Republica Bolivariana de Venezuela Ministerio del Poder Popular para la educacin Universitaria Universidad Central de Venezuela Facultad de Ciencias

Escuela de Biologa

Informe
Unidad I: Transferencia de informacin gentica en eucariotes

Introduccin
La mosca de la fruta Drosophila melanogaster presenta una serie de caractersticas que la hacen un material biolgico ideal en modelos experimentales, posee un ciclo de vida muy corto, distincin clara entre cada una de sus fases de desarrollo, gran cantidad de descendientes, su mantenimiento requiere poco espacio y es de costo reducido. Existen diferencias entre los machos y hembras de esta especie, la punta del abdomen es elongada en la hembra y redondeada en el macho, estos ltimos tambin poseen los llamados peines sexuales, un cepillo de fuertes setas negras en la articulacin basal del tarso del primer par de patas. Otra observacin importante es tomar en cuenta la pigmentacin abdominal como criterio de diferenciacin entre machos y hembras, pero para esto hay que tener cuidado debido a que en ejemplares que no estn totalmente desarrolladas, esta pigmentacin no es total, por lo cual puede haber confusiones. Los caractersticas que permiten a D. melanogaster como material biolgico adecuado para demostrar algunos principios genticos en eucariotes son: el bajo nmero de cromosomas que posee, cuatro en total; la disponibilidad de una gran variedad de cepas con rasgos mutados de fcil reconocimiento cuya ubicacin cromosmica es conocida y la facilidad de su crecimiento sobre medios de cultivo sencillos, pudindose obtener proles abundantes en aproximadamente 9 a 10 das. La condicin diploide de estos organismos eucariticos, se debe a que sus genes existen en pares denominados alelos, y cada alelo se encuentra en un locus determinado sobre cada cromosoma homlogo. Cuando la expresin de ambos alelos es idntica: (AA o aa), se dice que el organismo es homcigo para ese par de genes. Un par de genes alelos es hetercigo cuando la expresin de cada gen del par es diferente (Aa). En el caso de un individuo homocigoto, de genotipo AA o aa, la expresin de ambos alelos idnticos da lugar a un fenotipo particular, fenotipo A, o fenotipo a, respectivamente. Si la relacin entre los alelos A y a es de dominancia completa de A sobre a, el individuo heterocigoto Aa es de fenotipo dominante: A, y es fenotpicamente indiferenciable del homcigo AA. Si la relacin entre el par allico no es de dominancia completa, en los heterocigotos Aa el fenotipo puede ser diferente a A y a a, o intermedio entre A y a, y estas relaciones allicas se denominan de dominancia incompleta, y codominancia, respectivamente. Estos conceptos anteriores estn relacionados con algunos principios genticos que se desarrollaran mediante diseos experimentales acerca de la herencia independiente y herencia ligada al sexo. El cruce monohbrido es aquel que se realiza entre dos variedades que difieren en un slo rasgo: por ejemplo AA x aa. El fenotipo de la primera generacin F1 presentar el rasgo dominante A, y el genotipo ser Aa. Al cruzar la generacin F1 entre s, tanto los machos como las hembras producirn dos tipos de gametos (n): A y a. El cruce al azar de estos gametos durante la fecundacin, originar una generacin F2

integrada por 3/4 de individuos de fenotipo dominante A (AA, o Aa) y 1/4 de individuos de fenotipo recesivo a (aa). Por otro lado un cruce dihbrido es el que se establece entre individuos que difieren en dos caracteres, por ejemplo AA,bb x aa,BB. Los hbridos de la generacin F1 presentan el fenotipo dominante (Aa, Bb) y en la generacin F2, producto del cruce F1 por F1, se ve que cada rasgo se segrega individualmente. Si se analiza la segregacin de ambos rasgos conjuntamente se observa que un par allico segrega independientemente del otro, lo cual se conoce como Principio de Segregacin Independiente o Segunda Ley de Mendel. Tambin en este caso las frecuencias genotpicas son consecuencia de las frecuencias caractersticas de la formacin de gametos. Los hbridos de la generacin F1 forman cuatro tipos de gametos: A,B; A,b; a,B y a,b, todos con igual probabilidad (0,25 o ). Las frecuencias fenotpicas en la F2 dependern del tipo de interaccin allica que exista entre cada uno de los pares allicos considerados. Si en ambos es de dominancia completa, la proporcin fenotipica en la F2 ser: 9/16 Ab, 3/16Ab, 3/16aB, 1/16ab, siempre y cuando no haya influencia de factores ambientales o se den efectos epistticos entre los rasgos involucrados. En conclusin, cuando 2 o ms pares de alelos se encuentran ubicados en cromosomas diferentes, cada uno de ellos segregan independientemente de los otros. Cuando los rasgos considerados en un cruce estn ubicados sobre cromosomas autosomales, la combinacin particular en que se encuentren en los individuos que inician el cruce, por ejemplo que las hembras sean AA,BB y los machos aa,bb, o que sean aa,BB y AA,bb, etc., no influir en la forma como ellos se transmiten de una generacin a otra y los resultados sern similares. La distribucin de los fenotipos entre machos y hembras de la generacin F2 ser equitativa, tanto si ambos caracteres dominantes son aportados por uno de los progenitores, como si cada progenitor aporta solo uno de los caracteres dominantes. En el caso de caracteres ubicados sobre cromosomas sexuales, el principio antes enunciado sigue siendo vlido con algunas consideraciones. Se ha dicho que las hembras de D. melanogaster poseen un par cromosmico sexual homlogo XX, y los machos un par heterlogo XY. El cromosoma Y porta pocos genes y casi todos relacionados con funciones que determinan la fecundidad del macho. Por otra parte, los cromosomas sexuales X, contienen numerosos genes relacionados con distintos rasgos. Los alelos recesivos y ligados al sexo se expresan en hembras homcigas, y en machos debido a su carcter hemcigo (XY). Los caracteres ligados al sexo siguen una herencia cruzada, los machos transmiten sus caracteres ligados al cromosoma X a sus nietos F2 a travs de sus hijas F1, nunca a un hijo F1, ni mediante l. Esto es debido a que slo las hijas F1 reciben el nico cromosoma X del padre, y el otro cromosoma X de la madre. Los machos reciben el cromosoma Y del padre y el X de la madre. Por tanto, en los cruces de caracteres ligados al sexo no es indiferente el sexo del individuo que aporta el o los rasgos ligados al sexo y

dependiendo de ello en la generacin F2 se observarn diferencias cualitativas y cuantitativas en la distribucin de fenotipos entre machos y hembras. Otra interaccin gnica ocurre cuando una caracterstica est determinada por dos o ms genes diferentes, bajo esta condicin puede aparecer un fenotipo completamente nuevo. Adems de producir proporciones dihibridas modificadas, en D. melanogaster estas interacciones por ejemplo en el ojo de tipo silvestre de color rojo ladrillo, cuando se cruzan dos mutantes autosomicos recesivos, puede resultar en la F2 con la aparicin de un nuevo fenotipo. En las siguientes tablas se describe los loci de algunos marcadores genticos para nuestros experimentos de D. melanogaster. Todas las cepas, normal y mutantes, que sern utilizadas en los trabajos prcticos se encontraron disponibles en el cepario bajo la forma de cepas puras, homcigas. (Laboratorio de Gentica General, Gua de prcticas, 2008) Cromosoma I: Locus 1.5 Smbolo w: white (*) Mutacin ojos de color blanco Fenotipo silvestre ojos de color rojo

() El locus correspondiente a la mutacin "white" constituye lo que se denomina un SISTEMA DE ALELOS MULTIPLES. Este locus puede existir bajo diferentes versiones que difieren unas de otras en la tonalidad del color del ojo. Aca trabajaremos con la expresin wa (apricot) y w (white, blanco).

Cromosoma II
locus 13.1 Smbolo dp: dumpy Mutacin alas recortadas en el borde distal ojos de color rojo brillante Fenotipo silvestre alas largas

57.5

cn: cinabar

ojos de color rojo

Los cromosomas politenos fueron observadas por E. G. Balbiani en 1881, estos se encuentran en clulas interfsicas en distintos tejidos de las larvas de algunas moscas (glndulas salivales, tubo digestivo, recto y tubos excretores de Malpighi). Las estructuras son visibles bajo el microscopio ptico y es caracterizada por la presencia de una serie de lneas de bandas e interbandas alternantes, estas bandas tambin se denomina crommeros. A nivel molecular estas estructuras representan homlogos apareados y su DNA sufre varias rondas de replicacin pero sin que la cadena se separe y sin que haya divisin del

citoplasma. En su estructura tambin estn presentes regiones llamas Puffs, que son zonas donde se desdobla el DNA y ponen en manifest visible la actividad gnica, principalmente la transcripcin que da lugar a RNA. El estudio de los pigmentos oculares presentes en D. melanogaster se basa en las diferencias bioqumicas existentes entre individuos hetercigos y homcigos cuyas caractersticas fenotpicas pueden ser similares. Estas caractersticas varan dependiendo de las interacciones alelicas en condicin hetercigas, a este nivel de observacin se pone en evidencia la actividad o la ausencia de actividad de un gen recesivo. En D. melanogaster silvestre, la pigmentacin de los ojos se debe a la presencia de dos tipos de pigmentos: pteridinas y ommocromos; los primeros son compuestos de color brillante que fluorescen y emiten una luz de color caracterstico cuando se observan bajo luz UV. Los ommocromos son de color marrn y no fluorescen a la luz UV

Mtodos
Los cdigos y abreviaturas de los marcadores genticos trabajados en nuestros cruces de diferentes cepas de D. melanogaster para el caso I y II respectivamente, corresponden a la nomenclatura utilizada dentro de Laboratorio de Gentica General, Gua de prcticas (2008) de la Unidad de Gentica de la Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. La manipulacin de las moscas D. melanogaster sin narcotizar/narcotizadas, al igual que las condiciones de cultivo en laboratorio tambin siguen lo recomendado en esta publicacin. Es muy importante resaltar que para los inicios de cada cruce se utilizaron solo hembras vrgenes y se siguieron los siguientes protocolos de cruce: Caso I: Segregacin monohibrida autosomal. Cromosoma II. Locus (13.1). dumpy (dp): alas recortadas en el borde distal (mutacin); alas largas (fenotipo silvestre: +). Mutacin autosomal. Caso II: Herencia ligada al sexo y segregacin dihibrida. Aparicin de un nuevo fenotipo. Cromosoma II. Locus (57.5). cinabar (cn). Ojos de color rojo brillante (mutacin); ojos de color rojo (Fenotipo silvestre: +). Mutacin autosomal. Cromosoma I. Locus (1.5). white apricot (wa). Ojos de color blanco (mutacin); ojos de color rojo (Fenotipo silvestre). Mutacin ligada al sexo. Cruces a desarrollar Caso I: Segregacin Primer cruce (PA X PB): Segundo cruce (F1xF1): dpdp () x ++ (). dp+ () x dp+ (). monohibrida autosomal. Caso II: Herencia ligada al Primer cruce (PA X PB): Segundo cruce (F1 X F1): () x wawa+cn+cn () x sexo y segregacin wawacn+cn+ wacn+cn (). dihibrida. Aparicin de un wa+cncn (). nuevo fenotipo Para demostrar la distribucin de la informacin gentica con padres de diferente genotipo, se utilizaron hembras inicialmente vrgenes de una cepa A (dpdp y wawacn+cn+ para el caso I y II respectivamente) y machos de una cepa B (++ y wa+cncn para el caso I y II respectivamente), que fueron depositados en un frasco que contena medio de cultivo fresco para su desarrollo. Al cabo de una semana se presentan larvas dentro de cada medio de cultivo y en este momento se retiraron las cepas parentales del medio para que no se crucen con la generacin F1 que comenzara a nacer al dcimo da de iniciar el cruce. Para

obtener la F2 se cruzaron las generaciones F1 entre s. Se seleccionaron parejas respectivamente de los frascos en cuestin y se introdujeron en un frasco de cultico nuevo debidamente rotulado con los datos pertinentes. Una semana despus se extrajeron estas parejas F1 del frasco para que no se crucen con la generacin F2. La generacin F2 comienza a nacer a los 10 das aproximadamente, donde se inicia el contaje y observaciones de las proles. Se cosechan las moscas de F2 mediante narcosis y se separan por sus caractersticas de sexo y/o fenotpicas, se anotaron los resultados y finalizamos con los individuos descartados luego en la morgue. Anlisis estadstico Con el objetivo de demostrar las proporciones mendelianas monohibridas (3:1) para el caso I y dihibridas (2:6:2:6) para el caso II, se trabajo bajo los siguientes supuestos: Cada alelo es o dominante o recesivo; se produce la segregacin; se produce la transmisin independiente; y la fecundacin es al azar. Los tres ltimos estn sujetos al azar y por ende se producen fluctuaciones aleatorias (Klug, W. y Cummings, M., 1999). El impacto de las desviaciones al azar sobre el resultado final se disminuye con una cantidad de muestras grande. Para el caso I: Hiptesis nula: se asume la proporcin mendeliana (3:1) y la diferencia aparente entre los datos observados y los esperados se puede atribuir nicamente al azar. Para el caso II: Hiptesis nula: se asume las proporciones mendelianas (9:3:3:1) y la diferencia aparente entre los datos observados y los esperados se puede atribuir nicamente al azar. Para ambos casos se rechaza la hiptesis nula si la desviacin observada respecto de la esperada no es atribuible solo al azar. Si la hiptesis nula no se rechaza, las desviaciones que se observan pueden atribuirse al azar. El anlisis estadstico de Ji-cuadrado es la prueba ms simple para comprobar la bondad del ajuste de la hiptesis nula, este evala si los datos observados estn de acuerdo o difieren de los datos esperados. Esta prueba tiene en cuenta las desviaciones observadas de cada componente de una proporcin esperada, asi como el tamao de la muestra, y las reduce a un nico valor. Este valor (X2) se utiliza luego para estimar cuan frecuentemente la desviacin observada se puede esperar solo se d estrictamente como consecuencia del azar. Para el estudio de los cromosomas politenos se realizaron extracciones de las glndulas salivales de larvas instar III de la especie Drosophila speck segn los procedimientos sealados en Laboratorio de Gentica General, Gua de prcticas (2008).

En el estudio de pigmentos oculares asociados a la especie D. melanogaster se utilizo el mtodo de cromatografa sobre papel con solvente orgnicos, observando el patrn de pteridinas en cuerpo y cabeza presentes en las diferentes cepas. Las diferentes cepas estudiadas fueron: +; w; we; wa; cl+. Se rebel el resultado de la corrida en un visualizador con luz UV. Todo el procedimiento y nomenclatura siguen fielmente lo recomendado por Laboratorio de Gentica General, Gua de prcticas (2008).

Resultados
Durante el transcurso de 5 semanas de cultivos y desarrollo de los distintos cruces experimentales de D. melanogaster ac estudiados, se resumen las siguientes tablas de trabajo que contiene los valores cuantificados de fenotipo obtenidos para la F1 y F2 de cada caso particular. Caso I: Segregacin monohibrida autosomal. Cruce terico: Parentales: dpdp () x ++ (); Gametos: 1 dp, 1 +. F1: 100% dp+ (Fenotipo silvestre heterocigoto). Parentales F1 x F1: dp+ () x dp+ (); Gametos: ( dp, +) x ( dp, +) F2: dpdp; ++; dp+ Cruce practico: A partir del cruce inicial de 6 dpdp y 10 ++, se obtuvieron los siguientes datos experimentales. Caso I Machos Hembras Total F1: 100% dp+ 17 21 38 F2: dpdp 5 4 9 ; (dp+; ++) 18 21 39

Las representaciones fenotpicas resultantes del cruce parental se presentaron con individuos de fenotipo silvestre, no est dems resaltar el hecho de que estos individuos son 100% hetercigos, es decir, presentan el genotipo dp+. (Figura 1)

Figura 1: Hembra heterciga (dp+) de la F1 con fenotipo silvestre de D. melanogaster resultante del cruce parental.

Para obtener la F2 se cruzo la F1 X F1 entre s. Se realizo el contaje y observacin de la generacin F2, cosechando las moscas F2 mediante narcosis y se analizan bajo la lupa (Figura 2). Se anotaron los resultados y posteriormente se descartaron en la morgue.

Figura 2: Macho recesivo (dpdp) de D. melanogaster perteneciente a la fenotipo mutante alas dumpy (dp). Anlisis estadstico: Caso I: Segregacin monohibrida autosomal. Observado Esperado Desviacin Desviacion2 (o) (e) (o-e) 39 (3/4)(48)=36 (39-36)=3 (3)2=9 9 (1/4)(48)=12 (9-12)=(-3) (-3)2=9 Total= 48

F2 con

Proporciones esperadas

d2/e 9/39=0.23 9/9=1 X2=1.23 P=3,8415

Grados de libertad (n-1) = 1 con n=2 y P para 0.05 o 5%, P = 3,8415 > X2= 1,23 por lo tanto no se rechaza Ho ya que la desviacin observada no es estadsticamente significativa.

Caso II: Herencia ligada al sexo y segregacin dihibrida. Aparicin de un nuevo fenotipo. Cruce terico: Parentales: wawacn+cn+ () x wa+cncn (); Gametos: ( wawa+, wa) x (1 cn+cn) F1: wawa+cncn+; wacn+cn Cruce experimental: A partir de cruce inicial de 5 wawacn+cn+ y 18 wa+cncn, se obtuvieron los siguientes datos experimentales. Caso II Machos Hembras Total F1: wawa+cn+cn ; wacn+cn 0 45 45 35 0 35 F2: wa+,cn+ ; wa+,cn ; wa,cn+ ; wa,cn 18 20 38 4 4 8 21 19 40 5 4 9

Las distintas expresiones fenotpicas observadas durante este cruce se muestran en la siguiente figura. Arriba a la izquierda (Ojos cinabar : wa+cn ), al centro a la derecha (Ojos White apricot) y abajo a la derecha (Ojos con nuevo fenotipo: wacn )

Anlisis estadstico Caso II: Herencia ligada al sexo y segregacin dihibrida. Aparicin de un nuevo fenotipo. Proporciones Observado Esperado Desviacin Desviacion2 d2/e esperadas (o) (e) (o-e) 0.04/17.81=2.23x102 (3/16)(95)=17.81 (18-17.81)=0.19 (0.19) =0.04 3/16 18 3 2 (3/16)(95)=17.81 (20-17.81)=2.19 4.8/17.81=0.27 3/16 20 (2.19) =4.8 2 (1/16)(95)=5.94 (4-5.94)=(-1.94) 3.8/5.94=0.64 1/16 4 (-1.94) =3.8 2 (1/16)(95)=5.94 (4-5.94)=(-1.94) (-1.94) =3.8 3.8/5.94=0.64 1/16 4 2 (3/16)(95)=17.81 (21-17.81)=3.19 (3.19) =10.2 10.2/17.81=0.57 3/16 21 (3/16)(95)=17.81 (19-17.81)=1.19 1.4/17.81=0.08 3/16 19 (1.19)2=1.4 2 (1/16)(95)=5.94 (5-5.94)=(-0.94) (-0.94) =0.9 0.9/5.94=0.15 1/16 5 2 (1/16)(95)=5.94 (4-5.94)=(-1.94) 3.8/5.94=0.64 1/16 4 (-1.94) =3.8 Total=95 X2=2.99 P=14.0671 Grados de libertad (n-1) = 6 con n=7 y P para 0.05 o 5%, P = 14.0671 > X 2= 2.99 por lo tanto no se rechaza Ho ya que en los datos no se encuentran diferencias estadsticamente significativas.

Cromosomas politenos. Las dimensiones de un cromosoma politeno son 150 veces mayores que un cromosoma mittico. A partir del extracto de gandulas salivales de larvas de D. speck se logro observar mediante un microscopio ptico estas unidades genticas. Segn la literatura se observo las zonas de desdoblamiento locales de DNA, llamadas puff. Se observo la zona fusin de centromeros, llamada cromocentro, este tena la apariencia de una masa central densa de donde partan varios cordones equivalentes a los cromosomas. (Figura 4: Caractersticas al microscopio)

FIGURA 4: Cromosoma politeno donde se aprecia el cromocentro y los cordones de los distintos cromosomas, tambin las bandas y las interbandas no tan detalladas.

Cromatografa de pigmentos oculares En D. melanogaster la coloracin de los ojos se debe principalmente a la presencia de dos tipos de pigmentos: pteridinas y onmocromos, los primeros son compuestos de colores brillantes fluorescente y emiten luz de color caracterstico cuando se observa bajo luz UV. Con el mtodo de cromatografa sobre papel y utilizando un sistema de solventes orgnicos se logro separar en manchas diferentes identificables, los pigmentos de pteridina de diferentes cepas de D. melanogaster. Al analizar el resultado de la corrida de las muestras sembradas en la cromatografa de papel sobre luz UV, se observaron las manchas de corrida de las diferentes muestras para cabeza y cuerpo de las cepas a estudiar. Se observo que la distancia de corrida de las manchas para las distintas sepas sembradas era variante, esto ocurri en las siembras de cabeza y cuerpo respectivamente.

FIGURA 5: Cromatografa de cabeza de pigmentos oculares de D. melanogaster bajo la cmara de luz ultravioleta.

FIGURA 6: Cromatografa en papel de pigmentos de cuerpo de D. melanogaster observada bajo de la cmara de luz UV.

Discusin
Se realizaron cruces experimentales con la especie D. melanogaster cuya metodologia y resultados fueron descritos anteriormente, en resumen nos referiremos a Caso I y Caso II respectivamente. Para ambos, se realizo un anlisis estadstico (prueba de Ji-cuadrado) requerido para verificar si los resultados obtenidos se ajustaban a las proporciones tericas mendelianas. Para el caso I que corresponde a un cruce monohibrido autosomal, se obtuvieron las frecuencias fenotpicas esperadas 3:1. El anlisis estadstico arrojo que la desviacin observada se debe nicamente al azar y se acepta la hiptesis nula. Anlogamente para el caso II, donde se trabajo un cruce dihibrido con herencia ligada al sexo, se obtuvieron las frecuencias fenotpicas esperadas 2:6:2:6 y la aparicin de un nuevo fenotipo. La desviacin observada tambin se debe nicamente al azar y se acepta la hiptesis nula. Los datos no proporcionan ninguna razn para rechazar la hiptesis nula en ninguno de los dos casos y por consiguiente, la desviacin observada puede atribuirse razonablemente al azar. En los cromosomas politenos debido a que el patrn de bandeo que presentan es un reflejo constante de las secuencias de DNA, las bandas sirven como marcadores para localizar varias caractersticas genticas (por ejemplo: lugar de los genes). Esta caracterstica se han utilizado en diversos estudios genticos (Beermann y Clever, 1964) y evolutivos al ser estos variantes en la mayora de Dipteros donde encontramos los cromosomas politenos (Gunderina, L I. et al. 2005). Actualmente el estudio de estas estructuras es un campo en la gentica que aun avanza lentamente, sin embargo, se han logrado confirmar que existe una nica funcin gnica asociada con cada banda del cromosoma politeno (Lefevre, G. 1974), este ltimo trabajo no descarta una independencia en la funcin del gen y la distribucin de los cromomeros.

Un anlisis de los productos sintetizados por los genes en cuestin, permitir reconocer la actividad o la inactividad oculta del gen allico recesivo que en el hetercigo se encuentra enmascarada por la presencia del producto del gen dominante, ello permitir establecer diferencias entre individuos homcigos y hetercigos.

Conclusin
Se realizaron dos cruces experimentales con la especie D. melanogaster y en ambos (Caso I y Caso II) se acepta la hiptesis nula y sin una diferencia estadstica significativa, la desviacin observada se debe nicamente al azar. Se obtuvo, observo y discuti la presencia de cromosomas politenos de glndulas salivales de la especie D. speck en laboratorio. Se obtuvo un patrn de las pteridinas presentes en la cabeza y cuerpo de la especie D. melanogaster mediante cromatografa en papel con solventes orgnicos, revelado luego bajo una cmara de luz UV. Lamentablemente las cromatografas presentan un error metodolgico importante y los resultados no son apreciados correctamente.

Bibliografa
George, Lefevre Jr. (1974). The Relationship Between Genes and Polytene Chromosome Bands. Annual Reviews in Genetics: 8 (1):5162. Gunderina, L.I.; Kiknadze, I.I.; Istomina, A.G.; Gusev, V.D.; Miroshnichenko, L.A. (2005). Divergence of the polytene chromosome banding sequences as a reflection of evolutionary. Russian Journal of Genetics 41 (2): 130137, KLUG, W.S. y CUMMINGS, M.R. (1994). Concepts in Genetics. 4 Edicin. PrenticeHall, Inc. NJ, USA.