Qumica analtica

Profa. Lilia Araujo.

Prof. Avismelsi Prieto.
UNIDAD VII
Cromatografa
Qumica analtica
INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA
La cromatografa abarca un grupo de tcnicas de separacin que permite adems de
aislar; identificar y cuantificar componentes presentes en mezclas complejas, cuando se
le acopla a otras tcnicas analticas.

Mecanismo:
Los componentes de una mezcla son transportados a travs de una fase estacionaria por
accin de una fase mvil que fluye. Las separaciones se basan en las diferencias de
velocidad de migracin entre los diferentes componentes de la muestra.
1. Slido fino sostenido en un tubo de
vidrio o metal.
2. Papel Poroso.
3. Slido fino, soportado por una placa
de vidrio o plstico.
4. Lquido inmovilizado inmiscible con
la fase mvil.
FASES ESTACIONARIAS
FASE MVIL
Lquido o gas que se desplazan por efecto de la gravedad, percolacin, accin
capilar o presin.
Qumica analtica
CLASIFICACIN
a. Segn la geometra del medio fsico que soporta la fase estacionaria:

Cromatografa en Columna: La fase estacionaria est empaca en un tubo.
Cromatografa Plana: La fase estacionaria esta sostenida en una placa de
Vidrio, plstica o papel.

b. Segn el estado fsico de la fase mvil:
Cromatografa Lq-Slido
Cromatografa Lq-Lq
Cromatografa en Capa Fina
Cromatografa en Papel
Cromatografa Inica
Cromatografa de Permeacin de Gel
Cromatografa Lquida
Fase mvil
Lquida
Cromatografa Gas-Lquido
Cromatografa Gas-Slido
Cromatografa Gaseosa
Fase mvil
Gaseosa
Qumica analtica
c. Segn el mecanismo por el cual los solutos se separan.

C.1- Cromatografa de Adsorcin
Los solutos se separan segn su capacidad para adsorberse sobre la fase
estacionaria.








ANALITO
1,2-bencenodiol
(pirocatecol)
C.2.- Cromatografa de Reparto o Particin
La fase estacionaria esta formada por una pelcula de un lquido
inmovilizado que reviste la superficie de un slido inerte, la separacin de
los componentes de una mezcla, se debe a la diferencia del equilibrio de
reparto de los solutos entre la fase estacionaria lquida y la fase mvil
(lquido o gas).

ANALITO
Naftaleno
C.3.- Cromatografa de Intercambio Inico
Utiliza fases estacionarias slidas con grupos funcionales aninicos (Ej. R-SO
3
-
) o
catinicos (Ej. R-N(CH
3
)
3
+
) unidos por enlaces covalente a resinas polimricas. los
solutos inicos son atrados por las fuerzas electrostticas.
Qumica analtica
R-SO
3
-
sulfonico

R-N(CH
3
)
3
+
aminas cuaternarias

C.4.- Cromatografa de Exclusin por Tamaos
La separacin se debe a la diferencia de tamao de los solutos. La _
fase estacionaria suelen ser geles porosos que pueden ser penetrados
por los solutos de menor tamao.
APLICACIONES EXPERIMENTALES
Qumica analtica
PROCESO CROMATOGRFICO: Elusin en columnas
Qumica analtica
Cromatograma: Registro de la seal de deteccin en funcin del tiempo de elusin

SOLVENTE
Teora cintica de la cromatografa
I. Una vez introducida la muestra en la columna, el flujo de fase mvil
arrastra los componentes de la mezcla y se inicia la distribucin de las
especies qumicas entre la fase mvil y la fase estacionaria.
II. Las molculas son
sometidas a miles de
transferencias entre las fases
estacionaria y mvil.
III. El tiempo de residencia puede ser
corto en algunas transferencias y
largo en otras (tiempo de residencia
irregular).
Qumica analtica
Por que ocurren las separaciones cromatogrficas?
Fase mvil
Fase
estacionaria
Transferencias de una
especie entre las fases
mvil y estacionaria
Qumica analtica
V. La velocidad promedio en la que una
especie migra en la columna
depende de la fraccin de tiempo
que permanece en la fase mvil.
VI. Una sustancia retenida fuertemente por
la fase estacionaria presentar una velocidad de migracin promedio baja.
VII. Las diferencias de velocidad de migracin, hacen que los componentes
de la mezcla se separen en bandas o zonas estrechas.
IV. El movimiento de las distintas especies solo puede producirse
mientras las especies qumicas estn en la fase mvil.
Fase mvil
Fase
estacionaria
Transferencias de una
especie entre las fases
mvil y estacionaria
Qumica analtica
Descripcin cuantitativa de la eficiencia de una columna
Se emplean dos trminos para expresar la eficiencia de una columna:
1)La altura equivalente de un plato terico ( H o HETP) y
2)El nmero de platos tericos
N = L / H donde L es la longitud de la columna

El trmino altura de plato terico H proviene de la teora de Martin y Synge en la
que se considera que en cada plato (segmento de la columna) se debera
tericamente establecer el equilibrio de una especie qumica entre las fases
mvil y estacionaria.
Una pequea altura de plato terico da lugar a picos estrechos y esto
permite a su vez mejores separaciones.

Similarmente se obtienen excelentes separaciones cuando se tiene un
elevado nmero de platos tericos.
Qumica analtica
Considerando un pico cromatogrfico como una curva gaussiana:
H =
2
/ L
Adems = LW / 4tr H = LW
2
/ 16tr
2

Sustituyendo H en
N = L / H
N = L / (LW
2
/ 16tr
2
)


N = 16( tr / W )
2


N = 5,54(tr /W

)
2
tr = tiempo de retencin W = anchura de base de pico W
1/2
= anchura a mitad del pico

Se obtienen excelentes separaciones cuando se tiene un
elevado nmero de platos tericos.

Variables cinticas que influyen en la eficiencia de la columna
El ensanchamiento de pico refleja una prdida de la eficiencia de la
columna .
Este ensanchamiento se debe a un avance diferente de las
molculas de una misma especie a travs de la columna.

No todas las molculas de una misma especie fluyen de igual
forma, en el mismo instante de tiempo, es decir, no presentan un
comportamiento ideal. Este comportamiento no ideal se debe a tres
factores descritos por la ecuacin de Van Deemter:
1. Caminos mltiples o difusin en remolino (trmino A).
2. Difusin longitudinal (trmino B/u).
3. Tiempo de equilibrado o resistencia a la transferencia de materia
(trmino Cu).
Qumica analtica
H = A + B/u + Cu
U = velocidad lineal de la fase mvil
H = altura del Plato terico
Qumica analtica
(trmino A).
Caminos mltiples
Resistencia a la transferencia de materia
La ecuacin de Van Deemter expresa cmo influye la columna y la
velocidad de flujo en el ensanchamiento de la altura del plato terico.
H = A + B/u + Cu
Columnas empaquetadas A, B, C es 0

Columnas tubulares abiertas A = 0
Tiempo de equilibrio ente las fases
Caminos mltiples
Difusin longitudinal
Qumica analtica
Qumica analtica
CL
CG
Caractersticas de un Pico Cromatogrfico
S
e

a
l

d
e
l

D
e
t
e
c
t
o
r

Tiempo de Retencin
W
t
r
t
m
Qumica analtica
1 Tiempo de Retencin (tr): Es el que tarda un soluto
en desplazarse desde el inyector hasta el detector.
2 Anchura de Base (w): es el ancho (medida) de la banda
cromatogrfica de un soluto medida sobre la lnea base.
Unidades de w: tiempo, volumen o longitud.

3 Tiempo muerto (tm): es el tiempo necesario para que los
Solutos no Retenidos se desplacen desde el inyector al
detector.

Qumica analtica
A B
R
B B
A R, B R,
w w
t
2
) w 0.5(w
t - t
(R) RESOLUCIN
+
=
+
=
La resolucin puede mejorar, segn la ecuacin
a) Aumentando tr
b) Disminuyendo w
El tr depende de la interaccin de los solutos con la fase estacionaria.

W: la anchura del pico depende de la cintica asociada al movimiento del soluto
entre la fase mvil y estacionaria
RESOLUCIN (R) es una medida cuantitativa del grado de separacin entre dos
picos cromatogrficos A y B.
R=0.75
R=1.25
R=1.50
Se observa que a medida que R
aumenta mejora la separacin
entre los picos
PARMETROS CROMATOGRFICOS
A
A
A B B B
Qumica analtica
La resolucin depende de 3 factores:

Factor de capacidad (K) o factor de retencin (k)
Factor de selectividad ()
Nmero de platos tericos (N)
R =Resolucin entre los picos de A y B ( )
|
.
|

\
|
+ '
'
|
.
|

\
|

=
1
1
4
1
K
K
n R
o
o
Selectividad Eficiencia Capacidad
Se puede lograr disminucin de los anchos de picos y mejor resolucin si
experimentalmente se adoptan las siguientes medidas:

1. Se disminuye el tamao de las partculas de la fase estacionaria slida
2. Empleando capas mas finas de pelcula lquidas inmovilizadas sobre la
fase estacionaria.
3. Disminuyendo la viscosidad de la fase mvil.
4. Aumentando la temperatura.
5. Optimizando la velocidad o el flujo de la fase mvil
6. Seleccionando apropiadamente las polaridades de las fases mvil y
estacionaria.
Factor de Capacidad o Retencin (K`)
Medida de la fortaleza con que la fase estacionaria retiene un analito dado





Factor de Selectividad ():
Medida de la afinidad de la fase estacionaria respecto a dos analitos




0 >
'

=
'
K
tm
tm tr
K
1 >
'
<
'
'
'
=
B A
A
B
K K
K
K
Qumica analtica
Eficacia de la columna

2
16
|
.
|

\
|
=
w
tr
N
5
ANLISIS CROMATOGRFICO:

Cualitativo Tiempo de retencin, espectros de masas, infrarrojos.

Cuantitativo Cantidad de analito en la muestra: rea o Altura
TIPOS DE CUANTIFICACIN
1. Normalizacin del rea (no requiere patrn)

+ + + + =
n 3 2 1 i
A ... A A A A
100
A
A
%A
i
1
1
=

Los analitos deben tener el mismo factor de

respuesta con el detector
Ej.: hidrocarburos/ Detector de ionizacin a la
llama (FID)
2. Calibracin con estndares externos:
Se emplea una serie de soluciones patrn
que contienen mezclados los analitos que
se desean cuantificar. Se determinan las reas
y se grafica para cada analito

rea o
altura de la
seal de X
i

Concentracin del analito X
i
Qumica analtica
3. Estndar interno (EI)
Se adiciona a cada mezcla de soluciones
patrn, una sustancia (que no este presente
en la muestras) con una concentracin
fija. Se determinan las reas de los analitos
y del EI y se grafica para cada analito
A
X

A
EI
C
X
Qumica analtica
4. Adicin de patrn
Se adiciona cantidades creciente de soluciones
patrn, con o sin estndar interno, a un volumen
fijo de muestra. Se determinan las reas de los
analitos (y del EI) y se grafica para cada analito

Es recomendable cuando se presente
interferencia de matriz.
C
M
= Corte / Pendiente
0 P2 P1 P3



Mejor mtodo de cuantificacin, corrige variaciones experimentales.
Cp

A
X

A
EI
Cromatografa de intercambio inico.
Intercambio reversible de especies cargadas elctricamente entre una disolucin
en movimiento y un slido.

) ( ) ( ac s
X U R
+
+
) ( ) ( ac s
U X R
+
+
) ( ) ( ac s
M J R
+ +
+
) ( ) ( ac s
J M R
+
+
Qumica analtica
Resinas de intercambio aninico: R---N(CH
3
)
3
+
OH
-
(base fuerte)
R---NH
3
+
OH
-
(base dbil)

Resinas de intercambio catinico: R---SO
3
-
H
+
(cido fuerte)
R---COO
-
H
+
(cido dbil)
Eluentes: Para intercambio catinico soluciones cidas
Para intercambio aninico soluciones bsicas
En ocasiones se aaden bajas cantidades de solventes orgnicos polares.
Factores que afectan la retencin de los analitos



1.- Carga de los iones
Los iones polivalentes se retienen mas que las especies con una sola
carga. Tambin se dan diferencias relacionadas con el tamao del ion
hidratado entre mayor sea el radio de hidratacin menor es la retencin.
Para una resina de intercambio catinico fuerte:




Para una resina de intercambio aninico fuerte:

+ + + + + + +
+ +
+
+ + +
+ + + + + +
> > > > > > >
> > > > > >
> > > > >
Li H Na NH K Rb Cs
Ag Tl UO Mg Zn Cu
Cd Ni Ca Sr Pb Ba
4
2
2
2 2 2
2 2 2 2 2 2

> >
> > > > >
> > > > >
F OH
COO CH CHCOO Cl SCN Br
CrO NO I O C SO Citrato
3
2
4 3
2
4 2
2
4
3
Qumica analtica
Grupos de aplicacin
Separacin de iones inorgnicos.
-Separacin de molculas orgnicas cargadas elctricamente.

3. pH del sistema.
Afecta los iones en equilibrio con una forma molecular. Para incrementar la retencin, el
valor del pH debe promover la existencia de la forma inica.
Aniones: pH= pKa+ 1,5 Cationes: pH= pKb- 1,5

2. Concentracin del eluente o fase mvil
Si la concentracin del eluente es muy alta, los analitos eluyen a K=0; se debe ajustar la
concentracin del eluente para obtener K`=1 a 5
4. Temperatura
Los equilibrios de intercambio inico comnmente son ms rpidos a altas
temperaturas. Los cambios de temperatura tambin afectan a pKa o pKb. Un
incremento de la temperatura disminuye a K`.
5. Modificador Orgnico
Los solventes orgnicos modifican; la solubilidad, Ka, Kb, radio inico velocidad de
intercambio inico y la absorcin.
Qumica analtica
Esquema del
cromatgrafo inico.
Eluyente
Muestra



Columna
Analtica





Detector

Qumica analtica
(Conductividad)
Registrador
Membrana Supresora
o
Columna supresora
de la conductividad del
eluyente
Sin sistema supresor
de la conductividad
del eluyente.

Inyector
1) Sin sistema supresor de la conductividad de la fase mvil:
La deteccin se basa en las pequeas diferencias de conductividad entre los iones
de las muestras y los iones del eluyente. Para aumentar estas diferencias, se
utilizan eluyentes de bajas concentraciones (Ej HCl 2x10
-3
M) y resinas de baja
capacidad intercambiadora, hacen posible la elucin de los iones de la muestra.
Mtodo menos sensible que los sistemas que
suprimen la conductividad de la fase mvil.
2) Empleo de una columna supresora de la conductividad: Es una 2da columna
que se coloca despus de la columna analtica pero de carcter opuesto.
Presenta la desventaja de saturacin de las columnas con poco tiempo de uso, lo que
hace necesario regeneral la columna supresora.
En la separacin de cationes:
H
+
(ac) + Cl
-
(ac) + Resina
+
OH
-
Resina
+
Cl
-
+ H
2
O(l)
En la separacin de aniones:
2Na
+
(ac) + CO
3
2-
(ac) + 2Resina
-
H
+
2Resina
-
Na
+
+ H
2
CO
3
(ac)

Qumica analtica
columna supresora
columna supresora
columna supresora
columna supresora
Eluyente
Eluyente
O J O
Qumica analtica
3) Empleo de una membrana supresora
Membrana supresora para determinar cationes
Aplicaciones
Qumica analtica
CROMATOGRAFA DE GASES
Principio: Los componentes de una muestra vaporizada se fraccionan como
consecuencia de la particin entre una fase gaseosa mvil y una fase estacionaria
mantenida en una columna.
Crom. Gas-Slido (CGS) Equilibrio de Adsorcin Gaseosa
Crom. Gas-Lquido (CGL) Equilibrio de particin Gas-Lquido
Mtodo Cromatogrfico ms utilizado.
La Cromatografa gaseosa es la tcnica empleada para separar
compuestos orgnicos e inorgnicos trmicamente estables y voltiles.
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Ejemplos: Hexano, Acetona, decano, antraceno, Acetato de etilo, DDT,
sulfuro de hidrgeno, fenol, trihalometanos, etanol, hidrocarburos livianos,
Dixido de carbono, xidos de nitrgeno, etc.
Qumica analtica
Qumica analtica
Qumica analtica
Inyectores (Liner o Inserto)
Tubo de vidrio calentado a una temperatura suficientemente alta para convertir en
forma instantnea la muestra liquida en un tapn de vapor. Volmenes tpicos entre 1-
10 L para columnas empacadas.
Para columnas capilares se inyecta 1 L en un inyector-divisor. En el modo de trabajo
split (con divisin) solo entra a la columna 0.01 L.
Temperatura del inyector: sobre los 50 C por encima del soluto menos voltil.
Formas de inyeccin
1. Muestrador o inyector automtico
2. Inyeccin por la cabeza gaseosa (headspace)
3. Purga y atrapamiento
4. Manual
Qumica analtica
Modo Split: muestra dividida
Se usa para analitos con altas
concentraciones. Se expulsa
solvente y analitos.
Modo Splitless: muestra no dividida.
.Se usa para Analitos con bajas
Concentraciones.
Se expulsa solo el solvente-
Columnas cromatogrficas
Qumica analtica
Qumica analtica
Presentar adecuada retencin y afinidad con los analitos
Qumica analtica
Polidimetilsiloxano 95%
con 5% di fenil
300 C
En general para analitos no polares:
Plaguicidas, hidrocarburos,
Esteres, cetonas, aldehdos etc.

Qumica analtica
TERMOSTATIZACION DE LA COLUMNA
Control de temperatura de la columna ayuda a obtener Tr reproducibles
Barrido
Cromatogrficos
Isotrmicos

Programa de temperatura: aumento de la temperatura de la
columna en forma escalonada
Efecto de la
temperatura
sobre los
cromatogramas
de gases.
80 C
30 200 C
150 C
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DETECTOR
Es un dispositivo capaz de responder rpidamente a bajas concentraciones de los solutos
a medida que son eluidos de la columna.
Propiedades
Rapidez de respuesta
Respuesta lineal
Estabilidad de la lnea base
Reproducibilidad de la respuesta
Alta sensibilidad
Detector de Conductividad Trmica (TDC)
Las conductividades trmicas de H
2
y He son aprox. 6-10 mayores que la de los
compuestos orgnicos o inorgnicos (Ej. H
2
O, H
2
S, N
2
O, CH
4
, C
6
H
6
).
Detector no selectivo, no destruye la muestra, poco sensible, universal.
Entrada
Salida
Anlisis de gas natural utilizando un detector de
Conductividad trmica
Qumica analtica
Detector de Ionizacin a la Llama (FID)
Compuestos
Orgnicos
+
Llama H
2

Intermedios
Inicos
CO
2
+ H
2
O
La corriente electrnica atraviesa la llama
Detector que destruye la muestra, aceptable sensibilidad, no responde al H
2
O, CO,
CO
2,
SO
2
, CS
2
, NH
3
, N
2
O, NO, NO
2
; solo a compuestos orgnicos.
Anlisis de solventes aromticos empleando el
Detector de ionizacin a la llama
Especfico para compuestos orgnicos que contienen N o P, tales como
aminas, plaguicidas carbamatos y organofosforados
Qumica analtica
Se genera un
plasma (600-800 C)
que produce
intermediarios
inicos con N o P.
Determinacin de plaguicidas oganonitrogenados y
Organofosforados utilizando el detector NPD
Altamente sensible a compuestos orgnicos que contienen grupos
electronegativos: halgenos, perxidos, quinonas, grupos nitro.

(N
2
generalmente)
Qumica analtica
Deteccin de plaguicidas organoclorados utilizando
El detector ECD
Detector de espectrometra de masas
1. Los analitos que emergen de la columna cromatogrfica son
bombardeados por un haz de electrones.



2. El ion molecular formado se fragmenta siguiendo un patrn de
fraccionamiento nico para cada especie qumica
ABCDE + e
-
ABCDE
.
+
+ 2 e
-
ABCDE
.
+
AB
.
+ CDE
+
ABCDE
.
+
AB
+
+ CDE
.
ABCDE
.
+
A
+
+ BCDE
.
3. Los fragmentos inicos formados son separados magnticamente
de acuerdo con sus relaciones masa/carga (M/Z).
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Espectrometro de masas de cuadrupolo
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m/Z = 108
m/Z = 80
m/Z = 79
- CO
- (CO + H)
20 40 60 80 100 120 0
m / Z
Espectro de masas
del o-cresol
Qumica analtica
Anlisis de contaminantes en el aire
Utilizando el detector de espectrometra de masas
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Qumica analtica
Qumica analtica
Componentes del aceite del limn
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
Qumica analtica
Qumica analtica
Esquema de un Cromatgrafo Liquido
Qumica analtica
Deposito de Fase mvil: Envase de Acero Inoxidable o Vidrio
de volmenes mayor a 500 mL.
Desgasificadores: Las burbujas de gases disueltos en la fase
mvil causan problemas de estabilidad en la presin, al igual
que la presencia de partculas de polvo, esto hace necesario:
Eliminar las burbujas mediante:
Agitacin y calefaccin
Vibracin
Purga con un gas inerte no soluble en la fase mvil
Aplicacin de vaco
Qumica analtica
Vlvula de distribucin de disolvente
Este componente permite realizar:
Elucin ISOCRATICA: se mantiene igual la composicin de la fase mvil durante todo
el barrido.
Fase mvil:
B = CH
3
CN
A = Buffer pH:3,5
Qumica analtica

Elucin en GRADIENTE: la fase mvil cambia en forma continua producto
de un programa de mezcla de 2 o mas solventes con diferentes polaridades a lo
largo de la corrida. Se obtiene mayor eficacia en la separacin.
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1: Alcohol bencilico
2: Fenol
3: 3,4-dimetoxiacetofenona
4: Benzoina
5: Benzoato de etilo
6: Tolueno
7: 2,6-dimetoxitolueno
8: 0-metoxibifenilo
Condiciones:
Columna C-18, 5 m,
0,46 x 25 cm.
Flujo: 1,0 mL/min
Sistemas de Bombeo
Funciones:
Qumica analtica
Detectores empleados en HPLC
Qumica analtica
Fase mvil
Al desecho
Deteccin de carbohidratos empleando
Un detector de indice de refraccin
Qumica analtica
Qumica analtica
Deteccin de aminas utilizando un
Detector UV-visible
Qumica analtica
Qumica analtica
Qumica analtica
Qumica analtica
Deteccin amperomtrica de Vitamina A
y beta-caroteno
Qumica analtica
Qumica analtica
Qumica analtica
Qumica analtica
Slicas
modificadas
quimicamente
Si-O-Si-O-Si-O-H
Qumica analtica
Si-O-Si-O-Si-O-Si-
Si-O-Si-O-Si-O- Si-
Algunas terminaciones OH son sustituidas
por radicales orgnicos

Se Nombra: radicaSilano

Qumica analtica
Cromatografa
Fase Normal

Fase estacionaria: Polar
Fase mvil: No Polar
Ej: Fase Estacionaria: silica,
Alumina, cianopropil, diol,
aminopropil
Fase Mvil: Hexano, Eter
Dietilico, isopropanol.
Cromatografa
Fase reversa

Fase Estacionaria: No polar
Fase Mvil: Polar
Ej: Fase Estacionaria: Octadecil Silano
(C18), octil silano (C8).
Fase Mvil: Agua, Buffer, Metanol, Etanol,
Acetonitrilo, Tetrahidrofurano o mezclas.
TIPOS DE CROMATOGRAFA LQUIDA SEGN LA POLARIDAD
DE LA FASE MVIL Y LA FASE ESTACIONARIA.
Las sustancias no-polares
eluyen primero y las ms
polares eluyen al final.
Las sustancias polares
eluyen primero y las menos
polares eluyen al final.
Seleccin del modo cromatogrfico apropiado
Primera seleccin
Fase reversa
Razones:

1) Es la modalidad mas robusta y reproducible. Las columnas son
ms estables y eficientes.

2) Se logra una mejor deteccin en esta modalidad , debido a los tipos
de solventes utilizados, especialmente con el detector UV.
3) Aunque muchos compuestos orgnicos tienen limitada solubilidad en
fases mvil polares, esto no representa una limitacin ya que solo ng o g
de la muestra con inyectados en la columna.
Qumica analtica
Qumica analtica
Qumica analtica
aminocidos
Plaguicidas
organofosforados