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OFICINA ESPAOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAA
11

Nmero de publicacin: 2 212 904


21

Nmero de solicitud: 200300089


51

Int. Cl.
7
: A61K 9/16
A61K 31/7048
A61P 31/10
A61P 33/02
12

SOLICITUD DE PATENTE A1
22

Fecha de presentacin: 15.01.2003


43

Fecha de publicacin de la solicitud: 01.08.2004


43

Fecha de publicacin del folleto de la solicitud:


01.08.2004
71

Solicitante/s: Universidad Complutense de Madrid


Rectorado. Avenida de Sneca, n 2
28040 Madrid, ES
72

Inventor/es: Torrado Durn, Juan Jos;


Torrado Durn, Santiago;
Snchez-Brunete, Jos Antonio;
Bols Fernndez, Francisco;
Dea-Ayuela, M Auxiliadora;
Rama-Iiguez, Sara y
Aluda Rodrguez, Jos Mara
74

Agente: No consta
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Ttulo: Microesferas de anfotericina B.


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Resumen:
Microesferas de anfotericina B.
Se describe un nuevo proceso de obtencin de microes-
feras hidrodispersables de albmina que contengan anfo-
tericina B. El proceso se basa en la atomizacin de la al-
bmina con el frmaco a microencapsular. No se necesita
la formacin previa de una emulsin por lo que el proce-
so es industrialmente muy interesante ya que se puede
evitar la utilizacin de disolventes orgnicos y aceites. La
atomizacin es un proceso continuo y rpido que se pue-
de realizar en condiciones de asepsia lo que permite ob-
tener productos aptos para la administracin parenteral.
Las microesferas obtenidas tienen un tamao de partcu-
la pequeo (generalmente menores a 5 micrmetros) y
son hidrodispersables, por lo que se pueden administrar
por va intravenosa. Estudios realizados en animales de
experimentacin han demostrado que la nueva formula-
cin de anfotericina B es menos txica que la actualmente
comercializada de Fungizona y ms ecaz para el trata-
miento de leishmaniosis experimental en cricetos.
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Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. C/Panam, 1 28036 Madrid
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DESCRIPCIN
Microesferas de anfotericina B.
Objeto de la invencin
Nueva formulacin de antofericina B obtenida mediante atomizacin de microesferas hidrodispersables consti-
tuidas por albmina y conteniendo el frmaco anfotericina B para su aplicacin en el tratamiento de micosis y de
enfermedades parasitarias como leishmaniosis.
Estado de la tcnica
La anfotericina B es el cido (19E,21E,23E,25E,27E,29E,31E) - (1R,3S,5R, 6R,9R,11R,15S,16R,17R,18S,33R,35S,
36R,37S) - 33 [(3-amino-3,6-didesoxi--D-manopixranosil)oxi] - 1,3,5,6,9,11,17,37 - octahidroxi - 15,16,18 - trimetil
- 13 - oxo - 14,39-dioxabiciclo - [33.3.1] - nonatriaconta - 19,21,23,25,27,29,31 - heptaeno - 36 - carboxlico. Su
frmula emprica es C
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H
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NO
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(Real Farmacopea Espaola, 2 edicin, 2002).
La anfotericina B es un frmaco utilizado en la prctica clnica, tanto en seres humanos como en animales, con dos
indicaciones fundamentales (Catlogo de Especialidades Farmacuticas, 2002):
- En el tratamiento de cuadros de leishmaniosis, tanto mucocutnea como visceral
- Como antimictico, en el tratamiento de infecciones fngicas.
Se administra principalmente por va parenteral. No obstante, tambin se emplea en el tratamiento local de piel,
mucosas y tracto digestivo, para lo cual se aplica por medio de formas farmacuticas diversas como comprimidos,
suspensiones, emulsiones, colirios o aerosoles.
La diana farmacolgica de la anfotericina B es el episterol y el 5-dehidroepisterol presente en las membranas celu-
lares de algunos protozoos, entre ellos los del gnero Leishmania, as como el ergosterol existente en las membranas
celulares de los hongos.
La molcula de anfotericina B tiene la capacidad de asociarse al ergosterol, al episterol y al 5-dehidroepisterol.
Cuando se forma el complejo anfotericina-esterol, se produce una alteracin en la estructura de la membrana celular.
Como consecuencia de esa desestructuracin, y de la naturaleza parcialmente hidrofbica y parcialmente hidrolica
del frmaco, se altera la permeabilidad de la membrana y se forman en ella una serie de poros, crteres y canales a
travs de los cuales salen al espacio extracelular iones y elementos imprescindibles para el mantenimiento de la vida
celular (A.B.Mullen et al, Antimicrob. Agents Chemother. 41, 2089-92, 1997). Semejante alteracin de la permeabilidad
de la membrana y prdida de componentes vitales conducen a la muerte de la clula. Por otra parte, se aprecia en
ocasiones que la administracin de la anfotericina B produce un efecto estimulante sobre el sistema inmunitario (J.E.
Wolf et al, Infect. Immun. 5, 1296-300, 1990).
Desde el punto de vista teraputico, la anfotericina B presenta el inconveniente importante de tener propensin
a unirse tambin al colesterol de las membranas celulares de mamferos, con las mismas consecuencias que cuando
se asocia al ergosterol y a los episteroles. La anidad por el colesterol es mucho menor que por estos ltimos, y
por ello es un frmaco vlido para la prctica clnica (I.Gruda et al, Biochem. Cell Biol. 65, 234-8, 1987), pero
desafortunadamente las concentraciones ptimas ecaces para combatir las infecciones fngicas o protozoarias pueden
ocasionar una notable toxicidad al hospedador.
Las reacciones adversas ocasionadas por la anfotericina B son frecuentes e importantes, tanto a corto como a
largo plazo. A corto plazo, las reacciones adversas ms frecuentes son de diversa ndole: digestivas (nuseas, vmitos,
anorexia, dispepsia, calambres abdominales y dolor abdominal), sanguneas (anemia), urinarias (insuciencia renal,
acidosis tubular renal, nefrocalcinosis y anuria), metablicas (hipopotasemia), neuropsiquitricas (cefalea y malestar
general), osteomusculares (mialgia y artralgia), alrgicas, y febriles.
Raramente pueden aparecer otros efectos adversos, que van asociados generalmente a una sobredosicacin y que
pueden ser de extrema gravedad: hepatobiliares (hepatitis, ictericia colesttica e incremento de los valores sanguneos
de transaminasas y de fosfatasa alcalina), cardiovasculares (arritmias, cambios bruscos en la tensin arterial, sofocos
e incluso paro cardaco), respiratorios (disnea, edema pulmonar y espasmos bronquiales), oculares (visin borrosa y
diplopa), y otorrinolaringolgicos (sordera, alteraciones del equilibrio y tinnitus).
El tratamiento prolongado con anfotericina B conduce en un porcentaje muy elevado de casos a los efectos secun-
darios siguientes:
- Nefrotoxicidad, que a veces deriva en insuciencia renal: a medida que se prolonga el tratamiento se va produ-
ciendo un dao glomerular y tubular progresivo, y como consecuencia aumenta la excrecin urinaria de sodio,
potasio y magnesio, con el consiguiente riesgo de hipopotasemia, hipomagnesemia e hiponatremia. Por ello
conviene que exista un control peridico de los valores de nitrgeno ureico y de creatinina srica.
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- Anemia normoctica normocrmica: suele ser reversible, y posiblemente debida a la rotura de membranas de
los glbulos rojos y a una disminucin en la produccin de eritropoyetina.
Con frecuencia, las dosis de anfotericina B administradas son inferiores a las ptimas con el n de prevenir la
aparicin de reacciones adversas excesivamente graves, tanto a corto como a medio plazo (V.Yardley et al, Antimicrob.
Agents Chemother. 41, 752-6, 1997).
Los efectos adversos ocasionados por el tratamiento con anfotericina B han incitado a buscar alternativas con el
n de mejorar la relacin entre su actividad farmacodinmica y la toxicidad que produce.
El tratamiento clsico con anfotericina B, tanto en cuadros de leishmaniosis como de micosis sistmicas, se rea-
liza por infusin endovenosa de dispersiones del frmaco estabilizadas con agentes suspensores. Es de este tipo la
especialidad farmacutica Fungizona

, autorizada en Espaa desde 1974, que es una suspensin estabilizada con


desoxicolato de sodio. En los ltimos aos, se han autorizado en Espaa nuevas formulaciones que mejoran la re-
lacin benecio/riesgo del principio activo: Ambisome

(comercializada en Espaa por Nextar Farmacutica des-


de 1996), Abelcet

(Elan Farma, desde 1996), Amphocil

(Almirall Prodesfarma, desde 1999), y Anfotericina B


Combinopharm

(Combinopharm, desde 2002).


En la especialidad farmacutica Ambisome

, el frmaco se encuentra atrapado en liposomas unilaminares com-


puestos por fosfatidilcolina hidrogenada de soja, colesterol, diestearoilfosfatidilglicerol y -tocoferol. En Abelcet

,
el principio activo est en suspensin formando un complejo lipdico con fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol. En
Amphocil

y Anfotericina B Combinopharm

, se forma una suspensin estabilizada por asociacin de la anfotericina


B con sulfato sdico de colesterilo.
Pero estos nuevos medicamentos, tan ventajosos desde el punto de vista teraputico, presentan el inconveniente
de su elevado coste econmico (C.Prieto et al Revista Espaola de Salud Pblica 74, 351-9, 2000). Hay estudios
farmacoeconmicos que indican que el tratamiento de un ser humano de 70 kilogramos de peso con la dosis media
de anfotericina B cuesta entre 10 y 50 veces ms con estas especialidades que con la Fungizona, y esto limita su uso
(A. Wong-Beringer et al, Clin. Infect. Dis. 27, 603-18, 1998). Hay pases desarrollados que no los reconocen como
tratamientos de primera lnea si no es para personas que son intolerantes a la Fungizona o cuyas condiciones las hacen
especialmente vulnerables (J.H.Rex et al, Clin. Infect. Dis. 29, 1408-10, 1999). En los pases en vas de desarrollo, los
tratamientos con ese precio no pueden ser siempre administrados (S.Sundar et al, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg 94,
200-4, 2000). En la leishmaniosis canina el empleo de anfotericina B liposoma ha producido inconsistentes (Oliva,
2000, Canine leishmaniasis: treatment and follow-up, DG-EC), adems de la nefrotoxicidad asociada al empleo de
anfotericina B libre.
Con el objeto de obtener una nueva formulacin de antofericina B con baja toxicidad, fcil de realizar industrial-
mente y ecaz para el tratamiento de la leishmaniosis visceral, se ha desarrollado un proceso de microencapsulacin
de anfotericina B en albmina obtenindose microesferas hidrodispersables para administracin intravenosa.
Descripcin de la invencin
Microesferas de anfotericina B.
La presente invencin se reere a un nuevo procedimiento de vehiculizacin de la anfotericina B en albmina. El
sistema propuesto se basa en la formacin de microesferas de albmina que tengan incorporada en su estructura la an-
fotericina B. La fabricacin de estas microesferas se realiza por un proceso de secado continuo mediante atomizacin.
Este es un proceso industrial muy rentable que adems permite trabajar en condiciones aspticas, requisito ste muy
importante para la preparacin de medicamentos para aplicacin parenteral.
El proceso que se propone se basa en la preparacin de una suspensin de anfotericina B en una solucin de
albmina. Esta mezcla se atomiza, y por este proceso se obtienen pequeas partculas, de tamao generalmente menor
de 5 micrmetros, y fcilmente hidrodispersables, lo que permite la administracin parenteral. Es importante resaltar
que el proceso propuesto permite la obtencin de las microesferas sin necesidad de utilizar disolventes orgnicos en
los procesos de lavado o extraccin, ni aceites para la elaboracin de emulsiones, caractersticas estas frecuentes en
otros procedimientos de microencapsulacin, por lo que el proceso es fcil de realizar industrialmente y sin riesgo de
accidentes.
La formulacin de anfotericina B en el seno de microesferas de albmina ha demostrado ser de inters en el
tratamiento de la leishmaniosis visceral. Aunque todava no se han llevado a cabo estudios de la relacin entre ecacia
y aparicin de efectos adversos en el tratamiento de leishmaniosis mucocutnea y de infecciones fngicas sistmicas,
es posible que tambin pueda ofrecer ventajas en el tratamiento de estas afecciones.
La formulacin objeto de patente ha demostrado tener una mayor ecacia y una menor toxicidad que la Fungizona

,
que es la especialidad farmacutica clsicamente utilizada en el tratamiento con anfotericina B de la leishmaniosis vis-
ceral. A igual dosis (2 miligramos de anfotericina B por kilogramo de peso), ha demostrado ser mucho ms ecaz
en el tratamiento de cricetos infectados experimentalmente. De igual modo, ha demostrado menor toxicidad aguda,
dado que dosis de 5 mg./Kg. de Fungizona

administrada por va endovenosa en bolus producen la muerte en pocos


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minutos de los animales enfermos tratados, los cuales aguantan, sin ningn signo aparente de alteracin, tratamientos
realizados tambin por va endovenosa y con igual velocidad de inyeccin, de microesferas de albmina con anfoteri-
cina B en cantidad equivalente a 20 mg/Kg. de anfotericina B, y sobreviven a dosis de 40 mg./Kg. de peso.
La otra especialidad farmacutica a base de anfotericina B comercializada y que tiene entre sus indicaciones el
tratamiento de la leishmaniosis es el Ambisome

. An no se han comparado la ecacia y la toxicidad con respecto


a este medicamento. No obstante, hay ocasiones en las que no se emplea el Ambisome

por su coste econmico,


recurrindose a Fungizona

o a otros medicamentos a base de otros principios activos. El coste econmico de la fabri-


cacin de las microesferas puede ser muy inferior al de la fabricacin de los liposomas (que es la forma farmacutica
de Ambisome

), lo que permitira disponer de una alternativa teraputica mejor que Fungizona

y con menores cos-


tes que Ambisome

. Por otro lado, las microesferas al ser formulaciones slidas tendrn mejor estabilidad que las
formulaciones semislidas de liposomas.
Las dems especialidades farmacuticas con anfotericina B comercializadas no incluyen actualmente entre sus
indicaciones el tratamiento de la leishmaniosis visceral, pero presentan los mismos inconvenientes que Ambisome

.
Modo de realizacin de la invencin
El proceso de fabricacin de microesferas de albmina con anfoterina B incorporada en su molcula consiste en
un proceso de secado continuo mediante atomizacin.
A continuacin se ilustra la invencin mediante los siguientes ejemplos de preparacin de microesferas de anfo-
tericina B y de los resultados concretos de ecacia y toxicidad obtenidos con estas partculas. Estos ejemplos son
simplemente ilustrativos pero no limitativos del alcance de la invencin.
Ejemplo 1
Para preparar microesferas de microesferas de anfotericina B con albmina humana en proporcin 1:5, se atomiza
una suspensin de anfotericina B en una solucin acuosa estril de albmina (Behring de laboratorios Aventis) en un
atomizador Bchi (modelo B191). El proceso de atomizacin y la desnaturalizacin trmica de la albmina se realiza
en las siguientes condiciones:
- Temperatura de secado en cmara: 165 1

C.
- Temperatura de salida de la cmara de secado: 99 2

C.
- Presin de nebulizacin: 800 Nl/h.
- Flujo de alimentacin: 3,2 ml/min.
- Aspiracin de aire: 75%
Las partculas as obtenidas tienen un dimetro medio de 2,2 micrmetros, supercie lisa y son fcilmente hidro-
dispersables.
Ejemplo 2
Se realiz un estudio de la ecacia de la nueva formulacin en cricetos dorados, del tipo Syrian golden, todos
ellos de sexo masculino y de edad similar, los cuales fueron infectados mediante inyeccin por va intracardaca con
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promastigotes de Leishmania infantum M/CAN/ES/96/BCN 150. Los animales se mantuvieron en todo momento
con disponibilidad total de alimento y de bebida. En la sexta semana despus de la infeccin, se tomaron muestras
de sangre por sangrado retroorbital para determinar el nivel de anticuerpos en suero y, a partir de los datos obtenidos,
se clasicaron en lotes uniformes en funcin del ttulo de anticuerpos. Uno de los lotes no recibi tratamiento alguno
y se mantuvo como control, mientras que un segundo lote fue tratado con Fungizona endovenosa y el tercero con
microesferas de albmina con anfotericina B en los das 69, 71 y 73 post-infeccin. En cada uno de estos das, se
administr la formulacin correspondiente a travs de inyeccin por va intracardaca. Pasados 77 das desde el ltimo
da de tratamiento (da 150 post-infeccin), los cricetos fueron eutanasiados y se contabiliz el nmero de formas
parasitarias presentes en el hgado y en el bazo. Los resultados se resumen en la Tabla I:
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TABLA I
Fungizona, Formulacin,
Tratamiento Control no tratado 2mg/Kg de 2mg/Kg de
anfotericina B anfotericina B
N

de parsitos por 11,2x10


8
3,9x10
8
4,0x10
8
1,5x10
8
1,1x10
8
2,2x10
8
mg. de bazo
N

de parsitos por 69,0x10


8
3,1x10
8
27,5x10
8
4,0x 10
8
2,8x10
8
4,9x10
8
mg. de hgado
Reduccin del n

de parsitos 64,3% 89,9%


en bazo respecto al control
Reduccin del n

de parsitos 60,1% 95,9%


en hgado respecto al control
Ejemplo 3
Se desarroll un segundo estudio de ecacia igual que el estudio de ecacia del ejemplo 2 con la nica salvedad de
que uno de los lotes recibi la formulacin de microesferas de albmina con anfotericina B en una cantidad equivalente
a 40 miligramos de anfotericina B por kilogramo de peso del animal (dosis que con la nueva formulacin propuesta es
tolerable por el animal, mientras que con la formulacin convencional de Fungizona el lmite de toxicidad aceptable
est en 2 mg/kg). Los resultados se muestran en la Tabla II:
TABLA II
Control Fungizona, Formulacin,
Tratamiento Control no tratado microesferas vacias 2 mg/Kg de 40 mg/Kg de
anfotericina B anfotericina B
N

de parsitos por 8,5x10


4
11,7x10
4
12,0x10
4
10,3x10
4
0,7x10
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1,0x10
4
0 0
mg. De bazo
N

de parsitos por 5,1x10


4
7,7x10
4
4,6x10
4
1,6x10
4
1,9x10
4
2,7x10
4
296 363
mg. De hgado
Reduccin del n

de parsitos 0% 77,4% 100,0%


en bazo respecto al control
Reduccin del n

de parsitos 9,09% 71,1% 99,9%


en hgado respecto al control
Ejemplo 4
Se realiz un estudio de toxicidad aguda de la formulacin obtenida en cricetos dorados, todos ellos de sexo mas-
culino y de edad similar, los cuales fueron infectados mediante inyeccin por va intracardaca con 10
7
promastigotes
de Leishmania infantum BCN 150. Los animales se mantuvieron en todo momento con disponibilidad total de alimen-
to y de bebida. En la sexta semana despus de la infeccin, se tomaron muestras de sangre por sangrado retroorbital
para determinar el nivel de anticuerpos en suero y, a partir de los datos obtenidos, se clasicaron en lotes uniformes
de 6 unidades en funcin del ttulo de anticuerpos.
En el da 69 post-infeccin, cada lote recibi uno de los tratamientos indicados en la tabla recogida a continuacin
y se valor la mortalidad (si los animales resistan o moran) en las 24 horas siguientes a la inyeccin.
Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla III donde se observa que para la Fungizona una dosis de 5
mg/kg resulta mortal despus de 24 horas mientras que para la anfotericina B microencapsulada la supervivencia es
del 100% con dosis hasta 40 mg/kg.
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TABLA III
Tratamiento Dosis N

de cricetos N

de supervivientes % de supervivencia
1 mg/Kg 6 6 100%
Fungizona

2 mg/Kg 6 6 100%
5 mg/Kg 6 0 0%
1 mg/Kg 6 0 100%
2 mg/Kg 6 0 100%
Formulacin 5 mg/Kg 6 0 100%
10 mg/Kg 6 0 100%
20 mg/Kg 6 0 100%
40 mg/Kg 6 0 100%
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REIVINDICACIONES
1. Nueva formulacin de anfotericina B, caracterizada porque est formada por microesferas de albmina que
tienen incorporada en su estructura la anfotericina B.
2. Nueva formulacin de anfotericina B, segn la reivindicacin 1, caracterizada porque su elaboracin se realiza
mediante un proceso de secado continuo por atomizacin.
3. Nueva formulacin de anfotericina B, segn la reivindicacin 2, caracterizada por la obtencin de micropart-
culas hidrodispersables.
4. Uso de la nueva formulacin de anfotericina B, segn las reivindicaciones anteriores, para la fabricacin de un
medicamento til en el tratamiento de micosis y enfermedades parasitarias como la leishmaniosis.
5. Uso, segn reivindicacin 4, cuya administracin se realiza por va parenteral.
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OFICINA ESPAOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAA
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N de solicitud: 200300089
22

Fecha de presentacin de la solicitud: 15.01.2003


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Fecha de prioridad:
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TCNICA
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Int. Cl.
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: A61K 9/16, 31/7048, A61P 31/10, 33/02
DOCUMENTOS RELEVANTES
Categora Documentos citados Reivindicaciones
afectadas
Categora de los documentos citados
X: de particular relevancia
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la
misma categora
A: reeja el estado de la tcnica
O: referido a divulgacin no escrita
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentacin
de la solicitud
E: documento anterior, pero publicado despus de la fecha
de presentacin de la solicitud
El presente informe ha sido realizado

para todas las reivindicaciones



para las reivindicaciones n:
Fecha de realizacin del informe Examinador Pgina
01.07.2004 N. Vera Gutirrez 1/1
Y WO 2000047187 A (KINETANA INC.) 17.08.2000, pgina 1, 1-5
lnea 1 - pgina 7, lnea 18; reivindicaciones 1,2,5-7,9,10,13.
Y TORRADO DURN, J.J. "Microcpsulas, microesferas y nanopartculas 1-5
de albmina como nuevos sistemas de administracin de
medicamentos". Farmacia Clnica, 1989, 6 (10), pginas 724-733,
ISSN 0212-6583, todo el documento.
A PAVANETTO, F. y otros "Spray-dried albumin microspheres for the 1-5
intra-articular delivery of dexamethasone". Journal of
Microencapsulation, 1994, 11 (4), pginas 445-454,
ISSN 0265-2048.
A LI, F.Q. y otros iprooxacin-loaded bovine serum albumin 1-5
microspheres: preparation and drug-release in vitro". Journal of
Microencapsulation, 2001, 18 (6), pginas 825-829,
ISSN 0265-2048.