Estreptograminas, Oxazolidinonas

Glicilciclinas

Anfenicoles Lincosamidas Estreptograminas Fusdico cido

URL: http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/apua-cuba/v19-estreptograminas__un_modelo_interesante_para_hacerle_frente_a_la_resistencia_bacteriana.pdf

II. ESTREPTOGRAMINAS

Las estreptograminas son producidas por diversas especies de Streptomyces y constituyen un amplio conjunto de pptidos cclicos con caractersticas muy peculiares; cada miembro se conforma por una combinacin de 2 molculas o grupos: A y B, sin relacin estructural alguna, las cuales corresponden a macrolactonas poli-insaturadas y hexadepsipptidos cclicos, respectivamente; de cualquier manera, ambas inhiben la sntesis proteica bacteriana, actuando sobre el dominio de la peptidil-transferasa de la subunidad ribosomal 50S (4).

Sin lugar a dudas, una de las propiedades ms atractivas de estos compuestos radica en el hecho de que las molculas de ambos grupos actan de forma sinrgica en contra de los agentes causales; ello origina su accin bactericida y reduce la posibilidad de que sobrevivan las variantes resistentes que pudieran surgir hacia uno u otro componentes (15).

URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1043661810001969

Compuestos de tetraciclina con propiedades protectoras de rganos no antimicrobianos: posibles mecanismos de accin
1. Usos clsicos de las tetraciclinas
El compuesto original, clortetraciclina, fue aislado por primera vez en 1947 [1] . Poco despus, otras tetraciclinas naturales se han aislado, incluyendo la tetraciclina (TC), para los que la familia de molculas se llama. Dos de las tetraciclinas semisintticas ms comunes que se utilizan clnicamente como antibiticos son doxiciclina (DOX) y m inociclina (MIN). Debido a su eficacia de los antibiticos de amplio espectro, DOX est indicado para el tratamiento de una variedad de infecciones, incluyendo ntrax, infecciones por clamidias, la neumona adquirida en la comunidad, la enfermedad de Lyme, el clera, la sfilis, la Yersinia pestis (peste), infecciones periodontales, y otros . MIN tambin muestra una eficacia de amplio espectro y se utiliza lo ms a menudo clnicamente en el tratamiento de acn severo, sino que tambin est indicado para muchas de las mismas infecciones que DOX [2] . Las tetraciclinas ejercen su efecto antibitico principalmente mediante la unin a los ribosomas bacterianos y detener la sntesis de protenas [3] . Los ribosomas bacterianos tienen un sitio de unin de alta afinidad se encuentra en la subunidad 30S, as como varios sit ios de baja afinidad en ambos los 30S y 50S subunidades[4] . Tras la unin a los ribosomas, las tetraciclinas inhiben la unin alostrica de la amino acil-ARNt en el sitio aceptor (A-sitio), y la sntesis de protenas cesa [5] . El uso de tetraciclinas ha disminuido en las ltimas dcadas debido a la aparicin de cepas resistentes de bacterias ( . Fig. 1 ). Las tetraciclinas son eficaces tambin, pero de accin lenta medicamentos antimalricos [6] . DOX afecta la expresin de los genes apicoplast. Apicoplast (organelos importantes no fotosintticas que se encuentran en las clulas de las plantas) son anormales en la progenie de parsitos tratados con DOX.

La figura. 1. Medios propuestos por el cual las tetraciclinas pierdan la posibilidad capacidad inhibitoria sntesis de protenas en los patgenos. Esto puede ser secundaria a la extrusin mejorada del frmaco, disminucin de entrada, el desplazamiento de los ribosomas o inactivacin enzimtica. Opciones Figura

2. Propiedades qumicas
TC, DOX, y MIN estn compuestos de un ncleo de anillo de cuatro a los que estn unidos varios grupos secundarios ( . Fig. 2 ). El grupo dimetilamino en el carbono C4 en la mitad superior de la molcula ha demostrado ser necesaria para la actividad antimicrobiana. Tetraciclinas 4-De-dimetilamino, tambin llamados tetraciclinas modificadas qumicamente (CMT), actividad antimicrobiana falta in vivo , presumiblemente debido a la incapacidad de la molcula para adaptar una forma de ion hbrido necesario para la actividad [7] . Sin embargo, CMT retienen la capacidad de unirse a otros objetivos no microbiana, tales como metaloproteinasas de la matriz (MMPs), facilitando su uso en el tratamiento de otras enfermedades [8] . La mitad inferior de la molcula es crtico para la unin a ambos objetivos procariotas y eucariotas, y la interferencia con esta regin reduce o elimina la eficacia de la droga [9] . Esta regin es relevante como el sitio para la quelacin del ion

metlico. La unin de las tetraciclinas a protenas, incluyendo TetR, puede mejorarse en gran medida cuando la tetraciclina se compleja con iones de metales divalentes tales como Ca 2 + o Mg 2 + [10] . La unin de las tetraciclinas para las MMP se piensa que es mediado por la quelacin de Zn estructural y cataltico
2 +

iones

dentro

de

la

enzima

(.

Fig.

3 ) [9] y [11] .Adems, la unin a los ribosomas bacterianos implica la unin a ARN unido a Mg 2 + [12] . La fuerza de la interaccin de tetraciclina-metal es dependiente tanto de la tetraciclina y el in metlico presente. En general, la afinidad de las tetraciclinas para diferentes metales divalentes es, en orden decreciente de afinidad: Cu
+ 2+

> Co 2 + = Fe 2 + > Zn 2 + > Mn 2

> Mg 2 + > Ca 2 + [13] . Las afinidades tambin difieren y son altamente dependientes de pH y en comparacin con TC o

la presencia de otros iones de metal [14] , [15] y [16] . La superioridad relativa de DOX como un inhibidor de MMP es debido a su mayor afinidad para el Zn
2 +

MIN [7] . Otros factores que tambin pueden alterar la actividad tetraciclina; En general, existe una relacin directa entre la lipofilia y la actividad contra las bacterias gram-positivas. La lipofilia de TC, DOX, y MIN, como se determina por reparto entre octanol y tampn acuoso, son 0,025, 0,600, y 1,1, respectivamente [17] , y la concentracin mnima inhibitoria contra Staphylococcus

aureus es 0,21, 0,19, y 0,10 g / ml, respectivamente [18] . La lipofilia tambin afecta la
distribucin de tejido. MIN es capaz de cruzar la barrera sangre-cerebro mucho ms fcilmente que DOX o TC. MIN alcanza niveles en el cerebro casi 3 veces ms alta que DOX, y TC es indetectable en el cerebro [19] .

La figura. 2.

Estructura qumica de las tetraciclinas. Opciones Figura

La figura. 3. Medios propuestos por el cual la doxiciclina acta a travs de la quelacin de zinc y calcio pueden actuar para inhibir las metaloproteinasas de matriz. Opciones Figura

3. Metaloproteinasas de matriz (MMP) la inhibicin por tetraciclinas

Probablemente la mejor propiedad no antimicrobiano caracterizado de las tetraciclinas es su capacidad para inhibir los miembros de la familia de las MMP de endopeptidasas [20] . MMP pueden subdividirse en base a especificidades de sustrato crudo en las colagenasas, gelatinasas, estromelisinas y las MMP de tipo membrana (MT-MMP) [21] . El grupo incluye la colagenasa MMP-1, MMP-8, y MMP-13, que todos los colgenos fibrilares escinden (tipos I y III). Fragmentos de colgeno posteriormente se desnaturalizan e n gelatinas. Las gelatinasas, que incluyen la MMP-2 y MMP-9, proteolizar las gelatinas. Las gelatinasas tambin degradan el colgeno de la membrana basal (tipo IV). Las estromelisinas incluyen MMP-3, MMP-7, MMP10, y MMP-11 y son capaces de degradar los pr oteoglicanos, laminina, fibronectina, colgeno IV, y otros. La membrana celular anclado MT-MMP MMP incluye seis diferentes, de los cuales MT1-MMP es el mejor caracterizado [22] .

La inhibicin de las MMP es beneficiosa en muchas condiciones patolgicas en las que la proteolisis mediada por la MMP de la matriz extracelular (ECM) contribuye a la patognesis, tales como la remodelacin cardiaca, la invasin tumoral y la inflamacin [21] , [23] y [24] . Actualmente, el inhibidor de MMP slo est disponible clnicamente es DOX, y se indica slo para el tratamiento de la periodontitis [23] y [25] . El mecanismo por el que las tetraciclinas inhiben las MMP no ha sido completamente dilucidado. Se cree que ejercen sus efectos anti-proteolticas por tanto la inhibicin directa de las MMPs y mediante la inhibicin de su expresin. La inhibicin directa de MMPs parece estar mediada por una interaccin entre la molcula de tetraciclina y los iones metlicos dentro de la MMP; parece que el mecanismo de inhibicin es dependiente de la quelacin de los metales estructurales en lugar de quelacin del sitio activ o de Zn 2 + [26] .La eficacia de la inhibicin de tetraciclina contra diversas MMP depende de la especie de tetraciclina, especies de MMP, y el pH. Se ha demostrado que DOX es ms potente que el MIN o TC contra colagenasas purificados a partir de crneas de conejo, con IC
50

valores de 15 m, 190 m, y 350 M,

respectivamente, y esta tendencia puede explicarse por la afinidad relativamente alta de DOX y baja afinidad de la TC para el Zn2 + [7] . La CI 50 valores de DOX contra las colagenasas MMP-8, MMP-13 y MMP-1 son 1-10 M, 5-30 M, y> 200 M, respectivamente [27] , [28] y [29] ; las razones de las diferencias no son claras. El pH del sistema afecta tambin a la inhibicin como se evidencia por la capacidad de DOX para inhibir la MMP-8 a pH> 7,1 y la incapacidad para inhibir a pH <7,1 [30] . Adems de inhibir directamente las MMPs, las tetraciclinas inhiben tambin la sntesis de MMP. DOX inhibi inducida MMP-8 mRNA de citoquinas y la acumulacin de protenas en cultivos de fibroblastos sinoviales de rata [31] . En fibroblastos de piel humana cultivadas, TC inhibe la interleucina-1 (IL-1) inducida por la MMP-3 de expresin [32] . Desde la MMP transcripcin es inducida por una serie de citoquinas pro inflamatorias y otros factores de crecimiento, incluyendo IL-1, IL-6, factor de necrosis tumoralalfa (TNF-), factor de crecimiento epidrmico y otros [33] , es probable que estas cascadas de sealizacin aguas arriba que conducen a la expresin de MMP son objetivos importantes de las tetraciclinas. Una consecuencia interesante de la inhibicin de MMP es la inhibicin indirecta de las proteasas de serina. MMP pueden inactivar inhibidores de la proteasa serina (serpinas) [34] y [35] , y la inhibicin de MMP con DOX o CMT conserva serpinas bloqueando as la actividad de la proteasa de serina[36] , [37] , [38] , [39] y [40] .

URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283603006624

El mecanismo de accin de los macrlidos, lincosamidas y Estreptogramina B revela la ruta naciente Pptido Salir en el ribosoma

Abstracto
La clase B macrlidos lincosamida-estreptogramina (MLS) de los antibiticos contiene estructuralmente diferentes, pero funcionalmente medicamentos similares, que todos se unen a la 50 S ribosomal subunidad.Se ha sugerido que estos compuestos bloquean el camino por el que los pptidos nacientes salen del ribosoma. Se han estudiado los mecanismos de accin de los macrlidos (eritromicina cuatro, josamicina, espiramicina y telitromicina), uno lincosamida (clindamicina) y (pristinamicina IA) una estreptogramina B.Todos estos MLS drogas causan disociacin del peptidil-ARNt del ribosoma. Josamicina, espiramicina y clindamicina, que se extienden hasta el centro de peptidil transferasa, causan la disociacin del peptidil -ARNt que

contienen dos, tres o cuatro residuos de aminocidos. Eritromicina, que no alcanza el centro de peptidil transferasa, induce la disociacin de peptidil-ARNt que contienen seis, siete u ocho residuos de aminocidos. Pristinamicina IA causa la disociacin del peptidil-ARNt con seis residuos de aminocidos y telitromicina permite la polimerizacin de nueve o diez residuos de aminocidos antes de peptidil-ARNt se disocia. Nuestros datos, en combinacin con informacin estructural anterior, sugieren un modo de accin comn para todos los antibiticos MLS, que es modulada por el espacio disponible entre el centro de peptidil transferasa y el medicamento.

1. Introduccin
Macrlidos, lincosamidas y estreptogramina B (MLS) son clnicamente tiles antibiticos ( Figura 1 ), todos los cuales se unen a la subunidad ribosmica grande, cerca del centro de peptidil transferasa. 1. , 2. y 3. Este centro est compuesto enteramente de ARN y cataliza la formacin de enlaces peptdicos durante la elongacin de la protena. miembros del grupo de la MLS. 6
4.
y

5.

Varias alteraciones

en 23 S ribosomal RNA, por ejemplo, la metilacin de A2058, dar resistencia contra todos los

Figura 1. Las estructuras qumicas de los antibiticos utilizados en el presente estudio. La espiramicina es una mezcla de tres compuestos como se indica en la figura. Opciones Figura

Los macrlidos contienen un 14 - o 16-anillo de lactona miembros, sustituido con varios azcares neutros o amino -, 15. La eritromicina anillo de 14 miembros es probablemente la ms conocida a macrlidos 7 ( Figura 1 ). Josamicina y espiramicina ejemplifican macrlidos de 16 miembros de anillo lactona ( Figura 1 ).Recientemente, cetlidos (incluyendo la telitromicina) con amplio espectro de actividad contra los patgenos se desarrollaron a partir de macrlidos de 14 miembros. Estos medicamentos contienen un grupo ceto en lugar del residuo de cladinosa en la posicin 3 del anillo de lactona y tienen cadenas laterales de alquilo -arilo ( Figura 1 ). 8. , 9. , 10. y 11. Aunque funcionalmente similares a los macrlidos, la lincosamidas y antibiticos de tipo B estreptogramina tienen muy diferentes estructuras ( Figura 1 ). Lincosamidas y macrlidos que contienen un azcar micarosa inhiben la reaccin peptidiltransferasa, 12. y 13. tener sitios de unin se solapan parcialmente con los sustratos de la peptidil transferasa. 2. y 3. Por el contrario, los macrlidos del grupo de eritromicina y antibiticos

estreptogramina tipo B hacen no inhibir la reaccin de transferencia de peptidil per

se . 14. y 15. Ms bien, bloquean la entrada del tnel en la subunidad ribosmica

grande, 4. , 16. y 17. travs de la cual muchos, si no todos, cadenas de pptidos nacientes salen de la ribosoma. 18 Bloqueo de la salida del tnel por los macrlidos induce la disociacin prematura de peptidil-ARNt del ribosoma. 19. y 20. Tales acontecimientos "drop-off" se producen justo despus de la iniciacin de la sntesis de protenas, cuando la cadena de polipptido naciente es corto. En contraste, los ribosomas que han entrado en polisomas son refractarios a la droga. 21. , 22. y 23. Se ha propuesto que los antibiticos MLS desestabilizan la unin de pptidos nacientes al ribosoma, 24 pero sus mecanismos inhibitorios han permanecido en la oscuridad debido a la falta de informacin estructural acerca de las interacciones entre los pptidos nacientes y el ribosoma. Estructuras cristalinas de rayos X recientemente resueltos ahora revelar los detalles moleculares de cmo los antibiticos MLS se unen a la subunidad 50 S.
2. , 3.
y

11.

Definir

claramente las relaciones estructura-funcin de este grupo de frmacos y otros inhibidores de la sntesis de protenas, se han desarrollado un sistema experimental que permite estudios detallados de sus modos de accin. Los resultados ponen la accin de los antibiticos MLS en una nueva perspectiva y ayudar a seguir el camino por el que los pptidos nacientes salen del ribosoma a travs del tnel en el 50 S subunidad.

2. Resultados
Para estudiar el mecanismo de accin de los antibiticos MLS, un sistema libre de clulas para la sntesis de la protena fue reconstituida a partir de Escherichia

coli componentes. 25 Diferentes pptidos nacientes pueden tener muy diferentes propiedades
qumicas. Por lo tanto, sus interacciones con el ribosoma pueden ser diferentes, lo que conduce a diferencias en su sensibilidad contra los antibiticos MLS. Por ejemplo, la sntesis de polifenilalanina est mal inhibe por la eritromicina y estreptogramina B,
26. , 27.
y

28.

mientras que

estos frmacos inhiben fuertemente la incorporacin de aminocidos bsicos. Los pptidos traducidos de ribonucletidos homopolimricas y otros anlogos de ARNm sintetizados qumicamente tienen composiciones de aminocidos que no es probable que se enc uentra en la naturaleza. En contraste, el estudio actual utiliza secuencias de pptidos de origen natural. Dos ARNm diferentes se tradujeron en la ausencia o en la presencia de los antibiticos. La primera ARNm contena un marco de lectura abierto (ORF) que codifica los 12 aminocidos Nterminales de la protena de cubierta de MS2 fago (para mejorar la eficiencia de la produccin de pptido, el residuo de alanina en la posicin 2 fue sustituido con valina),
29.
y

30 .

, y la

segunda un ORF que codifica los primeros nueve residuos de aminocidos de la ermC pptido lder opern. 31 Las reacciones de traduccin no contenan factores de liberacin de la cadena de polipptidos. Por lo tanto, se forman complejos entre los ribosomas y peptidil-ARNt correspondientes al ltimo codn de la ORF en ausencia de antibiticos. Las reacciones de traduccin contenan la enzima peptidil-ARNt hidrolasa (PTH). 32 peptidil-ARNt que disocian del

ribosoma a gota-off se hidrolizaron por la accin de la PTH, pero no los permaneciendo unido al ribosoma. 33 Las incubaciones se detuvieron por Adems de cido frmico; un tratamiento que precipit peptidil-ARNt y dej la mayor parte de los pptidos libres en solucin. Despus de la centrifugacin, los pptidos tanto en sedimento y sobrenadante se cuantificaron por HPLC de fase inversa con radiometra en lnea ( Figura 2 y Figura 3 ). Algunos de los, de larga duracin libre de erm y pptidos MS2 precipit en presencia de cido frmico. Esto hizo que las estimaciones de sus valores menos precisos que los de los pptidos cortos ( Figura 4 y Figura 5 ). Con todas las drogas, el experimento se repiti al menos tres veces, y las cantidades relativas de los pptidos ms cortos variaron por menos de 20%. Las conclusiones que se presentan en la Figura 6 se basan en al menos tres experimentos independientes, todos muestran la misma tendencia y con poca variacin entre ellos.

Figura 2. Diseo experimental para la cuantificacin de la peptidil -ARNt unido al ribosoma y la peptidil-ARNt disociada en los eventos de recoleccin. Peptidil-ARNt que se disocian del ribosoma a gota-off son hidrolizados por la accin de la peptidil -ARNt hidrolasa (PTH). Las reacciones de traduccin se detuvo por adicin de cido frmico, un tratamiento que precipita todas las molculas de elevada masa molecular (incluyendo peptidil-ARNt y ribosomas), pero las hojas de los pptidos hidrolizados en solucin. Despus de la centrifugacin, los pptidos tanto en sedimento y sobrenadante se cuantifican por HPLC de fase inversa con radiometra en lnea ( Figura 3 ). Opciones Figura

Figura 3. Ejemplos de cromatogramas que se utilizaron para la cuantificacin de pptidos MS2 producidos en el sistema de traduccin libre de clulas. Los tiempos de retencin para diferentes pptidos se indican debajo de los cromatogramas.(Pequeas cantidades de [ 3 H]-metionina, formil-[ 3 H] metionina y [ 3 H] Met-tRNA estuvieron presentes en la [ 3 H] preparacin fMet-ARNt.) (a) En ausencia de antibiticos, en su mayora llenos se producen -pptidos de longitud. Debido a que ningn factor de liberacin de la cadena polipeptdica est presente, los pptidos de larga duracin permanecen en los ribosomas en la forma de peptidil-ARNt y precipitan con cido frmico. (B) En la ausencia de antibiticos, sin acumulacin significativa de pptidos se observ en el sobrenadante de cido frmico. (C) La eritromicina disminuye la cantidad de producto de longitud completa en el precipitado de cido frmico. (D) El mayor efecto de la eritromicina se observ en el sobrenadante cido frmico, donde los pptidos que contienen seis, siete u ocho residuos de aminocidos se acumulan. Opciones Figura

Figura 4. La acumulacin de pptidos durante la traduccin del ARNm de MS2. (A) Secuencia del pptido MS2. (B) Los pptidos en el precipitado de cido frmico (que corresponde a los peptidil -ARNt que no se disocian del ribosoma, estancado peptidil-ARNt). (C) Los pptidos en la fraccin soluble en cido frmico (correspondiente a los eventos de devolucin peptidil -ARNt). Opciones Figura

Figura 5. La acumulacin de pptidos durante la traduccin del erm ARNm. (A) la secuencia del erm pptido. (B) Los pptidos en el precipitado de cido frmico (que corresponde a los peptidil -ARNt que no se disocian del ribosoma, estancado peptidil-ARNt). (C) Los pptidos en la fraccin soluble en cido frmico (correspondiente a los eventos de devolucin peptidil-ARNt). Opciones Figura

Figura 6. La figura muestra la estructura cristalina de 50 S subunidades en complejo con un anlogo de la peptidil-ARNt y diferentes antibiticos MLS, as como la distancia entre cada medicamento y N3 de la A2451, un tomo situado muy cerca del sitio cataltico de la peptidil transferasa.
4 . , 5.
y

46.

Se muestra,

en cada caso, las longitudes de los pptidos en las peptidil-ARNt que se disocian del ribosoma por la accin de la droga (la longitud del pptido en la cada importante de producto se escribe en negrita enfrentar). (A) Haloarcula marismortui 50 S subunidad con un anlogo de la dipeptidil -tRNA en el sitio. 47 Para mayor claridad, no se muestran las partes de la analgica (cido caproico y residuos de biotina). El residuo fenilalanina N-terminal se muestra en rojo, el siguiente, residuo de tirosina en negro y A76 del ARNt se muestra en magenta. Los nucletidos A2058, A2059, A2062 ( E. coli numeracin) del RNA ribosomal 23 S, esencial para la unin macrlido, se muestran en verde, A2451, un componente importante del centro peptidil transferasa,
4.
y

5.

se muestra en rojo y C2452 se muestra en

azul. N3 de A2451 de 23 S RNA se muestra en amarillo y las protenas L4 y L22, que forman parte de la pared del tnel 4. , 5. y 46. se muestran en azul y amarillo, respectivamente. (B) carbomicina A unida a la H. marismortui 50 S ribosomal subunidad. 3 carbomicina se ha utilizado como una gua para las interacciones josamicina-ribosoma. Estos compuestos tienen estructuras qumicas muy similares y tienen los mismos grupos (micaminosa, micarosa y residuos isobutirato) se acercan al centro peptidiltransferasa. El anillo de lactona se muestra en rojo, las micaminosa y micarosa residuos en negro y el

residuo isobutirato, que se acerca al centro peptidil transferasa, se muestra en magenta. (C) Clindamicina (rojo), unido a las Deinococcus radiodurans 50 S subunidad ribosomal. 2 (d) espiramicina, unido a la H.marismortui 50 S subunidad ribosomal. 3 El anillo de lactona se muestra en rojo, la micaminosa y residuos micarosa en negro y el resto forosamina en magenta. (E) La eritromicina, unido a la D. radiodurans 50 S ribosomal subunidad. 2 El residuo desosamina de la eritromicina se muestra en negro y el resto de cladinosa (no presente en cetlidos) se muestra en magenta. (F) ABT 773 en el D. radiodurans 50 S ribosomal subunidad, magenta. Opciones Figura
11

como una gua para la unin de telitromicina al

ribosoma. El residuo desosamina de ABT 773 se muestra en negro y el grupo quinollylallyl en

Los experimentos revelaron que todos los MLS antibiticos en nuestro estudio causaron la disociacin del peptidil-ARNt del ribosoma, pero las longitudes de sus pptidos diferan de un frmaco a otro. La espiramicina y clindamicina, que se unen cerca del centro de peptidil transferasa, 2. y 3. as como josamicina disociacin inducida de peptidil-ARNt que contienen dos, tres o cuatro residuos de aminocidos ( Figura 4 y Figura 5 ). Josamicina tiene una estructura similar a la de carbomicina, que tambin se une cerca del centro de peptidil transferasa, 3 y por lo tanto en este carbomicina estudio se ha utilizado para modelar interacciones josamicinaribosoma. Eritromicina, que no alcanza el centro de peptidil transferasa,
2.
y

3.

, as como la

pristinamicina IA inducidos bajada de peptidil-ARNt con seis, siete u ocho residuos de aminocidos ( Figura 4 y Figura 5 ). La telitromicina, el ms pequeo de los macrlidos probados, permiti la polimerizacin de nueve o diez residuos de aminocidos antes de la disociacin del peptidil-ARNt producido ( Figura 4 ). Los efectos de los frmacos sobre la sntesis de los dos pptidos eran muy similares, pero pequeas diferencias en los espectros de longitud de pptido podran ser vistos por los antibiticos que se extienden hasta las proximidades del centro de peptidil t ransferasa ( Figura 4 y Figura 5 ). Por ejemplo, josamicina inducida drop-off de la dipeptidil-ARNt y tripeptidil-ARNt durante la sntesis del erm pptido que contiene glicina en la segunda posicin. En contraste, este medicamento caus la disociacin slo de la dipeptidil-ARNt durante la sntesis del pptido MS2, que contiene valina en la segunda posicin. Adems, espiramicina causada principalmente acumulacin de tetrapeptidyl-ARNt durante la sntesis de la ERMpptido y dipeptidil-ARNt en el caso del pptido MS2. La clindamicina causada acumulacin de dipeptidil ARNt y tetrapeptidyl-ARNt en el caso de la ERM pptido y di-y tripeptidil-ARNt en el caso del pptido MS2.Para la eritromicina, que no alcanza el centro de peptidil transferasa, as como la pristinamicina IA, el patrn de inhibicin fue idntico para los dos pptid os ensayados. Estos frmacos inducen la disociacin de peptidil-ARNt que contienen seis, siete u ocho residuos de aminocidos. Por ltimo, la telitromicina produjo bajada de peptidil-ARNt que contienen nueve o diez residuos de aminocidos durante la sntesis del pptido MS2, y no pudo inhibir la sntesis de la longitud completa erm pptido con nueve residuos de aminocidos.

3. Discusin

Los experimentos descritos aqu han investigado lo que ocurre durante la traduccin de los ARNm para dos cadenas peptdicas diferentes (la secuencia N -terminal de la protena de cubierta de MS2 fago y la ermCpptido lder opern) por los ribosomas en el complejo con macrlidos (eritromicina, josamicina, espiramicina y telitromicina), una lincosamida (clindamicina) y una estreptogramina B (pristinamicina IA). Se encontr que todos estos frmacos causan la disociacin del peptidil-ARNt del ribosoma. Se observ previamente que la eritromicina y estreptogramina B causa la disociacin del peptidil -ARNt del ribosoma durante la traduccin de poli (U) o poli (A, C) mensajeros.
15. , 19. , 27.
y

28.

Estos in vitro estudios son en

lnea con otros anteriores in vivo experimentos que muestran que los macrlidos y lincosamidas causan acumulacin de peptidil-ARNt en la clula. 20. , 34. y 35. Se sabe que la acumulacin de peptidil-ARNt en la clula provoca el agotamiento de piscinas tRNA libres y por lo tanto, es txico. 33. , 36. y 37. Es probable que la mayora de los pptidos nacientes salen del ribosoma a travs de un tnel en la subunidad 50 S. 4. y 18. Los sitios de unin para los antibiticos de la MLS se encuentran en el comienzo de este tnel, antes de que se constrie por las protenas ribosomales L4 y . L22 2. , 3. y 11. Figura 6 (a) muestra el ARN 23 S nucletidos A2058, A2059 y A2062 ( E.

coli numeracin) que son esenciales para la unin de los antibiticos MLS. Todos los tres
nucletidos interactan directamente con los macrlidos ; A2062 forma un enlace covalente con el grupo ethylaldehyde en macrlidos de 16 miembros. 3 Una explicacin de los efectos de los medicamentos de la MLS podra por lo tanto ser que impiden que los pptidos nacientes de entrar en el tnel. Cuando esto sucede sera de esperar que un alargamiento adicional pptido es inhibida, y que la nica forma en que una peptidil -ARNt puede dejar el ribosoma es en un evento de entrega. Las Figuras 6 (b) - (f) . muestran las estructuras cristalinas de carbomicina, clindamicina, espiramicina, eritromicina y un cetlido, ABT 773, en el complejo con la subunidad ribosmica grande .
2,. 3
y

. 11

En este estudio, carbomicina tiene ha utilizado para modelar interacciones

josamicina-ribosoma debido a que estos compuestos tienen estructuras muy similares; Por otra parte, los grupos qumicos que se acercan al centro de peptidil transferasa son idnticos. En los cetlidos ABT 773 y telitromicina, el gran grupo hidrfobo (alquilo -arilo o quinollylallyl, respectivamente) est unido al anillo de lactona en dif erentes posiciones. Sin embargo, los mismos cis -que actan pequeos pptidos que contienen una secuencia de consenso especfica confieren resistencia a todos los cetlidos,
8.
y

38.

pero

no

otros

macrlidos, 8. y 39. lo que sugiere que este subgrupo de macrlidos tiene miembros con el mismo estructural y funcional modos de accin. De acuerdo con ello, se utiliza el ABT 773:50 S subunidad complejo 11 como una gua de cmo telitromicina se une al ribosoma. La distancia entre el centro de drogas y la peptidil transferasa es ms corta para josamicina (4,2 ), casi igual para la clindamicina (4,6 ), significativamente mayor para la espiramicina (7 ), an mayor para la eritromicina (10,6 ) y el mayor para ketlidos (12,9 ). Si el modo de accin de los antibiticos es para bloquear el crecimiento de pptidos y la posterior entrada al tnel de salida, no debera haber una fuerte correlacin positiva entre el espacio disponible

entre el frmaco y el centro de peptidil transferasa en un lado y, por el otro, la longitud de los pptidos en las peptidil-ARNt que se disocian de los ribosomas bajo la influencia de estos frmacos. Para probar esta hiptesis, se determin la longitud de las cadenas de pptidos en peptidil ARNt que se haba disociado de la ribosoma por la accin de los frmacos de la ML S durante la traduccin de dos ORFs diferentes. La traduccin de la ORF para el pptido N -terminal MS2 ( Figura 4 (a) ) result en bajada de la dipeptidil-ARNt en presencia de josamicina, di-y tripeptidil-ARNt en el caso de clindamicina, la dipeptidil-ARNt en el caso de espiramicina y peptidil-ARNt con seis o siete residuos de aminocidos en el caso de la eritromicina ( Figura 4 (c) ). La traduccin de la ORF de la ERM pptido ( Figura 5 (a) ) result en bajada de di-y tripeptidil-ARNt en el caso de josamicina, di-y tetrapeptidyl-ARNt en el caso de clindamicina, di-, tri- y tetrapeptidyl-ARNt en el caso de espiramicina y de hexa-, hepta-o octapeptidyl-ARNt para la eritromicina (Figura 5 (c) ). La posicin de cetlidos ms lejos en el tnel y la ausencia del residuo de azcar cladinosa de su estructura ( Figura 1 ) sugieren que dejan ms espacio para el pptido en crecimiento que la eritromicina (Figura 6 (e) ). Esto est en consonancia con la constatacin de que la telitromicina produjo bajada de peptidil -ARNt con pptidos que van de nueve a 12 residuos de aminocidos en el caso del pptido MS2 ( Figura 4 (c) ) y no caus ninguna bajada durante la sntesis de la erm pptido ( Figura 5 (c) ). Pristinamicina IA, una estreptogramina B-tipo antibitico, caus la disociacin de hexapeptidyl-ARNt del ribosoma ( Figura 4 y Figura 5 ). Aunque una estructura de cristal de la subunidad de 50 S y una droga de estreptogramina B todava no est presente, el hecho de que la eritromicina y la pristinamicina IA inducida por bajada de peptidil-ARNt con longitudes de pptidos similares ( Figura 4 y Figura 5 ) sugieren que tanto bloquean la tnel ribosomal y dar espacio similar para el pptido naciente crezca. Los antibiticos de estreptogramina contienen dos componentes qumicamente distintos, A (IIA pristinamicina) y B (IA pristinamicina), que actan sobre el ribosoma sinrgicamente. 1. y 15. Es posible que el bajo nivel de inhibicin por pristinamicina IA que se ha observado en el estudio actual ( Figura 4 y Figura 5 ) podra ser mejorada por pristinamicina IIA. Estos datos son compatibles con un mecanismo para la inhibicin de la sntesis de protenas que es compartida por todos los antibiticos del grupo de la MLS. La sugerencia es que todos ellos bloquean la entrada del tnel ribosmico, pero que el espacio que permiten para los pptidos nacientes se limita a los diferentes grados ( Figura 6 ). El pptido ser en cada caso crecer a un punto en el que ms peptidil-transferencia es inhibida por impedimento estrico, y esta inhibicin eventualmente conducir a la disociacin del peptidil -ARNt del ribosoma. Esto explicara las observaciones anteriores de que algunos medicamentos MLS inhiben la peptidil transferasa, debido a la falta de espacio para un mayor crecimiento del pptido naciente. 12. , 13. y 14. Lamentablemente, no sabemos en que la conformacin de los pptidos nacientes estn en el ribosoma. Sin embargo, s sabemos que los pptidos no pueden estar en una conformacin extendida en presencia de eritromicina, pristinamicina IA o telitromicina,

desde entonces los restos de cinco aminocidos cubriran una distancia de aproximadamente 14 . Nuestro diseo experimental con tiempos de incubacin largos (un minuto) permiti estimar slo la probabilidad de drop-off frente a la probabilidad de la transferencia peptidil para cada longitud del pptido, pero no dio a conocer las tasas absolutas de estas reacciones. Por consiguiente, las mayores probabilidades gota-off podran ser causados por un aumento de las tasas de disociacin de peptidil-ARNt, la reduccin de las tasas de transferencia de peptidilo o por una combinacin de estos dos efectos. Nuestros datos han demostrado que la clindamicina, la eritromicina y la pristinamicina IA perder su capacidad para inhibir la sntesis de protenas en los ribosomas con pptidos que han crecido ms all de una longitud crtica ( Figura 4 y Figura 5 ). Esto est de acuerdo con la in

vivo de datos, que la eritromicina puede inhibir la sntesis de protenas slo en, o justo despus
de, la iniciacin de la traduccin del ARNm. 21Una razn podra ser que los medicamentos de la MLS y las cadenas de pptidos nacientes han superposicin de sitios de unin en el ribosoma. 22
.
y

23.

Dado que la afinidad de la peptidil-ARNt con cadenas de pptidos largos

hasta el ribosoma es muy alta, los medicamentos pueden ser incapaces de competir por estos sitios de unin cuando los pptidos son largas. La longitud del pptido en el que los antibiticos MLS comenzaron a inhibir la sntes is de protena era notablemente similares para los dos ORFs probadas ( Figura 4 y Figura 5 ). Slo cuando la traduccin es bloqueado en la etapa muy temprana, como en el caso de josamicina, espiramicina y clindamicina, se poda ver una diferencia en las longitudes de pptidos para las dos ORFs. Para los antibiticos que causan la disociacin del peptidil-ARNt con pptidos ms largos, el patrn de inhibicin en los dos ARNm fue esencialmente idntica. Esto sugiere que el pptido naciente est siguiendo una "pista de columna vertebral" en el tnel, de manera que descarrilamientos son independientes de las propiedades de la cadena lateral de aminocidos y slo dependen de donde la pista est bloqueado por el antibitico. Con la reciente aparicin de estructuras de cristal de alta resolucin, la investigacin sobre los ribosomas y antibiticos ribosoma dirigido ha dado un paso importante hacia adelante. Anteriormente, la mayora de los estudios bioqumicos sobre el mecanismo de accin de los antibiticos de ribosomas dirigida se han realizado en sistemas de traduccin con anlogos de ARNm sintetizados qumicamente, haciendo que los resultados menos relevante para la in vivo situacin. Por otra parte, la naturaleza exacta de los productos de reaccin no se ha determinado. Los enfoques desarrollados en este estudio han superado estas limitaciones experimentales. Los enfoques interactivos, en los que la informacin estructural con resolucin atmica y los resultados de la bioqumica avanzada se combinan, promesa oso de un conocimiento mucho ms profundo de los mecanismos bsicos de la sntesis de protenas, as como de los principios de accin antibitica subyacente.