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Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica

Roteiro da Aula Prtica Nro. 1


1. Ttulo: Uso do material de laboratrio e medidas de
segurana
2. Objetios:
Aprender e reconhecer os diferentes materiais e instrumentais
utilizados corriqueiramente no laboratrio.
3. As!ectos Tericos:
3! "aterial de la#oratrio
Todo o material de laboratrio deve ser usado somente para o fim para o
qual foi fabricado.
3$ %nstrumentos de &olume 'i(o
aquele que apresenta uma nica marca indicando o nvel a que deve
chegar o contedo lquido para se obter um determinado volume fixo.
3$! Bal)es &olum*tricos
So recipientes de vidro que permitem medir com preciso volumes fixos de
lquidos. So rigorosamente calibrados a determinada temperatura! no
podendo ser aquecidos ou submetidos a mudan"as bruscas de temperatura.
#s bal$es volum%tricos so utilizados para a prepara"o das solu"$es de
reagentes em concentra"$es exatas! particularmente de solu"$es padr$es.
#s bal$es volum%tricos esto calibrados para um volume exato de um
lquido. #s bal$es no devem ser usados para transferir volumes.
33 %nstrumentos graduados
So os que apresentam uma escala que permite medir! al%m de um volume
determinado! fra"$es deste volume.
33! C+lices graduados
So instrumentos de volume de pouca preciso. Se utilizam !em geral! para
preparar solu"$es de concentra"o aproximada ou para obter rapidamente
uma primeira aproxima"o da medida que logo ser& a'ustada.
33$ ,ro&etas graduadas
1
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
So instrumentos de medida volum%trica de pouca preciso! mas permitem
uma aproxima"o maior que a do c&lice! '& que! por sua forma! uma
varia"o de volume de seu contedo! pode ser apreciado por um maior
desnvel. Serve! portanto! para fazer medidas r&pidas de volumes. (xistem
provetas graduadas desde )ml at% v&rios litros! as provetas podero ter
rolhas esmerilhadas ou ser aberta em bico para vazo.
333 ,ipetas
333! ,ipetas de &idro
*entre deste tipo de pipetas devemos diferenciar entre as pipetas
volum%tricas e as pipetas graduadas. As primeiras permitem pipetar um
volume nico de lquido! em tanto que as pipetas graduadas permitem a
pipetagem de diferentes volumes. Ainda deve ser reconhecida uma
diferen"a importante+ as pipetas ,se'a de um tipo ou de outro- possuem
uma o duas listras no extremo superior. A exist.ncia de duas listras significa
que quando o liquido % despe'ado! o que restar dentro da pipeta no deve
ser extrado ,ou soprado-. # caso contr&rio acontece 'ustamente com as
pipetas que possuem uma listra. importante neste ponto considerar que
diferentes tipos de solu"$es podem ter distintas viscosidade e/ou tenso
superficial! com o qual um especial cuidado deve ser tomado quando se
pipeta um lquido viscoso com uma pipeta de duas listras. Se o liquido %
despe'ado muito rapidamente! a tend.ncia ser& a que fique maior
quantidade deste lquido no interior da pipeta! com o qual o volume
pipetado "#R$ %#NOR AO &A'OR NO%(NA'. 0ma pipetagem pr%via do
lquido % aconselh&vel para minimizar problemas de tenso superficial.
(%PORTANT#+ Sempre que pipetar &cidos ou bases fortes ,ou qualquer
outro lquido que se'a corrosivo-! evitar de colocar a pipeta na boca.
#S 12ST304(2T#S *( 5#604( 718# S9# *( 4A1#3 :3(;1S9# <0( #S
=3A*0A*#S ( (ST9# ;A61>3A*#S :A3A A 4(*1*A *# 6?<01*# (4
04A T(4:(3AT03A *(T(3412A*A.
333$ ,ipetas autom+ticas
As pipetas autom&ticas tem como vantagem a rapidez de uso. ;uidados
especiais! por%m! devem ser considerados. Toda pipeta autom&tica tem dos
est&gios no seu .mbolo. 2o momento de sugar o lquido! o .mbolo deve ser
colocado no primeiro est&gio. :ara expulsar o lquido das ponteiras! o
.mbolo tem que ser levado ao segundo est&gio.
5&rios pontos devem ser cuidadosamente verificados+

a. 2unca sugar um lquido ou solu"o colocando o .mbolo no segundo
est&gio. Se for assim! o volume pipetado seria maior do que o valor
nominal.
b. <uando selecionar o volume! verificar que o volume escolhido este'a
dentro da baixa de volumes da pipeta autom&tica a ser utilizada. #u se'a!
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se por exemplo uma pipeta tem uma faixa de volumes que vai de @AA a
BAAA l! sob nenhuma circunstCncia deve ser pipetado um volume de
Dpor exemploE BBAA l. 2a verdade! a elei"o da pipeta adequada depende
do volume que se dese'a pipetar e da faixa de volumes na qual cada pipeta
trabalha. (xemplo+ num laboratrio tem @ pipetas autom&ticas. A pipeta A!
tem uma faixa de volumes de BA a FA l e a pipeta ) tem uma faixa de
volumes de @A a BAA l ,*igura 1a-. Se fosse necess&rio pipetar FA l! a
escolha certa seria a pipeta )! devido a que o volume dese'a no fica num
dos extremos da faixa de trabalho da pipeta.
c. (speciais cuidados devem ser levados em considera"o quando a solu"o
que se quer pipetar % c&ustica ,um &cido ou uma base forte! por exemplo-.
2este caso qualquer gota do liquido ,ou ainda o vapor do composto- que
fique dentro da pipeta pode danificar seriamente o instrumental. 0ma
solu"o muito simples % colocar um peda"o de algodo dentro da ponteira!
verificando que no se'a atingida pelo lquido no momento de sugar. #
algodo absorver& qualquer respingo que houver! impedindo que o lquido
fique no interior da pipeta ,*igura 1b-.
3
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33- Recipiente no &olum*trico
o material que se usa para conter lquidos durante a sua manipula"o mas
no % um instrumento de medida. (xemplos+ tubos de ensaio! becGers!
erlenmeHer! etc.
3- .*cnicas e medidas de seguran/a no la#oratrio
3-! .*cnicas de pipetagem (pipetas de &idro)
1. seguraEse a pipeta entre o polegar e os I ltimos dedos da mo.
2. ;olocaEse a pipeta no lquido,bem abaixo de sua superfcie- e aspiraE
se cuidadosamente at% que a coluna do lquido este'a um pouco
acima da marca superior, a aspira"o se faz comumente com a boca!
no caso de lquidos vol&teis e/ou txicos! a mesma pode ser feita com
p.ras de aspira"o-.
3. 7echaEse a abertura com o dedo indicador e retiraEse a pipeta da
solu"o. *eixando entrar um pouco de ar vagarosamente pela
extremidade superior ,controlar com o dedo indicador-! permiteEse
escorrer a coluna de lquido at% a coluna atingir a marca superior
,mantendo em posi"o vertical e a marca ao nvel dos olhos-.
4. 3emoveEse ento o lquido aderente a parede externe da pipeta por
um papel absorvente.
5. (m seguida! colocaEse a ponta da pipeta 'unto a parede interna do
tubo receptor! deixando escoar lentamente o contedo da pipeta at%
o nvel dese'ado. 2o escoamento completo % importante remover a
ltima gota encostando a pipeta na parede do tubo.
R#+O%#N,A-.#"+
- Ao pipetar solu"$es cu'o frasco cont%m depsito de soluto! introduzir
a pipeta no sobrenadante.
- 2unca introduzir pipetas su'as nos frascos que contenham solu"$es
ou reativos qumicos puros.
- *eveEse sempre usar pipetas secas para no diluir o lquido.
3-$ 0quecimento
4uitos materiais so constitudos de vidro especial que resiste ao
aquecimento! mas deveEse ter alguns cuidados como+
- 2unca deveEse aquecer um vidro vazio em chama direta. ;uidar
que por acidente possa evaporar todo o contedo.
- Sempre que se aquece um lquido em um recipiente de vidro usar
uma tela de amianto.
- #s tubos de ensaio podem ser aquecidos em banhoEmaria ou
diretamente na chama do bico de g&s! cuidando para obter um
aquecimento regular ao longo do tubo. (ste tubo dever& conter
lquido abaixo da metade do seu volume total.
4
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- :ara segura o tubo so usados agarradores apropriados de
madeira.
- # tubo deve ser conservado sobre constate agita"o a fim de
evitar superEaquecimento localizado e consequentes esguichos do
material.
- *urante o aquecimento! seguraEse o tubo num Cngulo de F)
A
!
tendo o cuidado de dirigir a boca do mesmo em dire"o adequada!
a fim de evitar danos ou acidentes devido a esguichos.
- A chama do bico de g&s no dever& ser amarela e luminosa! o que
indicar& combusto incompleta e forma"o de fuligem! mas sim
azul! para tal deve se aberta e regulada a entrada inferior de ar.
Roteiro da Aula Prtica Nro. /
1. Ttulo: +ura de Titula0o
2. Objetios:
3econhecer o efeito tamponante.
1dentificar a composi"o de uma solu"o tampo.
3econhecer o significado de pGa de um &cido.
3. As!ectos Tericos:
*e maneira gen%rica! ao adicionar &cido ou base J solu"o aquosa seu pK
diminui ou se eleva respectivamente de forma significante. (ntretanto! ao
adicionar &cido ou base Js solu"$es tamp$es estas resistem ou sofrem
apenas pequenas varia"$es de pK! dentro de certos limites. (sta
propriedade das solu"$es tamp$es % importante no somente Lin vitroM mas
tamb%m para a prpria sobreviv.ncia dos organismos vivos. :or exemplo o
pK do sangue humano mant%m uma variabilidade mnima em torno de
N!I) D N!F)! e valores pouco distantes dessa faixa de normalidade
caracterizam um pK incompatvel com a vida.
4. Procedimento:
A1 D ;olocar em um >ecGer BAml de K
@
# destilada e com o auxlio de papel
indicador determinar o valor do pK. (m seguida adicionar K;l D A!)4 em
fra"$es de A!)ml! agitando e medindo o ph a cada adi"o anotando os
valores conforme descrito na tabela abaixo.
5olume
adicionad
o
K@#
BAml
K;l
A!)ml
K;l
A!)ml
K;l
A!)ml
K;l
A!)ml
K;l
A!)ml
5olume
total
BAml BA!)ml BBml BB!)ml B@ml B@!)ml
pK
5
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A/ D 3epetir AB! por%m utilizando 2a#K A!)4
5olume
adicionad
o
K@#
BAml
2a#K
A!)ml
2a#K
A!)ml 2a#K
A!)ml
2a#K
A!)ml
2a#K
A!)ml
5olume
total
BAml BA!)ml BBml BB!)ml B@ml B@!)ml
pK
)1 D ;olocar em um >ecGer BAml de solu"o tampo acetato A!@4 e com o
papel indicador medir o pK. Adicionar K;l A!)ml! agitando e medindo o pK
a cada adi"o anotando os valores conforme descrito na tabela abaixo.
5olume
adicionad
o
Tampo
Acetato
BAml
K;l
A!)ml
K;l
A!)ml
K;l
A!)ml
K;l
A!)ml
K;l
A!)ml
5olume
total
BAml BA!)ml BBml BB!)ml B@ml B@!)ml
pK
)/ D 3epetir >B! por%m utilizando 2a#K A!)4
5olume
adicionad
o
Tampo
Acetato
BAml
2a#K
A!)ml
2a#K
A!)ml
2a#K
A!)ml
2a#K
A!)ml
2a#K
A!)ml
5olume
total
BAml BA!)ml BBml BB!)ml B@ml B@!)ml
pK
1. Resultados:
;ada aluno dever& construir um gr&fico em papel milimetrado
colocando na abscissa as quantidades de K;l adicionadas em ordem
decrescente e as de 2a#K em ordem crescente. 2a ordenada colocar
os respectivos valores de pK. *evero ser construdas duas curvas!
uma referente ao item A e outra ao item >! no mesmo gr&fico.
Analisando o gr&fico descrever o valor do pOa do &cido ac%tico.
(m cada por"o da curva >,tampo acetato- representar as formas
predominantes do Pcido de >ronsted ,&cido ac%tico- e de sua base
con'ugada , acetato -.
6
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+O%PO"(-2O ,A "O'U-2O TA%P2O ,# A+#TATO
(m negrito as formas predominantes na solu"o quando em equilbrio.
Ao adicionar K;l ,K
Q
- na solu"o tampo! este on tende a se associar com
o on acetato ,+3
4
+OO
5
- produto da dissocia"o do acetato de sdio
,rea"o @- formando &cido ac%tico ,rea"o B-. Assim o equilbrio % mantido!
e mesmo com adi"o de K
Q
na solu"o este no permanece livre e portanto
o pK no diminui. (sse equilbrio % mantido at% que no exista mais acetato
disponvel ,proveniente da dissocia"o do sal-.
Ao adicionar 2a#K ,#K
E
- na solu"o tampo! este on tende a se associar
com o on K
Q
produto da dissocia"o do &cido ac%tico ,rea"o B- formando
mol%culas de &gua ,rea"o I-. (ssa associa"o desloca a rea"o reversvel
do &cido ac%tico para a direita! suprindo a demanda de K
Q
! e o pK no %
elevado.
(sse equilbrio % mantido at% que no exista mais on K
Q
disponvel
,proveniente da dissocia"o do &cido ac%tico-! a partir da o pK come"a a
aumentar.
CH
3
COOH H
+
+ CH
3
COO
-

CH
3
COONa Na
+
+ CH
3
COO
-

(cido fraco. reac. 1)
(base conjugada. reac. 2)
H
2
O H
+
+ HO
-
(reac. 3)
7
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Roteiro da Aula Prtica Nro. 4
Ttulo: #s!ectro6otometra 7 ,osagem de Protenas
1. Objetios:
Treinamento na utiliza"o de t%cnicas espectrofotom%tricas.
*etermina"o da concentra"o de protenas totais numa
amostra biolgica.
2.
Parte e8!erimental:
$! 0spectos tericos

*iversas biomol%culas absorvem luz em comprimentos de onda ,-
caractersticos por este motivo podemos usar um espectrofotRmetro para
fazer medi"$es da capacidade de absor"o de luz.
(ste m%todo % usado para+
1dentifica"o de mol%culas
o 4edir a concentra"o de solu"$es
'embremos alguns conceitos
# espectro eletromagn%tico
2a espectrofotometria vamos trabalhar na regio ultravioleta e na regio do
visvel.
;ores complementares
amarelo
vermelho
laranja verde
azul
violeta
amarelo
vermelho
laranja verde
azul
violeta
8
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
:ara fazer uma determina"o em uma solu"o de cor azul terei que fazer
incidir um feixe de luz cor laran'a ,cor complementaria do azul-! assim vou
ganhar preciso na leitura. 1sto pode ser feito com um monocromador. #
monocromador % utilizado para se obter uma luz monocrom&tica ,com uma
nica banda espectral-. =eralmente os monocromadores no conseguem
isolar um nico comprimento de onda ,-! eles isolam uma banda espectral
que quanto menor se'a esta banda mais preciso vou obter.
;omo funciona um fotocolormetro e/ou em espectrofotRmetro
(stes equipamentos consistem basicamente em+
*OTO+O'OR9%#TRO #"P#+TRO*OT:%#TR
O
7#2T( *( 60S >ranca ,Tungst.nio- >ranca ,Tungst.nio-T
deut%rioT mercrio
3(;1:1(2T( :A3A
S#60U9#
;ubeta ;ubeta
A absor"o de radia"$es eletromagn%ticas obedece aos seguintes dois
princpios+
7otoc%lula
;alan<metro
A=>?>/1
7onte de
luz
6Cmpada de
tungst.nio!
deut%rio ou
mercrio
:risma ;ubeta
com
amostra
7enda
1
A
1
;alan<metro
A=>?>/1
1
A
1
6ente
7iltro colorido
FOTOCOLO!"#TO
#$%#CTOFOT&"#TO
7otoc%lula
;alan<metro
A=>?>/1
7onte de
luz
6Cmpada de
tungst.nio!
deut%rio ou
mercrio
:risma ;ubeta
com
amostra
7enda
1
A
1
;alan<metro
A=>?>/1
1
A
1
6ente
7iltro colorido
FOTOCOLO!"#TO
#$%#CTOFOT&"#TO
'
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1( A rela"o entre a luz absorvida e o nmero de mol%culas de soluto
numa solu"o ,concentra"o- % exponencial.
2( A absor"o de luz relacionaEse exponencialmente com o comprimento
da distCncia que a luz percorre atrav%s da amostra
(stes dos princpios foram integrados na 'ei de 'ambert5)eer+
'ei de 'ambert5)eer. Absor0o de lu@ !elas molAculas.
log I0BI= cl
onde! %1 % a intensidade da luz incidenteT % % a intensidade da luz transmitidaT % o coeficiente de
extin"o molar ,em unidades litro por molEcentmetro-T c % a concentra"o da solu"o a ser analisada
,moles/litro-T l % a largura da cubeta ,em centmetros-.
A 6ei de 6ambertE>eer assume que a luz incidente % paralela e monocrom&tica e que a distribui"o das
mol%culas na solu"o % ao acaso.
A expresso log %1/% % chamada de absorbCncia ,extin"o ou densidade tica- % se designa com a
letra A! ficando ento
A=cl
# coeficiente de extin"o molar % caracterstico de cada substancia sobre uma serie de condi"$es
definidas tais como comprimento de onda! solvente e temperatura.
L<uando uma faixa de luz monocrom&tica atravessa uma solu"o colorida! a
quantidade de luz absorvida % diretamente proporcional J concentra"o da
solu"o colorida e J espessura da camada atravessada.M

# espectrofotRmetro informa quanta luz foi transmitida ,T- ou quanta luz foi
absorvida ,A-. Sendo T a percentagem de radia"o que atravessa uma
solu"o homog.nea. A escala de transmitCncia % decimal e vai de A a BAAV
e a de absor"o % logartmica e vai de A a @. A absorbCncia ,A- tem a
vantagem de que varia em forma linear com a concentra"o da amostra.
;omo a absorbCncia % a quantidade de luz que uma solu"o absorve e a
transmitCncia % a quantidade de luz que uma solu"o deixa passar! ou se'a
no absorve! % lgico que as duas escalas so inversamente proporcionais.
# que fa"o se a mol%cula que quero dosar no tem corW
1( :ode se transformar a biomol%cula em um composto corado por
liga"$es especficas com um corante ,ex. m%todo de >iureto para
dosar protenas-.
2( :oso usar radia"o da regio 05
4(T#*# *( >103(T#
X um m%todo para a determina"o de protenas totais. 2este m%todo os
ons cobre em meio alcalino ,reagente de >iureto- reagem com as liga"$es
1)
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
peptdicas das protenas formando uma cor prpura! que tem absorbCncia
m&xima em )F) nm! proporcional a concentra"o das protenas na amostra.
;#4# #>T(3 A ;#2;(2T3AU9# *A A4#ST3AW
#btida a absorbCncia no aparelho! podeEse obter o valor da concentra"o da
amostra atrav%s da frmula+
;Y A/ l.
K& duas maneiras de se fazer a an&lise colorim%trica+
:elo m%todo gr&fico ou ;urva :adro
:elo m%todo matem&tico ou 7ator de ;alibra"o
4T#*# =3P71;# #0 ;035A :A*39#
:reparamEse alguns padr$es de concentra"$es conhecidas e fazEse a
leitura das abs
;olocaEse os dados de concentra"$es no eixo das abcissas e os
valores de abs no eixo das ordenadas! em um gr&fico feito em papel
milimetrado! unindoEse os pontos obtidos temos a ;urva :adro
dessa substCncia.
Se a substCncia segue exatamente a 6ei de 6ambertE>eer! a curva %
uma reta de F)Z que passa pela origem e so necess&rios poucos
marcadores para sua elabora"o.
<uando a substCncia no segue exatamente a 6ei de 6ambertE>eer!
obtemEse uma curva qualquer e so necess&rios muitos marcadores
para sua elabora"o.
4. Procedimentos:
3! Constru/2o de uma Cur&a ,adr2o
0tilizando albumina bovina como protena de refer.ncia! sero feitas
solu"$es de concentra"o de [AT FAT @A e BA mg/ml. ;om esse intuito! ser&
feito B ml de uma solu"o de [A mg de albumina bovina. As seguintes
concentra"$es sero feitas diluindo J metade a solu"o de concentra"o
imediatamente superior.
3$ Determina/2o da concentra/2o de protenas totais
#s seguintes passos devem ser seguidos+
1. Tomar \ tubos de ensaio e marcaElos B! @! I! F! Am e > e preench.E
losde acordo com o seguinte esquema+ (m!ortante+ esta solu"o %
c&ustica! logo deve existir cuidado na manipula"o.
Tubos de
ensaio
marcados
B
[Amg/
ml
@
FAmg/
ml
I
@A
mg/ml
F
BA
mg/ml
Amostra
Am
>ranco
>
Pgua
destilada
0ma gota
B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml B!) ml
11
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
3eagente de
>iureto
(m!ortante+ o 3eagente de >iureto % uma solu"o c&ustica! logo
deve existir cuidado na manipula"o. *evido ao pequeno volume!
esta pipetagem tem que ser realizada cuidadosamente.
33 *eixar incubar B) minutos a IN
A
;! para dar tempo J forma"o do
complexo colorido.
3- :assar o contedo dos tubos para cubetas pl&sticas. 6er no
espectrofotRmetro a )FA nm. Tendo como refer.ncia o tubo >! para zerar a
leitura.
33 1nformar os resultados no quadro. ;om os resultados de todos os
grupos ser& feita uma reta comum.
34 Achar a concentra"o da solu"o problema.
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Roteiro da Aula Prtica Nro. D
1. Ttulo: Eumica de Protenas
2. Objetios:
*eterminar a composi"o elementar das protenas.
*etermina"o do ponto isoel%trico ,p1- de protenas.
4%todos de an&lise das protenas e amino&cidos.
4. Parte e8!erimental:
4.1. Teste da com!osi0o elementar das !rotenas.
3!! 0spectos tericos
As protenas so sempre compostas por ;arbono! Kidrog.nio! #xig.nio!
2itrog.nio e geralmente (nxofre. Atrav%s da pesquisa destes elementos
podeEse determinar a composi"o elementar das protenas.
(6(4(2T# 1*(2T171;A*# :#3 ...
;arbono ;arboniza"o do p ,:rotena- pelo aquecimento.
Kidrog.nio
#xig.nio
*eposi"o de vapores de &gua nas paredes do tubo.
3!$ 5(perimentos
E ;olocar em um tubo de ensaio uma pitada de casena em p ,o p e o
tubo devem estar bem secos-.
E Suspender na boca do tubo uma tira de papel tornassol vermelho
umedecido em &gua destilada! e um peda"o de papel filtro umedecido em
solu"o de acetato de chumbo.
E Aquecer o tubo diretamente na chama e observar.
E Assinalar no quadro abaixo os resultados observados.
#>S(35AU](S 3(S06TA*#
;or do resduo
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Aparecimento ou no de &gua
4./. ,etermina0o do !onto isoelAtrico da casena.
3$! 0spectos tericos
constatado que o nmero de cargas positivas e/ou negativas presentes
em uma protena depende do pK da solu"o que a contem. Assim! variando
o pK da solu"o % possvel obterEse um estado em que a protena apresenta
nmero igual de cargas positivas e negativas. # pK desta solu"o! nesta
condi"o! % chamado de ponto isoel%trico ou p1.
A determina"o do p1 pode ser obtida analisandoEse a solubilidade da
protena! '& que nele as mol%culas no apresentam carga el%trica efetiva e!
portanto! esto menos su'eitas J repulso entre siT consequentemente! elas
tendem a coalescer e precipitar.
3$$ 5(perimentos
;#4:#2(2T(S T0># B T0># @ T0># I
K@# destilada [!) m6 \!\ m6 @!F m6
Sol. ;asena
B m6 B m6 B m6

E ;olocar a casena como ltimo componente
E Agitar os tubos imediatamente
E #bservar a turbidez logo aps a agita"o.
E 5erificar o pK com pap%is indicadores e anotar no quadro abaixo os
resultados.
T0>#S B @ I
pK
Assinale com 8 o aparecimento da
turbidez
4.4. Rea0o da Ninidrina
33! 0spectos tericos

<uando um amino&cido % aquecido com 2inidrina formaEse um composto
intensamente corado. ;or violeta % obtida na rea"o de 2inidrina por todos
os amino&cidos! peptdios e protenas que apresentam um alfaEaminogrupo
livre ,a prolina e o hidroxiprolina! em que o AlfaEaminogrupo est&
substitudo! produzem derivados de cor amarela-.
33$ 5(perimentos
T0>#S
3(A=(2T(S
B @ I F
K@# ) m6
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Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Sol. 2inidrina Bg/BAAm6
A!) m6 A!) m6 A!) m6 A!) m6
E Aquecer em banhoEmaria fervente durante BA minutos.
E #bservar.
E Assinalar com ,Q-! no quadro abaixo o aparecimento de cor violeta nos
diferentes tubos.
T0>#S B @ I F
3esultado
4.D. Rea0o do )iureto
3-! 0spectos tericos

TemEse constatado empiricamente que ;uS#
F
diludo Q 2a#K em contato
com liga"$es peptdicas desenvolve uma colora"o viol&cea.
:ara que a rea"o do >iureto se'a positiva h& necessidade da presen"a de
pelo menos duas liga"$es peptdicas na mol%cula. :ortanto! amino&cidos e
dipeptdios no do rea"o do >iureto positiva. (sta rea"o de colora"o dos
peptdios e das protenas % largamente empregada na detec"o qualitativa e
quantitativa das protenas! como veremos na prxima aula.
3-$ 5(perimentos
T0>#S
3(A=(2T(S
B @ I F
K@# @ m6
;uS#F A!) g V
A!) m6 A!) m6 A!) m6 A!) m6
#bs.+ ;uS#
F
A!) V dever& ser adicionado gota a gota agitando no intervalo
de cada adi"o at% o aparecimento da cor.
Assinalar com ,Q- no quadro abaixo o aparecimento da cor azul viol&cea
nos diferentes tubos.
T0>#S B @ I F
3esultado
15
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Roteiro da Aula Prtica Nro. 1
1 . Ttulo:
+inAtica en@imtica
/. Objetios:

(studar o efeito da concentra"o do substrato sobre a


velocidade das rea"$es enzim&ticas! determinando o Om.
4. Parte e8!erimental:
3!0spectos tericos
2esta aula pr&tica ser& utilizada a invertase ,>.*. frutoEfuranosideE
frutohidrolase! I.@.B.@\-. (sta enzima % de grande importCncia no
desenvolvimento da cin%tica enzim&tica por ter sido a que Kenri e 4ichaelis
determinaram o efeito da concentra"o do substrato sobre a velocidade da
rea"o enzim&tica.
# trabalho pr&tico se realizar& em duas etapas+
:rimeira etapa+ 3ea"o (nzim&tica
A"o da invertase sobre o substrato ,sacarose- dando como produtos
frutose e glicose.
enzima
SA;A3#S( Q K
@
# =61;#S( Q 730T#S(
(sta rea"o dever& ocorrer em exatos ) min para que se possa avaliar a
atividade da enzima. 2este intervalo de tempo a velocidade da rea"o para
uma mesma concentra"o % constante.
Segunda etapa+ 3ea"o ;olorim%trica
Aps interrompida a rea"o enzim&tica com o reativo I!)*2S! iniciaEse
simultaneamente a rea"o colorim%trica! ou se'a! os produtos da rea"o
enzim&tica ,glicose e frutose- reagiro com o I!)*2S para formar o
I!)*AS.
I!)*2S EEEEEEEE Pcido I!) *initrossaliclico
I!)*AS EEEEEEEE Pcido I!) *iaminossaliclico
16
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
3$ 5(perimentos
:reparar N tubos seguindo o quadro abaixo+
T0>#S
B @ I F ) \ >
3eagentes
Tampo Acetato pK F!N A!^ml A!^ml A!^ml A!^ml A!^ml A!^ml A!^ml
K@# destilada
B!)ml
:ara obter um tempo de incuba"o de ) min! adicionar em cada tubo A!B ml
da enzima invertase e interromper a rea"o com B ml de I!)*2S segundo o
quadro abaixo+ ,agitar cada tubo aps a adi"o das solu"$es-.

T0>#S
B @ I F ) \ >
Tempo
Tempo para a adi"o da
invertase ,A!Bml-
Tempo
inicial
A_
IA__ B_ B_IA__ @_ @_IA__ EEEEEEE
Tempo para interrup"o
da rea"o com Bml de
I!)*2S
)_ )_IA__ \_ \_IA__ N_ N_IA__ <ualE
quer
- ;olocar todos os N tubos em banhoEmaria a BAA
A
; por )mim.
- 3etirar do banhoEmaria e adicionar a cada tubo N!) ml de K
@
# destilada
- Komogeneizar
- 6er no espectrofotRmetro contra o branco a ))Anm
- Anotar as absorbCncias lidas no quadro abaixo+
T0>#S
`sacarosea AbsorbCncia
B B)
\
FAA

17
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
- ;onstruir o gr&fico em papel milimetrado! com a concentra"o de
sacarose nas abcissas e a absorbCncia nas ordenadas. *eterminar o Fm
segundo 4ichaelisE4enten.
18
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Roteiro da Aula Prtica Nro. G
1 . Ttulo:
#6eito da aria0o de !3 na atiidade
en@imtica
/. Objetios:

Avaliar a influ.ncia do pK nas rea"$es catalisadas por enzimas.


4. Parte e8!erimental:
3!0spectos tericos
# pK afeta o estado de ioniza"o dos resduos de amino&cidos das
protenas. (m valores extremo de pK! existiro resduos de amino&cidos na
forma ionizada que pode pre'udicar a intera"o entre o stio ativo e o
substrato! diminuindo a atividade enzim&tica.
3$ 5(perimentos
:reparar N tubos seguindo o quadro abaixo+
T0>#S
B @ I F ) \ >
3eagentes
Sol. Tampo pK I!A A!^ml
K@# destilada
B!)ml
:ara obter um tempo de incuba"o de ) min adicionar em cada tubo A!Bml
de invertase e interromper a rea"o com Bml de I!)*2S! seguindo o quadro
abaixo+ ,agitar cada tubo aps a adi"o das solu"$es-

T0>#S
B @ I F ) \ >
1'
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Tempo
Tempo para a adi"o
da invertase ,A!Bml-
Tempo
inicial
A_
IA__ B_ B_IA__ @_ @_IA__ EEEEE
E
Tempo para
interrup"o da
rea"o com Bml de
I!)*2S
)_ )_IA__ \_ \_IA__ N_ N_IA__ <ual
E
<uer
- ;olocar todos os N tubos em banhoEmaria por ) minutos.
- 3etirar do banho e adicionar a cada tubo N!) ml de K
@
# destilada
- Komogeneizar
- 6er no espectrofotRmetro contra o branco a ))Anm
- Anotar as absorbCncias no quadro abaixo+
T0>#S
:K AbsorbCncia
B I!A
\
^!A
- ;onstruir o gr&fico em papel milimetrado! com os valores de pK nas
abcissas e a absorbCncia nas ordenadas. *eterminar o valor do pK
timo.
2)
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Roteiro da Aula Prtica Nro. H
1. Ttulo:
Eumica de ;licdios
/. Objetios:

#bservar a idrlise &cida e enzim&tica do amido at% sua ose


fundamental! a glicose.
4. Parte e8!erimental:
3!6idrlise 7cida 0spectos tericos
# amido % um homopolisacardeo noEredutor que! quando tratado com
&cido sulfrico J quente! sofre uma sucesso de hidrlises at% se converter
totalmente em mol%culas de sua ose fundamental! a glicose.
A comprova"o da hidrlise &cida do amido se d& pela positividade da
rea"o de >enedict realizada! '& que a glicose % um a"car redutor! pois
possu uma nica hidroxila livre. 2o tubo ;B! que % tomado como
testemunha da prova! a rea"o de >enedict foi negativa! pois no houve
degrada"o do amido.
3$ 5(perimentos
1. (m I tubos marcados A! > e ;! colocar+
Tubo A D ) ml de amido Bg V e ) ml de K
@
S#
F
@2.
Tubo > D pequenas partculas de gro de milho! ) ml de K
@
#
destilada e ) ml de K
@
S#
F
@2.
Tubo ; D ) ml de amido BgV e ) ml de K
@
#.
2. ;olocar os tubos em banhoEmaria por IA minutos.
3. *epois de retirar os tubos do banho! resfriar os mesmos.
4. 2os tubos A e >! adicionar )ml de 2a#K @2,para neutralizar o K
@
S#
F
@2
da hidrlise-.
5. 2o tubo ; adicionar mais ) ml de &gua.
6. 3eservar os tubos.
(fetuaEse agora a rea"o de >enedict! para demonstrar que o amido! por
hidrlise &cida! se degradou at% glicose! conforme a seguir+
1. Tomar outros I tubos e marc&Elos como AB! >B e ;B! adicionando em
cada o seguinte+
Tubo AB D @ml do tubo A ,da etapa da hidrlise- e @ ml do
reagente de >enedict.
21
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Tubo >B E @ml do tubo > ,da etapa da hidrlise- e @ ml do
reagente de >enedict.
Tubo ;B E @ml do tubo ; ,da etapa da hidrlise- e @ ml do
reagente de >enedict.
2. Aquecer os tubos em banhoEmaria fervente por ) minutos.
3. #bservar a redu"o ,cor alaran'ada com precipitado vermelho- nos tubos
AB e >B! no tubo ;B no ocorre redu"o.
336idrlise 5n8im+tica 0spectos tericos
# amido quando tratado com saliva! se degrada totalmente at% glicose! sua
ose fundamental. 1sso ocorre por que encontramos na saliva a enzima
Eamilase! que atua sobre o amido! realizando sua hidrlise enzim&tica.
2essa hidrlise! o amido passa pelas seguintes etapas intermedi&rias+
A%(,O +or a@ul com lugol IiodoJ

A%('O,#KTR(NA +or ro8a com lugol

#R(TRO,#KTR(NA +or ermelLa com lugol
A+RO,#KTR(NA (ncolor com lugol
%A'TO"# Rea0o de )enedict M
;'(+O"# Rea0o de )enedict M
Ao colocarmos a saliva em contato com o amido! no tubo 8! se inicia a
hidrlise enzim&tica! por a"o da Eamilase. ;onforme vamos adicionando
volumes do contedo deste tubo 8 nos outros tubos que cont%m lugol!
podemos observar todas as etapas do processo de hidrlise+ amilodextrina!
eritrodextrina! acrodextrina! maltose e glicose ,conforme a mundan"a de
cor-.
<uando colocamos o reagente de >enedict no tubo 8! ocorre uma colora"o
alaran'ada que indica redu"o. # amido inicial colocado no tubo! '& foi
hidrolizado pela enzima chegando at% maltose e glicose.
2o experimento @ a alta temperatura inativa a enzima Eamilase pesente na
saliva assim no h& hidrlise do amido! isso % comprovado pela rea"o de
>enedict negativa.
3- 5(perimentos
22
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
(xperimento B+
(m N tubos de ensaio marcados A! >! ;! *! (! 7 e = colocar F gotas de
lugol em cada tubo.
Tomar um tubo de ensaio J parte! marc&Elo como 8 e colocar neste tubo
BA ml de solu"o de amido BgV.
3etirar B ml deste tubo 8 e adicionar no tubo A. #bservar a cor azul
,neste tubo no h& hidrlise! permanece amido puro-.
;olocar [ gotas de saliva ,recolhida previamente em um >ecGer- no tubo
8.
4isturar bem! por inverso do tubo.
4arcar o tempo! e aps um minuto! colocar B ml do contedo do tubo 8
no tubo >.
Aps mais um minuto! colocar B ml do contedo do tubo 8 no tubo ;.
Suceder desta forma at% o tubo =.
(m seguida! colocar em um tubo de ensaio @ ml da solu"o do tubo 8.
Adicionar @ ml do reagente de >enedict.
;olocar em banhoEmaria fervente por ) minutos.
(xperimento @+
;olocar [ gotas de saliva ,recolhida previamente em um >ecGer- no tubo
b com I!A ml de K
@
#.
*eixar no banho maria fervente por BA minutos.
Adicionar B!A ml de solu"o de amido BV esperar ) minutos.
3etirar B!A ml da solu"o do tubo b e adicionar @ gotas de lugol.
Retirar 1?> ml da solu0o do tubo N e adicionar /?> ml do reatio de
)enedict.
23
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Roteiro da Aula Prtica Nro. O
1 . Ttulo:
+adeia Res!iratria
/. Objetios:

*emonstrar o transporte de el%trons na cadeia respiratria.

Avaliar o efeito de um inibidor e um descapolador do transporte de


el%trons.

Avaliar o efeito de diferentes substratos no transporte de


el%trons.
4. Parte e8!erimental:
4.1. %aterial utili@ado
E *issecar fgado de rato! camundongo ou peixe. Aps a extra"o do rgo!
secar em papel de filtro e pesaElo. # fgado ser& homogeneizado em solu"o
fisiolgica numa propor"o de I ml de solu"o por cada B g de tecido. #
homogeneizado deve ser centrifugado ,)AA x g durante BA min! a F
o
;- e
mantido no frio.
E /?G ,+*(* Idicloro6enol indo6enolJ+ 0tilizar numa concentra"o de B
m4. # @! *;717 % um composto de cor azul que quando % reduzido perde
esta cor. comumente utilizada na determina"o da atividade da succinato
desidrogenase. #bserve que um fluxo maior de el%trons acontecendo ao
longo da cadeia respiratria deveria
aumenta a taxa de descoramento do @!\
*;717
24
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
E "ubstratos+ succinato numa concentra"o de BAA m4.
E (nibidor da cadeia res!iratria+ O;2! numa concentra"o de BA m4.
4./. Procedimento
IaJ ;ada grupo dever& preencher tr.s tubos! segundo o indicado na tabela+
Tubo 1 Tubo / Tubo 4
,1- Tampo )AA l )AA l )AA l
,51- Substrato
E B@) l B@) l
ObseraPes im!ortantes:

# inibidor % um composto #KTR#%A%#NT# TQK(+O. A manipula"o fica
por conta dos docentes a cargo.
Aps colocar o inibidor ,passo 15-! esperar 1 %(NUTO" antes de colocar o
corante e o substrato ,passos 5 e 51-.

#bserve que o Tubo 1 constitui o branco dos Tubos / e 4.
IbJ ;ada grupo dever& registrar o tempo que leva descoramento em cada
tubo. Alternativamente podeEse registrar numa escala qualitativa que tubo
ou tubos apresentaram cor mais intensa e quais apresentaram menor cor.
25
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
IcJ #s dados ,tempo ou intensidade de descoramento- obtidos por cada
grupo sero registrados numa tabela+
Tratamento Tem!o ou intensidade
de descoramento
Tubo B
Tubo I
2o relatrio! deveram ser interpretados os resultados obtidos em cada tubo!
discutindo os efeitos do inibidor utilizado.
Roteiro da Aula Prtica Nro. R
1 . Ttulo:
Eumica de 'i!dios
/. Objetios:

*iferenciar &cidos graxos saturados e insaturados.

;aracterizar lipdios saponific&veis,complexos-.

3econhecimento da lecitina a partir da detec"o do seu grupo


fosfato e da colina.
4. Parte e8!erimental:
4.1. ,i6erencia0o entre cidos gra8os saturados e insaturados
Iteste de iodo !ara cidos gra8osJ.
3!! 0spectos tericos
#s &cidos graxos insaturados adicionam o iodo Js
liga"$es duplas tornandoEse saturados. # vermelho rseo
que se observa no tubo que cont%m clorofrmio % a cor
26
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
caracterstica das solu"$es em que o iodo se encontra na
forma livre.
3!$ 5(perimento
*istribuir os reagentes em F tubos de ensaio conforme o esquema abaixo+
S#60U](S
T0>#B
T0>#@
T0>#I
T0>#F
:adro de cor
,clorofrmio-
@!A ml B!)ml
Sol 8 ,'& pipetada-
A!)ml
#s &cidos graxos esto dissolvidos em clorofrmio.

Adicionar aos F tubos B gota de reativo de Kubl ,1


@
Q Kg;l
@
Q
etanol-.

Agitar e observar.

Adicionar mais B gota aos F tubos de reativo de Kubl! agitar e


observar.

3epetir at% que se'am adicionadas mais ) gotas de reativo em


cada tubo.

Anotar o que foi observado no quadro de respostas.


4./. "a!oni6ica0o
3$! 0spectos tericos
#s lipdios complexos quando hidrolizados em meio alcalino produzem
glicerol e sais de &cidos graxos. (xemplo+
27
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
3$$ 5(perimento

(m tubo de ensaio que '& cont%m I!A ml de lipdio! acrescentar ,com


pipeta de )!Aml- @!Aml de 2a#K BA2 e BA ml de etanol absoluto.

7echar o tubo com algodo.

;olocar em banho mara fervente! agitando ocasionalmente at% a


forma"o de uma pasta.

#bservar o produto formado e anotar na folha de respostas.


4.4. +aracteri@a0o da 'ecitina
33! 0spectos tericos
A lecitina quando hidrolisada totalmente produz+ glicerol! &cidos graxos!
&cido fosfrico ,K
I
:#
F
- e colina ,K#D;K
@
D;K
@
D2
Q
E,;K
I
-
I
-.
# fosfato reage com o molibdato de amRnio formando fosfomolibdato de
amRnio. ;om a adi"o do reagente redutor formamEse xidos de molibd.nio
que determinam a colora"o azul! o que evid.ncia indiretamente a presen"a
de fosfato inorgCnico.
7osfato Q 4olibdato de AmRnio 7osfomolibdato de amRnio
7osfomolibdato de amRnio Q reagente redutor cxido de
molibd.nio,azul-
33$ 5(perimento9 Determina/2o dos grupos 'os'atos
H
2
C

|
HC
H
2
C
|
OCO-R
1
OCO-R
2
OCO-R
3
+ 3 NaOH
OH
OH
OH
|
H
2
C
HC
|
H
2
C

+ 3 R-COO
-
Na
+
Triacilglicerdio
Glicerol
Sal do
cido graxo
28
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
# material a ser utilizado % o hidrolisado completo de lecitina.
3eagentes T0># B T0>#@ T0>#I
K
@
# B!A ml
Sol molibdato de
amRnio
B!A ml B!A ml B!A ml
A<0(;(3 (4 >A2K#E4A31A :#3 B min
3eagente redutor A!F ml A!F ml A!F ml
3egente redutor+ &cido aminonaftol sulfRnico Q bissulfito de sdio Q sulfito
de sdio. Agitar aps adi"o deste reagente e assinalar com ,Q- no quadro
da folha de resposta o aparecimento da cor azul.
333 5(perimento9 Determina/2o dos cristais de Florence
E ;olocar B gota de hidrolisado sobre uma lCmina.
E Adicionar B gota de lugol concentrado.
E ;olocar a lCmina no refrigerador durante o tempo de execu"o dos demais
testes.
E (xaminar ao microscpio o produto da rea"o entre iodo e a colina! a qual
precipita sob a forma cristalina,cristais de 7lorence- J temperatura inferior a
B)
o
;.

2'
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica 3)
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
Roteiro da Aula Prtica Nro. 1>
1 . Ttulo:
+romatogra6ia
/. Objetios:
1.
(studar os princpios b&sico da cromatografia e suas aplica"$es na
identifica"o de compostos executando o processo de cromatografia
em papel.
4. Parte e8!erimental:
3! 0spectos .ericos9
A cromatografia % um m%todo fsicoEqumico de separa"o e identifica"o de
substCncias baseado na diferen"a de afinidade de duas ou mais substCncias
em rela"o a um material estacion&rio e uma fase mvel.
A fase mvel pode ser lquida ou gasosa e a fase estacion&ria pode ser
lquida! slida ou fase ligada.
A cromatografia em papel possui fase mvel lquida. 0m eluente que %
escolhido conforme os compostos a serem analisados na pr&tica de aula %
composto por >utanol/ Acetona/ Pcido Ac%tico/ Pgua ,I)/I)/N/@I v/v-. A
fase estacion&ria % slida representada pelo papel.
3$ 5(perimento9
1. ;om auxlio de um tubo capilar de vidro aplicar uma gota de cada uma
das solu"$es de amino&cidos ,glicina! alanina! creatina e a mistura- nos
respectivos pontos indicados no papel! as gotas devem estar a B!) D @!A
cm da borda inferior e B!A cm entre cada gota.
2. =rampear as extremidades do papel conforme orienta"o.
3. 1mergir o papel no eluente que est& no >ecGer de modo que a
extremidade do papel que cont%m os pontos fique em contato com o
lquido.
4. Tampar o >ecGer.
5. *eixar proceder a cromatografia por aproximadamente FA minutos.
6. 3etirar o papel.
7. 4arcar a altura do solvente.
8. *esgrampear.
'. Secar o papel com secador.
1). >orrifar o papel com reativo revelador ,solu"o de ninidrina-.
11. ;olocar o papel na estufa J FA
Z
31
Departamento de Cincias Fisiolgicas (FURG) Disciplina de Bioqumica
12. 4arcar com l&pis as manchas formadas delimitando o seu contorno e
centro geom%trico.
13. #bservar a separa"o das substCncias da solu"o 4.
33 C+lculo do R' (Fator de Reten/2o)9
3f % uma constante fsica importante para determinar um composto.
3f Y distCncia de migra"o percorrida pela amostra / distCncia de migra"o
percorrida pelo eluente
,istCncia de migra0o !ercorrida !ela amostra+ % a distCncia entre o
ponto de aplica"o at% o centro geom%trico da mancha.
,istCncia de migra0o !ercorrida !elo eluente+ % a distCncia entre o
ponto de aplica"o e a frente percorrida pelo eluente.
32

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