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Prparation d'une suspension cellulaire partir de sang humain et d'un

organe murin
Sparation de cellule sur coussin de Ficoll
1. Intrt de la sparation des lymphocytes des autres lments figurs du sang
C'est la premire tape de nombreuses analyses d'immunologie cellulaire. Elle permet le typage des
lymphocytes et la numration des sous-populations.
1.1. Identification des lymphocytes T
Les lymphocytes T possdent un marqueur membranaire, le CD !CD signi"iant Classe de
Di""renciation#. CD prsente de l'a""init pour une protine membranaire des globules rouges de
mouton. En utilisant cette proprit, on peut reprer puis numrer les lymphocytes T.
1.2. Identification de sous types de lymphocytes T
$n distingue types de lymphocytes T circulant dans le sang par la prsence de marqueurs
membranaires e%clusi"s CD& !lymphocytes T CD&
'
ou LT&# et CD( !lymphocytes T CD(
'
ou LT(#. La
distinction entre ces marqueurs se "ait gr)ce * l'utilisation d'anticorps monoclonau% !importance dans
le sui+i clinique du ,-D.#.
1.3. Identification du type HLA (Human Lymphocyte Antigen)
Cette tude permet de dterminer le Comple%e /a0eur d'1istocompatibilit !C/1#. Le C/1 !ou 1L.# est
di""rent d'un indi+idu * l'autre et correspond * la carte d'identit immunologique d'un indi+idu. 1 est en
outre indispensable au "onctionnement du systme immunitaire et responsable du re0et de gre""e !cas
d'incompatibilit entre C/1 du gre""on et du rece+eur#.
1.4. Ralisation de tests fonctionnels
L'obtention de lymphocytes puri"is est indispensable * la comprhension de leur "onction.
2. Principe de la sparation des lymphocytes / monocytes
2 La sparation des lymphocytes est obtenue par centri"ugation sur un coussin de 3icoll !polymre
glucidique rami"i arti"iciel de masse molaire le+e (44 444 Da#. La solution de 3icoll est de densit
gale * 5,466. Les lments "igurs ont des densits di""rentes7
- d !lymphocytes, monocytes, plaquettes# 8 5,466 alors que
- d !hmaties et granulocytes neutrophiles# 9 5,466
2 E""et de la centri"ugation de sang sur coussin de 3icoll
. l'inter"ace plasma-3icoll, les lymphocytes se positionnent et "orment un anneau opalescent.
2 .prs limination du plasma, on rcupre la couche de lymphocytes, puis ils sont la+s de "a:on *
liminer toute trace de 3icoll !to%ique pour les cellules#.
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. !ode opratoire
3.1. !at"iel pa" #in$me
; mL de sang +eineu% hparine
5 tube * "ond rond pour gradient
mL /,L !/ilieu pour la sparation des lymphocytes#
5 tube * "ond conique pour la+ages
<4 mL de solution de la+age de 1an=s
,olution de La>arus pour numration des leucocytes ! acide actique ;4?, @leu de mthylne#
Aisques potentiels 7 manipulation de sang humain, utilisation de centri"ugeuses.
3.2. %"otocole
Brle+er un aliquote de sang pour raliser la numration des leucocytes du sang initial 7
diluer le sang au 5C54 dans du liquide de La>arus
incuber < min ! au moins# pour permettre la lyse des hmaties
numrer * la cellule de /alasse>
Diluer le sang au 5C dans la solution de 1an=s.
Brparer le coussin de 3icoll 7
dans un tube * "ond rond dposer mL de /,L
incliner le tube
dposer < mL de sang dilu trs soigneusement au dessus du 3icoll. ."in d'+iter tout
mlange, "aire couler le sang diluer lentement le long de la paroi du tube !tube maintenu inclin et
pipette droite#
Centri"ugation
centri"uger 4 minutes * (44g ! ........rpm# * temprature ambiante !5&-DC#.
laisser la centri"ugeuse s'arrEter lentement !pas de "rein#
retirer dlicatement les tubes de la centri"ugeuse
contrFler la qualit de la sparation
Gliminer soigneusement par aspiration le liquide surnageant !plasma ' plaquettes# en
prenant soin de ne pas atteindre la couche de lymphocytes.
Trans"rer la galette de lymphocyte dans un tube * "ond conique en +itant de prle+er du
3icoll.
La+er ; "ois les cellules a+ec 54 mL de solution de 1an=s. Entre chaque la+age, centri"uger,
une "ois * (44g !......rpm# - < minutes et les dernires 5<4g !........pm# - < minutes.
Gliminer le surnageant "inal.
Aesuspendre le culot cellulaire dans <44HL de solution de 1an=s.
Aaliser une numration des lymphocytes +iables, diluer au 5C5I la suspension cellulaire
dans du bleu trypan !4,(?#
3.3. &alcule"
le nombre de lymphocytes rcuprs
le pourcentage de lymphocytes +iables
le nombre de lymphocytes +iables rcuprs
le rendement de rcupration des lymphocytes !sachant que dans le sang normal, les
lymphocytes reprsentent en+iron (4? des leucocytes#
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Prparation de cellules splni"ues de souris
La rate "ait partie des organes lymphoJdes secondaires comme les ganglions lymphatiques, les /.LT et
les K.LT. C'est dans ces structures que se dclenche et se coordonne la rponse immunitaire
adaptati+e.
Cet organe se localise * la base de la cage thoracique du cot gauche des mammi"res. -l contient
ma0oritairement des lymphocytes et des hmaties, mais aussi des cellules pithliales et con0oncti+es,
des monocytes, des macrophages, des plasmocyes et les granulocytes.
!atriel par #in$me%
5 souris, trousse * dissection,
/ilieu de 1an=s7
&g.L
-5
LaCl - 4,(g.L
-5
MCl - I4mg.L
-5
La

1B$
(
,1

$ - 544mg.L
-5
/g,$
(
,61

$ - 5g.L
-5
CaCl

- 5g.L
-5
glucose - 544mg.L
-5
/gCl

,I1

$ - ;<4mg.L
-5
La1C$
;
- 54mg.L
-5
Aouge de phnol.
eau distille
liquide de La>arus !@leu actique#, @leu Trypan $"" 4,(?
&issection de la souris
Bositionnement de l'animal dans le bac * dissection
2 Blacer la souris sur le dos, pingler les pattes en e%tension. /ouiller les poils du +entre * l'alcool.
-ncisions cutanes
2 Aaliser une boutonnire au dessus de l'ori"ice urinaire
2 Engager la sonde cannele dans la boutonnire , soule+er la peau a+ec une pince, "aire progresser la
sonde cannele progressi+ement 0usqu'au sternum. -nciser la peau en pla:ant une lame des ciseau%
dans la rigole de la boutonnire.
2 -ncise> la peau sur les cots !+olets#.
2 Gpingler la peau.
-ncisions musculaires !Document 5#
2 -nciser la paroi musculaire de l'abdomen aprs a+oir ralis une boutonnire au bas du +entre selon le
schma donn au document.
reprer la rate.
Prl'(ement la rate et prparation des suspensions cellulaires
Suspension splni"ue
2 Brle+er la rate et l'introduire dans une boite de Btri contenant mL de milieu de 1an=s
2 Couper la rate en dans le sens trans+ersal. /aintenir solidement l'e%trmit de la demi rate * l'aide
d'une pince et +ider le contenu de la capsule splnique * la spatule. Aenou+eler sur l'autre moiti.
2 Neter la capsule +ide !tissu pithlium et con0oncti"#
2 Dissocier mcaniquement et dlicatement les cellules * partir du prl+ement ralis par une srie
d'aspiration re"oulement * la pipette pasteur, par passage * tra+ers l'aiguille d'une seringue ou * l'aide
d'un potter.
O9 /aintenir une bonne +italit cellulaire en ralisant des traitements dou%.
2 -ntroduire la suspension dans un tube * hmolyse. Aincer le matriel utilis de "a:on * rcuprer le
ma%imum de cellules.
2 Gliminer les grosses impurets soit7
- par sdimentation de -; minutes et prl+ement du surnageant.
O9 une sdimentation trop longue aboutirait * un culot contenant aussi les cellules dissocies.
- par "iltration sur un carr de ga>e.
2 La+ages7 centri"uger 54 minutes * ;<4g. Gliminer le surnageant et reprendre le culot dans < mL de
milieu de 1an=s. Aenou+eler plusieurs "ois. Loter l'aspect du surnageant !,L#.
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)umration des suspensions
2 Aeprendre le culot cellulaire dans <44HL
2 Aaliser une dilution au 5C54 de la suspension dans du milieu de 1an=s
2 Aaliser une numration en hmatimtre de /alasse> des cellules +iables et mortes
- aprs au PC54 en bleu trypan pour la suspension de cellules splniques.
*+,S-I.)S
2 .nalyser la composition du milieu de 1an=s
2 Acapituler le rFle des di""rentes tapes du protocole de prparation des suspensions.
2 Calculer, le nombre de cellules totales rcupres, le nombre de cellules +iables et le pourcentage de
cellules +iables.
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