Universidad Autnoma de Baja California Bioingeniero Facultad de Ingeniera Mexicali

Bioqumica Manual de Prcticas de a!oratorio "r Fernando Amlcar #ols "omngue$

M%I% #usana &or$agara' Plasencia
(

Prctica No. 7
ACTIVIDAD ENZIMTICA Y FACTORES QUE LA AFECTAN
OBETIVO!
Estudiar los factores que afectan la actividad enzimtica y comprender la especificidad de las enzimas por el
sustrato.
INTRODUCCI"N
Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica, la mayora de ellas. Con la actividad
enzimtica se verifican numerosos procesos bioqumicos, el conjunto de los cuales constituye la esencia del
metabolismo. nfluyendo en la velocidad de las reacciones metablicas, las enzimas son capaces de regular
efectivamente procesos vitales. !e manera similar a los catalizadores inorgnicos, las enzimas aumentan la
velocidad de las reacciones con baja energa de activacin. Las enzimas son sensibles a las variaciones de las
condiciones del medio en que estn funcionando y tienen una serie de particularidades relacionadas a su
naturaleza protenica.
I. LABILIDAD TRMICA DE LAS ENZIMAS
La temperatura del medio influye muc"o en la actividad de las enzimas. Con cierto aumento de la
temperatura del medio ocurre aceleracin de la reaccin a consecuencia de la activacin de las mol#culas
de sustrato. $ la vez, incluso un aumento peque%o de la temperatura conduce al debilitamiento de los
enlaces que mantienen la conformacin de la mol#cula de enzima, necesaria para la manifestacin de su
actividad cataltica. La inactivacin de la enzima con aumento de la temperatura del medio es irreversible. $l
bajar la temperatura la enzima disminuye su actividad tambi#n. El mecanismo de este proceso no est claro.
&in embargo, el enfriamiento no causa desnaturalizacin de la enzima y por lo tanto su inactivacin puede ser
reversible.
Materiales y equipo.
' tubos de ensaye,
&oporte universal con anillo,
(ela de asbesto,
)aso de precipitados de *+, ml,
Estufa '-.C.
Reactivos.
&aliva diluida / a + con agua destilada,
Cubos de "ielo,
$lmidn al /0 disuelto en 1aCl ,.'0,
Lugol.
M#to$o%o&'a.
/. Colocar en ' tubos de ensayo * ml de solucin salival y rotularlos como (2/, (2* y (2'.
*. La muestra del tubo (2/ se calienta en ba%o mara a /,, 3C durante / min.
'. !ejar enfriar el tubo (2/ y a%adir 4 ml de disolucin de almidn cada uno de los tres tubos 5.(2/, (2* y (2'6
4. Los tubos (2/ y (2* se incuban a '-.C durante/, min.
+. El tubo (2' se sumerge en "ielo durante /, min.
7. (ranscurrido el tiempo a%adir una gota de lugol en cada tubo y registrar los resultados en la siguiente tabla

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)

(ubo Enzima Condiciones &ustrato ncubacin Coloracin con lugol
(2/ $milasa !esnaturalizada $lmidn '-3C, /, minutos
(2* $milasa 1ativa $lmidn '-3C, /, minutos
(2' $milasa !esnaturalizada $lmidn 2/,3C, /, minutos
-. !iscutir y concluir los resultados.
II. INFLENCIA DEL !" S#BRE LA ACTI$IDAD ENZIM%TICA
8ara cada enzima e9iste un ptimo del p: a que crean las condiciones ms favorables para el mantenimiento
de la conformacin funcionalmente activa de la mol#cula. Los grupos amino y carbo9ilo de los restos de
aminocidos onizados a una magnitud de p: determinada, participan en el mantenimiento de la
conformacin de la mol#cula protenica necesaria para la formacin de los centros catalticos de la enzima y
favorecen su ligamiento al sustrato. $ una magnitud de p: distinta se altera la ionizacin de los grupos
correspondientes, y como resultado se rompen los enlaces que aseguran la formacin de los centros
catalticos, y la enzima se inactiva. $ valores de p: muy altos o muy bajos las enzimas se desnaturalizan.
Materiales y equipo.
' tubos de ensaye,
parrilla de calentamiento,
ba%o ;ara 5'-.C6,
vaso de pp de *+, ml,
' pipetas de/, ml.
Reactivos.
<osfato sdico disustituido 5dibsico6 ,.* ; 5$6,
cido ctrico ,./ ; 5=6.
&oluciones amortiguadoras>
p: +.,> se mezclan +./+ ml de $ con 4.?+ de =@
p: 7.?> se mezclan -.-*+ ml de $ con *.*-+ de =@
p: ?.,> se mezclan A.-*+ de $ con ,.*-+ de =.
&olucin salival,
$lmidn /0,
lugol.
Meto&olo'(a.
/. Botular ' tubos de ensaye como (2/, (2* y (2'
*. $l tubo (2/ agregar * ml de solucin amortiguadora p: +,
'. $l tubo (2* agregar * ml de solucin amortiguadora p: 7.?
4. $l tubo (2' agregar * ml de solucin amortiguadora p: ?
+. En todos los tubos de ensaye a%adir * ml de amilasa salival y 4 ml de solucin de almidn.
7. ;ezclar, e incubar a '-.C, durante /, minutos.
-. 8osteriormente se agregar una gota de lugol y se registrar los resultados en la siguiente tabla.
(ubo Enzima p: del medio &ustrato ncubacin Coloracin con lugol
(2/ $milasa + $lmidn '-3C, /, minutos
(2* $milasa 7.? $lmidn '-3C, /, minutos
(2' $milasa ? $lmidn '-3C, /, minutos
?. !iscutir y concluir los resultados.


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III. ES!ECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS
Las enzimas se distinguen de los catalizadores inorgnicos por su especificidad e9cepcionalmente alta. La
etapa inicial del acto cataltico consiste en la formacin del complejo enzima2sustrato, es decir, el ligamiento
del sustrato con el centro cataltico de la enzima. La conformacin espacial del centro de sustrato debe estar
en la correspondencia geom#trica e9acta con la estructura de la mol#cula de sustrato. &olamente en este
caso es posible la formacin del complejo enzima2sustrato y el cumplimiento de la funcin cataltica de la
enzima. !o tal modo, la esencia de la especificidad de enzimas consiste en el "ec"o de que el sustrato le
corresponde a la enzima, como una llave a la cerradura.
Maeriales y equipo.
4 tubos de ensaye,
pipetas,
incubadora.
Reactivos.
$lmidn al /0,
sacarosa al *0,
saliva diluida,
(acara(a 5/, g levadura se "omogeneizan
en /,, ml de agua6,
lugol,
licor de <e"ling.
Meto&olo'(a.
/. Botular cuatro tubos de ensaye como (2/, (2*, (2' y (24
*. En los tubos (2/ y (2* colocar 4 ml de solucin de almidn.
'. En los tubos (2' y (24 Colocar 4 ml de solucin de sacarosa.
4. $ los tubos (2/ y (2' adicionar * ml de a)i%a(a salival.
+. En los tubos (2* y (24 adicionar * ml de (acara(a.
7. &e agitan los tubos y se incuban a '-.C.
-. $ los tubos (2/ y (2* se agrega una gota de lugol,
?. y en los tubos (2' y (24 se adiciona / ml de reactivo de <e"ling, calentarlos a ba%o "irviente durante +
min.
A. Begistrar en la tabla la especificidad de las enzimas a)i%a(a y (acara(a.
(ubo Enzima &ustrato ncubacin Beactivo Coiloracin
(2/ $milasa $lmidn '-3C, /, minutos Lugol
(2* &acarasa $lmidn '-3C, /, minutos Lugol
(2' $milasa &acarosa '-3C, /, minutos <e"ling
(24 &acarasa &acarosa '-3C, /, minutos <e"ling
/,. Begistrar las observaciones, discusin de resultados y conclusiones.
Bi*%io&ra+'a $rzola2$lvarez C. y col. ;anual de =ioqumica. <acultad de Cootecnia. Dniversidad $utnoma de
C"i"ua"ua.