doxilamina presentaba unas bandas caractersticas, fcilmente identificables en los espectros de extractos en cloroformo de la especialidad farmacutica. En la Figura 42 se muestran los espectrosde un extractodemuestra yde unpatrn de succinato dedoxilamina.Comopuedeverse,aparece una banda intensa hacia 1720 cm1, correspondiente al pico del grupo carboxilo de la molcula de succinato, mientras que hacia 16001400 cm1 aparecen las bandas de deformacin de los enlaces de la doxilamina y del succinato. Con el fin de seleccionar el criterio de medida ms adecuado para la determinacin del succinato de doxilamina se realiz el estudio correspondiente, encontrando como mejores condiciones de las ensayadas el valor de la suma de rea entre 1710 y 1730 cm1 ms el rea entre 1462 y 1485 cm1, corregidasconunalneabaseestablecidaentre1800y2000cm1. 112
0.060
0.050
0.040
0.030
A
0.020
B
0.010
C
-0.000
1900
1800
1700
1600
1500
1400
1300
Nmero de onda (cm -1)
Figura 42. Espectros FTIR de: A) un patrn de succinato de doxilamina de 4.24 mg mL-1 preparado en una mezcla al 13 % (v/v) de etanol en cloroformo, B) un extracto de una muestra en la misma mezcla, correspondiente a 4.51 mg mL-1 de succinato de doxilamina y C) blanco del disolvente. Las condiciones de medida son 10 scans acumulados, 8 cm-1 de resolucin nominal.
A continuacin se estudiaron las condiciones de extraccin (en modo batch), a saber, la composicin del disolvente, el tiempo y el tipo de agitacin (mecnica o por ultrasonidos). Pruebas realizadas previamente indicaron que, a pesar de la aceptable solubilidad del succinato de doxilamina en cloroformo, la extraccin no era completa si se empleaba slo este disolvente (77.9 1.4 % de extraccin para 5 rplicas de una muestra). Segn estos resultados, el cloroformo por s solo no es capaz de extraer todo el succinato de doxilamina,quepermaneceretenidoenlamatriz,mspolar. En este punto se decidi evaluar el efecto de la polaridad del disolvente en el rendimiento de la extraccin. Para ello se ensayaron diferentes mezclas de etanol en cloroformo. De esta manera se consigui aumentar el rendimiento de la extraccin hasta alcanzar valores prximos al 100 %, para la mezcla al 13 % (v/v) de etanol en cloroformo. El hecho de que un aumento de la polaridad facilite la extraccin se debe probablemente a la naturalezapolar/apolardelparinicoqueeselsuccinatodedoxilamina.
113
Por otra parte, el estudio del efecto de la agitacin sobre el rendimiento de la extraccin mostr que era innecesario cualquier tipo de agitacin para conseguir la extraccin completa del analito empleando la mezcla al 13 % (v/v) de etanol en cloroformo. Este hecho sugiri la posibilidad de adaptar posteriormente el mtodo FTIR en modo batch almodoconextraccinenlnea. Para establecer condiciones de medida ms adecuadas se estudi el efecto de la resolucin nominal y del nmero de scans acumulados por cada espectro. Ambos estudios se llevaron a cabo tanto para un patrn como para una muestra tratada con cloroformo conteniendo un 13 % de etanol. Se seleccion finalmente una resolucin de 8 cm1 y 10 scans acumuladosalofrecerestascondicioneselmejorcompromisoentresensibilidad,precisiny rapidezenlamedida. Finalmente se aplic el mtodo FTIR en modo batch al anlisis de muestras y se compararon los resultados obtenidos con los del mtodo de referencia. Ambos mtodos resultaron ser comparables. Por otro lado, los estudios de recuperacin realizados demostraron la exactitud del mtodo FTIR, al encontrarse recuperaciones alrededor del 100 % en todos los casos. En consecuencia, se decidi dar un paso ms y adaptar el mtodo desarrolladoparalograrlaextraccinydeterminacinenlneadelsuccinatodedoxilamina, conelobjetivodereducireltiempodeanlisisylamanipulacindelasmuestras. En la figura 43 se muestra el esquema del montaje experimental diseado para la extraccin y determinacin en lnea del succinato de doxilamina. Veremos a continuacin el funcionamientodeestesistema. El cartucho conteniendo 50 mg de la muestra se inserta en el bucle de extraccin y, manteniendo la vlvula de inyeccin en posicin de carga y la vlvula direccional de 3 vas enposicinabierta,secargaelbucledeldisolventedeextraccinconlamezclade2.6mLde etanol en cloroformo al 13 % (v/v). A continuacin se inserta el disolvente en el cartucho conectando la vlvula direccional de 3 vas y dejndola cerrada, mientras la vlvula de 6 vas se coloca en posicin de carga del cartucho, registrando el background del disolvente en 114
ese momento. Despus se coloca nuevamente la vlvula de 6 vas en posicin de extraccin (equivalente a la de carga del bucle de disolvente) y se registran los espectros en modo continuoenfuncindeltiempoenelintervalode4000a600cm1obteniendoelregistrodela seal frente al tiempo correspondiente al rea de los espectros comprendida entre 1730 y 1710cm1,corregidaconunalneabaseestablecidaentre2000y1800cm1.
Inyector
Bomba peristltica Cartucho de extraccin micro-celda de flujo Vlvula direccional de tres vas
Vlvula de 6 vas Bucle
Bomba peristltica Disolvente
Residuos
Extraccin de la muestra Direccin del flujo Etapa de llenado del bucle Etapa de limpieza del sistema
Figura 43. Esquema del montaje para la extraccin y determinacin en lnea de succinato de doxilamina.
En este sistema, el disolvente recircula a travs de la celda de flujo y la muestra mientras se lleva a cabo la extraccin. Por tanto es posible verificar la consecucin completa de la extraccin en continuo. El calibrado externo se puede preparar mediante inyecciones
115
sucesivasde25Ldeunadisolucinpatrnde50mgmL1desuccinatodedoxilaminaenel mismomontajedescritoparalaextraccinencontinuoperoconelcartuchovaco.
El tratamiento en lnea de la muestra supone que el analito sea extrado a medida que el disolvente atraviesa el sistema. Como ya se ha indicado, la variacin de la concentracin se verifica a partir del registro continuo de los espectros FTIR. Conforme el disolvente recircula por el circuito cerrado atravesando el cartucho que contiene la muestra, lasealregistradaseaproximaaunvalorconstante,valorquesesuponecorrespondienteal estado estacionario.En tal estado estacionario,noslosehaextradolatotalidaddelanalito yportantoseencuentrasteendisolucin,sinoquetambinsuconcentracinalolargodel sistema se hace constante. La primera fraccin que atraviesa la muestra extrae el analito en gran proporcin y por tanto la concentracin de la disolucin es mxima en el frente del disolvente. Las siguientes fracciones contienen cada vez una menor proporcin de analito, porloquelaconcentracinenundiferencialdevolumenescadavezmspequea.Cuando todoelvolumenhaatravesadoelsistema,vuelveaaumentarlaconcentracindetectadapor el espectrmetro y as sucesivamente, dando como resultado una curva de tipo sinusoidal cuya amplitud va disminuyendo con el tiempo a medida que la disolucin se homogeniza. Estahomogenizacindependefundamentalmentedelcaudalderecirculacinutilizadoyde las caractersticas fsicas del montaje experimental (dimetro y longitud de los tubos) y es la que va a determinar el tiempo necesario para que se alcance el estado estacionario. En la Figura 44 se muestra un ejemplo del registro de la seal frente al tiempo para la extraccin en continuo de una muestra, en el que se seala el periodo de recirculacin (tiempo en el atraviesaelsistematodoelvolumendedisolucin). Se realizaron los estudios correspondientes del efecto del caudal de recirculacin (8.5 mL min1) y del nmero de scans acumulados (4) por cada punto del chemigrama, con el objeto de llevar a cabo el anlisis con la mayor rapidez y precisin posibles. El periodo de recirculacin result ser de 0.3 min en estas condiciones, lo que permita alcanzar el estado estacionario en pocos minutos gracias a la homogeneizacin que sufre la disolucin mientrascirculaporelsistema.
116
En este punto se decidi aplicar la estrategia de coadicin de espectros para reducir todava ms el tiempo de anlisis. A partir del registro en funcin del tiempo es posible coadicionar un nmero de espectros consecutivos para obtener un espectro promedioque,entreotros detalles,se caracterizarporteneruna mejorrelacinseal/ruido debidoaladisminucindeesteltimo.EnlaFigura44sedescribeesteproceso.
A b s o r b a n c e
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0 1 Time (minutes)
I n t e n s i t y
Periodo de recirculacin
A b s o r b a n c e 2000
A b s o r b A 1500 a b Wavenumbers (cmn s c o e r A 2000 b 1500 a b Wavenumbers (cmn s c o e r A 2000 b 1500 a b Wavenumbers (cmn s c o e r b 2000 a 1500 Wavenumbers (cmn c e 2000 1500 Wavenumbers (cm2000 1500
A b s o r b a n c e
2000
1500
Intervalo de coadicin
Espectro coadicionado final Co-adicin de los espectros individuales a lo largo del intervalo
Registro de la seal frente al tiempo
Figura 44. Registro de la seal frente al tiempo para la extraccin en continuo de una muestra donde se indica el periodo de recirculacin y se describe el proceso de co-adicin de espectros FTIR.
La coadicin de espectros resulta evidente cuando tenemos una seal constante, como sera el caso de encontrarse en el estado estacionario; sin embargo cuando tenemos una seal variable, como es elcaso del proceso de extraccin/homogeneizacin en lnea que se propone en este trabajo, al promediar un mayor o menor nmero de espectros FTIR del registro se pueden obtener espectros promedio totalmente diferentes en cuanto a intensidades de las bandas de absorcin. Con el fin de seleccionar las condiciones de co adicin que permitan llevar a cabo el anlisis con mayor rapidez y exactitud, se procedi a la realizacin de los estudios del tiempo inicial e intervalo de coadicin correspondientes. Estos resultados se muestran en la Figura 45. Se encontr que fijando un tiempo de co adicin igual a 9 veces el espaciado de datos del registro continuo de los espectros FTIR, se logran diferencias menores de un 1 % respecto de la concentracin medida en el estado
117
estacionario a tiempos superiores a 1.7 min. As pues se recomend este intervalo de co adicinparaladeterminacindelsuccinatodedoxilaminaenlnea.
100
valor absoluto de la diferencia %
x9 x4
10
x7 x11 x14
0 ,0
0 ,5
1,0
1,5
2 ,0
2 ,5
3 ,0
tiem po (m in)
0,1
0,01
Figura 45. Valor absoluto de la diferencia relativa obtenida al comparar el rea medida bajo diferentes condiciones de co-adicin con la correspondiente al estado estacionario en funcin del inicio de la co-adicin. Como origen de tiempos se ha considerado el inicio de la extraccin. x4, x7, x9, x11 y x14 corresponden a cada intervalo de co-adicin equivalente al nmero de veces del espaciado de los datos experimentales del registro continuo, que son respectivamente el 44, 78, 100, 122 y 156 % del periodo de recirculacin del disolvente en el circuito de extraccin. Nota: el eje de ordenadas est representado en escala logartmica.
Finalmente seaplicel mtodoFTIR conextraccinenlnea alanlisisdemuestras ysecompararonlosresultadosconelmtodoFTIRenmodobatchyelmtododereferencia. EnlaTabla11seresumenestosresultados. Se encontr que el uso de la adicin estndar en el mtodo con extraccin en lnea mejoraba los resultados respecto de los obtenidos mediante calibrado externo en lnea. Se dedujo que esta mejora se deba a que la adicin estndar permite compensar los posibles efectos negativos producidos por el arrastre de excipientes durante el proceso de extraccin en lnea. En la adicin estndar se inyectan sucesivamente alcuotas de 25 L de disolucin 118
patrn en la disolucin mientras sta recircula a travs del sistema. En la Figura 46 se muestraunejemplodeadicinestndarenlnea.
Mtodo FTIR batch FTIR en lnea calibrado externo FTIR en lnea adicin estndar UV-vis de referencia Succinato de doxilamina (mg/tableta) 24.8 0.5 23.6 0.4 25.19 0.05 25.2 0.7
Tabla 11. Resultados medios obtenidos con los mtodos FTIR en batch y en lnea desarrollados y por el mtodo espectrofotomtrico utilizado como referencia.
Por tanto, se consider recomendable el uso de la adicin estndar para la determinacin del succinato de doxilamina mediante el mtodo FTIR con extraccin en lnea,no siendonecesariaenel casodel mtodo FTIR enmodobatch.ElnuevomtodoFTIR conextraccinenlneadesarrolladoenestetrabajopermiteelanlisisde10muestrasenuna hora y consume 2.6 mL de la mezcla de etanol y cloroformo al 13 % por cada rplica realizada.
1,0 S E A L 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0 2 4 8 6 Tiempo (min) 10 12 14
Figura 46. Registro de la seal frente al tiempo (rea entre 1700 y 1730 cm-1 corregida con una lnea base establecida entre 2000 y 1800 cm-1) obtenida para la determinacin de succinato de doxilamina mediante adicin estndar.
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CONCLUSIONES EnestetrabajosehapuestoapuntoenprimerlugarunmtododeanlisisFTIRen modo batch para la determinacin del frmaco succinato de doxilamina en especialidades farmacuticas. En segundo lugar, y a partir del mtodo en batch, se ha desarrollado un mtodoFTIRconextraccinenlnea.Conellosehaconseguidounareduccindelconsumo dedisolventecloradoysehaminimizadolamanipulacindelamuestra.Laaplicacindela coadicindeespectroshapermitidoreducireltiempodeanlisisymejorarlaprecisin.
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Captulo IV: Resultados
IV.Resultados
1. Anlisis directo por ATRFTIR con celda de diamante: determinacindeNTAendetergentes
Attenuatedtotalreflectanceinfrareddeterminationofsodium nitrilotriacetateinalkalineliquiddetergents
JosepF.VenturaGayete,MigueldelaGuardia,SalvadorGarrigues Talanta70(2006)870875
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2.Desarrollodemtodosdeanlisisporespectrometravibracional conmulticonmutacin
2.1. Determinacin ATRFTIR de olefinsulfonato sdico: sistemas con multiconmutacinymedidasenmodostoppedflow MulticommutationATRFTIR:determinationofsodiumalphaolefin sulfonateindetergentformulations
Josep Francesc VenturaGayete, Boaventura F. Reis, Salvador Garrigues, ngel MoralesRubio, Miguel delaGuardia MicrochemicalJournal78(2004)4754
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2.2. Determinacin FTIR de benceno en gasolina: uso de la multiconmutacin como estrategiaalternativaalFIA MulticommutationFouriertransforminfrareddeterminationofbenzeneingasoline
Eva RdenasTorralba, Josep VenturaGayete, ngel MoralesRubio, Salvador Garrigues, Miguel de la Guardia AnalyticaChimicaActa512(2004)215221
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2.3. Determinacin de hexythiazox en formulaciones fitosanitarias: aplicacin de la multiconmutacinacopladaalaespectrometraFTNIR MulticommutationNIRdeterminationofHexythiazoxinpesticideformulations

Josep F. VenturaGayete, Sergio Armenta, Salvador Garrigues, ngel MoralesRubio, Miguel de la Guardia Talanta68(2006)17001706
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3. Desarrollo de mtodos de anlisis FTMIR con extraccin previa delanalito

3.1. Determinacin de methidathion y tricyclazole en aguas con
preconcentracinmedianteSPEyelucinenlnea
OnlineFourierTransforminfrareddeterminationofmethidathionandtricyclazolein watersamplesaftersolidphaseextraction
JosepF.VenturaGayete,M.Khanmohammadi,SalvadorGarriguesandMigueldelaGuardia Enviadoparapublicacin
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ONLINEFOURIERTRANSFORMINFRAREDDETERMINATIONOFMETHIDATHIONAND TRICYCLAZOLEINWATERSAMPLESAFTERSOLIDPHASEEXTRACTION JosepF.VenturaGayete,M.Khanmohammadi,SalvadorGarriguesandMigueldelaGuardia* DepartamentodeQumicaAnaltica,ResearchBuilding,UniversitatdeValncia,50Dr.MolinerSt., 46100Burjassot,Valncia,Spain. DepartmentofChemistry,FacultyofScience.ImanKhomeiniInternationalUniversity,Qazvin,Iran. *Correspondingauthor.Email:miguel.delaguardia@uv.es Abstract The potential of the application of the FTIR spectrometry coupled with solid phase extraction has been evaluated through the development of a method for the determination of methidathion and a method for the determination of tricyclazole, both in water samples, by FTIR spectrometry after online solid phase preconcentration. The experimental parameters for the preconcentration, elution and online determination of each analyte were evaluated by the corresponding studies. In the preconcentration step,100mLofspikedwaterwerepassedthroughacartridgecontainingthecorrespondingmassofthe C18 or C8 solid phase. For the elution and FTIR determination of methidathion or tricyclazole 2 mL of chloroform are enough to obtain a quantitative recovery of the pesticide. The elution step could be monitored online with FTIR spectrometry. The transient signal recordings for samples were interpolated in a calibration line prepared in the same conditions. The two methods were applied for spiked water samples at the mg L1 level. Although the results were in good agreement with the real content in both methods developed, the disadvantages of the online elution and determination as the low throughput (56 h1) and residue generation (700 mL per 100 determinations) avoids its application asanalternativetochromatographicmethodsinthisanalyticalfield. Keywords:methidathion,tricyclazole,FTIR,onlinesolidphasepreconcentration.
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1.Introduction In recent years, Fourier Transform infrared spectrometry (FTIR) has been applied to the analysis of pesticides in commercial formulations by using different approaches, from the simple batch strategies [1]tothemostelaboratedflowanalysismethods[2,3]includingmulticommutatedflowsystems[4]. However, in the field of environmental pollution control analysis the classical handicaps associated to the FTIR, as the low sensitivity and the reduced number of solvents suitable to be used, caused an evident lack of methods proposed for the determination of pesticide residues based on this technique, infrontofthecommonlyusedchromatographybasedmethods. Most of the pesticides monitored in environmental samples are present at the mg L1 or g L1 level, enforcing the use of high sensitivity techniques. On the other hand, a previous separation step is often necessary to increase the selectivity of the determination as well as to increase the sensitivity through thepreconcentrationoftheanalyte. So,theeffortsfortheadaptationoftheFTIRspectrometrytoenvironmentalanalysismustbeorientated to:i)improvethelimitofdetectionandii)tosimplifythepreconcentrationsteps. Solidphaseextraction(SPE)isafastandsimplealternativetothetraditionalliquidliquidextraction[5] in order to improve the preconcentration factors and to avoid the use of large volumes of organic solvents. Because of that the hyphenation between SPE and FTIR offers a lot of possibilities, to improve theanalysisoforganiccontaminantsinwater[6,7]andfoodsamples[8]byvibrationalspectrometry. On the other hand, the FTIR spectrometry is often coupled with online systems in which the continuous measurement leads to important advantages in terms of improvement of throughput and manipulation of samples. However, in some cases an offline method could be more convenient and faster than an online method. So, it is necessary to evaluate the advantages and disadvantages of both offlineandonlineanalyticalstrategies,inaspecificlaboratorycontext. Methidathion is a nonsystemic organophosphorous insecticide and acaricide which inhibes certain enzymes in the insects and mites by contact or stomach action. Methidathion is widely used for the treatment of some fruits and it is highly toxic to aquatic organisms [9]. It is available in different presentations as a wettable powder, ultralow volume liquid and emulsifiable concentrate. Tricyclazole
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(5Methyl1, 2, 4triazole(3, 4b)benzothiazole) is a systemic fungicide widely used for the treatment of some crops, specially rice [10]. The mechanism of its action is the inhibition of two fungal hydroxynaphthalene reductases of the melanin synthesis pathway which causes the degradation of the fungi cell wall and the loss of the pathogenicity [11]. Both pesticides are widely used at present day in ourcountry. Most of the methods developed recently for the determination of pesticides in water have been orientated to the multicomponent analysis, due to the fast evolution of chromatographic techniques coupledwithMassSpectrometry(MS)[12]. There are no precedents on the determination of methidathion or tricyclazole residues in water by vibrational spectrometry. In fact, in our knowledge there is only a direct precedent for the online determination of a pesticide by FTIR spectrometry [13]. So, we asked if the disadvantages of the use of FTIRspectrometryinthisanalyticalfieldjustifiedthelackofthistypeofanalyticalmethods. In this sense, the aim of this work has been the development, step by step, of two different FTIR methods, one of them for the determination of methidathion and the other for the determination of tricyclazole in water samples at the mg L1 level, studying in depth the parameters affecting the preconcentration step, both comparing the inbatch elution and determination with the online elution and determination for both pesticides, in order to provide an integrated approach to do this kind of analysis. 2.Experimental 2.1.Apparatus ATensor27FTIRspectrometerfromBruker(Bremen,Germany), equippedwitha RTDLaTGSdetector and a KBr beam splitter was used to collect the whole FTIR spectra between 4000 and 800 cm1, with a scanning velocity of 10 kHz. Acquisition of spectra was made by OPUS 4.2 software from Bruker. The measurementsinthecontinuousmodewerecarriedoutwiththeOPUSChromutility. Processing of FTIR spectra was carried out with the Omnic 6.1a software from Nicolet (Madison, WI, USA).
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For FTIR measurements a microflow cell (SpecacGraseby, Orpington, UK), with a ZnSe windows and an optical pathlength of 0.3 mm was employed. A Gilson Minipuls 3 peristaltic pump (Villiersle Bel, France) with a 1.85 mm i. d. polyvinyl chloride (Tygon) tubes was employed in the sampling setup and a Viton tube of 1 mm i.d. was used in the elution step for filling the loop with chloroform and for the elution of the pesticide (methidathion or tricyclazole) from the corresponding column. Flow lines were madeofPTFEtubingof0.8mminternaldiameterinbothsamplingandonlineelutionmanifolds. 2.2.Reagentsandsamples C18 SPE BondElut cartridges from Varian (Middelburg, The Netherlands) containing 100 mg of solid phase were used for the preconcentration of methidathion, and C8 SPE BondElut cartridges containing200mgofsolidphasewereusedforthepreconcentrationoftricyclazole. Chloroform HPLC grade and methanol Multisolvent from Scharlau (Barcelona, Spain) were used in the elution step and FTIR determination of methidathion and tricyclazole and for the conditioning of theC18andC8cartridges,respectively. NanopurewaterwasusedtopreparestandardsandspikedsamplesanditwasobtainedfromaMilliQ waterpurifiersystemofMillipore(Bedford,MA,USA). Spiked water samples were prepared dissolving directly the mass of solid methidathion technical standard (with a purity of 96.9 % (w/w)) (Artemis 2000, Artana, Castelln, Spain), or dissolving solid tricyclazoletechnicalstandardof75%(w/w)(Artemis2000)intheadequateamountofnanopurewater. 2.3.Generalprocedure 2.3.1.Previousconditioningofthecolumns In the method for the determination of methidathion, each column was filled with 100 mg of the C18 solid phase. Two mL of methanol were passed through the column followed by 15 mL of nanopure water,beforetobeusedforsamplepreconcentration.
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In the method for the determination of tricyclazole, each cartridge was filled with 200 mg of C8. Two mL of methanol were passed through the C8 column followed by 15 mL of nanopure water, and then thesamplewasloaded. Itmustbeavoidedthatthecolumnsbecame dry since the methanolwaspassedthroughthem,inorder toassurethecorrectactivationofthecorrespondingsolidphase. 2.3.2.Retentionexperiments The columns, previously conditioned, were connected for laboratory experiments, as it is shown in figure 1A. For the retention of methidathion 100 mL of samples or standards were passed through the cartridges with a flow rate of 10 mL min1. Then, the cartridges were dried with a N2 stream during 90 min opening the corresponding valve. For the retention of tricyclazole, the C8 cartridges were previously conditioned and 100 mL of the sample were passed through each cartridge with a flow rate of2.1mLmin1.Then,thecartridgesweredriedwithaN2streamopeningthecorrespondingvalve.The dryingofthecolumnswas strictlynecessarydue tothewellknownstronginfraredabsorptionofwater intheinfraredregion,whichinterferesinthedeterminationofbothtricyclazoleandmethidathion. Forinfieldexperiments,columnspreviouslyactivatedcanbedirectlyconnectedtotheperistalticpump andemployedforsamplingfilteredaqueoussamples. 2.3.3.BatchelutionandbatchFTIRdeterminationprocedure Two mL of chloroform were passed through the corresponding C18 or C8 cartridge and methidathion or tricyclazole were eluted by the solvent by pumping with a plastic syringe. Each eluate was introduced in the FTIR microflow cell and the FTIR spectra between 4000 and 800 cm1 were collected inthe stoppedflowmode witha nominalresolutionof8cm1and accumulating50 scansperspectrum, usingabackgroundofthecellfilledwithchloroformobtainedinthesameinstrumentalconditions. For methidathion measurement it was selected the peak area values between 1038 and 996 cm1 correctedwithatwopointsbaselineestablishedbetween1105and884cm1.Methidathionconcentration was obtained by interpolating peak area values of samples in a calibration line established from standard solutions in chloroform for 0.032 to 1.129 mg g1, measured in the same experimental conditionsthansamples.
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Fortricyclazolemeasurementitwasselectedthepeakareavaluesbetween1511and1482cm1corrected with a baseline established between 1526 and 1434 cm1. Tricyclazole content in samples was obtained by interpolating peak area values of samples in an external calibration line established from standard solutions ranged between 0.056 and 0.975 mg g1 measured in the same experimental conditions than samples. Table1resumestheprincipalFTIRparametersselectedforthedeterminationofbothpesticides. 2.3.4.OnlineelutionFTIRdeterminationprocedure Each cartridge loaded with methidathion or tricyclazole was placed in the manifold as indicated in figure 1B. The 2 mL loop was filled with chloroform, taking care that no bubbles were present in the flow system. Then valves V1 and V2 were turned in the corresponding way and the pump flow was inverted. The chloroform contained in the loop was introduced in the cartridge by the bottom aperture, at a flow rate of 0.43 mL min1. When the loop was empty, the pump was stopped, inverted and switched on again with a flow rate of 0.66 mL min1 for the determination of methidathion, or at a flow rateof0.75mLmin1forthedeterminationoftricyclazole.Thecorrespondingeluatepassedthroughthe FTIRmicroflowcellandthetransientsignalwascontinuouslycollected. In the case of the determination of methidathion, the concentration in the sample was calculated interpolating the peak area of the transient signals eluted (obtained in the same wavenumber ranges than in the batch mode) in a calibration line ranged from 3.84 to 11.51 mg L1 obtained from water methidathion standards preconcentrated in C18 cartridges and eluted in the same conditions than samples. In the case of the determination of tricyclazole, the concentration in the sample was calculated interpolating the peak area of the transient signals eluted in a calibration line ranged from 0.00 to 6.09 mgL1tricyclazoleinwaterstandards,preconcentratedinC8cartridgesbythesameprocedureusedfor samplesinthesameexperimentalconditions.
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3.Resultsanddiscussion 3.1.FTIRspectraofmethidathionandtricyclazole 3.1.1.FTIRspectrumofmethidathion Figure 2a shows the FTIR spectra of a methidathion standard in chloroform, the eluate from a cartridge loaded with an aqueous dissolution of methidathion and eluted with chloroform, and the chloroform blank.Ascanbeseen,themainfeaturesofmethidathionabsorptioninthemidinfraredregionwerethe band at 1693 cm1, corresponding to the carbonyl absorption, and other present at 1589, 1252, 1280 cm1 togetherwiththeethercharacteristicgroupabsorptionat1022cm1[14].Allthosebandswerepresentin both,standardandeluatespectra,andthusweresusceptibletobeusedformethidathiondetermination. Table2summarizesdifferentmeasurementcriteriaaspeakareaorpeakheight,differentbaselines,and different bands tested to determine methidathion. It can be seen that in all cases linear calibration lines wereobtained.Ontheotherhand,theuseofpeak areavaluesprovidesatleastone orderofmagnitude better sensitivity than peak height values. However, the carbonyl and the 1589 cm1 bands were not adequate due to the strong water absorption around 1600 cm1, which can not be eliminated quantitativelyevendryingthecartridgesformanyhours. Finally, the peak area between 1038 and 996 cm1 corrected with a baseline established between 1105 and 884 cm1 (see inset Figure 2a) was selected for the determination of methidathion as a good compromisebetweensensitivity,repeatabilityandlimitofdetection. 3.1.2.FTIRspectrumoftricyclazole Figure 2b shows the FTIR spectra of a tricyclazole standard, the eluate from a C8 cartridge loaded with tricyclazole, both prepared in chloroform, and the chloroform blank. As can be seen, the main absorption bands of tricyclazole in the midinfrared fingerprint region were the band at 1495.1 cm1, correspondingtotheCHabsorption[14],andotherfainterat1315.3cm1.Theabsorptionbandspresent at 1600 cm1 and at higher wavenumbers are due to the presence of water in the dried column which elutes together with the analyte. The region around 1200 cm1 is darkened because of the strong absorption of chloroform. The band at 1495.1 cm1 was present in both standard and eluate spectra, and itwassusceptibletobeusedfortricyclazoledetermination.
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Two measurement modes, peak area and peak height, both corrected with different baselines, were tested in order to find the most adequate conditions for tricyclazole determination. The peak area between 1511 and 1482 cm1 corrected with a baseline established between 1526 and 1434 cm1 was selectedforthedeterminationoftricyclazoleinordertoobtainsensitiveandreproducibledata. 3.1.3.Selectionoftheinbatchmeasurementparameters Theeffectofthenumberofaccumulatedscansperspectrumandtheeffectofthenominalresolutionon the peak area selected were evaluated for both methidathion and tricyclazole using the corresponding standards prepared in chloroform. The results indicated that the accumulation of a great number of scansincreasesthemeasurementprecision.However,theacquisitiontimeincreaseswiththenumberof scans and thus, it was necessary to select a compromise value between measurement time and precision. So, it was selected 50 accumulated scans for carrying out the subsequent studies for both experimentalprocedures. About the effect of the nominal resolution in the peak area, it was found a strong decrease in the IR signals for both methidathion and tricyclazole on increasing the nominal resolution, and so, it was selected a nominal resolution of 8 cm1 as a measurement condition for the two different inbatch determinationsofmethidathionandtricyclazole. On the other hand it is clear from spectra recordings in Figure 2 that the correct drying of the C18 and C8 cartridges loaded with methidathion and tricyclazole respectively was strictly necessary to avoid importanterrorsinthe quantificationofthecorrespondingpesticide.Forthisreasonitisrecommended todrytheloadedcartridgesduringaminimumtimeof90min. 3.2.Effectoftheexperimentalparametersfortheretentionofmethidathionandtricyclazole 3.2.1.Massofsolidphase PreviousstudiesevidencedastrongretentionofmethidathionatthemgL1levelbytheC18phasefrom watersamples.So,itwasdecidedtouseC18astheuniquesolidphaseinthesubsequentassays.Table2 shows the effect of the amount of C18 in the cartridge on the recovery of methidathion, using a fixed volume of chloroform (2 mL) for elution. The increase in the C18 mass produced a decrease in the recoveryofmethidathion.Howeveritwasconfirmedthatthisbehaviouraffectstheelutionprocessand
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not the retention one, which is approximately the same in the 100500 mg range assayed. For a column loaded with 100 mg of C18, 2 mL of chloroform were enough for eluting 96 % of methidathion, but not in the case of using 500 mg C18. So, it was selected 100 mg of C18 for ensuring the elution of methidathionwithonly2mLofchloroform. On the other hand, preliminary studies evidenced a strong retention of tricyclazole by the C8 solid phase at the mg L1 level from water samples. So, it was decided to use C8 as the unique solid phase in the subsequent essays for the determination of tricyclazole. The recovery of tricyclazole reaches a maximum for 200 mg of C8 mass (results not shown). For a column loaded with 200 mg C8, 2 mL of chloroform were enough for eluting all the tricyclazole, but for 500 mg of C8, it was necessary a high volumeofsolventforaquantitativeelutionoftricyclazole.So,itwasselected200mgofC8forensuring theelutionoftricyclazolewithonly2mLofchloroform. 3.2.2.Effectofsaltaddition The effect of the ionic strength in the retention of methidathion on C18 columns was studied using samples with 0.006.05 % (w/w) of added NaCl and other samples with 0.006.04 % (w/w) of NaNO3. Results evidenced that the saline concentration did not affect the retention of methidathion in the C18 column in all cases. So, the addition of salt to samples seems unnecessary for achieving the complete retentionofmethidathionfromsamplesatmgL1level.
The retention of tricyclazole on C8 columns is not affected by the ionic strength of sample, as it was studied using samples with 1.017.08 % (w/v) NaCl. So, the addition of salt to samples is unnecessary forachievingthecompleteretentionoftricyclazoleusing200mgofsolidphaseand asamplingvolume of100mL. 3.2.3.Effectofthemassofanalyte Different volumes from a water sample containing 7.59 mg L1 of methidathion were passed through cartridges containing 100 mg of C18 at a flow rate of 10 mL min1 and eluted in all cases with 2 mL of chloroform. As can be seen in Figure 3, the recovery of methidathion strongly depends on the amount of pesticide loaded in the cartridge which must be equal or lower than 2.94 mg to guarantee the quantitative retention of the pesticide in 100 mg of solid phase. So, it can be established a mass of 2.94 mg of methidathion per 100 mg of C18 as the saturation value. On the other hand it was confirmed a
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linear correlation between absorbance and the volume of sample loaded for the range between 0 and 400 mL of a sample containing 7.59 mg L1 of methidathion with an equation Y(peak area)= (0.00894 0.00008)V(mL) (0.01 0.02), R2= 0.9991. In order to decrease sampling time, it was decided to use 100 mLofsamplesforpracticalpurposes. The saturation of 200 mg of C8 was achieved for 2.3 mg of tricyclazole (0.012 mg tricyclazole / mg C8). Inordertodecreasesamplingtime,itwasdecidedtopreconcentrateonly100mLofsamples. The calibration line was obtained for tricyclazole standards prepared in chloroform in the 0.000.97 mg g1concentrationrangeusingpeakareameasurementscorrectedwiththebaselineindicatedpreviously. 3.2.4.Effectofthesamplingflowrate SamplingflowrateinSPEisacriticalparametersincethephysicalinteractionbetweentheanalytetobe preconcentrated requires the diffusion of the sample into the solid phase. So, the extraction of methidathion could be affected by the flow rate in the experimental conditions we used. Different sampling flow rates (from 1.6 to 10 mL min1) were assayed for the preconcentration of 100 mL aliquots of a sample containing 7.95 mg L1 methidathion. The recovery of methidathion was constant in the aforementioned range. It can be concluded that this behaviour was due to the high affinity of methidathion for the unpolar C18 phase. So, it was selected a sampling flow rate of 10 mL min1 for carrying out the preconcentration in order to reduce the sampling time, although the precision was betterwithsmallflowrates. Theanalysisofsamplesspikedwithmethidathionusingtheaforementionedexperimentalconditionsin the recommended FTIR batch procedure shown quantitative recovery for methidathion concentrations in the 3.158.28 mg L1 range. On the other hand, the repeated use of the same cartridges for 10 times in the preconcentration step did not result in a decrease of methidathion recovery nor in a cross sample contaminationifthepreviousconditioningwascarriedoutproperly. Differentsamplingflowratesfrom0.2to2.1mLmin1wereusedtopreconcentrate100mLaliquotsofa samplecontaining5.81mgL1tricyclazole.Therecoveryoftricyclazolewasconstantinthisrange.Itcan be concluded that this behaviour was due to the high affinity of tricyclazole for the unpolar C8 phase. So, it was selected a sampling flow rate of 2.1 mL min1 for carrying out the preconcentration with the shortest sampling time, although the precision of measurements increased on reducing the sampling
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flow rate. It is noticeable the great difference in the range of flowrates which guarantees the complete retentionformethidathionand thatfortricyclazole.Inthissense, methidathionis easilyseparatedfrom water with C18 with minimum experimental requirements, whereas the retention of tricyclazole with C8 is more sensitive to the experimental conditions due to the differences in the chemical structure of bothpesticidesandtheirinteractionwitheachsolidphase. The analysis of samples spiked with tricyclazole using the aforementioned experimental conditions in therecommendedFTIRbatchmodeprovidedrecoveryvaluesaround100%. 3.3.Flowsystemcharacteristicsandeffectoftheonlineelutionparameters Figure 1B shows the manifold employed for the online elution and FTIR online determination of methidathion from C18 cartridges and that of tricyclazole from C8 cartridges, all of them loaded in the corresponding selected experimental conditions. To carry out the online elution, a fixed volume of solvent, measured in a loop, was introduced from the bottom of the column at a very slow flowrate, and then eluted through the FTIR microflow cell and the transient signal, corresponding to the peak area values between 1038 and 996 cm1 corrected with a baseline established between 1105 and 884 cm1 in the case of the determination of methidathion, and the peak area values between 1511 and 1482 cm1 corrected with a baseline established between 1526 and 1434 cm1 in the case of the determination of tricyclazole, was recorded. In this way, the formation of bubbles in the system was minimized, because theairpresentintheintersticesofthesolidphasewasdisplacedbythesolventraisingon.Additionally, the first point of the transient signal recording corresponded to pure chloroform thus providing a good baseline and the elution peak was clearly depicted from the beginning to the end of the continuous record. The area of the corresponding elution peaks was used for the determination of both analytes. On comparing the proposed batch approach with the continuous elution with fresh solvent, it can be concludedthattheselectedconditionsreducestronglysignalunstabilityandbubbleformation. Previous studies evidenced that 10 accumulated scans per spectrum was the best condition for the acquisition of the transient signals for both pesticides. The accumulation of a big number of scans resulted in a loss of information and the use of a reduced number of scans accumulated resulted in a badsignaltonoiseratio.
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To avoid the bubbles formation in the flow system, it was necessary to introduce the chloroform from thebottomofthecolumn,slowlytodisplacetheairfromthesolidphase.Sometestsweredonetoselect anadequatefillingflowrate,anditwasfinallyselectedaflowrateof0.43mLmin1,thusconsuming4.7 min in that filling process, for the determination of methidathion and for the determination of tricyclazole, as the effect of the different selected mass of solid phase in the column did not affect the fillingprocess. On the other hand, the elution flowrate was critical to obtain an appropriate sensitivity and repeatability. It was found that an elution flowrate of 0.66 mL min1 produced the narrowest and sufficiently high peaks for the methidathion determination. So it was selected as a fixed experimental condition for the online determination of methidathion. Surprinsigly, for tricyclazole determination it wasfoundthatanelutionflowrateof0.75 mL min1gavethebest results(seeFigure4).Thisdifference is not obvious because the different mass of solid phase present in the case of the determination of methidathion and in the determination of tricyclazole could compensate the effect of the different polarityofthesolidphaseinbothdeterminations. 3.4.AnalyticalfiguresofmeritoftheonlineelutionFTIRdetermination Figure 5 shows the transient signals corresponding to the online calibration used for methidathion determination. Fiagram peak height and peak area were tested to establish the calibration line. The calibration line obtained using the peak area provided a LOD of 0.3 mg L1, which is of the same order than the limit value accepted by the Spanish law in fresh waters which corresponds to 0.1 mg L1 [15]. Two different samples were analysed by the recommended online SPE preconcentration FTIR method. Sample 1, which was spiked with methidathion to a concentration of 7.67 mg L1, gave a content of methidathion of 7.5 0.7 mg L1, and sample 2, which was spiked to 7.70 mg L1, gave a content of methidathion of 8.0 0.7 mg L1. So, we obtained relative errors of 2.2 and 3.9 % respectively, which wereacceptableconsideringthevariabilityinherenttothepreconcentrationstep. On the other hand, for the determination of tricyclazole the calibration line obtained using the elution peak area provided a LOD of 0.1 mg L1. A sample containing 6.09 mg L1 tricyclazole was analysed by therecommendedonlineelutionFTIRprocedurebeingfoundacontentoftricyclazoleof6.100.32mg L1, for three independent replicates. So, provides a relative error of 0.2 % which is acceptable consideringthevariabilityinherenttothepreconcentrationstep.
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3.5.CriticalcomparisonbetweenFTIRinbatchandFTIRonlinedeterminations On comparing the features of the online process with those found in batch it can be seen that the FIA procedure provides a reduced sensitivity and a LOD four times higher than that obtained in batch for the determination of methidathion (see Table 3). However, for the determination of tricyclazole the LOD is slighty improved by the online procedure, although this improvement does not justify the application of the online procedure. Additionally, the repeatability of the analytical measurements, the samplingthroughputandthegenerationofwastewereaffectedbythelackofreproducibilityoftheon line elution process as compared by the batch methodology. So, for the FTIR determination of methidathion and for the FTIR determination of tricyclazole the batch strategy seems to be the best electionanditmustbenoticedthat,inthiscase,thecorrespondingLODsarearoundthetolerancevalue andpurechloroformsolutionsofmethidathionortricyclazolecanbeusedforexternalcalibration. In that point, it can be asked what advantages offers the use of the FTIR spectrometry in front of the typical chromatographic methods for the determination of this kind of analytes in water samples. We concluded that this FTIR strategy, though potentially useful for concrete applications in this field, does not fulfil the requirements of the pesticide residue analysis, due to the hard limitations in terms of sensitivity, the difficulty of avoiding interferences and the lack of multicomponent facilities. Only it couldbepossibletoapplyourFTIRdevelopedmethodsfortheanalysisofwastewatersfromindustrial activities, in order to control the presence of small amounts of methidathion or tricyclazole in their correspondingmanufacturingprocesssteps. 4.Conclusions Two different FTIR methods for the determination of methidathion and tricyclazole in the mg L1 concentration level have been developed to evaluate them as a possible alternative to the classical chromatographic ones. The use of C18 and C8 for SPE coupled with FTIR determination offers exciting possibilities for the separation of nonpolar compounds from polluted waters and enhances the LOD values of the vibrational spectrometric methods till the level tolerated by the environmental legislation. Resultsobtained forspikedsamplescontainingtheanalytesat the mg L1levelwereingoodagreement with the real concentration. However, the disadvantages intrinsic to this FTIR strategy reduce the applicationofthedevelopedmethodstospecificcontrolanalysisinthepesticideindustry.
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Acknowledgements The authors acknowledge the financial support of the Direcci General dUniversitats i Investigaci de la Generalitat Valenciana (Project GV04B/247 and Grupos 03118) and Universitat de Valncia (Project UVAE20050203). References [1]S.Armenta,G.Quints,S.Garrigues,M.delaGuardia,Anal.Chim.Acta524(2004)257. [2]M.Gallignani,S.Garrigues,A.MartnezVado,M.delaGuardia,Analyst118(1993)1043. [3]A.R.Cassella,S.Garrigues,R.C.deCampos,M.delaGuardia,Talanta54(2001)1087. [4]J.F.VenturaGayete,S.Armenta,S.Garrigues,A.MoralesRubio,M.delaGuardia, Talanta,inpress. [5] S. Mitra, (Ed), Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, in: Chemical Analysis vol 162,J.D.Winefordner(ed),WileyInterscience,2003. [6]Y.Daghbouche,S.Garrigues,M.delaGuardia,Anal.Chim.Acta314(1995)203. [7]A.Colume,J.Diewok,B.Lendl,Int.J.Environ.Anal.Chem.84(2004)835. [8]Y.Daghbouche,S.Garrigues,M.T.Vidal,M.delaGuardia,Anal.Chem.69(1997)1086. [9]http://extoxnet.orst.edu/pips/methidat.htm [10]M.J.Kawai,Pesticide.Sci.14(1989)407. [11]M.J.Butler,R.B.Gardiner,A.W.Day,BiologicalControl32(2005)326. [12]M.Petrovic,S.Gonzlez,D.Barcel,TrendsAnal.Chem.22(2003)685. [13]Y.Daghbouche,S.Garrigues,M.delaGuardia,Anal.Chim.Acta314(1995)203. [14] D. LinVien, N. B. Colthup, W. G. Fateley, J. G. Grasselli, Infrared and Raman Characteristic FrequenciesofOrganicMolecules,AcademicPress,London,1991. [15] Real Decreto 849/1986, de 11 de abril, por el que se aprueba el Reglamento del Dominio Pblico Hidrulico, que desarrolla los Ttulos Preliminar, I, IV, V, VI y VII de la Ley 29/1985, de 2 de agosto, de Aguas.
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Legendoffigures Figure1.ManifoldemployedforSPEFTIRdeterminationofmethidathionortricyclazoleinwaters.1A. Setup used for the preconcentration of the analytes. Note: four samples or standards were aspirated with the peristaltic pump and passed through the activated C18 or C8 cartridges. When the selected volume of sample was passed through the column, the valves V were opened and the nitrogen stream driedthecartridgesduringca.90min. 1B. Flowsystem employed for the online elution and FTIR determination of methidathion or tricyclazole. Note: the loop was filled with chloroform with the peristaltic pump, and the chloroform backgroundwascollectedusingthebypassfromvalvesV1andV2.ThenvalvesV2andV1wereturned and the sense of the pump was inverted, being inserted the solvent in the cartridge with a flow rate of 0.43 mL min1. Valve V2 was turned and the pump inverted using a flow rate of 0.66 mL min1 in the case of the determination of methidathion or 0.75 mL min1 in the case of the determination of tricyclazole. The corresponding analyte was eluted from the cartridge and passed through the FTIR microflow cell. Finally, fresh chloroform was introduced continuously in the cartridge from the upper sideforcleaningthecartridgeandtorecoverthechloroformbaseline. Figure 2a. FTIR stoppedflow spectra of methidathion. A) a 0.63 mg g1 standard of methidathion in chloroform, B) an eluate obtained from the preconcentration in a C18 cartridge of 100 mL of a water sample containing 7.95 mg L1 of methidathion eluted with 2 mL of chloroform and C) a chloroform blank. Measurement conditions: 50 scans accumulated per spectrum and 8 cm1 nominal resolution. Inset:spectralregionselectedforthequantificationofMethidathion. 2b.FTIRstoppedflowspectraoftricyclazole.A)a0.65mgg1standardoftricylazolinchloroform,B)an eluate obtained from the preconcentration, in a C8 cartridge, of 100 mL of a water sample containing 6.09 mg L1 of tricyclazole eluted with 2 mL of chloroform and C) a chloroform blank. Measurement conditions:thesamethanin2a. Note:thespectraweredisplacedontheYaxisforaclearidentification. Figure 3. Effect of methidathion mass on its recovery from aqueous solutions. Experimental conditions: differentvolumesfrom100to2000mLofa7.59mgL1methidathionsolutionwerepreconcentratedina SPEcartridgecontaining100mg C18,withaloading flowrateof10mLmin1.Measurement conditions asindicatedinFigure2.
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Figure 4. Transient signal recordings obtained for the online elution of tricylazole at different flow rates. Note: samples were previously retained on C8 cartridges corresponding to 100 mL of 6.09 mg L1 solutions.Themeasurementconditionswere:10accumulatedscansperspectrumand8cm1ofnominal resolution. The recordings were obtained independently and graphically treated to eliminate the effect ofsomesmallbubblesontheshapeofthefiagrampeaks. Figure 5. Typical transient signal recordings obtained for the elution of methidathion previously retained on C18 cartridges, corresponding to standards prepared in water with concentrations in the 0.0011.51 mg L1 range. The elution flow rate was fixed at 0.66 mL min1. The recordings were obtained independently and graphically treated for eliminating the effect of small bubbles in the shape of the fiagrampeaks.
170
Valves N2 C18-C8 cartridges Pump Samples
Waste
valve 1 Peristaltic pump cartridge Chloroform
2 mL loop valve 2 FTIR flow-cell
Waste
Figure1.
171
0,12
0.12
0,10 0,08 A B S 0,06 0,04 0,02
0.10 A B S O R B A N C E 0.08 0.06
0,00 1150 1100
0.04 0.02
1050 1000 950 -1 Wavenumbers (cm )
900
850
B 0.00 3500 3000 2500 2000 Wavenumbers (cm-1) C 1500 1000
0.10 A 0.08 B S O 0.06 R B A 0.04 N C E 0.02
0.00
C 1800 1600 1400 1200 Wavenumbers (cm-1) 1000
Figure2.
172
100 80 % Recovery 60 40 20 0 0 4 8 mg methidathion

Figure3.
12
16
173
Figure4.
174
Figure5.
175
Table 1. FTIR spectrometer measurement conditions used in the inbatch and online methods for the determinationofmethidathionandtricyclazoleinwatersamples. SpectrometerParameter Aperture(mm) Gain Scannervelocity(kHz) Numberofscansperspectrum Resolution(cm1) Spectralwindow(cm )
1
Value 6 8 10 inbatch=50 online=10 8 4000600 BlackmanHarris3Term 2
Apodization Zerofillingfactor
176
177
178
3.2.Determinacindegrasaenlechesenpolvoconextraccinpresurizadacondisolvente
PressurizedsolventextractionFourierTransformInfrareddeterminationoffat
JosepF.VenturaGayete,SalvadorGarrigues,AgustnPastorandMigueldelaGuardia Enviadoparapublicacin
179
PRESSURIZEDSOLVENTEXTRACTIONFOURIERTRANSFORMINFRARED DETERMINATIONOFFAT JosepF.VenturaGayete,SalvadorGarrigues,AgustnPastor andMigueldelaGuardia* DepartamentodeQumicaAnaltica,ResearchBuilding,UniversitatdeValncia, 50Dr.MolinerSt., 46100Burjassot,Valncia,Spain. *Correspondingauthor.Email:miguel.delaguardia@uv.es Abstract A new method for fast determination of fat content in dried milk samples has been developed using Pressurized Solvent Extraction (PSE) and midFourier transform infrared (FTIR) spectrometry. The proposed method improves analytical throughput (12 h1), reagents consumption (12 mL per replicate) and waste generation in front of classical gravimetric methods. Results obtained shows that FTIR method is applicable to whole dried milk samples (error lower than 2 %), but not to skimmed dried milk samples. Analysis of other kind of feed with PSEFTIR method were carried out, and results demonstrated that extraction in the previously selected conditions for dried milk samples was not completeandFTIRdeterminationisnotreliableforthesefeedproducts. Keywords:milk,FTIR,pressurizedsolventextraction,feed. 1.Introduction Thefatcontentplaysanimportantroleinthenutritionalcharacteristicsofmilk,andsubsequently,inits quality. Moreover, the milk quality is commonly estimated as a factor of fat, lactose, protein, bacterial and somatic cells percentage, so these parameters are linked with the final price of the commercial product[1].Theeffectofdietaryintakeoffatsandoilsinhumanhealthiscontroversial,andithasbeen suggested a linkage between coronary disease and some fatty acids intake. On the other hand, fat adulterationoffoodsisacommonpracticewhichrequiresspecificcontrolmethods. Thetraditionalmethodsforthedeterminationoffatinmilkarebasedini)gravimetry,ii)otherphysical essays,iii)turbidimetry,andiv)spectrometry.
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The classical reference gravimetric methods used for fat determination in milk as RseGottlieb or Mojonnier methods are timespending and tedious, with high reagent consumption and waste generation because it is necessary to carry out some series of successive extractions with organic solvents. For example, the AOAC recommended modified Mojonnier method requires the dissolution of casein with NH4OH, addition of ethanol and ethyl ether, shaking, addition of petroleum ether and centrifugation for the first extraction, the same except ammonium hydroxide for the second extraction andonlyextractionwithethersforthethirdextraction.Finally,etherextractsareputtogetheranddried toconstantweight[2]. Modificationsofgravimetricmethodsforfatdeterminationinfeedincludesupercriticalfluidextraction [3], ultrasoundassisted extraction [4], and accelerated or pressurized solvent extraction [5, 6], which involvelongtimestagesinherenttotheextractionmethodology,buteliminatesthetiresomehydrolysis stage. Babcock reference method consists in the milkacid reaction with H2SO4 and separating the fat by centrifugation, measuring total fat content in a graduated Babcock or alternative test bottle [7]. This method implies a strict control of temperature and it lacks chemical information about the fat which is beingdetermined. The turbidimetric reference method is based in the light dispersion caused by fat globules after eliminationofcaseinmicelleswithEDTA[8]. TheAOACmidIRspectroscopic methodforthedeterminationoffat,lactose,proteinandtotalsolidsis basedonthespecificabsorptionofthecorrespondingcharacteristic functionalgroups.The milksample is measured directly in the IRcell and fat content is calculated by means the absorbance of the CH (fat B) peak at 2873 cm1 and the carbonyl peak (fat A) at 1747 cm1, using partial least squares (PLS) calibrationforquantification[9]. The method proposed by PriegoCapote et al uses focused microwaveassisted Soxhlet extraction prior to the transfatty acids determination by FTIRATR measurements. This method is based in the AOCS Recommended Practice Cd 14d96. The volume of solvent (nhexane) used for the extraction is 125 mL, and the mass of sample is 4 g. The extraction is complete for 712 cycles, depending on the type of sample analyzed (bakery products). After extraction, solvent is evaporated and the traces are removed withanitrogenstream.Transfattyacidscontentisdeterminedusingthepeakat966cm1[10].
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Fourier transform infrared spectrometry (FTIR) has been applied to the determination of oils and greases in diverse matrices. This technique offers advantages as the high signaltonoise ratio, the multiplex and reduced scan time, improving the limited yield of dispersive instruments. So, several methods for oil determination in soil and water samples take advantage of FTIR, differing in what extractiontechniqueisused.Daghboucheetal[11]haddeterminedoilsandgreasesinwatersamplesby FTIR spectrometry, using liquidliquid extraction (LLE), solid phase extraction (SPE) and microwave assisted extraction (MWAE). The absorbance spectra for the extracts were measured and the total peak area from 30582780 cm1 was taken as the analytical parameter. The baseline was measured from 3200 2700cm1. In recent years, Pressurized Solvent Extraction (PSE) or Accelerated Solvent Extraction (ASE) based strategies had been developed for reducing time and solvent consumption typical of traditional extraction techniques as the Soxhlet. In these approaches, the extraction is improved using high temperature which increases the dynamical interchange of the analyte between matrix (solid or semisolid) and the organic solvent phase. High pressure ensures the maintenance of solvent in the liquid state at working temperature (typically 50200 C). PSE and ASE were applied to a wide variety of samples and analytes, including the determination of total lipids in poultry meat [12], oxysterols in eggcontaining food [13], gestagens in kidney fat [14], PCBs in fat containing matrices [15], oils in contaminated soil [16], and several others as chlorinated pesticides in animal feed [17] or organotin, organolead and organomercury in soil [18], showing the enormous versatility of this extraction technique. The objective of this work is to show the advantages of coupling PSE extraction with FTIR determination of total fat in dried milk samples, resulting in an improvement in analytical frequency and a reduction in waste generation and reagents consumption. Moreover, the FTIR discrimination of fats from different feed is investigated, analyzing a wide variety of feed from dried milk to fish tissue and nuts. Spectral characteristics of fat from diverse origin were pointed out. The developed PSEFTIR methodrequiressmallsolventvolumesandiscompletedinafewminutes,allowingafast,accurateand environmentallyfriendlydeterminationoffatinwholedriedmilk.
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2.Experimental 2.1.Apparatus A fastPSE from Applied Separations (Allentown, PA, USA), with nitrogen as a purge gas and a pump flow rate of 100 mL min1, furnished with 11 mL stainless extraction vessels and collection vials of 60 mL,wasusedfortheextractionstage. ATensor27FTIRspectrometerfromBruker(Bremen,Germany), equippedwitha RTDLaTGSdetector and a KBr beam splitter was used to collect the whole FTIR spectra between 4500 and 800 cm1, with a scanningvelocityof10kHz.AcquisitionofspectrawasmadebyOPUS4.2softwarefromBruker. ProcessingofspectrawascarriedoutwiththeOmnic6.1asoftwarefromNicolet. 2.2.Reagentsandsamples Hexane (fraction from petroleum) Multisolvent from Scharlau (Barcelona, Spain), dichloromethane p. a.(>99%)fromFluka(Buchs,Switzerland)andmethanolfromPanreac(Barcelona,Spain)wereused for preparingthe3:2:1extractionmixing. Petroleum ether (4060C fraction) and diethyl ether (BHT stabilized) from Scharlau (Barcelona, Spain) wereusedinthereferencemethodforextractingfatfromdriedmilksamplesandforthedetermination of fat in chocolate. A series of commercial samples were analysed by the proposed method. Non manufactured hazelnuts and walnuts were homogenized in a mortar for obtaining samples. Liofilized salmon, bacon and chicken were supplied by our laboratory samples service, and samples were prepared by homogenizing tissues in a mortar. Chocolate samples were from Spanish market, with the cacaocontentinthe4399%(w/w)range. Fatstandards from0.1%to4.7% (w/w)werepreparedbyweighingastock fatobtainedfromapoolof whole milk samples extracted by the reference method and diluting with the adequate extraction mixingsolvent.
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Chocolate fat standards from 2.11 % to 12.0 % (w/w) were prepared by weighing a stock fat obtained from a pure chocolate sample (99 % w/w) extracted by the PSE gravimetric method and diluting with theadequatevolumeofpetroleumether. 2.3.RecommendedPSEFTIRprocedureforfatdeterminationindriedmilk Weigh accurately 1.7500 g of sample and mix in a mortar with approximately 5.0 g of Ottawa sand as a dispersing agent. Place the disk filters in the 11 mL internal volume stainless extraction vessels and fill them with the sample mixture. Fill one of these extraction vessels only with Ottawa sand in order to obtain the blank. Refill the vessels with sand to complete internal volume and cap with glass wool. Weigh accurately the empty 60 mL collection vials with a precision of 0.1 mg. Then run the extraction programme, completing 3 static cycles consisting in: a) 2 min vessels preheating at 80 C and 50 bar of pressure,b)fillingthevesselswiththeextractionsolvent;c)1minstaticmaintenanceofsolventat80C and 100 bar of pressure; d) discharge of the extracts with a nitrogen stream during 2 min. At the end of the PSE programme, remove extraction vessels and collection vials and substitute them by sandfilled vessels and new collection vials. Then run a static cycle with the same conditions as before in order to clean and to get ready the PSE system for the next extraction set. On the other hand, weigh the collectionvialscontainingtheextractswithaprecisionof0.1mg,andafterthatintroduceeachextractin theFTIRspectrometerwiththeaidofaperistalticpump,andcollecttheFTIRspectrabetween4500and 800 cm1 in the stoppedflow mode, with a nominal resolution of 8 cm1 and accumulating 50 scans per spectrum. Weigh the collection vials after FTIR measuring for carrying out the gravimetric determinationifitisnecessary.Fatcontentisobtainedbyinterpolationofthepeakareabetween1774.2 and1712.5cm1withabaselineestablishedbetween1805.0and1581.3cm1inacalibrationlineobtained for fat standards in the 0.1310.26 % (w/w) range in the same conditions than samples. FTIR spectrometerparametersaresummarizedinTable1. 2.4.Referencemethodforthedeterminationoffatindriedmilk Weigh 1.0000 g of whole dried milk sample or 1.5000 g of skimmed dried milk sample in a beaker, add 10mLofwaterandshakeuntilfullhomogenization,warmingifnecessary.Add1.25mLofa30%(v/v) NH4OH solution and heat in a water bath at 6070C during 15 min, shaking occasionally. Let cool and pour in the extraction flask. Add 10 mL of ethanol (96 %), mixing gently but completely keeping the flask opened. Add 25 mL of diethylic ether (BHT stabilized), close the extraction flask and shake vigorously, inverting the flask some times, during 1 min. Open the flask carefully and add 25 mL of
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petroleum ether; close the flask, shake and invert during 30 seconds. Let the flask rest until the top liquid layer is completely clear and separated from the aqueous phase. Then separate the phases by decantation.Theorganicphaseisdecantedintoanerlenmeyerflask,andtheaqueousphaseisextracted twotimesmoreinthesamewayasthefirstextraction,repeatingtheoperationpreviouslydescribedbut using only 15 mL of each solvent. The corresponding organic phases are transferred to the erlenmeyer flask. Then eliminate most of the solvent by distillation or evaporation. When there is no noticed any solvent odour, heat the flask at 102 0.2 C during 3060 min. Let cool at room temperature and weigh withaprecision of0.1mgtoconstantweight.Thenadd1525mL ofpetroleumether.Heatslightly and shake until all the fat dissolves. Let rest the nonfat residues at the bottom of the flask and decant it. Heat the flask during 1 h in the oven and proceed as before. Fat content is obtained by difference betweenthefirstconstantweight(total)andthefinalconstantweight(nonfatresidues). 2.5.RecommendedPSEprocedureforfatdeterminationinchocolate Weigh1.0000gofsampleand mixina mortarwithapproximately 2.0gofOttawasandasadispersing agent. Pack carefully this mixture with filter paper. Place disk filters in the 11 mL internal volume stainless extraction vessels and fill them with the sample packs. Fill one of these extraction vessels only with Ottawa sand packed with filter paper in order to obtain the blank. Refill the vessels with sand to complete internal volume and cap with glass wool. Weigh accurately the 60 mL collection vials previously with a precision of 0.0001 g. Then run the extraction programme, completing 3 static cycles consisting in: a) 2 min vessels preheating at 100 C and 50 bar of pressure, b) filling the vessels with petroleumether;c)3minstaticmaintenanceofsolventat125Cand100barofpressure;d)dischargeof the extract with a nitrogen stream during 2 min. At the end of the PSE programme, remove the extraction vessels and collection vials and substitute them by sandfilled vessels and new collection vials. Then run a static cycle with the same conditions as before in order to clean and to get ready the PSEsystemforthenextextractionsampleset. For the gravimetric determination of fat in chocolate, evaporate the solvent from the extracts with a nitrogen stream. Then heat at 102C in an oven for 30 min. Weigh with 0.1 mg precision until constant weight. FortheFTIRdetermination,introduceeachextractintheFTIRspectrometerwiththeaidofaperistaltic pump, and collect FTIR spectra between 4500 and 800 cm1 in the stoppedflow mode, with a nominal resolutionof8cm1andaccumulating50scansperspectrum.
185
3.Resultsanddiscussion 3.1.PSEparameters Previous assays showed that fat from dried milk could be extracted quantitatively by PSE with a mixture of hexane, dichloromethane and methanol in a proportion of 3:2:1 in volume. So, the different PSEparametersaffectingtheprocesswereevaluated.Figure1showstheeffectofthedriedmilksample mass in the percentage of total fat contained in the sample. As can be seen, the adequate mass is between 1.00 and 1.75 g. For masses below 1.00 g the percentage of fat obtained is lower than the maximum because the error is due to the incomplete transference of sample from mortar to the extraction vessel. For masses over 1.75 g, fat extraction is not completed in the experimental conditions used. On the other hand, the highest fat percentageprecision ratio was achieved for a mass of 1.75 g of sample,soitwasselectedforsubsequentstudies. On the other hand, it was evaluated the effect of the number of 1 minute static extraction cycles in the fatextraction.Inastaticcycle,solventismaintainedinthevesselwiththesampleatafixedtemperature and pressure, during a fixed time. So, it is necessary to repeat these cycles in order to obtain the complete extraction of the analyte. As can be seen in Figure 2, most extraction occurs in the first static cycle(about90percent).Inthesecondcycleisextractedaboutthe10%ofthefatanditisextractedthe1 %inthethirdcycle.So,onlythreecyclesareneededforachievingthecompleteextractionofthefatand subsequentlythreestaticcycleswereprogrammedintherecommendedprocedure. 3.2.FTIRspectraoffats Figure3showstheabsorbanceFTIRspectraofextractsfromwholedriedmilkandskimmeddriedmilk extracted with the solvent mixture of hexane: dichloromethane: methanol in a volume proportion of 3:2:1. Whole milk has a characteristic strong band at 1750 cm1 which corresponds with the carbonyl group from the ester linkage of fatty acids [19]. Solvent absorption in the (CH) region (28503025 cm1) avoids the use of this region for our quantification purposes. However, the fingerprint region is mostly notaffectedbysolventabsorption,exceptthecisandtransbondsregionsat1000cm1approximately. There are some differences between whole and skimmed milk extracts. For skimmed milk, the typical fatty acids band at 1750 cm1 appears only as a muscle in the broad amide band at 1640 cm1 which correspondstotheproteinsextractedtogetherthefat.Thisfeatureisconsequentwiththeabsorbancein
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the fingerprint region due to the fat CH bonds, and so, with the low fat content in the sample (< 1% w/w), but it complicates the final quantification of fat in skimmed milk. It was evaluated a set of measurement conditions as peak area or absorbance and different baselines for quantification. The selected conditions were finally the peak area between 1774.2 and 1712.5 cm1 with a baseline established between 1805.0 and 1581.3 cm1. The baseline selected allows us to compensate the amide band spectral interference from proteins extracted with fat by the PSE programme. No significant advantages were obtained using the first derivative spectra, and the lack of sensitivity suggests using directspectra.So,theseconditionswereselectedforthedeterminationoffatindriedmilk. On the other hand, a set of diverse fat containing solid samples, consisting in whole, skimmed dried milk, several infant dried milks, liofilized salmon, hazelnuts, walnuts, chicken hide and pig bacon was extracted with the aforementioned recommended procedure and the corresponding absorbance spectra were recorded. This set of spectra was used as a spectral library in order to compare the different extracts among them. Figure 4 shows the FTIR spectra of extracts from four different samples. The figureinsetpointsouttheregioninwhichappearsmorespectraldifferences(11501075cm1). The regions selected for comparison purposes were 1797.591511.59 cm1, 1399.531282.90 cm1, 1227.14 1071.99 cm1 and 1003.03847.88 cm1. This selection is due to the strong absorption of the solvent in the fingerprint region (14001500 cm1, 13001225 cm1 and 10701000 cm1), which causes high variability in the extract absorbance and avoids the use of this narrow regions in the classification with the spectral library. Results shown that the whole dried milk (A) had a similarity higher than 99 % with 21 library spectra, and a similarity in the 9990 % range with 10 another spectra, from 35 spectra contained in the library. The three skimmed dried milks recorded in the library were the least similar spectra with regard to the whole milk. On the other hand, the skimmed dried milk spectra were comparable at 9990 % of similaritywiththemselves,whereastherestofspectrahadasimilaritylowerthan60%withthem. 31 spectra had a similarity in the 10090 % range as compared with baby dried milk spectra. On the other hand, the spectrum of a pig bacon extract was mostly different from any spectra in the level over 99 %, and 31 spectra had a similarity in the 9590 % range. That means that pig bacon spectrum had significantdifferenceswithmostofthelibraryspectra.However,arelatedtypeofextractwhichisfrom anotheranimalsource(chickenhide),hadasimilarityhigherthan99%with17libraryspectra,meaning that fat from this origin was poorly discriminated from that from another samples. Salmon extract
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spectrum hadacorrelationhigherthan95%with 27libraryspectraand with3babydried milk spectra at 9590 % level. A correlation higher than 99 % with 8 spectra was obtained for hazelnut, with 21 spectra in the 9990 % range. Walnut shown a correlation higher than 99 % only with hazelnut and 27 spectrawereinthe9990%similarityrange. So, the extracts FTIR spectra of feed samples from different origin shown significant differences in the fingerprint region, suggesting the possibility of discriminate the origin of a fat extracted by the PSE recommendedprocedure. 3.3.Determinationoffatsinmilk Three whole dried milk and three skimmed dried milk samples were analysed by the PSEFTIR recommended method, by PSE extraction and gravimetry, and by the official gravimetric method. Results are summarized in Table 2. As can be seen, similar contents of fat were obtained for the whole milksbythethreedifferentmethods.However,theskimmedmilkswerenotquantifiedaccuratelywith the proposed FTIR method. The calibration curve was prepared using fat from whole dried milk, extracted by PSE and purified as in the gravimetric method, and the type of fat contained in skimmed and whole milk could be different. For that reason, the calibration could not be applied for the quantificationofskimmedmilkfat.Theuseoffirstderivativespectradidnotimprovetheresults. 3.4.Analyticalfiguresofmerit The developed method has a limit of detection of 0.004 % (w/w). The calibration line obtained for standards in the 0.134.7 % (w/w) range was Y(peak area)= (0.1012 0.0004)CF (% w/w) + (0.0029 0.0008), with R2=0.9994. The main advantages of the proposed method were the improvement in analytical throughput and the reduction of reagents consumption and waste generation. The productivity was enhanced greatly, with a throughput of 12 h1 for the PSEFTIR method in front of a throughput of 4 h1 for the gravimetric reference method. The PSE equipment allows extracting 6 samples simultaneously and automatically, whereas in the reference method each extraction has to be done manually. On the other hand, in the developed method the extract obtained in the FTIR method is introduced directly in thespectrometerandnoadditionalmanipulationisnecessary,savingtheevaporatingordistillingtime. On the other hand, the manipulation of sample is reduced, preserving it from crossing contaminations and protecting the analyst from solvent toxicity. Moreover, the volume of wastes generated in the case of the PSEFTIR method is ten times lower than that generated by the reference method (12 mL in front of131.25mLpereachreplicate).
188
3.5.Determinationoffatinfeed All feed samples used for the preparation of the spectral library were analyzed by the proposed FTIR methodandthePSEgravimetricmethod.TheresultsfornonmilkproductsaresummarizedinTable3. For most samples, FTIR method provides higher contents of fat. In this sense, FTIR method is not comparable with gravimetric method in the conditions fixed in this work, due to the following reasons: a) the original milk fat calibration is not applicable to these samples because the type of fat is different, b) there are some interferents extracted because the conditions are not optimized for these types of matrices. So, specific methods for the determination of fat in different types of feed are necessary. The PSE parameters more critical are the solvent and temperature of extraction. These parameters are easily selected by the corresponding studies. On the other hand, the standards are easily prepared by mixing fat extracts from a pool of extracted samples by the PSE specific procedure. In that point we applied a PSEFTIR modified method for the determination of fat in chocolate, in order to verify the correlation between fat content and pure cacao, as an example of the applicability of the FTIR approach for fat determination. In this method, petroleum ether was enough for the complete extraction of fat from chocolate and it was unnecessary the use of the ternary mixture. Figure 5 shows the FTIR spectra of a chocolate extracted sample, a chocolate fat standard and a petroleum ether blank. As can be seen, the FTIR spectrum of the chocolate fat presents the typical carbonyl absorption band at 1750 cm1 and the fingerprint region around 1160 cm1. The measurement parameters were evaluated, being selected a nominal resolution of 8 cm1 and 50 scans accumulated per spectra. On the other hand, different measurement modes as peak height or peak area corrected with different baselines were evaluated for theaccurateand precisedeterminationoffatin chocolate.Finallyitwasselected thepeakareabetween 1211.1 and 1130.1 cm1 corrected with a baseline established between 1531.2 and 914.1 cm1. The calibration line obtained in these conditions, for standards prepared from pure chocolate (99 %) in the 2.1112.00 % (w/w), was Y(peak area)= (2.271 0.002) CF % (w/w) (0.055 0.014), with R2= 0.99998. The FTIR developed method was applied to ten different chocolate samples and the results showed significant differences with the PSE gravimetric method, probably due to the extraction of interferents. However,thecorrelationbetweencacaocontentandfatcontentisapproximatelylinear(seeFigure6).
189
4.Conclusion It has been evaluated the pressurized solvent extraction coupled with FTIR spectrometry for the determination of fat in dried milk. Indeed, the characterization of different types of samples with the aforementioned method has been investigated. The proposed method has been applied to some whole and skimmed dried milk samples. Results obtained for whole milk were consistent with these obtained with reference method, showing that the proposed method is accurate, precise and directly applicable to whole dried milk. Skimmed milk, however, was not correctly quantified at all with the proposed method. On the other hand, results obtained from other feed samples shown that there were some important errors in the PSEFTIR determination of fat. The correlation between the cacao content and the fatcontentinchocolatehasbeeninvestigatedusinga modified PSEFTIRmethod.Resultsindicated a direct correlation between these parameters, but some differences between gravimetric and FTIR methodresultsshowedthenecessityofstudyingindepththereliabilityoftheFTIRapproach.Themain goals of these PSEFTIR methods are the improved analytical throughput and the reduced reagents consumption and waste generation in front of that corresponding to reference official methods. So, futureeffortswouldbeconcentratedtodevelopnewstrategiesbasedonthePSEFTIRmethodology. 5.References [1]ReglamentoNo.2597/97delConsejo,18dediciembrede1997,DiarioOficialdelasComunidades Europeas. [2]AOACofficialmethod989.05. [3]D.E.LaCroix,W.R.Wolf,J.AOACInt.86(2003)86. [4]J.RuizJimnez,M.D.LuquedeCastro,Anal.Chim.Acta502(2004)75. [5]R.K.Richardson,J.AOACInt.84(2001)1522. [6]DionexApplicationNote340(2000)47. [7]AOACofficialmethod989.04. [8]AOACofficialmethod969.16. [9]AOACofficialmethod972.16. [10] F. PriegoCapote, J. Ruiz Jimnez, J. GarcaOlmo, M. D. Luque de Castro, Anal. Chim. Acta 517 (2004)13. [11] Y. Daghbouche, S. Garrigues, A. MoralesRubio and M. de la Guardia, Anal. Chim. Acta 345 (1997) 161. [12]T.G.Toschi,A.Bendini,A.Ricci,G.Lercker,FoodChem.83(2003)551. [13]E.Boselli,V.Velazco,M.F.Caboni,G.Lercker,JournalofChromatographyA917(2001)239.
190
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191
Figure 6. Dependence of the fat content obtained by the PSEFTIR method proposed for the determinationoffatinchocolatewiththemanufacturersdeclaredcacaocontentinpercentage.
192
30
26
% Fat (w/w)
22
18
14
10 0,5 1,0 Sample mass (g)

Figure1.
1,5
2,0
100 % Yield accumulated 90 80 70 60 50 1 2 Number of cycles

Figure2.
193
Figure3.
Figure4.
194
Figure5.
50 45 40
% Fat (w/w) PSE-FTIR
35 30 25 20 15 10 5 0 30 40 50 60 70 80 90 100
% Cacao (w/w)
Figure6.
195
Table 1. FTIR spectrometer instrumental parameters used in the spectra acquisition from PSE extracted feed. Parameter Detector Beamsplitter Aperturesetting(mm) Scannervelocity(kHz) Gain Apodization ResolutionPhase Phasecorrectionmode Zerofillingfactor Numberofscans Resolution(cm1) Selectedcondition RTDLaTGS KBr 6 10 Autogain BlackmannHarris3terms 32.00 Mertz 2 50 8
196
Table 2. Results obtained for the determination of fat in whole dried milk samples (13) and skimmed dried milk (46), by the PSEFTIR proposed method, the PSEgravimetric method and the reference gravimetric method. Percentages of error from PSEFTIR method respect to PSEgravimetric and referencemethodsareincluded. % Difference (FTIR reference method) 0.00
Sample
PSEFTIR
Reference gravimetric method
PSE gravimetric
%Difference (FTIRPSE gravimetric)
27.480.06
27.480.03
27.27
0.78
26.490.09
26.080.11
25.81
2.64
1.59
26.690.05
26.400.04
26.11
2.19
1.10
0.360.03
0.860.02
0.36
0.19
58.58
0.0000.019
0.770.03
0.22
100.23
100.10
0.4110.003
0.6130.009
0.56
26.07
32.96
197
Table 3. Results obtained for the determination of fat in different feed using the PSEFTIR developed methodfordriedmilkandbythePSEgravimetricmethod. PSEgravimetric% (w/w) 33,6
Sample
PSEFTIR%(w/w)
Difference%
Liofilizedsalmon
31,4
6,9
Nut
63,8
56,04
13,8
Walnut
56,4
49,1
15,1
Sheepcheese
37,1
40,8
9,0
Bacon
73,0
63,9
14,2
Chicken
69,8
62,3
12,1
Goatcheese
28,8
37,6
23,5
Softcheese
16,3
25,6
36,3
Curedcheese
22,8
31,3
27,2
198
4. Tratamiento en lnea de la muestra: determinacin de succinato dedoxilaminaenespecialidadesfarmacuticas

OnlinesampletreatmentandFTIRdeterminationofdoxylamine succinateinpharmaceuticals
JosepF.VenturaGayete,MigueldelaGuardia,SalvadorGarrigues Talanta70(2006)11001106
199
200
201
202
203
204
205
206
207
Captulo V: Conclusiones
V.Conclusiones
Como se ha demostrado a lo largo de esta memoria, la presente Tesis Doctoral ha supuesto la elaboracin de diversos mtodos de anlisis cuantitativo por espectrometra vibracional. En el proceso de desarrollo de cada uno de los mismos se han estudiado los parmetros ms importantes propios de este tipo de anlisis, y se ha pretendido, en el conjuntodeellos,lautilizacindecantidadesmnimasdedisolventestxicosonocivospara el medio ambiente. En general, los mtodos desarrollados resultan adecuados para el anlisisderutina,orientadohaciaelcontroldecalidaddeproductos. Por otra parte, los resultados obtenidos en los trabajos incluidos en esta Tesis muestran la potencialidad de la espectrometra vibracional por Transformada de Fourier en elmbitodelanlisisdemuestrasdenaturalezamuydiferente.Enestesentidocabeesperar futuros avances en las aplicaciones de la espectrometra FTIR con fines de anlisis cuantitativo. Las desventajas que presentan las tcnicas vibracionales empleadas en esta Tesis han resultado ser superables mediante el uso de estrategias como el uso de accesorios ATR(enelcasodemuestrasacuosas)ylapreconcentracinenfaseslida. En trminos de nuevos mtodos de anlisis desarrollados, bien a partir de la modificacin o adaptacin mediante automatizacin de mtodos preexistentes, bien de maneracompletamenteoriginal,seencuentranloslogrosquesedetallanacontinuacin. 1. Por una parte, se han ampliado las aplicaciones de la espectrometra FTIR con medidasporATRmediante la puestaapunto de unnuevo mtodode anlisis directoATR FTIR para la determinacin de nitrilotriacetato sdico en formulaciones de limpieza industrial. Este mtodo supone una generacin mnima de residuos pues no utiliza disolventes orgnicos, con un consumo de muestra de 0.2 mL por cada rplica. Adems, el empleo de una celda ATR de diamante permite el anlisis directo de muestras de pH muy alto que no podran ser analizadas con los accesoriosATR clsicos que utilizan un cristal de
208
ZnSeyquepuedeseratacadoenestascondiciones.Elmtodoresultaaplicablealcontrolde calidad de las formulaciones estudiadas por su sencillez y elevada frecuencia de anlisis (50 h1), a pesar de ser un mtodo en batch, y se sugiere su futura automatizacin mediante la insercindeunasondaATRdediamanteenlamuestraproblema. 2. Bajo un nuevo punto de vista, se han puesto a punto tres mtodos basados en la espectrometra vibracional que utilizan la estrategia de la multiconmutacin para dar solucinadiferentescuestionesanalticas. En el primero de ellos, se ha conseguido un nuevo mtodo de anlisis ATRFTIR completamente mecanizado para la determinacin del surfactante olefinsulfonato sdico en formulaciones de detergentes lquidos. Con este mtodo se consigue un aumento de la frecuencia de anlisis respecto de las medidas en ATR horizontal convencional y adems se logra la limpieza en lnea de la celda ATR de flujo, evitando manipulaciones peligrosas del accesorio ATR. Las caractersticas del mtodo lo hacen especialmente indicado para el anlisis de control de calidad. Adems se ha puesto de manifiesto la gran versatilidad del acoplamiento ATRFTIR con multiconmutacin para el anlisis de diversos tipos de muestras. En el segundo trabajo, se ha desarrollado y puesto a punto un mtodo de anlisis FTIR en flujo con multiconmutacin a partir los estudios FIA preexistentes para la determinacin de benceno en gasolina. En este caso se ha conseguido reducir notablemente el consumo de reactivos y la generacin de residuos a travs del aprovechamiento de las caractersticas de los sistemas con multiconmutacin, mejorando el lmite de deteccin y manteniendo una precisin comparable al mtodo FIA. El mtodo resulta perfectamente aplicablealanlisisdecontroldecalidad. El tercer mtodo corresponde al anlisis en flujo FTNIR con multiconmutacin para la determinacin del pesticida hexythiazox en formulaciones fitosanitarias. Se ha logrado un mtodo alternativo a los habituales cromatogrficos, orientado hacia el anlisis de control de calidad, con un lmite de deteccin de 0.1 mg mL1 adecuado para el tipo de 209
muestras analizadas. Se ha demostrado la robustez y versatilidad de los sistemas acoplados FTNIR con multiconmutacin. El uso de esta estrategia evita errores producidos por cambios en las variables ambientales como pueda ser la temperatura. Adems se ha aplicado la interpolacin entre dos puntos correspondientes a una concentracin superior y unaconcentracininferioralaesperadaenlamuestra,con elfindemejorarlaeficienciadel anlisisdecontroldecalidad. 3.Se ha investigado el acoplamientodelaespectrometra FTIRcon laextraccinen fase slida para el anlisis a nivel de traza, por un lado, y el acoplamiento con la extraccin presurizada con disolvente para la determinacin de materia grasa en leches en polvo, por otro. En el primer caso se ha puesto de manifiesto la gran dificultad de la aplicacin de mtodos no cromatogrficos en este campo, lo que tiene un especial sentido en el caso de la espectrometra IR debido a las limitaciones de sensibilidad intrnsecas de esta tcnica. A pesardeello,sehalogradoponerapuntodosmtodosparaladeterminacinaniveldemg L1 de los pesticidas methidathion y tricyclazole en aguas. Se ha comprobado que la estrategia de elucin y determinacin en lnea si bien supone la posibilidad de automatizacin del procedimiento, no supone ventajas adicionales en trminos de sensibilidad,precisin yexactitudfrente a la estrategiaenbatch cuandoeloperadordispone deunadecuadogradodedestreza. En el segundo trabajo, el desarrollo de un mtodo PSEFTIR ha permitido reducir considerablementeel tiempodeanlisis y la generacinderesiduosen ladeterminacindel contenido de materia grasa en leches en polvo. Sin embargo, se han encontrado errores importantes en su aplicacin a leches en polvo desnatadas, debido a problemas de calibracin e interferencias espectrales, a priori difcilmente subsanables. Adems se ha investigadolautilidadde la espectrometraFTIRparaladiscriminacinrpidade grasasde diferente origen. Tambin se ha realizado un estudio de la relacin entre el contenido de grasayelcontenidoencacaodechocolates,medianteunnuevomtodoPSEFTIR. 210
4.Porloquerespectaaltratamientoenlneadelasmuestras,sehadesarrolladoun nuevo mtodo de anlisis FTIR en lnea para la determinacin del frmaco succinato de doxilamina en especialidades farmacuticas. Este mtodo implica el uso de tan slo 2.6 mL de una mezcla de etanol y cloroformo al 13 % (v/v) por cada rplica, mostrando su aplicabilidad al anlisis de rutina, aun siendo necesario recurrir a la adicin estndar. La extraccin y determinacin del analito se realizan en lnea, explotando la coadicin de espectros como la estrategia ms conveniente para reducir al mnimo el tiempo de anlisis, logrando una frecuencia de anlisis de 10 h1. En este caso se ha demostrado la gran mejora que supone la extraccin en lnea de la muestra, que reduce hasta en cuatro veces el consumo de disolvente respecto del mtodo FTIR equivalente en modo batch y que implica una mnima manipulacin de las muestras, reduciendo al mximo la exposicin de los disolventesaloperadorodelentornoambientaldellaboratorio. En trminos generales, la presente Tesis ha supuesto el desarrollo de al menos 7 nuevos mtodos de anlisis aplicables al control de calidad, que implican consumos reducidos de disolventes y la disminucin de los residuos generados en el anlisis. Estos logros forman partede los esfuerzos orientados hacialapreparacinde mtodosde anlisis medioambientalmentesosteniblesenlosqueseinscribeestaTesis. Granpartedeestemritocorrespondealusodelamulticonmutacinacopladacon las tcnicas del infrarrojo. Los aspectos prcticos de la multiconmutacin, que se han demostradoaquyque,amijuicio,sonlosmsimportantessegnmipropiaexperiencia,se pueden resumir en: i) versatilidad de la estrategia de anlisis, ii) reduccin de la manipulacindelamuestrayiii)facilidaddediseo. Respecto a la versatilidad, hemos mostrado tres estrategias que plantean la multiconmutacin de manera diferente: en una de ellas tiene como principal funcin el reducir la manipulacin del cristal ATR; en las otras dos se aprovecha su capacidad para conseguir la dilucin y adicin de un estndar en lnea; en una se realizan las medidas en modo stoppedflow; en las otras dos la adquisicin de espectros se lleva a cabo en modo continuo. Son ejemplos de la mltiple variedad de enfoques que permite la 211
multiconmutacin a la hora de plantear un diseo experimental adecuado un problema analtico. En referencia a la manipulacin de la muestra, los sistemas con multiconmutacin permiten una intervencin mnima del analista: esto representa un aumento de la comodidad y, en consecuencia, supone la mejora de la eficiencia de un laboratorio de anlisis,independientementedelincrementoenlafrecuenciadeanlisisqueselogregracias almtodoensmismo. Entercerlugar,laexperienciahademostradoqueconunosconocimientosmnimos de programacin y electrnica se pueden disear y construir sistemas que permiten llevar a cabo casi cualquier proceso tpico de un mtodo de anlisis. Esta ventaja, quiz no suficientemente explotada hasta la fecha, en particular en el caso de la espectrometra vibracional, sugiere una enorme cantidad de aplicaciones casi inmediatas, que podran ser deenormeutilidadenelanlisisdecampoyderutina. Finalmente, la tcnica ATRFTIR con celda de diamante ha resultado ser extraordinariamente prctica debido a la dureza y resistencia qumica de este material, a pesar de su fragilidad. La posibilidad de obtener el espectro de prcticamente cualquier sustancialquidaoslidaindependientementedesureactividadqumicalaconvierteenuna tcnica especialmente interesante. El anlisis directo de las muestras que permite este tipo de celdas es quiz uno de los objetivos de la investigacin en el campo de la espectrometra vibracionalmsbuscados. En conclusin, futuras investigaciones deberan explotar al mximo el potencial de la multiconmutacin en la automatizacin de los mtodos de anlisis, por una parte, y aprovechar la gran versatilidad de las celdas ATR de diamante para el anlisis directo de muestrasmuycorrosivas.
212
En definitiva, se ha demostrado la gran capacidad de las tcnicas FTIR para resolver problemas analticos comunes y el papel decisivo que en la actualidad debe tener enloslaboratoriosanalticos. 213
214
215
Captulo VI: Apndices
ApndiceI
ProgramacinenQuickbasic4.5 orientadahaciaelcontroldesistemasconmulticonmutacin El control de las vlvulas solenoides de los sistemas con multiconmutacin que forman parte de esta Tesis ha requerido el diseo de pequeos programas en lenguaje Quickbasic4.5.Comentaremosbrevementelaformabsicadeestosprogramas. El funcionamiento de la vlvula solenoide se debe al paso de corriente elctrica. Cuando sta circula a travs del solenoide, el pistn interno de la vlvula se desplaza bloqueando una de las salidas del flujo. Si no hay paso de corriente elctrica, el pistn se mantiene bloqueando la otra salida. La vlvula recibe la corriente de una placa que le proporciona la intensidad y diferencia de potencial requerida para activarla. A su vez, a la placalellegalaseal(conunadeterminadadiferenciadepotencialeintensidad)procedente delPCdesdeelpuertoapropiado,siendolafuncindelaplacatransformarlasealrecibida desde el PC en la adecuada para que se active la vlvula. Dependiendo de si desde el PC se enva a la placa la seal correspondiente al valor bit 1 o al valor bit 0, la vlvula se activa o no. El control de la vlvula se logra, por tanto, mediante el envo de la seal desde el PC, y ellosehaceconunprogramaenQuickbasic4.5. A modo de ejemplo se describe un pequeo programa de prueba diseado para la realizacindeunaadicinestndar(correspondientealtrabajodedeterminacinFTNIRde hexythiazox en formulaciones de pesticidas). En este sistema slo se emplean dos vlvulas solenoides, una para el carrier (acetonitrilo) y muestra (V1) y otra para la insercin de patrn (V2). El sistema se ha diseado de tal manera que, cuando se activa la vlvula V1 estando desactivada V2,se introduce acetonitrilo a travs del sistema. Si est activada V2 se introduce nicamente patrn. La explicacin de los comandos se ha resaltado entre corchetes (que no pertenecen al programa en s). La versin definitiva es ms compleja. En
216
lo que se refiere al control de las vlvulas este programa de prueba contiene todos los elementos necesarios para realizar una adicin estndar y resulta ms sencillo de explicar, motivoporelqueloreproducimosaqu.
DIM SHARED v1, v2, v3, v4, porta,

[Define las variables comunes utilizadas en el programa, en este caso se han definido hasta cuatro vlvulas(v1,v2,v3,v4)ylaentradadelasvlvulas(porta)]
porta = &H378: v1 = &H1: v2 = &H2: v3 = &H4: v4 = &H8 v5 = &H10: v6 = &H20: v7 = &H40: v8 = &H80:
[Definelacorrespondenciadecadavlvulaconlaentradadelpuertodelaimpresora&H378]
SCREEN 12
[Generalapantalla]
inicio:
[Marcaunpuntoenlasecuenciadeaccionesquerealizaelprograma]
CLS
[Borraloquehubieseanteriormenteenlapantalla]
LINE (2, 2)-(630, 450), 3, B LINE (4, 4)-(626, 446), 3, B

[Generadosrectngulosenlapantalla]
LOCATE 8, 4 PRINT "Adicin estndar"

[Escribeeltextoentrecomillasapartirdelpunto8,4delapantalla]
LOCATE 10, 4 INPUT "tiempo patrn(s)"; tpa

[Pide el valor de la variable tiempo patrn definida como tpa (en segundos). El volumen de patrn insertadoserproporcionalaltiempotpa]
217
LOCATE 12, 4 INPUT "tiempo AcCN(s)"; tac LOCATE 14, 4

[Pide el valor de la variable tiempo de acetonitrilo definida como tac (en segundos). El volumen de acetonitriloinsertadoserproporcionalaltiempotac]
LOCATE 10, 4 PRINT " LOCATE 12, 4 PRINT " " "
[Borralaslneas10y14sinnecesidaddeborrarelrestodelapantalla]
LOCATE 10, 4 PRINT tpa; "segundos de patrn" LOCATE 12, 4 PRINT tac; "segundos de AcCN" LOCATE 14, 4 PRINT "0.5 segundos de muestra" LOCATE 16, 4 PRINT "30 ciclos establecidos"
[Escribelosvaloresdetiempoparalasvariablestpa,tacysealaeltiempodemuestra,queesconstante en este caso, y el nmero de ciclos de insercin, tambin constante (30), que se ha seleccionado previamenteconunestudiodelavariable]
FOR nl = 1 TO 30
[Abre un bucle de accin que se repite 30 veces. Se corresponde con el nmero de ciclos que constituye cadapuntodelaadicinestndar]
LOCATE 22, 4 PRINT nl; "...ciclo"

[Escribeenlapantallaelcicloenelqueseencuentraelsistemaencadamomento,nl]
218
OUT porta, 0
[Dejatodaslasvvulasdesactivadas(bit0)]
p1x = TIMER WHILE (TIMER - p1x) < .5 LOCATE 24, 4 PRINT "Muestra!" LOCATE 25, 5 PRINT .5 - (TIMER - p1x) WEND
[Escribeenlapantallaeltiempoquerestadeinsercindelamuestra]
OUT porta, v1
[Activaslolavlvulav1(bit1),porloqueseinsertaacetonitrilo]
p1bx = TIMER WHILE (TIMER - p1bx) < tac LOCATE 24, 4 PRINT "Acetonitrilo!" LOCATE 25, 5 PRINT tac - (TIMER - p1bx) WEND
[Escribeenlapantallaeltiempoquequedadeinsercindelacetonitrilo,demaneraquecuandotermina sehainsertadountiempotacdeacetonitrilo]
LOCATE 24, 4 PRINT "

219
"
LOCATE 25, 5 PRINT " OUT porta, v2

[Activaslolavlvulav2,esdecir,seinsertaslopatrnporquev1vuelveaestarinactivada]
"
pabx = TIMER WHILE (TIMER - pabx) < tpa LOCATE 24, 4 PRINT "Disolucin patrn!" LOCATE 25, 5 PRINT tpa - (TIMER - pabx) WEND
[Escribe en la pantalla el tiempo que queda de insercin del patrn, de manera que cuando termina se hainsertadountiempotpadepatrn]
NEXT
[CompletaelbucleanteriordemaneraquetodoelprocesodesdeFORnl=1TO30serealiza30vecesen total,igualalnmerodeciclosdeinsercin]
OUT porta, 0
[Inactivatodaslasvlvulas]
BEEP
[Produceunsonidodeaviso]
CLS
[Borralapantalla]
220
aax = TIMER DO WHILE INKEY$ = ""

[GenerauncronmetromedianteelusodelrelojinternoTIMER,cuyotiempoinicialesaax.Estdentro deunbucleinfinitoqueseterminacuandosepresionaunatecla]
LOCATE 24, 4 PRINT "tiempo desde ltimo ciclo..."; TIMER aax

[Escribeenlapantallaeltiempotranscurridodesdequesecompletelltimociclodeinsercin]
LOOP
[Cierraelbucledelcronmetro]
LOCATE 8, 10 INPUT "Desea realizar otro punto de la adicin estndar"; ade$ IF UCASE$(ade$) = "S" THEN GOTO inicio
[Preguntasiserealizaotropuntodelaadicinestndar.SisetecleaS,entoncessevuelvealmarcador inicio:ycontinaelprocesodesdeesesitio.Sisetecleacualquierotrocarcter,elprogramatermina]
BEEP END
[Finalizaelprograma]
221
ApndiceII
Glosariodetrminos procedentesdelingls Background: Espectro de transmisin que se utiliza como referencia para fijar los valores absolutos de seal obtenidos en los espectros realizados posteriormente. En general se utilizaelespectroparalaceldademedidallenadedisolvente. Batch: Proceso que se realiza de manera discontinua o discreta, en este caso referido a un mtododeanlisis. Beam splitter: Dispositivo divisor de un haz de radiacin electromagntica, en este caso de radiacininfrarroja,queformapartedeuninterfermetro. Bypass:Desviacindeunflujoatravsdeuncanalalternativoalprincipal. Carrier:Especieutilizadacomoportadordelamuestraenunsistemadeflujo. Coil:Tubo enrollado atravsdel quese produceuna mezclaoreaccinde los componentes insertadosalternadamenteenunsistemadeflujo. Scan: Cada uno de los barridos realizado a lo largo de todo el intervalo espectral que se promediaparaobtenerelespectrofinal. Slug: Bolo de lquido, definido como cada una de las porciones individuales insertadas en unsistemadeflujo. Software:Programainformtico. Stoppedflow:Flujoparado,referidoalprocesodemedicinenunsistemadeflujo. Zerofilling: Adicin de ceros al interferograma, proceso que se realiza para completar los 2npuntosnecesariosparalaTransformadadeFourieryobtenerelespectroeneldominiode lafrecuencia.
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Captulo VII: Bibliografa
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Desarrollo de Métodos Analíticos Ftir Nir Discusion Ojo

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DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA

DESARROLLO DE MTODOS ANALTICOS MEDIOAMBIENTALMENTE SOSTENIBLES POR ESPECTROMETRA FTIR

JOSEP FRANCESC VENTURA GAYETE

UNIVERSITAT DE VALENCIA Servei de Publicacions 2007

Va ser dirigida per: D. Miguel de la Guardia Cirugeda D. Salvador Garrigues Mateo

Copyright: Servei de Publicacions Josep Francesc Ventura Gayete

DESARROLLODEMTODOSANALTICOS MEDIOAMBIENTALMENTESOSTENIBLES PORESPECTROMETRAFTIR

JosepFrancescVenturaGayete UniversitatdeValncia Valencia,2006

Fdo.: Dr. Miguel de la Guardia

Fdo.: Dr. Salvador Garrigues

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Lasestrellasensucurso combatenporelhombrejusto. Proverbiochino.

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

2.2. Determinacin FTIR de benceno en gasolina: uso de la multiconmutacincomoestrategiaalternativaalFIA.. Introduccin. Resumenydiscusin..

Conclusiones........ Determinacin de hexythiazox en formulaciones

fitosanitarias: aplicacin de la multiconmutacin acoplada a la espectrometraFTNIR... Introduccin. Resumenydiscusin.. Conclusiones

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

FIA 2.3. Determinacin de hexythiazox en formulaciones

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

posibles. La Figura 1 reproduce el esquema de la radiacin electromagntica polarizada en elplano.

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

m nm cm-1 0.033 3.3

0.77 770 390 26000 200 50000 10 0.05

donde k es la constante de fuerza y la masa reducida de la molcula diatmica [(m1

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

En la Figura 5, a modo de ejemplo, se indican las bandas ms caractersticas de algunos gruposfuncionalesimportantes.

Alquenos Alquinos Aromticos OH C=O NH2NH CN NO2 SH S=O

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Figura 6. Relacin ideal entre Absorbancia y concentracin y desviaciones de la misma.

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Beam splitter Interfermetro Espejo colimador Espejo fijo

Detector del lser Fuente IR Lser de referencia

Figura 7. Diseo ptico bsico de un espectrmetro FT con interfermetro de Michelson.

Seal Interferograma Seal Espectro

Diferencia camino ptico x

I(x) cos 2xdx

B() cos 2xd

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Sol. en H2O, alcohol y glicerina Higroscpico

Sol. en H2O y alcohol. Higroscpico

Insol. en H2O, cidos y bases

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Desarrollo de mtodos analticos medioambientalmente sostenibles por espectrometra FTIR

Ventana Placa posterior

n2 n1 A n2 n1 Amplitud del campo elctrico

Haz de radiacin IR de la fuente

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Compuesto no deseado Analito Compuesto no deseado

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Como ya hemos comentado, un mtodo de anlisis comprende una serie de

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