Comparacin de varios mtodos para la extraccin de los lpidos eficaz a partir de microalgas

Centro de Investigacin en Biotecnologa Ambiental , Instituto Coreano de Investigacin de

Biociencia y Biotecnologa ( KRIBB ) , 111 Gwahangno , Yuseong -gu , Daejeon 305-806 , Repblica
de Corea
informacin del artculo
Historia del artculo :
Recibido el 07 de noviembre 2008
Recibido en forma revisada 16 de marzo 2009
Aceptado 19 de marzo 2009
Disponible en lnea 21 de abril 2009
palabras clave:
Biodiesel
Mvil interrupcin de extraccin de lpidos de microalgas
Abstracto
Varios mtodos , incluyendo tratamiento en autoclave, latido del grano, microondas , ultrasonidos
, y una solucin de NaCl al 10 % , se pusieron a prueba para identificar el mtodo de disrupcin
celular ms eficaz . Los lpidos totales de Botryococcus sp . , Chlorella vulgaris y Scenedesmus sp.
se extrajeron utilizando una mezcla de cloroformo y metanol (1:1 ) . El contenido de lpidos de las
tres especies fueron 05.04 a 11.09, 07.09 a 08.01, 10,0-28,6, 6.1 a 8.8 , y 6.8 a 10.9 g L- 1 cuando
se utiliza tratamiento en autoclave , latido del grano, microondas , ultrasonidos , y una solucin de
NaCl al 10 % , respectivamente . Botryococcus sp. Mostr la productividad ms alta de cido oleico
en 5,7 mg L- 1 d 1 cuando las clulas eran interrumpidas utilizando el mtodo del horno de
microondas. Por lo tanto, entre los mtodos de prueba, el mtodo del horno de microondas fue
identificado como el ms simple , fcil y eficaz para la extraccin de lpidos a partir de microalgas .
1 . introduccin
El calentamiento global y el agotamiento de los combustibles fsiles son los principales problemas
mundiales . Por lo tanto , la produccin de biodiesel a partir de varios materiales , tales como
plantas , microalgas y grasa animal, se ha tratado como una fuente de energa alternativa
(Vasudevan y Briggs, 2008) . En particular, el biodiesel tiene dos ventajas principales, la de
mitigacin de dixido de carbono y como sustituto del petrleo ( Chisti , 2008 ) . Adems, las
microalgas tambin tiene ciertas ventajas en comparacin con otros cultivos energticos ,
incluyendo una alta tasa de crecimiento , tiempo de crecimiento a corto plazo , alta produccin de
biomasa , y el uso de la tierra baja ( Milne et al. ,1990 ) .
Los procesos clave que participan en la produccin de biodiesel a partir de microalgas son cultivo,
la recoleccin, la extraccin de lpidos ( rotura de las clulas ) , y la transesterificacin de los lpidos
. Aunque todos estos pasos son esenciales , la rotura de las clulas es particularmente importante,
ya que los contenidos de los lpidos extrados se determinan de acuerdo con el mtodo de
disrupcin y el dispositivo . Por lo tanto , el mtodo de disrupcin celular y dispositivos adecuados
son clave para aumentar la eficacia de la extraccin de lpidos .
Varios mtodos, tales como microondas , ultrasonidos , y latido del grano, ya se han utilizado
para la rotura de las clulas . Por ejemplo , las microondas que rompen las clulas que utilizan el
choque de ondas de alta frecuencia se sugirieron recientemente como un mtodo eficiente para la
extraccin de aceite vegetal ( Cravotto et al, 2008 ; . . Virot et al, 2008 ), mientras que el
tratamiento con ultrasonidos grietas de la pared celular y la membrana debido a un efecto de
cavitacin ha sido ampliamente utilizado para romper las clulas microbianas ( Engler , 1985 ; . Lee
et al , 1998 ) . Adems, latido del grano causa dao mecnico directo a las clulas sobre la base de
hilado de alta velocidad con los granos finos se ha utilizado tanto en un laboratorio y a escala
industrial ( Lee et al , 1998 ; . . Geciova et al , 2002 ) . Sin embargo , el mtodo ms eficiente para
microalgas an no ha sido resuelto . Por consiguiente, otros mtodos de disrupcin celular,
incluyendo tratamiento en autoclave a una temperatura y alta presin y el uso de una solucin de
NaCl al 10 % para romper la pared celular por la presin osmtica , se compararon con micro -
ondas , sonicacin , y el latido del grano para determinar el mtodo ms eficiente .
2 . Mtodos
2.1 . Cultivo de microalgas y la cosecha
Botryococcus sp . , Chlorella vulgaris y Scenedesmus sp . Se obtuvieron del Centro de Recursos
Biolgicos (BRC ) , Corea. Las micro algas se incubaron en frascos de 9 -L separadas en un medio
BG11 ( Rippka et al . , 1979 ) con 150 lmol m 2 s l 0,3 v / v / m y aire .
MEDIO BG11
MEDIOS DE CULTIVO DE CIANOBACTERIAS.
Hay muchas recetas de medios de cultivos para el crecimiento y mantenimiento de
cianobacterias y microalgas en laboratorio. Las principales consideraciones para desarrollar estas
formulaciones son:
1. La concentracin total de sal depende del origen ecolgico del organismo (agua dulce,
suelo, ambientes marinos, o hipersalinos, etc) .
2. La composicin y concentracin de los componentes inicos mayoritarios tales como el K,
Mg, Na, Ca, sulfato y fosfato.
3. El crecimiento es altamente dependiente de la disponibilidad de nitrgeno. Las fuentes de
nitrgeno ms utilizadas son: nitrato, amonio o urea; todo depende de la especie y del pH
ptimo de crecimiento. En el caso de cianobacterias fijadoras de nitrgeno no es necesaria
la presencia de estas fuentes.
4. La fuente de carbono ms comnmente utilizada es el CO
2
gaseoso suministrado en
diferentes proporciones con el aire (0,03-5%). Otra fuente es el bicarbonato o el
carbonato, todo depender del pH de cultivo ptimo del organismo.
5. pH
6. Elementos traza. Para la estabilidad de la mezcla de estos elementos traza se utilizan
agentes quelantes tales como el citrato y el EDTA.
7. Vitaminas, sobre todo para las algas.

La biomasa de clulas cultivadas se recogieron por centrifugacin , a continuacin, la masa celular
hmeda se congel durante la noche a 70 C y se liofiliza a 70 C bajo un vaco .

2.2 . La disrupcin celular
Una alcuota ( 0,5 g ) de la biomasa celular seco se mezcl con 100 ml de agua destilada y la mezcla
se interrumpi el uso de cinco mtodos diferentes de la siguiente manera : ( 1 ) tratamiento en
autoclave a 125 C con 1,5 MPa durante 5 min , ( 2 ) del taln - superando usando un batidor de
taln ( 0,1 mm de dimetro de la perla , BioSpec Productos Inc. , EE.UU.) a una alta velocidad de
2.800 rpm durante 5 min , ( 3 ) microondas usando un horno microondas a una temperatura alta
(alrededor de 100 C y 2450 MHz ) durante 5 min , ( 4 ) tratamiento con ultrasonidos utilizando un
sonicador ( sonic y Materials Inc. , EE.UU.) a una resonancia de 10 kHz durante 5 min , y ( 5 ) el uso
de un choque osmtico de NaCl al 10 % solucin con un vrtice durante 1 min y se mantuvo
durante 48 h .
2.3. extraccin de lpidos
Los lpidos totales se extrajeron con cloroformo - metanol ( 01:01 v / v ) de mezcla con las
muestras en una proporcin de 1:01 utilizando una versin ligeramente modificada del mtodo de
Bligh y Dyer ( 1959 ) . Las mezclas se transfirieron a un embudo de separacin y se agitaron
durante 5 min . La fraccin lipdica se separ a continuacin del embudo de separacin y se
evapor el disolvente usando un evaporador rotatorio . El peso del lpido crudo obtenido de cada
muestra se midi utilizando una balanza electrnica.



2.4. Anlisis de la composicin de cidos grasos
Un anlisis de la composicin de cidos grasos se realiz con un cromatgrafo de gases ( Shimadzu
GC - 2010 , Japn ) . Cincuenta miligramos muestras se colocaron en tubos de ensayo cubiertas ,
saponifica con 1 ml de una solucin de KOH - CH3OH saturado a 75 C durante 10 min , y luego
sometido a metanolisis con HCl al 5 % en metanol a 75 C durante otros 10 min . A partir de
entonces, la fase que contiene los cidos grasos se separ mediante la adicin de 2 ml de agua
destilada y luego se recurre. Los componentes fueron identificados por comparacin de sus
tiempos de retencin y patrones de fragmentacin con los de los estndares ( Xu et al . , 2001 ) .
Seis cidos grasos ( C16 : 1 , C17 : 0 , C18 : 0 , C18 : 1 , C18 : 2 y C18 : 3 ) fueron utilizados como los
materiales estndar .
2.5. El anlisis estadstico
El contenido de lpidos extrados de las tres especies de microalgas fueron comparados de acuerdo
a los cinco mtodos de interrupcin mediante un ANOVA de una va y la prueba de Tukey. El nivel
de diferencia era significativa a P < 0,05 .
3 . Resultados y discusin
3.1 . biomasa celular

Se incubaron hasta que se produjo una biomasa similar de las tres especies de microalgas.
Mientras Botryococcus sp . se cultivaron durante 14 das , C. vulgaris y Scenedesmus sp . slo se
incubaron durante 7 das ( Tabla 1 ) . El C. vulgaris mostr la mayor biomasa de la productividad en
74.2 mg L 1 d 1 en el da 7 , en comparacin con las otras especies. La productividad de la biomasa
de Scenedesmus sp . fue similar a la de C. vulgaris . Sin embargo, la productividad de la biomasa de
Botryococ cus sp. Fue slo 35,7 mg L 1 d 1, que era la mitad de la de C. vulgaris y Scenedesmus sp .
3.2 . Comparacin de los mtodos de extraccin de lpidos
El contenido de lpidos de Botryococcus sp . fue aproximadamente 160,3 mg L 1 , que era de
aproximadamente 2 veces mayor que la de C. vulgaris y Scenedesmus sp . Mientras tanto , C.
vulgaris y Scenedesmus sp . mostr un contenido de lpidos similares . La productividad de lpidos
de BotryococUS sp. Era ms alto en 11,5 mg L 1 d 1 , que era similar a la de C. vulgaris ( Tabla 1).
Un contenido de lpidos superior se extrajo a partir de las tres especies cuando se utiliza el mtodo
del horno de microondas en lugar de los otros mtodos (Fig. 1 ) . Los mtodos horno taln golpear
y microondas eran los ms eficientes entre los mtodos comparados en 28,1 % y 28,6 % ,
respectivamente , para Botryococcus sp . ( P < 0,05 ) , mientras que el mtodo de sonicacin tena
la eficiencia ms baja a 8,8 % . Adems, en un estudio anterior , el mtodo latido del grano fue
tambin demostrado con un extracto de un mayor contenido de lpidos de Botryococcus braunii
de sonicacin , homogeneizacin, prensa francesa , y liofilizacin (Lee et al. ,1998 ) . Sin embargo ,
a pesar de la eficacia del mtodo latido del grano , no es fcil de escalar -up . Para C. vulgaris, los
mtodos horno autoclave y microondas mostraron la mayor eficiencia, mientras que el mtodo
latido del grano mostr la menor eficiencia en el 7,9 %. Para Scenedesmus sp . , El mtodo del
horno microondas mostr la ms alta eficiencia , mientras que las eficiencias de latido del grano ,
sonicacin , choque osmtico y mtodos fueron similares . Aunque el mtodo de choque osmtico
es simple y mostr resultados similares al mtodo del latido del grano de C. vulgaris y
Scenedesmus sp . se requiere un tiempo de tratamiento ms largo ( 48 h ) .
Un mtodo de extraccin de lpidos similar usando microondas ya ha sido reportado para los
aceites vegetales y grasas animales ( Mahesar et al . ,2008 ; Virot et al, 2008 ) . . Adems, este
estudio encontr que , el mtodo de horno de microondas era el mtodo ms sencillo , fcil y
eficiente para la microalga probado. Adems, este mtodo de extraccin de lpidos puede ser
fcilmente a mayor escala. En conclusin, se encontr que el mtodo del horno de microondas
puede ser el ms aplicable para la extraccin de lpidos a gran escala a partir de una biomasa de
microalgas.
3.3. Composicin de cidos grasos
La principal composicin de cidos grasos de la microalga probado se determin usando un
anlisis de GC ( Tabla 2 ) . En un informe anterior ( Knothe , 2008 ) , palmtico , esterico , oleico y
cido linolnico eran reconocido que los cidos grasos ms comunes contenidos en biodiesel. En
las tres microalgas probadas, cido oleico ( C18 : 1 ) y cido linoleico ( C18 : 2 ) fueron
comnmente dominante. El cido oleico es mayor en Botryococcus sp . y Scenedesmus sp. a 6,68 y
10,75 mg g- 1 DW , respectivamente , mientras que el cido linoleico fue mayor en C. vulgaris a los
19,79 mg g 1 dw . La productividad de lpidos diaria de cada una de las especies de microalgas se
muestra en la Tabla 1 . La productividad de cido oleico calculado en base a la productividad diaria
de lpidos fue mayor para Botryococcus sp . a 5.7 mg L 1 d 1 . En particular , los aceites con un alto
contenido de cido oleico se han notificado a tener un balance razonable de las propiedades del
combustible ( Rashid et al. , 2008 ) . Las propiedades de un combustible biodiesel , incluyendo su
calidad de ignicin , el calor de combustin , filtro fro taponamiento
Tabla 1
La biomasa , el contenido de lpidos , y la productividad de Botryococcus sp . , Chlorella vulgaris y
Scenedesmus sp
artculo Especies de algas

Botryococcus sp. C. vulgaris Scenedesmus sp.
Das de incubacin 14 7 7
El peso seco (g L
1
) 0.5 0.5 0.5
Productividad de la biomasa (mg L
1
d
1
) 35.7 74.2 71.4
El contenido promedio de lpidos (mg L
1
) 160.3 77.9 66.5
La productividad de lpidos (mg L
1
d
1
) 11.5 11.1 9.5
Mtodo del horno microondas
Productividad de lipidos (mg L
1
d
1
)

10.2

7.4

7.4
Productividad de cido oleico (mg L
1
d
1
) 5.7 1.2 4.2






sin interrupcin; autoclave; latido del grano; microondas; sonicacin; schock osmtico
figura 1 . Lpidos eficiencia de extraccin segn la especie y el mtodo . Las letras diferentes en los
grficos indican una diferencia significativa de p < 0,05 .





Tabla 2
Composicin de cidos grasos de Botryococcus sp . , Chlorella vulgaris y Scenedesmus sp .
cidos grasos Las cantidades de cidos grasos (mg g
1
dw)
Botryococcus sp. C. vulgaris Scenedesmus sp.
C16:1 0.58 (4.8) ND ND
C17:0 0.10 (0.8) 0.20 (0.1) 0.13 (0.7)
C18:0 0.52 (4.3) 0.85 (3.4) 0.57 (3.0)
C18:1 6.68 (55.7) 4.07 (16.3) 10.75 (57.2)
C18:2 4.10 (34.2) 19.79 (79.4) 6.91 (36.8)
C18:3 0.02 (0.2) 0.03 (0.1) 0.40 (2.2)
Total 12.00 (100) 24.94 (100) 18.78 (100)

ND : no detectado.
( ) : Composicin de cidos grasos ( % en peso ) .
punto ( CFPP ) , estabilidad oxidativa , viscosidad y lubricidad , estn determinadas por la
estructura de sus steres grasos componentes. Como tal , un mayor contenido de cido oleico
aumenta la estabilidad oxidativa para el almacenamiento ms largo ( Knothe , 2005 ) y disminuye
la CFPP para su uso en regiones fras ( Stournas et al . , 1995 ) . Por lo tanto , entre las especies de
microalgas probadas , Botryococcus sp . mostr el ms alto contenido de cido oleico , por lo que
es el ms adecuado para la produccin de biodiesel de calidad buena .
4 . Conclusiones
Se encontr que la eficiencia de la extraccin de lpidos a partir de microalgas a diferir de acuerdo
con el mtodo de las especies y la extraccin. El alto contenido de lpidos fue extrado de
Botryococcus sp . y fue aproximadamente dos veces mayor en comparacin con la de las otras
especies . Adems, el mtodo del horno microondas mostr la mayor eficiencia para todas las
especies probadas. Botryococcus sp. Mostr la productividad ms alta de cido oleico en 5,7 mg L-
1 d 1 , cuando las clulas se rompieron mediante el mtodo del horno de microondas . Por lo tanto
, se concluy que el mtodo del horno de microondas parece ser el mtodo ms sencillo , fcil y
eficiente para la extraccin de lpidos a partir de microalgas .
Agradecimientos
Esta investigacin fue apoyada por una beca M102KP010017 -08K1601 - 01710 de la reduccin del
dixido de carbono y el Centro de Investigacin del secues -tro , un Programa de la Frontera Siglo
21 financiado por el Ministerio de Educacin, Ciencia y Tecnologa de Corea.