Cintica Enzimtica

Denise Godoy
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Processos Bioqumicos
ENZIMAS
Introduo
O conhecimento das propriedades cinticas
das enzimas importante para compreender
as transformaes que ocorrem no interior
das clulas que participam dos processos
fermentativos e tambm dos reatores
enzimticos.
Introduo
ENZIMA APLICAO
Proteases *Fabricao de aspartame
*Obteno de insulina humana a partir de insulina
suna
Amilase (Bacillus subtilis) *Indstria de fermentao alcolica *Produo de
glicose
Tripsina (pncreas animal) Amolecimento de carnes
Papana (mamo) e Bromelina (abacaxi) *Auxiliar digestivo
*Amolecimento de carnes
Pepsina (estmago animal) Auxiliar digestivo
Renina (estmago de bezerros) Fabricao de queijo
Pectinase (Aspergilus niger) Retirada de pectina na clarificao de sucos de
frutas
Tabela 1: Enzimas aplicadas na indstria
Introduo
Enzimas so protenas (seqncia de
aminocidos) com peso molecular muito
grande, e com propriedades catalticas. Na
maioria das vezes so protenas globulares
http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-
misc/anim/prot/estruc.html
Caractersticas
Produtos naturais biolgicos;
Alto grau de especificidade;
Reaes baratas e seguras;
Mecanismo turnover: desempenha funes
consecutivas;
Altamente eficientes: aceleram a velocidade das
reaes 10
8
a 10
11
vezes;
Econmicas: reduz a energia de ativao.
Caractersticas
mostrado na tabela 2 uma comparao
entre as caractersticas das enzimas e dos
catalisadores inorgnicos.
Caractersticas
mostrado na tabela 2 uma comparao
entre as caractersticas das enzimas e dos
catalisadores inorgnicos.
Caractersticas
CARACTERSTICA ENZIMAS
CATALISADORES
QUMICOS
1 Especificidadeao substrato Alta Baixa
2 Natureza da estrutura Complexa Simples
3 Sensibilidade temperatura Alta Baixa
4 Condies de reao (T, P e pH) Suaves Drsticas (geralmente)
5 Custo de obteno (isolamento e
purificao)
Alto Moderado
6 Natureza do processo Batelada/contnuo Batelada/contnuo
7 Consumo de energia Baixo Alto
8 Formao de subprodutos Baixa Alta
9 Reutilizaodo catalisador Simples/cara Simples
10 Atividade cataltica (temperatura
ambiente)
Alta Baixa
11- Presena de cofatores Sim No
12 Energiade ativao Baixa Alta
13 Velocidadede reao Alta Baixa
Tabela 2: Comparao entre as enzimas e os catalisadores inorgnicos.
Caractersticas
Stio ativo: regio especfica da superfcie
Constituda por grupos R de aminocidos;
Especificidade catalise enzimtica.
Especificidade Enzimtica
A caracterstica mais importante das enzimas
a elevada especificidade.
Muitas enzimas possuem um grupo limitado
de substratos, mas outras possuem uma
especificidade absoluta para um nico
substrato.
Especificidade Enzimtica
http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/conform.html
http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/quim.html
Especificidade Enzimtica
Como exemplo de especificidade enzimtica pode ser tomado a
hidrlise enzimtica do amido:
-amilase atua na amilose rompendo a ligao o-1,4 produzindo
maltose e glicose.
-glicosidase atua na o-1,6 produzindo amilose.
Com a atuao das duas enzimas no amido produzido maltose e
a glicose.
Amiloglicosidase ( ou glicoamilase ) atua na o-1,6 e o-1,4 de forma
a produzir tambm maltose e glicose a partir do amido.
Velocidade das Reaes
E + S ES EP E + P
Catalisador: | velocidade da reao NO
afetamo equilbrio.
Diagrama de coordenadas da reao:
http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/enz/e-t.html
Atividade Enzimtica
Medida da atividade velocidade da reao;
Dosagem
Amostra + | concentraes de substrato;
Velocidade da reao Unidades
Internacionais (U);
U = quantidade de enzima capaz de formar 1
mol de P por minuto em condies timas;
Atividade especfica = U
mg de protena
Influncia do pH
Valor de pH timo =atividade mxima;
Velocidade da reao: + pH afasta do timo;
Influncia do pH
pH 5 e 8 = no afeta a
atividade;
Declnio entre pH 6,8-8
e 6,8-5 = forma inica no
adequada;
5 > pH > 8 = inativao
irreversvel.
Influncia da Temperatura
| T | velocidade de reao = | energia
cintica;
T muito elevadas =desnaturao da enzima
Rompidas as pontes de hidrognio alteraes
estruturas =nova conformao;
T desnaturao pouco acima da T tima.
Influncia da Temperatura Influncia da Temperatura
Enzimas so termolbeis reao
enzimtica =inativao trmina
Efeito da T na velocidade das reaes
coeficiente de temperatura
Velocidade | quando a T | 10C.
10
log 3 , 2
10 1 2
Q T T R
E
a

=
RT
e k k

=
'
0
'
CINTICA ENZIMTICA
Objetivos
Medir velocidade das transformaes;
Estudar a influncia das condies de trabalho;
Correlacionar: velocidades fatores;
Otimizao do processo;
Critrios para o controle;
Projetar o reator mais adequado.
Influncia do Substrato
Concentrao de substrato [S]: afeta a
velocidade da reao;
Efeito de [S]: varia durante o curso de uma
reao S P;
Velocidade inicial (V
0
): [S] >> [E] tempo
muito curto [S] =constante.
Influncia do Substrato
[E] =cte
+ [S] =V
0
| linear
| [S] =V
0
|
V
0
=V
mx
Influncia do Substrato
Alguns casos a V
0
no pode ser medida
No existe tcnica experimental;
Equao qumica no representa a
transformao;
Velocidade da reao:
Velocidade mdia de consumo ou produo;
Variao de uma propriedade no sistema.
Influncia do Substrato
Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para
formar ES passo obrigatrio;
Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)
E combina-se reversivelmente com S ES
k
1
E + S ES
k
-1
ES se rompe E e P
k
2
ES E + P
Influncia do Substrato
Qualquer instante da reao: E e ES;
[S] + =velocidade da reao [S];
V
mx
=todas as molculas de E estiverem na
forma ES enzima saturada;
| [S]: estado pr-estacionrio | ES;
Estado estacionrio [ES] =cte;
V
0
estado estacionrio.
Equao Michaelis-Menten
Curva: possui a
mesma forma para a
maioria das enzimas;
Expressa pela
Equao de Michaelis
e Menten;
Hiptese: limitante quebra de ES E + P.
Equao Michaelis-Menten
Equao da velocidade para uma reao
catalisada enzimaticamente e com um nico
substrato;
Relao quantitativa entre a V
0
, a V
mx
e a [S]
inicial relacionadas atravs de K
m
.
| |
| | S K
S V
V
m
mx
+

=
0
Equao Michaelis-Menten
Relao numrica:
V
0
metade de V
mx
;
k
m
=afinidade pelo
substrato;
KK
mm
afinidade afinidade
mx
V V =
2
1
0
V
mx
proporcional [E].
Significado de K
m
e V
mx
Equao Michaelis e Menten = dependncia
hiperblica;
Mecanismos de reao diferentes catalisam
reaes com6 ou 8 passos;
Significado e magnitude de V
mx
e K
m
varia;
K
m
: depende de aspectos especficos do
mecanismo de reao.
Parmetros Cinticos
Lineweaver-Burk
| |
mx mx
m
V S V
K
V
1 1 1
+ =
Parmetros Cinticos
Mtodo de Hanes
| |
| | S
V V
K
V
S
mx mx
m
1
+ =
Parmetros Cinticos Parmetros Cinticos
Mtodo de Eadie-Scatchard
| | S
V
K V V
m mx
=
Parmetros Cinticos
Exemplo:
[S] (g/L) V
o
(g/L.h)
0,25 0,78
0,51 1,25
1,03 1,66
2,52 2,19
4,33 2,35
7,25 2,57
0,0
1,0
2,0
3,0
0 2 4 6 8
[S] (g/L)
V
o

(
g
/
L
.
h
)
Parmetros Cinticos Parmetros Cinticos
Exemplo: Lineweaver-Burk
y =0,228x +0,3668
R
2
=0,9991
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1 2 3 4 5
1/[ S] (L/g)
1
/
V
o

(
L
.
h
/
g
)
| |
| |
L
g
K
V
K
h L
g
V
V
S V
V S V
K
V
m
mx
m
mx
mx
mx mx
m
622 , 0 228 , 0
73 , 2 3668 , 0
1
Portanto,
3668 , 0
1
228 , 0
1
1 1 1
0
0
= =

= =
+ =
+ =
Parmetros Cinticos Parmetros Cinticos
Exemplo: Mtodo de Hanes
y =0,3595x +0,2419
R
2
=0,9993
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 2 4 6 8
[ S] (g/L)
[
S
]
/
V
o

(
h
)
| |
| |
| |
| |
L
g
K
V
K
h L
g
V
V
S
V
S
S
V V
K
V
S
m
mx
m
mx
mx
mx mx
m
672 , 0 2419 , 0
78 , 2 3595 , 0
1
Portanto,
3595 , 0 2419 , 0
1
0
0
= =

= =
+ =
+ =
Reao de 1 Ordem
[S] << K
m
k = constante de velocidade de 1 ordem
(min
-1
)
| |
m
mx
K
S V
V =
0
| | S k V =
0
[S] + V
0
+
Frao constante de S P
| |
| | dt S
S d
k
1
=
Reao de 1 Ordem
Determinar S utilizado
ou P formado durante
qualquer intervalo de
tempo Equao
integrada de 1 ordem.
| |
| |
( )
0
0
log 3 , 2 t t k
S
S
=
Reao de 1 Ordem
t
1/2
= tempo de
meia vida tempo
necessrio para
converter em P
metade do S
presente.
k
t
693 , 0
2
1
=
Reao de Ordem Zero
[S] >> K
m
| |
| | S
S V
V
mx
=
0
mx
V V =
0
Inibio Enzimtica
Inibio Enzimtica
Um inibidor uma substncia que reduz a
atividade de uma enzima.
H 2 tipos de inibio:
Reversvel
Irreversvel
Inibio Enzimtica
Inibio Irreversvel
O inibidor se liga covalentemente ao stio ativo da
enzima. Ele pode agir de modo a destruir o stio
ativo.
Inibio Enzimtica
Inibio Reversvel
Ligao no-covalente ao stio ativo da enzima.
A atividade pode ser restaurada removendo o
inibidor.
Inibio Competitiva (IC)
Inibio Acompetitiva (IA)
Inibio No-Competitiva (INC)
Inibio pelo Substrato
E +S ES E +P
k
b
k-
b
k
cat
+
I

k
i
EI
+
I

k
i
EIS
IC
IA
+S
IN
C
Inibio Enzimtica
Inibio Competitiva
Afeta a afinidade ES; muda o km mas no muda
Vmx;
S e I competem pelo mesmo stio de ligao;
I e S so mutuamente excludentes por
impedimento estrico;
A ligao do I ou do S provoca mudana de
conformao que no permite a ligao de outro
S ou I, logo no tem a possibilidade de forma
ESI.
Inibio Enzimtica
Inibio Competitiva
Inibio Enzimtica
Inibio Competitiva
Inibio Enzimtica
Inibio Competitiva
Inibio Enzimtica
Inibio Competitiva
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
s, g/L
v
,

1
/
h
com inibio competitiva
alfa=0
alfa=2
alfa=4
alfa=6
alfa=8
alfa=10
Inibio Enzimtica
Inibio Competitiva
Inibio Enzimtica
Inibio Acompetitiva
Inibio Enzimtica
Inibio Acompetitiva
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
s, g/L
v
,

1
/
h
Com inibio acompetitiva
alfa=1
alfa=2
alfa=4
alfa=6
alfa=8
alfa=10
Inibio Enzimtica
Inibio Acompetitiva
Inibio Enzimtica
Inibio No-competitiva
Inibio Enzimtica
Inibio No-competitiva
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
s, g/L
v
,

1
/
h
Com inibio no-competitiva
alfa=alfai
alfa=2 alfai=1.5
alfa=4 alfai=3
alfa=6 alfai=5
alfa=8 alfai=6.5
alfa=10 alfa=8
Inibio Enzimtica
Inibio No-competitiva
Inibio Enzimtica
Inibio pelo Substrato
Ocorre em altas concentraes de substrato
em 20% de todas as enzimas conhecidas (p.
ex., a invertase inibida pela sacarose).
causado por mais de uma molcula se
ligando a diferentes substios do stio ativo.
Se o complexo resultante inativo, esse
tipo de inibio causa uma reduo na taxa
de reao.
Inibio Enzimtica
Inibio pelo Substrato