BQ24

i
UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS

CARRERA: INGENIERA BIOQUMICA

TRABAJO DE INVESTIGACIN

ESTANDARIZACIN DE LOS PARMETROS DE VALIDACIN DE UN
MTODO ANALTICO PARA CUANTIFICAR LA CONCENTRACIN DE
METANOL EN BEBIDAS ALCOHLICAS UTILIZANDO CROMATOGRAFA
DE GASES

Trabajo de Investigacin (Graduacin), Modalidad: Trabajo Estructurado de
Manera Independiente (TEMI) presentado como requisito previo a la obtencin
del Ttulo de Ingeniero Bioqumico otorgado por la Universidad Tcnica de
Ambato a travs de la Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos.

David Luna
Tutor: Dr. Roman Rodrguez Ph.D.

Ambato, 2012

ii

APROBACIN DEL TUTOR

Dr. Roman Rodrguez.

En mi calidad de Tutor del Trabajo de Investigacin realizado bajo el tema:
DE GASES, de la egresado Eduardo David Luna Ortiz; considero que dicho
trabajo investigativo rene los requisitos y mritos suficientes para ser sometido
a la evaluacin del J urado Examinador designado por el H. Consejo Directivo
de la Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos.
Ambato, J ulio de 2012

Dr. Roman Rodrguez.

TUTOR

iii

AUTORA DEL PROYECTO

La responsabilidad del contenido del Proyecto de Investigacin, corresponde
exclusivamente a Eduardo David Luna Ortiz; Dr. Romn Rodrguez, Tutor del
trabajo de Investigacin ESTANDARIZACIN DE LOS PARMETROS DE
VALIDACIN DE UN MTODO ANALTICO PARA CUANTIFICAR LA
CONCENTRACIN DE METANOL EN BEBIDAS ALCOHLICAS
UTILIZANDO CROMATOGRAFA DE GASES , y el patrimonio intelectual de
la misma a la Universidad Tcnica de Ambato.

David Luna


iv

APROBACIN DEL TRIBUNAL DE GRADO
UNIVERSIDAD TCNICA DE AMBATO
FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERA EN ALIMENTOS
CARRERA DE INGENIERA EN ALIMENTOS

Los miembros del Tribunal de Grado aprueban el presente Trabajo de
Graduacin de acuerdo a las disposiciones emitidas por la Universidad Tcnica
de Ambato.


Para constancia firman:

PRESIDENTE DEL TRIBUNAL

MIEMBRO DEL TRIBUNAL MIEMBRO DEL TRIBUNAL

v

DEDICATORIA
A mi Anita, por inspirarme con el ejemplo a no rendirme, y si caigo levantarme
las veces que sean necesarias, para cumplir las metas, de verdad madre que
afortunado que soy por tenerte junto a m, tu apoyo, comprensin y amor han
sido vitales para este proceso.

A mi papi si bien no ests fsicamente a mi lado pero tu energa siempre la he
sentido, de seguro te hubiera encantado estar ac,

A mis hermanos Fer y Juanjo, incondicionales, ejemplo, y sobre todo paciencia,
entre juegos, disputas, y alegras cada momento junto a ustedes ha sido
enriquecedor.

A Liliana, sin ti hubiera sido mucho ms difcil, tu comprensin en momentos de
tensin y tus consejos siempre los he sabido escuchar, tu paciencia y tu cario
mi mejor inspiracin en tiempos de angustia, y emocin en los de alegra.

A Roman, por creer en m, amigo incondicional, leal, bohemio, loco en un
mundo de normales y soador, tus consejos acertados me han guiado por el
camino correcto, ensendome a ser humano.

A Sofa mi cuada buena amiga y consejera, y por supuesto a mi sobrino Ariel,
la alegra de mis ojos.

A mi familia en general, abuelos , abuelas, tos, tas, primos, primas, y dems.

A mis amigos, Jacobo, Roberto, Alberto, Cristian, Daniela, Juan Carlos Prez,
Juan Carlos Cceres, Diana, Gaby, Andrea, Rafaela, Mirari, Arita, Rosala,
pendencieros, luchadores y soadores, en su momento han sido
extremadamente importantes para m.

A todos los que han aportado en m, sabidura y conocimiento, Gracias Totales

David Luna

vi

AGRADECIMIENTO

A mi Madre sin vos muy difcil, hacer esto posible.

A mis hermanos de verdad son grandes en mi vida.

A mis amigos cada uno importante a su manera.

Al Laboratorio de Anlisis y control de alimentos, LACONAL, a todo su equipo
de trabajo, por el apoyo y facilidad de trabajo.

A la universidad Nacional de Jujuy y su facultad de Ingeniera, el inicio de este
trabajo.

A los profesores que trascendieron y fueron ms que simple guas.

A la industria Licorera Asociadas ILA, por confiar en este trabajo.

Y a todos los que de una u otra manera creyeron que era posible escribir mi
propia historia.

David Luna

1
ndice

RESUMEN EJECUTIVO .................................................................................... 6
CAPITULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACION ...................................................................................................... 7
1.1. TEMA DE INVESTIGACIN ................................................................................................................... 7
1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.......................................................................................................... 7
1.2.1. Contextualizacin macro, meso y micro. .............................................................................. 8
1.2.2. Anlisis Crtico ................................................................................................................... 11
1.2.3. Prognosis ........................................................................................................................... 12
1.2.4. Formulacin del Problema ................................................................................................. 12
1.2.5. Preguntas directrices ......................................................................................................... 13
1.3. JUSTIFICACIN ............................................................................................................................... 14
1.4. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 15
1.4.1. General .............................................................................................................................. 15
1.4.2. Especficos ......................................................................................................................... 15
CAPITULO II
MARCO TEORICO .......................................................................................... 16
2.1 ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS ....................................................... 16
2.2 FUNDAMENTACIN FILOSFICA .......................................................................................................... 31
2.1 FUNDAMENTACIN LEGAL. ................................................................................................................ 32
2.4 CATEGORAS FUNDAMENTALES ........................................................................................................... 33
2.4.1 CATEGORIZACIN DE VARIABLES ....................................................................................................... 33
2.5. HIPTESIS .................................................................................................................................... 34
2.5.1. Hiptesis de la Investigacin .............................................................................................. 34
2.5.2. Hiptesis Estadstica .......................................................................................................... 34
2.5.2.1. Hiptesis Nula ................................................................................................................. 34
2.5.2.2. Hiptesis Alternativa ....................................................................................................... 34
2.4. SEALAMIENTO DE VARIABLES DE LA HIPTESIS ...................................................................................... 34
CAPITULO III
METODOLOGIA .............................................................................................. 35
3.1. ENFOQUE ..................................................................................................................................... 35
3.2 MODALIDAD BSICA DE LA INVESTIGACIN ............................................................................................ 35
3. 3. NIVEL O TIPO DE INVESTIGACIN........................................................................................................ 35
3.4. MTODO Y TCNICA DE INVESTIGACIN ............................................................................................... 36
3.5. POBLACIN Y MUESTRA ................................................................................................................... 45
3.5.1. Diseo Experimental .......................................................................................................... 45
3.5.1.1. Factores o niveles en estudio para la estandarizacin de un mtodo analtico para la
cuantificacin de la concentracin de metanol. ........................................................................... 45
3.4.1.2. Tratamientos .................................................................................................................. 46
3.4.2 MUESTRA................................................................................................................................... 47
3.5. OPERACIONALIZACIN DE VARIABLES. .................................................................................................. 47
3.6. RECOLECCIN DE INFORMACIN ........................................................................................................ 48
3.7. PROCESAMIENTO Y ANLISIS ............................................................................................................. 49

2

CAPTULO IV
4.1. ANLISIS DE RESULTADOS. ................................................................................................................ 50
4.2 VERIFICACIN DE HIPTESIS............................................................................................................... 52
CAPTULO V
CONCLUSIN Y RECOMENDACIONES ........................................................ 53
5.1 CONCLUSIONES: .................................................................................................................................. 53
5.2 RECOMENDACIONES. ............................................................................................................................ 54
CAPTULO VI
PROPUESTA ................................................................................................... 56
6.1 DATOS INFORMATIVOS ..................................................................................................................... 56
6.2 ANTECEDENTES DE LA PROPUESTA ....................................................................................................... 56
6.3 JUSTIFICACIN ................................................................................................................................ 57
6.4 OBJETIVOS .................................................................................................................................... 58
General ....................................................................................................................................... 58
Especficos .................................................................................................................................. 58
6.6 FUNDAMENTACIN ......................................................................................................................... 59
BIBLIOGRAFA. .............................................................................................. 63

ANEXOS

ANEXO A TABLAS DE RESULTADOS
ANEXO B ANLISIS ESTADSTICO
ANEXO C GRFICAS
ANEXO D DIAGRAMA

3
Anexo A

Tablas de resultados

Tabla A-1 Relacin de reas de metanol (A1) con n-butanol (A2) A1/A2.

Tabla A-2 Recuperacin en porcentaje.

Tabla A-3 Curva de calibracin

Tabla A-4 Promedios de la curva de calibracin

Tabla A- 5 Grado Alcohlico Brandy FAPAS

Tabla A-6 Relacin de reas del Material de Referencia

Anexo B

Anlisis estadstico.

Tablas del anlisis estadstico.

Tabla B-1 Curva de calibracin

Tabla B-2 Anlisis de varianza para la relacin de reas de la concentracin de
metanol A1 y n- butanol A2 (A1/A2).

Tabla B-3 Anlisis de Tukey para diferencias significativas.

Tabla B-4 Lmites de confianza

Tabla B-5 Prueba de hiptesis comparacin con t de student Da 1.

4


Grficos del Anlisis Estadstico

Grfico B-1 Factores principales para la relacin a1/a2.

Grfico B-2 Interacciones de la relacin de reas y las concentraciones.

Grfico B-3 Interacciones de los factores relacin a1/a2.

Anexo C

Grficas

Grfica C-1 Datos de la curva de calibracin de metanol y la relacin de reas
Metanol/n-Butanol.

Grfica C-2 Cromatogramas de Metanol a 0mg/100ml.

Grfica C-3 Cromatogramas de Metanol a 1,570mg/100ml.


Grfica C-5 Cromatogramas de Metanol a15,74 0mg/100ml.


Grfica C-7 Cromatogramas de Metanol a 9 4,10mg/100ml.

5

Grfica C-9 Cromatogramas de Material referencia Da 1.

Grfica C-10 Cromatogramas de Material referencia Da 2.

Grfica C-11 Cromatogramas de Material referencia Da 1

Anexo D

Diagramas

Diagrama D-1 Estandarizacin del mtodo para la cuantificacin de metanol.

6
RESUMEN EJECUTIVO
El poco o inexistente control de parte de los organismos obligados a
llevar un control de calidad en las bebidas alcohlicas de expendio masivo,
sumada a la poca capacitacin de algunos productores de bebidas alcohlicas,
ha generado graves inconvenientes en la salud del consumidor, como se
evidencio el mes de agosto del 2011, cuando una intoxicacin masiva por
causa de metanol quito la vida de alrededor de 50 personas.

Es por ello que el Laboratorio de Anlisis y Control de Alimentos de la
Universidad Tcnica de Ambato (LACONAL), necesita de un mtodo
estandarizado que permita cuantificar el metanol en bebidas alcohlicas, por
medio de cromatografa de gases acoplado a un detector de ionizacin en
llama (FID), y de esta forma proporcionar elementos que permitan con facilidad
validar el mtodo a futuro, y asegurar la confiabilidad de los resultados.

La estandarizacin se inici preparando una curva de calibracin,
utilizando metanol grado cromatogrfico, adems de n butanol como estndar
interno, para minimizar los errores, porque al ser inyeccin manual es
importante tener cuenta los errores que pueden afectar directamente al mtodo
y sus resultados. Para el desarrollo del mtodo fue importante determinar el
grado alcohlico, porque para los clculos respectivos de la concentracin de
metanol la respuesta debe ser expresada en mg / 100 ml de alcohol anhidro.

En base a los anlisis estadsticos, se determino que la curva de
calibracin est en los parmetros de aceptacin para estandarizar el mtodo,
por el factor de correlacin lineal existente que fue de 0,9993, adems los
lmites de confianza, de cuantificacin y deteccin son aceptables para este
mtodo.

El material de referencia Brandy Fapas, fue inyectado en 3 das
diferentes con 3 replicas por da, se hizo una comparacin estadstica entre el
resultado referencial y el resultado experimental con un error mnimo y con la
aceptacin de la hiptesis del mtodo a estandarizar.
7
CAPITULO I
EL PROBLEMA DE INVESTIGACION
1.1. Tema de Investigacin
DE GASES
1.2. Planteamiento del problema
La industria de bebidas alcohlicas es una de las que ms demanda
genera a nivel mundial. Cada da aumentan consumidores de bebidas de todo
tipo, desde las no destiladas como la cerveza, con bajo contenido alcohlico,
hasta las destiladas como el ron, donde el contenido de etanol en
concentracin de volumen es elevado.
El alto grado de rentabilidad econmica que la industria de bebidas
alcohlicas genera y el intenso consumo de la poblacin ha provocado que en
muchos lugares del mundo se elaboren bebidas alcohlicas de forma casera
con alto grado alcohlico y a bajo precio. Esta forma de elaboracin, al carecer
de estndares de calidad y estar fuera de toda norma establecida, crea una
serie de complicaciones tcnicas y legales y se convierten en un atentado a la
salud y a la vida de las personas que las consumen.
El metanol, por ejemplo, puede ser uno de los contaminantes de la
fermentacin y destilacin, o en algunos casos, producto del desconocimiento,
es utilizado como adulterante. La ingestin de alcohol metlico puede provocar
dao a la retina, intoxicacin crnica e inclusive la muerte, dependiendo del
contenido en el producto.
8
En la actualidad, el poco o casi inexistente control de calidad de las
bebidas alcohlicas en el Ecuador, se da por muchos factores, que van desde
la inexistencia de un organismo regular de control, la falta de instrumentacin
en el pas, hasta la poca preparacin tcnica de la gente en la parte
operacional de los equipos utilizados para el anlisis qumico.
Por estos motivos, aprovechando el instrumental existente en el
laboratorio de Control y Anlisis de Alimentos de la Facultad de Ciencia e
Ingeniera en Alimentos de la UTA, es necesario validar un mtodo de anlisis
por cromatografa de gases para la determinacin de la concentracin de
metanol en bebidas alcohlicas, y de esta forma establecer un centro de
control de calidad que por un lado brinde informacin tcnica a los productores
artesanales e industriales, as como tambin, permita monitorear la calidad de
productos importados.
Aunque muchos productores de alcohol tienen ciertas obligaciones con
respecto a la salud pblica (por ej. control de calidad, advertencias para la
salud), sus metas principales muchas veces se contraponen con ella. De
particular preocupacin es la globalizacin del mercado del alcohol, donde las
compaas buscan ampliar sus mercados y por consiguiente que haya una
mayor disponibilidad y consumo de alcohol. [1]
1.2.1. Contextualizacin macro, meso y micro.
El consumo de bebidas alcohlicas implica la obtencin de grandes
ganancias por parte de los productores, los publicistas, y la industria, adems
de producir importantes ingresos scales para los gobiernos. Bebidas como el
vino y la cerveza, son considerados como productos agrcolas en pases
desarrollados y en vas de desarrollo y cumplen un rol importante en la
economa de estos pases.
Los licores destilados y la cerveza se pueden producir a escala industrial
y su reglamentacin esta bajo la responsabilidad de los ministerios de salud y
de la industria. Es por esto que en algunos casos existen conictos de
intereses para los gobiernos, quienes necesitan las utilidades generadas de las
9
ventas de las bebidas alcohlicas, pero que tambin tienen la obligacin de
cuidar y proteger la salud y bienestar de los consumidores. [1]
En el inicio de la dcada de los aos 60 el consumo mundial de bebidas
alcohlicas alcanzaba un promedio de 4 a 6 litros por persona al ao, hasta la
dcada de 1980 en donde se estabilizo a un nivel de alrededor de 5 litros por
ao. En Europa, frica y Amrica el consumo de bebidas alcohlicas alcanz
su punto mximo a principios de 1980, Europa es el lugar donde ms se
consumi comparado con otras regiones llego hasta los 17 litros por persona
al ao, llegando a mantenerse en los aos 90 en un poco mas de 10 litros por
persona al ao. [2]
En la Figura 1 se presenta un detalle de la media de consumo per capital en
regiones de la OMS.

Figura 1: La media de consumo per cpita en regiones de la OMS 1961-1999
Amrica muestra el segundo nivel ms alto de consumo, seguida por
frica y el Pacfico Occidental, en tanto que el Mediterrneo Oriental y el
sudeste asitico muestran el nivel ms bajo de consumo. En la regin de Asia
Sudoriental el consumo de bebidas alcohlicas ha aumentado de manera
constante mientras que en las regiones del Pacfico Occidental se mantiene
estable o decrece en relacin con las otras regiones.
10
Los niveles de consumo de alcohol en todo el mundo tienden a
converger, con excepcin de la regin del Mediterrneo Oriental en donde la
mayora de poblacin es musulmana y el consumo es relativamente bajo. En
general el consumo de alcohol sigue aumentando en relacin directa con el
creciente desarrollo econmico. [2]
La gran demanda de las bebidas alcohlicas ha generado que tambin
exista la produccin no reglamentada, la misma que va desde la forma casera
a la informal o ilcita, situacin comn en muchos pases en vas de desarrollo
que genera una fuente de ingresos para familias de escasos recursos por ser
alcohol de consumo muy barato.
Este mercado es muchas veces responsable de productos de calidad y
seguridad dudosa, o francamente mala, y existen informes de
envenenamientos no fatales y fatalidades por bebidas con concentraciones
considerables de alcohol metlico y otros aditivos, que pueden ser perjudiciales
para la salud,. En Mxico por ejemplo se da el consumo de alcohol etlico con
96 GL (grados Gay Lussac), en Nicaragua se dio una intoxicacin masiva por
bebidas que tenan metanol que caus ms de 40 muertes y todo un rango de
secuelas en cientos de personas ms. [1]
En el Ecuador a partir del mes de julio del 2011 empez una intoxicacin
por bebidas alcohlicas con metanol tanto como adulterante o como producto
congnere de la destilacin, El Ministerio de Salud confirm un total de 244
personas intoxicadas de las que 50 personas fallecieron por esta causa. La
mayora de victimas se dio en la provincia de Los Ros y la provincia de
Tungurahua teniendo 25 y 11 fallecidos respectivamente. [3]
A nivel mundial existen normativas en cada pas las que obligan tener un
lmite mximo permisible de metanol en las distintas bebidas alcohlicas. La
mayor parte de los mtodos usados en la determinacin de metanol se basan
en la oxidacin a formaldehido y su posterior determinacin
espectrofotomtrica actualmente se cuantifica la concentracin utilizando la
cromatografa de gases. [4]
11
En el Ecuador el organismo de control vigente es el Ministerio de Salud
Pblica con sus distintas direcciones provinciales, y el organismo encargado de
expedir un registro sanitario que permita la comercializacin de productos
alimentarios, farmacuticos o de ingesta para el ser humano es
el Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Prez.
El cuantificar la concentracin del metanol por cromatografa de gases
en la ciudad de Ambato permitir tener un control en las industrias productoras
de bebidas alcohlicas de la ciudad y la provincia, de esta forma garantizar la
calidad a los distintos consumidores.
La validacin de mtodos analticos es de mucha importancia en los
laboratorios, ya sean de servicio o de investigacin, de esta manera se asegura
la fiabilidad de sus resultados los mismos que son utilizados en la toma de
decisiones segn sean los requerimientos.
1.2.2. Anlisis Crtico
EFECTOS

PROBLEMA

CAUSAS
rbol de Problemas
Elaborado por: David Luna.
PRESENCIA DE
METANOL EN BEBIDAS
ALCOHLICAS
Control de
calidad durante
el proceso de
produccin.
Correcta medicin
de la
concentracin de
metanol en
Mejoramiento en las
bebidas alcohlicas
comercializadas
Descentralizar los
anlisis de
bebidas
alcohlicas
Falta o inexistente
conocimiento de
los productores de
bebidas
Errnea
determinacin del
grado alcohlico.
Ausencia de
laboratorios
capacitados en el
anlisis de metanol
Presencia de
metanol en la
materia prima
12
Relacin Causa Efecto
Causa:

Concentracin de metanol en bebidas alcohlicas

Efecto:

Validacin del mtodo analtico para el control de la calidad de las bebidas
alcohlicas.

Para esta investigacin se utilizar el cromatgrafo de gases como
instrumento de anlisis para cuantificar la concentracin de metanol existente
en las bebidas alcohlicas, este anlisis proporcionar informacin til sobre la
calidad de bebidas alcohlicas que consume la ciudadana.
1.2.3. Prognosis
La carencia de herramientas en la investigacin aplicada para la
cuantificacin de la concentracin de metanol en bebidas alcohlicas como
producto congnere o adulterado con alcohol refinado de origen poco confiable,
no ha permitido conocer su calidad. La estandarizacin de parmetros para la
validacin del mtodo evaluara de la calidad de los licores garantizando que el
producto no tenga componentes que adulteren su composicin permitida por
las normas vigentes, y as exigir mejoras en su industrializacin,
1.2.4. Formulacin del Problema
Los mtodos para la determinacin de la concentracin de metanol en
bebidas alcohlicas son varios, desde los cualitativos que indican ausencia o
presencia, hasta los cuantitativos como la espectrofotometra y la cromatografa
de gases. La seleccin de un mtodo para la cuantificacin es bastante
esencial para un laboratorio, y se debe seleccionar en funcin de la sensibilidad
del mtodo, para este caso el cromatgrafo de gases presenta mejor
sensibilidad de deteccin adems de presentar buenas caractersticas como la
selectividad, exactitud, precisin, repetitividad, limites de deteccin y
13
cuantificacin, sensibilidad, linealidad y otros parmetros exigidos por la norma
ISO/IEC 17025.

La estandarizacin de parmetros que permitan la validacin para la
cuantificacin de la concentracin de metanol en bebidas alcohlicas se
realizar utilizando cromatografa de gases?

1.2.5. Preguntas directrices
Existe relacin directa entre la destilacin y la concentracin de
metanol en bebidas alcohlicas?
Es fundamental hacer una correcta medicin del grado alcohlico para
determinar la concentracin de metanol en las bebidas alcohlicas
analizadas?
Se requiere del anlisis cuantitativo por cromatografa de gases de la
concentracin de metanol en las bebidas alcohlicas?
Existe la necesidad de estandarizar un mtodo analtico para la
determinacin de la concentracin de metanol por cromatografa de
gases?
Se requiere determinar los parmetros para validar un mtodo analtico
satisfaciendo lo que dice la norma ISO/IEC 17025.

1.2.6. Delimitacin

rea: Qumica Analtica
Sub-rea: Anlisis Cuantitativo
Sector: Alimentos
Sub-sector: Bebidas alcohlicas
Situacin geogrfica: Laboratorio de Control y Anlisis de Alimentos de la
Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos de la
Universidad Tcnica de Ambato
Espacial: Octubre 2011 - J ulio 2012
14
1.3. Justificacin
En funcin de la industrializacin que avanza y las civilizaciones ganan
terreno, tambin crecen sus malas artes, existen parsitos en la sociedad que
viven a costa de ella y se enriquecen a beneficio del fraude. As como el
verdadero cultivador de las ciencias se desvela por arrebatar un secreto a la
naturaleza para aplicarle en beneficio de la sociedad, as mismo esos falsarios
de oficio trabajan y discurren da y noche para inventar engaos. A tal altura ha
llegado la sofisticacin del engao que es preciso recurrir a todos los medios
imaginables para contrarrestarlos. [5]
La industria de las bebidas alcohlicas emplea a varios millones de
personas en todo el mundo, y cada diferente tipo de bebida produce unos
ingresos del orden de billones de dlares anuales. Se pueden obtener licores
destilados a partir de muchos materiales, entre los que se encuentran las
masas fermentadas de cereales, los zumos de fruta fermentados, jugo de
azcar de caa, melazas, miel y jugo de cactus.[6]

La cromatografa de gases es una tcnica analtica rpida, precisa y
exacta que tiene un costo relativamente bajo y amplia aplicabilidad a las
separaciones analticas, adems brinda informacin cuantitativa acerca de las
especies que separa. [7]

El estandarizar parmetros para validar un mtodo analtico que permita
la cuantificacin de metanol utilizando cromatografa de gases es importante,
porque de esta forma el laboratorio LACONAL estar en la capacidad de
brindar resultados confiables y sobre todo que cumplan con los requerimientos
que exige la Norma tcnica ecuatoriana NTE-INEN ISO 17025. [25]
15
1.4. Objetivos
1.4.1. General
Estandarizar parmetros para validar un mtodo analtico que permita la
cuantificacin de la concentracin de metanol en bebidas alcohlicas
utilizando cromatografa de gases.
1.4.2. Especficos
Establecer los parmetros fsicos que permitan la preparacin de la
muestra por medio de la destilacin previa.

Determinar la curva de calibracin optima, los lmites de deteccin y de
cuantificacin, necesarios para la validacin de un mtodo.

Evaluar las concentraciones de metanol en materiales de referencia.

Cuantificar la concentracin de metanol en muestras de bebidas
alcohlicas.

16
CAPITULO II
MARCO TEORICO
2.1 Antecedentes investigativos
En los ltimos aos el desarrollo de la instrumentacin qumica para
anlisis cuantitativos ha servido para controlar los lmites permisibles de
sustancias que resultan toxicas para el cuerpo humano y que se encuentran
en las bebidas alcohlicas ya sea como producto congnere o como
adulterante.

La cromatografa de gases es una tcnica de separacin analtica que
ha experimentado un gran desarrollo desde sus inicios en los aos 50, se la
utiliza en la resolucin de diversos problemas en la industria, en la medicina, en
la biologa y en el anlisis ambiental, convirtindose en la actualidad como una
herramienta para el control en una gran variedad de reas. [8]

mayor disponibilidad y consumo de alcohol. [1]

En la actualidad el control del aseguramiento de la calidad, permite
demostrar a los laboratorios que los mtodos analticos que emplean para sus
anlisis, proporcionan resultados fiables, los mismos que son resultado de una
previa validacin en la que se verifica y documenta la adecuacin de requisitos
determinados y previamente establecidos para resolver un problema analtico
particular. [9]

Segn la norma ISO/IEC 17025, los laboratorios deben validar los
mtodos que se utilicen en el laboratorio, tanto los desarrollados por ellos
17
mismos como aquellos procedentes de fuentes bibliogrficas o desarrolladas
por otros laboratorios. [25]
2.1.1. Fermentacin de carbohidratos.
Es el proceso de sntesis qumica mas antiguo empleado por el hombre,
y hasta la actualidad sigue siendo de gran importancia para la preparacin de
alcohol etlico y de otros alcoholes. Este proceso se da gracias a la accin de
las levaduras sobre los azcares, los mismos que proceden de varias fuentes
como la melaza de caa de azcar o del almidn que se obtiene de varios
granos, por esto al alcohol etlico tambin se lo conoce como el alcohol de
granos. [10]

Los azcares por accin de la fermentacin se transforman en etanol, este
proceso ocurre cuando la glucosa por medio de la glucolisis se transforma en
piruvato, y este se descarboxila en una reaccin irreversible catalizado por
accin de la enzima piruvato descarboxilasa, como se muestra en la figura 2 el
resultado de esta reaccin da acetaldehdo que se reduce a etanol a travs de
la enzima alcohol deshidrogenasa.

Figura 2. Transformacin de acido pirvico a etanol.
2.1.2. Alcohol etlico
La norma tcnica ecuatoriana INEN 375 es el producto obtenido de la
destilacin y rectificacin de mostos que han sufrido fermentacin alcohlica,
como tambin el producto de la rectificacin de aguardientes naturales y que
puede ser utilizado en la fabricacin de bebidas alcohlicas.

2.1.3. Metanol.
El alcohol metlico es el ms simple de los alcoholes, se caracteriza por
ser incoloro, inflamable y toxico, fue descubierto por Boyle en 1661 en el
18
alquitrn de madera, se lo denominaba como o alcohol de madera por la forma
en la que se lo obtena originalmente, destilando esta materia prima en
ausencia de aire. [11]

En la actualidad el metanol se obtiene a gran escala a partir del gas de
agua o gas de sntesis como se muestra en la ecuacin [12]

C0 +2E
2
cut
P,1
-- E
3
C 0E

Esta reaccin se produce a una temperatura de 300-400 C y a una
presin de 200-300 atm. Los catalizadores usados son ZnO o Cr2O3. El gas de
sntesis (CO +H
2
) se puede obtener de formas distintas una de las formas de
obtencin del gas de sntesis es a partir de la combustin parcial del gas
natural en presencia de vapor de agua. [13]

El metanol es un disolvente industrial que se emplea como materia prima
en la fabricacin de formaldehdo, se utiliza como anticongelante en vehculos,
combustible de bombonas de camping-gas, disolvente de tintas, tintes, resinas
y adhesivos. Es altamente inflamable y la mezcla vapor aire es explosiva,
existen varias formas de causar dao en el humano como la inhalacin que por
ser ms pesado que el aire puede causar asfixia en espacios poco ventilados,
teniendo como sntomas principales tos, vrtigo, dolor de cabeza y nauseas. Es
fcilmente absorbible por la piel causando irritacin, y su ingesta conduce a
una intoxicacin sistemtica grave que pueden ser precedidos por un perodo
asintomtico latente, provocando dolor abdominal, cansancio, prdida del
conocimiento y vmitos.

La toxicidad por ingestin es de 0,1g metanol/kg peso corporal o ms, es
considerada como grave, la ingestin de ms de 1 g metanol/kg peso corporal
siendo potencialmente letal. La exposicin por inhalacin de una concentracin
de ms de 1309 mg/m3 (1000 ppm) o el contacto prolongado o extenso de la
piel puede causar tambin toxicidad sistmica. [14]

19
El metanol no producto de la fermentacin alcohlica, su presencia se da
por la desesterificacin de las pectinas estearasas presentes en las frutas. El
contenido de metanol es de 0,5 g /100g de alcohol en vino tinto, 30mg/100ml
en brandy, en whisky 15 mg/100ml y en ron 10 mg/100ml, an cuando este tipo
de bebidas alcohlicas es destilada para aumentar el contenido de alcohol
etlico y disminuir otros alcoholes contaminantes que pueden ser congneres
de la produccin de estas bebidas. [15]
2.1.4. Bebidas alcohlicas.
Segn la norma tcnica ecuatoriana INEN 362 indica que es el producto
obtenido mediante fermentacin y la destilacin de jugos y otros derivados de
la caa, sometido a rectificacin de modo que conserve sus caractersticas
organolpticas. Tambin se denomina aguardiente o aguardiente de caa,
indica que debe ser incoloro o ambarino, con sabor y olor caractersticos de
aguardiente de caa rectificado, adems no debe ser adicionado ningn tipo de
edulcorantes artificiales ni colorantes diferentes al caramelo de sacarosa,
esencias naturales o artificiales que modifiquen sus caractersticas
organolpticas, ni bonificaciones artificiales. [16]

Tabla 2. Requisitos del aguardiente de caa rectificado.
REQUISITOS UNIDAD MNIMO MXIMO MTODO DE
ENSAYO.
Grado alcohlico a 15C GL INEN 340
A nivel del productor 85 -
A nivel de consumidor 30 50
Acidez total como acido
actico
* - 40 INEN 341
Esteres, como acetato de
etilo
* - 80 INEN 342
Aldehdos como etanal * - 20 INEN 333
Furfural * - 1,5 INEN 344
Alcoholes superiores * - 150 INEN 345
Metanol * - 10 INEN 347
Congneres * 18 250
Fuente: NTE-INEN 362
20
Existen varias definiciones relacionadas con las bebidas alcohlicas,
como se indica a continuacin:

Aguardiente anisado.- Es el producto que se obtiene de la destilacin de una
maceracin de ans ya sea el comn o el estrellado en aguardiente rectificado,
con o sin adicin de otras sustancias aromticas o tambin mezcla de
aguardientes rectificados con esencias naturales de ans, seguida o no de
destilacin. [17]

Bebidas alcohlicas. Son los productos alcohlicos aptos para el consumo
humano, provenientes de la fermentacin, destilacin, preparacin o mezcla de
los mismos, de origen vegetal, salvo las preparaciones farmacuticas. [17]

Grado alcohlico. Es el volumen de alcohol etlico expresado en centmetros
cbicos contenidos en 100cm
3
de bebida alcohlica, a una temperatura
determinada. [17]

Grado absoluto. Es el producto de multiplicar el grado alcohlico, en Gay
Lussac, por el volumen medido en litros. Debe expresarse en litros. [17]

Grado alcohlico aparente. Es el grado de una mezcla hidroalcohlica pura,
indicado por el alcoholmetro de Gay Lussac a una temperatura diferente a la
de referencia. La lectura de un grado alcohlico aparente debe darse siempre
indicando la temperatura a la cual dicha lectura fue tomada. Tambin se
considera grado alcohlico aparente la lectura alcoholimtrica de una mezcla.
En este caso, para determinar el grado alcohlico real, debe someterse a un
proceso de destilacin, hasta obtener una, mezcla hidroalcohlica pura. [17]

Licor. Es la bebida alcohlica obtenida mezclando o redestilando alcohol etlico
rectificado extra neutro o aguardiente de caa rectificado, con aditivos
alimentarios de uso permitido, producidos por destilacin, infusin, percolacin
o maceracin, pudiendo edulcorare con azcar p miel, coloreados con
sustancias de uso permitido.
Se clasifican en:
21
Licor seco.- Es el producto que contiene menos de 10g/l de azcares.
Licor semiseco.- Es el producto que contiene azucares comprendidos entre 10
y 50 g/l
Licor dulce.- Es el producto cuyo contenido de azcares est comprendido
entre 50 y 250 g/l.
Licor crema o crema.- Es el producto de consistencia viscosa que contiene ms
de 250 g/l de azcares.
Licor escarchado. Es el producto sobresaturado de azcar. [18]
En la tabla 3 se indican los requisitos de los licores

Tabla 3. Requisitos de los licores
Requisitos Unidad A B C Mtodo
de
ensayo
Mn. Mx Mn. Mx Mn. Mx
Grado alcohlico
a 15C
GL 15 45 15 45 15 45 INEN 340
Acidez total.
Como acido
actico
* - 1,5 - 15 - 40 INEN 341
Esteres como
acetato de etilo
* - 2 - 5 - 30 INEN 342
Aldehdos como
etanal
* - 0,5 - 2 - 1,0 INEN 343
Alcoholes
superiores
* - 0,5 - 5 - 150 INEN 345
Metanol * - 2 - 6 - 10 INEN 347
Fuente: NTE-INEN 1837.

A.- Licores fabricados en base de alcohol etlico rectificado extra neutro
B.- Licores fabricados en base de alcohol etlico rectificado
C.- Licores fabricados en base de aguardiente de caa rectificado.
*.- mg/100cm
3
.

22
Brandy.- Es el producto obtenido por destilacin de mostos de uvas
fermentados, sometido a un perodo de aejamiento no inferior a 3 aos, en
barriles de roble, de tal manera que al fina posea el gusto y el aroma que le son
caractersticos. [19]

En la tabla 4 se indica los requerimientos del brandy

Tabla 4.- Requisitos del brandy
ENSAYO.
Grado alcohlico a 15C GL 38 45 INEN 340
actico
* - 100 INEN 341
etilo
* - 60 INEN 342
Furfural * - 10 INEN 344
Congneres * 57 450
*.- mg/100cm
3
de alcohol anhidro.

Ron.- Es la bebida alcohlica obtenida exclusivamente de materias
provenientes de la caa de azcar, sometidas a los procesos de fermentacin
alcohlica, destilacin y subsecuente aejamiento natural mnimo de un ao en
barriles de roble de no ms de 700 litros, en tal forma que al final posea el
aroma y el gusto que son caractersticos del ron. [20]

23
En la tabla 5 se indica los requerimientos del ron

Tabla 5.- Requisitos del Ron
ENSAYO.
actico
* - 100 INEN 341
etilo
* - 100 INEN 342
Furfural * - 1,5 INEN 344
Congneres * 18 300
*.- mg/100cm
3
de alcohol anhidro.

Vino.- Es el producto obtenido mediante la fermentacin del mosto de uvas.
[21]
En la tabla 6 se indica los requerimientos del vino.

Tabla 6.- requisitos del vino.
REQUISITOS UNIDAD MNIMO MXIMO M. ENSAYO.
Acidez voltil como acido
actico
g/l - 100 INEN 341
tantrico
g/l - 100 INEN 341
Glicerina * - 20 INEN 355
Cenizas g/l - 1,5 INEN 348
Cloruros, como cloruro de
sodio
* - 150 INEN 345
24
Metanol ** trazas 0,5 INEN 347
*
**
cm
3
por 100 cm
3
de alcohol anhidro
g por 100 g de alcohol anhidro

Vino de frutas.- Es el producto obtenido mediante la fermentacin del mosto
de frutas. [22]
En la tabla 7 se indica los requerimientos del vino de frutas.

Tabla 7.- requisitos del vino de frutas
REQUISITOS UNIDAD MNIMO MXIMO M. ENSAYO.
Acidez voltil como acido
actico
g/l - 2 INEN 341
tantrico
g/l 4 16 INEN 341
Glicerina * 1 10 INEN 355
Cenizas g/l - INEN 348
Cloruros, como cloruro de
sodio
* - 150 INEN 345
Metanol ** trazas 0,02 INEN 347
*
**
cm
3
por 100 cm
3
de alcohol anhidro
g por 100 g de alcohol anhidro
2.1.5. Cromatografa de gases.-
La cromatografa consiste en la separacin de compuestos para poder
identificarlos, cuantificarlos y purificarlos, siendo una de las tcnicas analticas
mas sensibles, la cromatografa de gases (Figura 3), la misma que est basada
en un soluto gaseoso que es transportado por una fase mvil gaseosa, la fase
estacionaria suele ser un liquido no voltil que recubre el interior de una
columna, esta es la forma ms comn de cromatografa de gases conocida
como cromatografa de reparto gas-liquido, en ocasiones la fase estacionaria
25
contiene partculas solidas en donde el soluto puede adsorberse, a esta tcnica
se la denomina cromatografa de adsorcin gas-solido.

Figura 3.- Diagrama esquemtico de un cromatografo de gases
Los principales componentes en un sistema de cromatografa de gases
(Figura 3) son: gas portador, el puerto de inyeccin, el horno del inyector el
horno que contiene la columna, el horno del detector, el detector y el sistema
de registro e integracin siendo este un software computarizado. La velocidad
de flujo del gas acarreador se controla para asegurar tiempos de retencin
reproducibles y minimizar las variaciones y ruidos en el detector. [23]

Gas portador.- Es el que cumple la funcin de fase mvil, el Helio es el mas
utilizado pero tambin se utilizan otros como el Nitrgeno (N
2
), Argn (Ar) y el
Hidrgeno (H
2
), los mismos que vienen en tanques presurizados con
reguladores de presin, calibradores y medidores para controlar la velocidad
en el flujo.

Sistema de inyeccin de muestra.- Se usan microjeringas calibradas para
inyectar la muestra en el septum de caucho o silicona localizado en la cabeza
de la columna, el mismo que se encuentra a una temperatura sobre el punto de
ebullicin del componente menos voltil de la muestra, la cantidad a inyectar
est entre el 1ul hasta los 20 ul.

Columnas y hornos de columnas.- Existen dos tipos de columnas las
empaquetadas y las tubulares abiertas o capilares, siendo las segundas las
ms utilizadas en la actualidad de los anlisis cromatogrficos por ser ms
26
rpidas y eficientes. Las columnas varan de longitud desde 2 metros hasta 50
metros, son de acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln, son enrolladas a
fin de que encajen en el horno.

La temperatura ptima de la columna se la da en el horno, y depende del
punto de ebullicin de las muestras y el grado de separacin necesario, en el
caso de muestras con un intervalo de ebullicin amplio, frecuentemente se
utiliza un programa de temperaturas o rampas, en donde se incrementa la
temperatura de forma continua o escalonada, segn avanza la separacin.

Sistemas de deteccin.- Se han investigado y empleado muchos sistemas de
detectores en la cromatografa de gases, son elegidos en funcin de las
siguientes caractersticas:
- Sensibilidad adecuada. Ubicadas entre 10
-8
a 10
-5
gramos de soluto por
segundo.
- Buena estabilidad y reproducibilidad.
- Respuesta lineal a solutos que abarque varios ordenes de magnitud.
- Intervalo de temperatura, desde la ambiental hasta aproximadamente
400C.
- Tiempo de respuesta breve e independiente de la velocidad de flujo.
- Alta fiabilidad y facilidad de empleo.
- Similitud en la respuesta a todos los solutos.
- Que no destruya la muestra.

El detector de ionizacin de llama (FID) es el mas aplicable y utilizado en
cromatografa de gases (Figura 4), funciona enviando el efluente de la columna
hacia una pequea llama de aire/hidrgeno, los efluentes generalmente
orgnicos producen iones y electrones cuando se descomponen qumicamente
a la temperatura de la llama aire/hidrgeno, esta monitorizacin de la corriente
que se da por captar las cargas permite la deteccin, la recoleccin de los
iones y electrones se da por la aplicacin de varios centenares de voltios entre
la punta del mechero y un electrodo colector que se encuentra encima de la
llama, esta corriente resultante en amperios se mide en un picoampermetro.
[23]
27

Figura 4.- Detector de ionizacin de llama caracterstico.
2.1.6. Anlisis cuantitativos.-
La cromatografa de gases se basa en la comparacin de las reas o
alturas de los picos del analito, frente al de uno o ms patrones, en condiciones
controladas se puede tener que ambos parmetros varan con la
concentracin. Los cromatgrafos modernos estn equipados con
computadores y software que brindan medidas de reas de pico relativas.

Calibrado por patrones.- Es el mtodo ms directo para anlisis cuantitativo
por cromatografa de gases, se prepara una serie de disoluciones patrn de
composicin que se aproxima a la de la disolucin desconocida. Los
cromatograma obtenidos se representan grficamente ya sean sus alturas o
reas de pico en funcin de la concentracin obteniendo una curva de
calibracin. Para lograr mayor exactitud se requiere calibrar con frecuencia.

Mtodo de patrn interno.- La utilizacin de patrones internos eleva la
precisin cuantitativa, ya que minimiza las incertidumbres que se originan en la
inyeccin de la muestra, velocidad de flujo y variaciones en las condiciones de
la columna. Este procedimiento consiste en introducir una cantidad similar de
un patrn interno en cada patrn y muestra, y se usa como parmetro analtico
la proporcin del rea del pico del analito sobre el rea del pico del patrn
interno, para que el mtodo tenga meno error es necesario que el pico del
patrn interno est alejado de los picos de los componentes de la muestra, que
28
no forme parte de la misma y se conozca su concentracin, la utilizacin de
patrn interno a logrado precisiones de 0,5 a 1 % segn informes. [7]

2.1.7. Validacin de mtodos analticos.
La validacin de mtodos emplea un conjunto de pruebas que
comprueban todas las hiptesis en las que se basa el mtodo analtico, y
establecen y documentan las caractersticas de rendimiento de un mtodo,
demostrando as si dicho mtodo es adecuado para un propsito analtico
particular. Las caractersticas de rendimiento de los mtodos analticos son: la
aplicabilidad, la selectividad, el calibrado, la veracidad, la fidelidad, la
recuperacin, el rango de funcionamiento, el lmite de cuantificacin, el lmite
de deteccin, la sensibilidad y la robustez. Pueden aadirse la incertidumbre de
la medicin y la adecuacin al propsito. [24]

Para la validacin de un mtodo analtico es necesario cumplir con ciertas
exigencias que incluye la norma tcnica INEN ISO/IEC 17025 como son:

- Organizacin funcional
- Personal suficiente y capacitado
- Instalaciones adecuadas
- Mtodos escritos, actualizados y aprobados
- Equipos apropiados, cualificados
- Procedimientos apropiados para la toma de muestras
- Reactivos adecuados y soluciones valoradas.
- Material auxiliar apropiado
- Patrones estandarizados para el anlisis y material de referencia
- Verificacin y control de los resultados llevados en registros de los
anlisis para su posible auditoria
- Informacin y comunicacin de los resultados obtenidos en los anlisis
realizados
- Higiene y seguridad en el rea de trabajo
- Auditoras internas con personal del laboratorio. [25]
29
Seleccin, elaboracin y normalizacin del mtodo.

La seleccin del mtodo est dada por la necesidad tanto del laboratorio
como del cliente y de esta forma llegar a resultados satisfactorios, estos
mtodos deben ser apropiados para las calibraciones y ensayos pertinentes.

Todo ensayo est sujeto de un procedimiento, que debe realizarse
especificando las acciones relativas al ensayo, equipos a utilizar reactivos,
condiciones ambientales, preparacin de estndares, materiales de referencia,
muestras de anlisis y sus clculos pertinentes. [24]

Los mtodos seleccionados se deben normalizar, de esta forma se
pueden corregir y hacer ajustes segn sean necesarios para tener un
funcionamiento consistente. [26]

Parmetros para la validacin.

Selectividad y especificidad.- Es el grado en que un procedimiento se puede
determinar con exactitud un analito en presencia de dos o tres componentes en
una matriz dada, la selectividad de un mtodo se investiga usualmente
estudiando la habilidad de medir el analito de inters en una muestra a la que
se han aadido posibles interferentes deliberadamente.

Linealidad.- Es la relacin lineal entre la seal y la concentracin del analito.
y =a+bx donde, y: es la seal del equipo, b: la pendiente y x: la concentracin
del analito. [27]

Sensibilidad.- Termino utilizado generalmente en qumica analtica, se define
como la sensibilidad de calibracin, o el cambio en la seal de respuesta por
cambio unitario en la concentracin de analito. [7]

Precisin.- La precisin esta definida como el grado de concordancia mutua
entre los datos obtenidos de una misma forma, indica tambin la medida del
error aleatorio o indeterminado, de un anlisis, los parmetros de son la
30
desviacin estndar relativa, absoluta, el coeficiente de variacin y la varianza.
Las medidas ms comunes de la precisin son repetibilidad y reproducibilidad
[28].

Repetibilidad: es el grado de concordancia entre los resultados de mediciones
sucesivas de concentracin del analito en las mismas condiciones de medicin;
mide la variabilidad de los resultados cuando el mtodo es aplicado por un solo
analista, con un mismo equipo, en un periodo de tiempo corto, etc.

Reproducibilidad: es el grado de concordancia entre los resultados de
mediciones de la misma concentracin del analito bajo condiciones de
medicin modificadas, es decir realizar diversas rplicas en distintos das con
diferentes instrumentos, analista e inclusive otro laboratorio. [27]

Lmite de Cuantificacin.- Es un parmetro importante para caracterizar y
seleccionar los mtodos analticos. Conceptualmente es ms simple que las
capacidades de deteccin. La IUPAC lo define como el valor verdadero de la
seal o de la concentracin de analito que conducir a estimaciones o medidas
con una desviacin estndar relativa especificada. [29]

Limite de deteccin.- Se define como la concentracin ms pequea que se
puede detectar a un cierto nivel de confianza, todas las tcnicas analticas
tienen un lmite de deteccin, se lo utiliza cuando se realiza una curva de
calibrado. [7]

Exactitud.- La norma ISO 3534, la define como el grado de concordancia entre
el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado.

Rango de trabajo.- comprendido entre el lmite de cuantificacin y el valor del
patrn con la concentracin ms alta

Incertidumbre.- Los valores de las magnitudes obtenidas, sea cual sea su
complejidad y sensibilidad, siempre tienen asociadas imprecisiones que
denominamos incertidumbres experimentales o errores experimentales.
Criterios de aceptacin.-
31
Los criterios de aceptacin estn establecidos por la necesidad analtica
establecidos en los lmites de cuantificacin, exactitud y precisin; si no se
dispone de requisitos obligatorios, la fuente de informacin es bibliogrfica o
por la experiencia adquirida durante la normalizacin del mtodo. [20]
Tratamiento estadstico.-
Se realiza el anlisis de varianza simple para los resultados obtenidos,
en el clculo de la precisin por niveles, adems de los lmites de deteccin y
cuantificacin, el intervalo de trabajo y la incertidumbre asociada a cada nivel.
Evaluacin de resultados analticos e informes tcnicos.-
Los resultados obtenidos en la realizacin de la validacin, deben ser
sometidos a auditorias diarias de laboratorio u hojas de trabajo. Los informes
tcnicos deben contener la siguiente documentacin:
- Referencias de calibracin y cualificacin de la instrumentacin utilizada.
- Mtodos que describan el procedimiento para la determinacin de cada
analito de los parmetros a evaluar.
- Resultados de las cuantificaciones de los parmetros analizados que
incluyan copias originales de cromatogramas, de espectros, curvas de
calibracin, etc.
- Certificado de la validacin o documento formal de aprobacin que
deber ser firmado por las personas responsables.
- La documentacin referente a la validacin se deber archivar
adecuadamente durante todo el tiempo de vida del anlisis y de los
analitos evaluados [31]
La documentacin de la validacin deber ser utilizada desde el inicio del
anlisis y ser permanente durante todo el proceso de los anlisis.
2.2 Fundamentacin filosfica
Los tiempos actuales en los que la nutricin y la alimentacin estn
llenos de intereses econmicos y de ciencias falsas controvertidas que
nicamente favorecen a los que quieren vender sus productos sin pensar
32
siquiera en lo que los mismos pueden contener, es por eso que la presente
investigacin se basa en la idea aristotlica sobre su percepcin de tica que
se resume en la bsqueda de la felicidad.

Para algunos, la felicidad consiste en los placeres; para otros, en las
riquezas; pero el hombre sabio la busca en el ejercicio de la actividad que le es
propia al hombre, es decir, en la vida intelectiva. Ello no excluye el goce
moderado de los placeres sensibles y de los dems bienes, con tal de que no
impida la contemplacin de la verdad. Sobre esta base desarrolla Aristteles el
concepto de virtud. La virtud consiste en el justo medio. Lo que quiere dar a
entender es que el actuar del hombre debe estar regido por la prudencia o
regla recta. Hay dos modalidades de virtud: las dianoticas (que se refieren al
ejercicio de la inteligencia) y las ticas (que se refieren a la sensibilidad y los
afectos). Todas las virtudes son hbitos que se adquieren por medio de la
repeticin. La virtud por excelencia es la justicia, la cual consiste en el
acatamiento de las leyes y en el respeto a los dems ciudadanos.
[32]
La tica contempornea ha conocido aportes importantsimos por parte
de numerosos autores: los vitalistas y existencialistas desarrollan el sentido de
la opcin y de la responsabilidad, Max Scheler elabora una fenomenologa de
los valores. Autores como Alain Badiou han intentado demostrar que esta
principal tendencia (en las opiniones y en las instituciones), la cuestin de "la
tica" contempornea, es en realidad un verdadero nihilismo y una amenazante
denegacin de todo pensamiento. [33]
2.1 Fundamentacin legal.
La presente investigacin est amparada en la constitucin del ecuador
del ao 2008 que en su captulo segundo de los derechos del buen vivir en la
seccin primera de agua y alimentacin en el art. 13 seala que, las personas y
colectividades tienen derecho al acceso seguro y permanente de alimentos
sanos, suficientes y nutritivos; preferencialmente producidos a nivel local y en
correspondencia con sus diversas identidades y tradiciones culturales.
El estado ecuatoriano promover la soberana alimentaria. [34]
33

Norma Tcnica Ecuatoriana NTE INEN 0338:92

2.4 Categoras fundamentales
2.4.1 Categorizacin de variables
CATEGORIZACION DE VARIABLES

V.I. V.D.
SUPERORDINACION SUBORDINACION
Control de
Calidad
Parmetros
Contaminacin

Toxicidad

Concentraci
n Metanol

Cromatografa
de Gases
34
2.5. Hiptesis
2.5.1. Hiptesis de la Investigacin
El empleo de la cromatografa de gases permitir la cuantificacin de la
concentracin de metanol, a partir de la curva de calibracin as como en el
material de referencia utilizados para la validacin del mtodo analtico.
2.5.2. Hiptesis Estadstica
2.5.2.1. Hiptesis Nula
El resultado del anlisis cuantitativo cromatogrfico determinar si existe
concentracin de metanol en el material de referencia y sus respuestas
experimentales
2.5.2.2. Hiptesis Alternativa
El resultado del anlisis cuantitativo cromatogrfico no determinar que
existe concentracin de metanol en el material de referencia y sus respuestas
experimentales.
2.4. Sealamiento de variables de la hiptesis
Variable Independiente:
Estandarizacin para la validacin del mtodo analtico utilizando cromatografa
de gases.
Variable Dependiente:
Concentracin de metanol en el material de referencia Brandy Fapas.

35
CAPITULO III
METODOLOGIA
3.1. Enfoque
El presente estudio est enfocado en el anlisis de la muestra objeto de
estudio para determinar la concentracin de metanol, mediante el empleo de un
mtodo estandarizando que permita la futura validacin por medio de la
cromatografa de gases con un detector FID, ya que el metanol puede estar
presente en las bebidas alcohlicas ya sea como producto congnere o como
adulterante.
3.2 Modalidad bsica de la investigacin
En este proyecto de investigacin, por ser un anlisis cuantitativo se
emplearn dos tipos de modalidades de investigacin una experimental y otra
documental.
Experimental
La presente investigacin permiti la estandarizacin de un mtodo para
la cuantificacin de la concentracin de metanol como producto congnere o
adulterante de bebidas alcohlicas utilizando la cromatografa de gases con
FID como herramienta para el anlisis.
Documental
Se realizo una exhaustiva revisin bibliogrfica con informacin sobre
estudios realizados sobre el tema de investigacin.
3. 3. Nivel o tipo de investigacin
Exploratorio.- El nivel de profundizacin del presente trabajo de investigacin
es exploratorio ya que por primera vez en el Ecuador se propone un mtodo
36
estndar para la determinacin de niveles de metanol por cromatografa de
gases en bebidas alcohlicas con el fin de lograr su futura validacin.

Descriptivo.- Se realiz el anlisis mediante el uso del cromatgrafo de gases
con FID en funcin del anlisis qumico cuantitativo de la concentracin de
metanol.

Asociacin de variables

La estandarizacin de un mtodo analtico para la cuantificacin de
metanol permitir evaluar la calidad de las bebidas alcohlicas comercializadas
en el pas, y de esta forma brindar resultados de calidad a los productores e
importadores.

3.4. Mtodo y Tcnica de Investigacin
3.4.1. Preparacin de la muestra.
El presente trabajo se realiz con muestras preparadas de concentracin
de metanol conocido para la curva de calibracin, bebidas adulteradas con
metanol y con el material de referencia FAPAS proficiency Test Report 1362
Analysis of Brandy September - October 2011, que sirvi como material de
referencia certificado para la cuantificacin de metanol en bebidas alcohlicas.

3.4.1.1. Determinacin de grado alcohlico

El grado alcohlico de las muestras, fue determinado en base de la norma
tcnica ecuatoriana NTC-INEN 340-1994

3.4.1.1.1. Materiales y equipos:

- Alcoholmetro de Gay-Lussac, calibrado a 15C y 20C graduados en
dcimas de grado alcohlico, de calidad certificada.
- Termmetro graduado en dcimas de grado Celsius (centgrados).
37
- Matraz volumtrico, de 250 cm3.
- Probeta de capacidad y dimetro adecuados para evitar rozamiento con
el alcoholmetro.
- Bao de agua, con temperatura constante de 15 0,5C, 20 0,5C,
segn el caso, de profundidad Igual o superior a 30 cm.
- Ncleos de ebullicin.
- Aparato para destilacin (figura 5), compuesto por:

Figura 5. Aparato de destilacin

a) matraz de destilacin, de 1000 cm
3
, con fondo redondo,
b) malla de asbesto,
c) fuente elctrica de calentamiento,
d) tubo de vidrio delgado, de aproximadamente 6 mm de dimetro interno y de
dimensiones 300 x 300 mm x 150 mm,
e) refrigerante de Liebing de longitud igual o mayor a 400 mm,
f) tubo de vidrio adecuado para dirigir el destilado al recipiente colector,
g) matraz volumtrico, de 250 cm3, y
h) bao de agua con hielo, en el que debe sumergirse el matraz volumtrico.
[23]
38
3.4.1.1.2. Preparacin de la muestra.

- Para productos alcohlicos que contienen extracto seco, debe destilarse
previamente la muestra, y determinar en el destilado el grado alcohlico
volumtrico utilizando el alcoholmetro Gay- Lussac.
- Lavar cuidadosamente el equipo para destilacin con agua destilada y
proceder a armarlo.
- Enjuagar el matraz con una porcin de la muestra de bebida alcohlica,
llenarlo con la muestra hasta sobrepasar la marca de 250 cm3 y tapar el
matraz.
- Colocar el matraz en el bao de agua, a temperatura constante de 15
0,5C 20 0,5C, segn el caso, durante 20 minutos y retirar el
exceso de muestra que sobrepasa la marca, utilizando una pipeta, hasta
obtener el volumen exacto de 250 cm
3
.
- Transferir el contenido al matraz del aparato de destilacin y lavar con
tres porciones de 10 cm
3
de agua destilada, recogiendo el agua de
lavado en el mismo matraz del aparato de destilacin. Aadir ncleos de
ebullicin.
- Destilar lentamente la muestra, recogiendo el condensado en un matraz
volumtrico de 250 cm
3
, al que se aaden previamente 10 cm3 de agua
destilada, hasta que se haya recogido 220 cm
3
aproximadamente.
- Colocar el matraz en un bao de agua a temperatura constante 15
0,5C 20 0,5C, segn el caso, durante 20 minutos y luego aadir
cuidadosamente agua destilada a 15C 20C, segn el caso, hasta
completar el volumen de 250 cm
3
y homogeneizar.
-
3.4.1.1.3. Procedimiento
- Efectuar la determinacin en la misma muestra preparada por duplicado.
- Colocar la muestra preparada en la probeta perfectamente limpia y seca.
- Limpiar y secar cuidadosamente el alcoholmetro y el termmetro e
introducirlos suavemente en la probeta con la muestra, mantenindolos
as durante 10 minutos
- Agitar ligeramente para Igualar la temperatura del sistema y leer la
temperatura.
39
- Dejar en reposo hasta que desaparezcan las burbujas de aire que se
forman en el seno del lquido y efectuar la lectura en el alcoholmetro,
considerando el nivel real del lquido y no la elevacin del menisco,
utilizando una lupa, si fuera necesario.
- Corregir el grado alcohlico aparente medido a 15C, utilizando la tabla
de correccin.
- Corregir el grado alcohlico aparente medido a 20C utilizando la tabla
de correccin.
- Corregir el grado alcohlico aparente Intermedio, por interpolacin. [23]

3.4.2. Preparacin de la curva de calibracin.

La Preparacin de la curva de calibracin se determino a partir de la
solucin patrn de metanol con una concentracin de 78,677 mg/100ml, como
se indica en la tabla B-1 del Anexo B.

3.4.2.1. Materiales

- Balones aforados de 10, 50,100, 1000 ml
- Pipetas volumtricas calibradas de 0.5, 1 y 5 ml
3.4.2.2. Reactivos y soluciones estndares

- Estndar de metanol de 78,677 mg/100ml
- Etanol de alta pureza 99,9%
- Metanol de alta pureza 99,9%
- N-butanol P.A.
- Agua desionizada (0.054 s/cm)
3.4.3. Cuantificacin de metanol

Para la cuantificacin de metanol, se tom como referencia la norma
tcnica ecuatoriana NTC-INEN 2014 Bebidas alcohlicas determinacin de
productos congneres por cromatografa de gases, adems como soporte
para el mtodo se uso la tcnica de la AOAC 972.11, estos dos mtodos
sirvieron como gua, porque las condiciones que especifican cada uno son en
40
cromatgrafos distintos al que se tienen en LACONAL, y fueron acopladas al
cromatografo de gases HP- AGILENT 6890.

3.4.3.1. Equipos

- Cromatografo de gases HP-AGILENT 6890 con FID (detector
ionizacin llama)
- Generador de Hidrgeno
- Computador de escritorio con el software CLARITY
3.4.3.2. Materiales

- Tanque de Nitrgeno seco 4,5 de pureza de 6 metros cbicos.
- Tanque de Aire medicinal puro de 8 metros cbicos.
- Balones aforados de 10,50, 100, 250 y 1000 ml
- Pipetas volumtricas calibradas de 0.5, 1 y 5 ml
- Probetas calibradas de 50 a 1000ml.
3.4.3.3. Reactivos y soluciones

- Estndar de metanol de 78,677 mg/100ml
- Etanol de alta pureza 99,9% Borohidruro de sodio
- Metanol de alta pureza 99,9%
- N-butanol P.A.
- Agua desionizada (0.054 s/cm)
- Material de referencia
- Bebidas con concentracin de metanol como patrn interno

41
Diagrama de flujo para la estandarizacin de los parmetros de
validacin de un mtodo analtico para cuantificar la concentracin de metanol
en bebidas alcohlicas utilizando cromatografa de gases:

42
3.4.4 Estandarizacin de parmetros para la Validacin del Mtodo
Analtico

La estandarizacin de los parmetros para la validacin, fueron
establecidos segn indica la Norma Internacional ISO/IEC 17025, basado en el
procedimiento indicado en la norma tcnica ecuatoriana NTE-INEN 2014 y las
normas de la AOAC para determinacin de metanol por cromatografa de
gases, en funcin de esta norma y procedimiento los parmetros de validacin
se describen a continuacin:

Linealidad.-
La linealidad para la curva de calibracin se la realiz a partir de una
solucin con una concentracin de metanol de 78,677 mg/100ml, llevando a
diluciones (Tabla B-1 Anexo B.) con 7 diferentes concentraciones que van
desde 0 hasta 150 mg/100ml de metanol cada una con una concentracin de n-
butanol como estndar interno de 80,557 mg/100ml, inyectadas cada una en el
cromatgrafo de gases y obteniendo valores de sus respectivas reas en el
lapso de dos das y aplicando la linealidad de las mismas para obtener la
ecuacin:
y =bx +o (1)
Donde:
y es la relacin de las reas de metanol y n-butanol ( rea metanol/ rea n-
butanol).
X es la concentracin de metanol en mg/100ml

Para la obtencin de la concentracin (mg/100ml) a partir de las reas del
cromatografo de gases conseguidas se estableci el clculo con ayuda de la
ecuacin 2:
Conccntrocin Jc mctonol
mg
100mI
=(

Arcc dc mctcncl
Arcc dcl n-butcncl
+u
muL
FJ)

Donde:
Fd es el factor de dilucin utilizado y,
GL, el grado alcohlico determinado
(2)
43
Con las cifras obtenidas se estableci la curva de calibracin y se logr reportar
y calcular los siguientes datos:
Ecuacin de la recta:
rclocin Jc Arcos [
mctuboI
n-butunoI
= m[conccntrocin mctonol
mg
100mI
+o
Coeficiente de correlacin:
R =0,9993
Lmites de confianza de la pendiente:

LC
m
=mtS
m

Lmites de confianza de la ordenada al origen:

IC
u
=o tS
u

Determinacin de la sensibilidad de linealidad:
La sensibilidad de calibrado y la sensibilidad analtica:
Sensibilidad de calibrado:
La sensibilidad de calibrado esta dado por la pendiente de la recta; m
Sensibilidad Analtica:
Se determina mediante la ecuacin:
y =
m
Ss

Donde:
m: pendiente de la recta.
Ss: desviacin estndar de la sensibilidad.
Determinacin de lmite de deteccin y lmite de cuantificacin
Para determinar el lmite de deteccin y el lmite de cuantificacin se utilizan las
siguientes ecuaciones:
(3)
(4)
(5)
(6)
44
(7)
(9)
Lmite de Deteccin:

I0 =
S y x
m
3_
1
m
+
1
N
+
X
2
(Xi X
)
2 N
=1

Donde:
Sy/x : es la desviacin estndar de la recta de calibrado
m: es la pendiente de la recta de calibrado
N: es el nmero de patrones de calibrado
xi: es cada una de las concentraciones de los patrones de calibrado
x : es la media de las concentraciones de los patrones de calibrado

Lmite de Cuantificacin:
I0 =
S x
k
m_
1
m
+
1
N
+
X
2
(X-X
)
2 N
i=1

Donde:
Sy/x: es la desviacin estndar de los residuales de la recta de calibrado
b1: es la pendiente de la recta de calibrado
N: es el nmero de patrones de calibrado
xi: es cada una de las concentraciones de los patrones de calibrado
x : es la media de las concentraciones de los patrones de calibrado

Determinacin de la exactitud:
Para la exactitud del mtodo se utiliz el material de referencia certificado
FAPAS proficiency Test Report 1362 Analysis of Brandy September - October
2011, utilizando la ecuacin:
%Rccupcrocin =
0btcndo
1cco
100 (18)
Anlisis estadstico de los resultados.
Para el anlisis estadstico de los resultados se utiliz la prueba t student
que por una distribucin de probabilidad estima de la media de
45
una poblacin normalmente distribuida cuando el tamao de la muestra es
pequeo utilizando las siguientes frmulas:
t
cxp
=
|%R|n
C
(21)
C: =
S
X
(22)
Donde:
texp valores de t experimentales
Cv coeficiente de variacin
s desviacin estndar
X promedio del porcentaje de recuperacin
Los valores obtenidos se compararon con el valor de t a un nivel de
confianza del 95%.
3.5. Poblacin y muestra
3.5.1. Diseo Experimental
3.5.1.1. Factores o niveles en estudio para la estandarizacin de un
mtodo analtico para la cuantificacin de la concentracin de metanol.
TABLA N 8.Factores de estudio

Factores Niveles

A. Concentracin de Metanol
a0: 0 mg/100ml
a1: 1,57 mg/100ml
a2: 3,15mg/100ml
a3: 15,74mg/100ml
a4: 47,21mg/100ml
a5: 94,41mg/100ml
a6: 149,49 mg/100ml

B. Da de Experimentacin
b1: primer da

b2: segundo da
Elaborado por: David Luna
46
3.4.1.2. Tratamientos
Los tratamientos resultantes de la correlacin de los factores de estudio
en la estandarizacin de un mtodo analtico para la cuantificacin de la
concentracin de metanol se muestran a continuacin:
TABLA N-10 Obtencin de los tratamientos resultantes de la correlacin
de los factores de estudio para establecer la curva de calibracin

Tratamientos Factores de Estudio
N Codificacin Concentracin de Metanol Das de experimentacin
1 a0b1 0 mg/100ml Primer da
2 a0b2 0 mg/100ml Segundo da
3 a1b1 1,57 mg/100ml Primer da

4 a1b2 1,57 mg/100ml Segundo da









13 a6b2 149,49 mg/100ml

Primer da

14 a6b2 149,49 mg/100ml Segundo

Para la comparacin estadstica de datos se usara la prueba t de student para
determinar los limites de confianza.
Respuestas experimentales:
- Qumicas:
Cuantificacin de metanol por cromatografa de gases
47
3.4.2 Muestra
Para el presente anlisis se trabajar con metanol grado cromatogrfico
para la curva de calibracin y material de referencia certificado.
3.5. Operacionalizacin de variables.
Variable Independiente: Empleo de cromatografa de gases
LO ABSTRACTO LO OPERATIVO
CONCEPTUALIZACION CATEGORIAS INDICADORES ITEM BASICO
TECNICAS E
INSTRUMENTOS
Estandarizacin de
un mtodo analtico.

Equipo de
destilacin.

Utilizacin de
cromatografa
de gases con
un detector
de ionizacin
de llama
(FID).
- Obtencin de
resultados
confiables de
cada parmetro
de
estandarizacin
para la
validacin
establecidos en
los lmites
permisibles de
metanol segn
las exigencias de
la normativa
ecuatoriana.
Existen
cambios
importantes en
funcin de la
destilacin?

Se
estandarizara
un mtodo
analtico para
la
cuantificacin
de metanol y
establecer
parmetros
para su futura
validacin?
Equipo de
destilacin.

Cromatografo
de gases.

Variable Dependiente Cuantificacin de metanol.
48
LO ABSTRACTO LO OPERATIVO
CONCEPTUALIZACION CATEGORIAS INDICADORES ITEM BASICO
TECNICAS E
INSTRUMENTOS
Cuantificacin
de metanol
Concentracin de
metanol

-Proceso

Caractersticas
establecidas
en los
resultados a
comparar

Es necesario
realizar
comparaciones
de la
concentracin
de metanol en
muestras de
bebidas
alcohlicas y un
material de
referencia?

Tratamiento
estadstico y
diseo
experimental.

3.6. Recoleccin de informacin
El diseo experimental planteado tendr como finalidad obtener datos
experimentales reales de la cuantificacin de la concentracin de metanol en el
material de referencia para su aplicacin en bebidas, por esto se establece un
diseo AxB con dos rplicas y siete respuestas experimentales, dando como
resultado 14 pruebas de anlisis para establecer la curva de calibracin.
Para la matriz se realiza un diseo AxB con dos replicas y 6 respuestas
experimentales, del material de referencia, de las muestras de anlisis con
adicin de metanol, y el blanco; dando como resultado 12 pruebas de anlisis.
Estos parmetros fundamentarn la respuesta que se d a la hiptesis
planteada.

49
El anlisis de la cuantificacin de metanol fue realizado en el laboratorio
de control y anlisis de alimentos LACONAL de la Facultad de Ciencia e
Ingeniera en Alimentos de la Universidad Tcnica de Ambato.
3.7. Procesamiento y anlisis
El procesamiento de la informacin obtenida en la fase experimental de
la investigacin, se realiz en base a un estudio estadstico con la ayuda de
hojas de clculo diseadas con ecuaciones matemticas que estableciendo los
parmetros de estandarizacin y validacin.

El anlisis de la informacin se bas en la interpretacin de los
resultados obtenidos del estudio estadstico y sustentado con revisin
bibliogrfica, lo cual permiti la comprobacin de la hiptesis para establecer
conclusiones y recomendaciones sobre la investigacin desarrollada.

50
CAPTULO IV

ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS
4.1. Anlisis de resultados.
4.1.1. Estandarizacin del mtodo para la cuantificacin de metanol.
Para estandarizar el mtodo de cuantificacin de metanol se utilizo el
cromatografo de gases HP agilen 6895, con las siguientes condiciones, la
presin de nitrgeno fue de 3,9 psi de presin, la temperatura del inyector de
200C el horno que empez con una temperatura de 60C con una rampa de
10C/min hasta 110C permaneciendo ah por 1 minuto, despus de esto una
nueva rampa de 10C hasta llegar a los 140C donde se mantiene por 1minuto,
de esta forma se asegur que los alcoholes con punto de ebullicin menor a
100C puedan ser retenidos por la columna HP-INNOWax, 30m x 0.32mm x
0.25m. La temperatura del detector se mantuvo en 260C, de esta forma la
circulacin del analito se dio por completo y separada. En funcin a la
respuesta de sus reas se pudo establecer los parmetros de estandarizacin
para una futura validacin.
4.1.2. Estandarizacin de los parmetros de validacin
4.1.2.1. Curva de Calibracin.
La curva de calibracin para Metanol se la preparo como se indica en la
Tabla B-1. Los datos de la relacin de reas entre metanol y n-butanol,
obtenidos experimentalmente como indican los cromatogramas de las grficas
C-2, C-3, C-4; C-5, C-6, C-7, C-8, interactuaron con los das de inyectado como
se reportan en la Tabla A-1.

El anlisis de varianza reportado en la Tabla B-2, indica que en la
interaccin doble existen diferencias significativas, entre los factores de
estudio. Al analizar los factores principales de manera individual se encuentra
diferencia estadstica significativa en todos los casos, lo cual denota que al
modificar los niveles de cada factor, vara notablemente la relacin de reas
51
obtenidas en el cromatografo. Por esto se busca la interaccin de los dos
factores seleccionados para el presente estudio y as definir la curva de
calibracin ptima en donde no existan diferencias entre las concentraciones y
los das de corrido.

El Grfico B-1, seala que los niveles de la curva de calibracin y su
ascendencia desde la mnima concentracin hasta la concentracin final. La
Tabla B-3 indica el anlisis de Tukey para las diferencias significativas de las
distintas concentraciones en los dos das, indicando que la diferencia de las
medias entre un da y otro son similares lo que indica la realizacin correcta de
la curva y su respectiva corrida en el cromatgrafo de gases. En el grfico B-2
y B-3 se ven las interacciones y las relaciones de las reas cromatogrficas en
sus distintas concentraciones observndose su similitud entre los das de
anlisis.
4.1.2. 2.Linealidad.
La linealidad se determin estadsticamente analizando las
concentraciones (mg/100ml) distintas de metanol, y las relaciones
experimentales de las reas de metanol y n-butanol, de los datos promediados
del anlisis de varianza realizado para la curva de calibracin.
En la grfica G-1 se indica la recta ajustndose a un modelo lineal con un
coeficiente de regresin igual 0,9987, que para efectos de anlisis de
laboratorio cumple con el lmite mnimo permitido para una regresin que es de
0,995. La ecuacin de la curva de calibracin que ajusta el modelo para la los
estndares establecidos es:

A1/ A2=0,0073[metanol]-0,005

Los valores mximos y mnimos de confianza del presente mtodo analtico
fluctan entre 0,00027 para la pendiente y 0,0019 para la ordenada como se
indica en la Tabla B-4.

52
4.1.2.3. Determinacin de la sensibilidad
La sensibilidad de la calibracin se da por el valor de la pendiente en la
ecuacin de la recta correspondiente a 0,0073, en tanto que la sensibilidad
analtica dio un valor de 0,0195.

4.1.2.4. Determinacin del lmite de deteccin y del lmite de
cuantificacin
El lmite de deteccin (LOD), cantidad mnima de analito presente en la
muestra, dio un valor de 0,6519 mg/100ml (ANEXO B).

El lmite de cuantificacin (LOQ), cantidad de analito que ha sido
detectada dio un valor de 4,40 X 10
-06
mg/100ml. (ANEXO B).
4.2. Material de referencia.

4.2.1 Preparacin de la muestra,

El material de referencia Brandy Fapas resultado de una ronda inter
laboratorios llevada a cabo en el mes octubre del 2011, convertido en material
de referencia despus de su respectiva evaluacin, como est indicado en el
procedimiento la muestra fue sometida a una destilacin previa para obtener el
grado alcohlico real tal como se indica en la Tabla A-5.
En las tablas B-5, B6 y B-7 se indica la comparacin de medias y desviaciones
entre el resultado real y el obtenido en las distintas rplicas durante tres das.
4.3 Verificacin de Hiptesis
Despus de realizar el anlisis estadstico en las tablas B-5, B6 y B-7,
es posible aceptar la hiptesis nula, lo que establece que los tratamientos
resultantes del producto de la correlacin de los factores de estudio no
presentan diferencias significativas en sus medias de las respuestas
experimentales al momento de ser relacionadas con los valores crticos
tabulados a niveles de confianza del 95%.

53
CAPTULO V

CONCLUSIN Y RECOMENDACIONES

5.1 Conclusiones:

5.1.1 El presente estudio estableci 3 pasos para el proceso de
estandarizacin, preparacin de la curva de calibracin, destilacin y medida
de grado alcohlico del material de referencia y la cuantificacin de la
concentracin de metanol por medio del cromatografo de gases acoplado a un
detector de ionizacin de llama. En la validacin de mtodos analticos para
laboratorios existen varios pasos que se deben cumplir. Por ello, el presente
estudio se bas en estandarizar el mtodo que permita cuantificar la
concentracin de metanol existente en bebidas alcohlicas, y algunos de los
parmetros de validacin, utilizando como herramienta principal de anlisis al
GC-FID y como muestra el material de referencia con concentracin de
metanol conocida.

5.1.2 Segn la curva de calibracin los resultados indican una interaccin entre
los das de inyectado y las concentraciones inyectadas en el cromatografo.
Esto demuestra que la relacin de reas de metanol y n-butanol para las
diferentes concentraciones se mantienen con una diferencia mnima entre los
dos das de corrida. El coeficiente de correlacin lineal obtenido fue de 0,9993
que est dentro de los lmites de aceptacin para la linealizacin.

5.1.3 El valor obtenido para el lmite de deteccin se considera cualitativo
porque no afecta directamente en la medicin de la respuesta del equipo, en
tanto que el lmite de cuantificacin es indicativo de que se puede detectar el
metanol sin incurrir en falsos positivos, y quedando establecida as la curva de
calibracin de manera confiable.

54
5.2.3 La destilacin del material de referencia dio pequeas variaciones en las
lecturas del alcoholmetro de Gay-Lussac que no influyeron en los posteriores
clculos para determinar la concentracin de metanol ya que la determinacin
segn las normas indica que los resultados deben ser reportados nicamente
en alcohol anhidro, es decir en base seca.

5.2.4 Para el anlisis estadstico de la prueba de hiptesis realizada entre la
concentracin de metanol reportada y la concentracin obtenida, no se vieron
diferencias en un lmite de confianza del 95% por lo que la comprobacin de la
estandarizacin del mtodo fue verificada. El presente mtodo analtico
empleado se puede considerar sumamente til para la determinacin de
metanol en bebidas alcohlicas por no presentar diferencias significativas entre
las corridas del material de referencia y lo reportado.

5.1.5 En la investigacin desarrollada, no se emplearon estndares certificados
para la preparacin de la curva de calibracin, sin embargo el metanol utilizado
fue de pureza cromatogrfica. Para reducir el error se utiliz el estndar interno
n-butanol, as la relacin de reas al momento de calcular la concentracin no
afect en los resultados obtenidos.

5.1.6 Se cuantificaron diez muestras de bebidas alcohlicas, que por
confidencialidad del laboratorio no se han colocado sus marcas, sacando su
respectivo grado alcohlico y su concentracin de metanol obtenida en el
cromatografo de gases, de estas muestras tres no presentan contaminacin
por metanol, pero hay otras tres que salen de los lmites permisibles indicados
en la norma tcnica ecuatoriana.
5.2 Recomendaciones.

5.2.1 La determinacin precisa y exacta del grado alcohlico para bebidas
alcohlicas es de suma importancia porque el reporte de los resultados se
expresa directamente como alcohol anhidro. Para ello, es importante tener en
consideracin las temperaturas indicadas en la escala Gay Lussac, sea
nicamente a 15 C o 20C. Por otro lado, el procedimiento para la destilacin
55
de las muestras que lo necesitan debe realizarse bajo la normativa existente,
en este caso, la norma Tcnica ecuatoriana INEN 340 porque nicamente de
esa manera se garantiza el resultado.

5.2.2 Para la correcta cuantificacin del metanol se requiere que la seal del
cromatgrafo mantenga una lnea base lo ms cercana al cero, para de esta
forma evitar errores de lecturas del detector. Esto se logra acondicionando la
columna en las condiciones de inyeccin, pero nicamente utilizando solvente
como hexano. Adicionalmente, si el detector presenta seales con valores
altos, es recomendable realizar una limpieza del mismo.

5.2.3 El mtodo propuesto puede ser utilizado en la cuantificacin de cualquier
otro tipo de alcoholes, steres y aldehdos congneres, pero para ello se
requiere previamente la estandarizacin del mtodo para cada componente.

5.2.4 Uno de los mayores inconvenientes que e presenta en nuestro medio es
el acceso a estndares de referencia, los mismos que nicamente se los
consigue por medio de importacin, lo cual genera mucho tiempo de espera,
adems de los elevados costos. Si existe la necesidad de validar un mtodo, lo
primero que se debe realizar es solicitar la importacin de dichos reactivos.

56
CAPTULO VI
PROPUESTA
6.1 Datos Informativos

Ttulo: Verificacin del contenido de metanol en Bebidas alcohlicas
mediante la utilizacin de cromatografa de gases y el cumplimiento de
las normativas tcnicas ecuatorianas

Unidad Ejecutora: Universidad Tcnica de Ambato.
Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos.
Laboratorio de Anlisis y Control de Alimentos LACONAL.

Beneficiario: Estudiantes de la Facultad de Ciencia e Ingeniera en
Alimentos: Carrera de Ingeniera Bioqumica, y la sociedad en general

Director del Proyecto: Dr. Roman Rodrguez Ph. D.
Personal Operativo: Egdo. Eduardo Luna
Tiempo de Duracin: 10 meses
Lugar de Ejecucin: LACONAL
Costo: 5000 $.
6.2 Antecedentes de la Propuesta

El metanol es un alcohol extremadamente txico y nocivo para la salud
de los seres humanos, muy utilizado en los anlisis qumicos y como solvente
industrial puede estar presente en bebidas alcohlicas. Dado que la
comercializacin de las mismas implica la obtencin de grandes ganancias
econmicas, algunos productores utilizan materia prima de procedencia dudosa
y esto implica que la calidad de las mismas no satisfaga los parmetros
establecidos en las distintas normas tcnicas que tienen lmites mximos
permisibles de los diferentes compuestos ya sean por producto de la
fermentacin o congnere de las bebidas alcohlicas.
57
Las bebidas alcohlicas estn sujetas a verificaciones del cumplimiento
de los estndares de calidad, pero en el Ecuador el poco o casi inexistente
control a generado que no se conozca a ciencia cierta si las mismas cumplen
con lo establecido en las normas tcnica ecuatorianas INEN.
Por este motivos, aprovechando el instrumental existente en el
laboratorio de Control y Anlisis de Alimentos de la Facultad de Ciencia e
Ingeniera en Alimentos de la Universidad Tcnica de Ambato, despus de la
estandarizacin del mtodo de anlisis por cromatografa de gases para la
determinacin de la concentracin de metanol en bebidas alcohlicas,
monitorear la calidad de los licores nacionales e importados, y de esta forma
establecer un centro de control de calidad que brinde informacin tcnica sobre
el cumplimiento o no de los limites sealados en las NTE-INEN.
6.3 Justificacin
La importacin de las bebidas alcohlicas en pases en vas de
desarrollo es bastante elevada, ya sea por la publicidad o simplemente la
necesidad de beber algo extranjero, la comercializacin de licores importados
produce unos ingresos del orden de billones de dlares anuales. Entre las
bebidas de mayor demanda para la importacin estn los vinos, whisky, tequila,
vodka, ron entre otras, que se expanden en el pas sin una certificacin extra
que evalu la calidad real de estas bebidas.

La cuantificacin de metanol en las bebidas alcohlicas importadas por
medio de la cromatografa de gases que es un mtodo rpido, preciso y exacto
que tiene un costo relativamente bajo y amplia aplicabilidad a las separaciones
analticas, adems brinda informacin cuantitativa acerca de las especies que
separa. Todo esto permitir obtener datos reales sobre la concentracin de
metanol existente en las distintas bebidas alcohlicas importadas, de esta
forma determinar si cumplen con las normas tcnicas ecuatorianas INEN.[7]

58
6.4 Objetivos

General
Verificar el contenido de metanol en Bebidas alcohlicas mediante la
utilizacin de cromatografa de gases y el cumplimiento de las
normativas tcnicas ecuatorianas.

Especficos
Preparar la muestra para establecer los parmetros fsicos de las
bebidas alcohlicas importadas por medio de la destilacin.

Cuantificar la concentracin de metanol en las bebidas
alcohlicas, por cromatografa de gases.

Comparar los resultados obtenidos de la cuantificacin de
metanol en las bebidas alcohlicas nacionales e importadas, con
los lmites mximos permitidos indicados en las normas tcnicas
ecuatorianas INEN

6.5. Anlisis de Factibilidad

El estudio ha desarrollarse es de tipo investigativo y tecnolgico, ya que
con ello se puede implementar un mtodo confiable para verificar si las bebidas
alcohlicas cumplen con los parmetros establecidas segn la normativa
tcnica del Ecuador.

Este anlisis de factibilidad es de carcter econmico, porque se podr
valorar el grado de concentracin de bebidas alcohlicas importadas a bajo
costo, constituyendo un aporte valioso para la evaluacin de la calidad de las
bebidas alcohlicas.

El conocer la calidad de las bebidas alcohlicas se convertir en una
excelente alternativa para el control de calidad de la comercializacin de este
tipo de productos.
59
Tabla 6-1 Recursos Econmicos Estimados para la Propuesta Planteada
Recursos humanos UTA GRADUANDO
Tutor 1000
Egresado
Recursos fsicos
Materia prima 1800
Reactivos 1200
Material de escritorio 400
Recursos econmicos
Transporte 250
Imprevistos 200
Publicaciones 150
Subtotal
Total 5000
David Luna

6.6 Fundamentacin

La cromatografa de gases es una tcnica de separacin analtica que
ha experimentado un gran desarrollo desde sus inicios en los aos 50, se la
utiliza en la resolucin de diversos problemas en la industria, en la medicina, en
la biologa y en el anlisis ambiental, convirtindose en la actualidad como una
herramienta para el control en una gran variedad de reas. [8]

mayor disponibilidad y consumo de alcohol. [1],

Para evitar indeseados problemas de intoxicacin por metanol como ya
ocurri en el Ecuador en el mes de J ulio del ao 2011 es necesario tener un
60
control riguroso en la calidad de las bebidas expendidas en el mercado, tanto la
nacionales con las importadas, lamentablemente no existe base de datos
alguna que permita tener una idea de los licores importados y su respectivo
certificado de calidad nacional, sino simplemente la idea de que si viene de
afuera es bueno, sin pensar en si cumplen o no con los requerimientos tcnicos
requeridos por el organismo de control local.

6.7. Metodologa. Modelo Operativo

Tabla 6-2 Modelo Operativo (Plan de accin)
Fases Metas Actividades Responsable Recursos Pres. Tiempo
Formulacin
de la
propuesta
Verificacin de la
concentracin de
metanol en las
bebidas alcohlicas

Revisin
bibliogrfica
Investigador
Humanos
Tcnicos
Econmicos
$800
2
meses
Desarrollo
preliminar de
la propuesta

Cronograma de la
propuesta
Obtencin de
Materia prima
Extraccin del
analito de
estudio.
Fijacin de la
concentracin
de metanol
Investigador
Humanos
Tcnicos
Econmicos
$ 3750
3
meses
Implementaci
n de la
propuesta

Ejecucin de la
propuesta
Aplicacin de
la tcnica de
cromatografa
de gases
acoplada a
detector de
ionizacin de
llama para
cuantificar la
concentracin
de metanol en
bebidas
alcohlicas.
Investigador
Humanos
Tcnicos
Econmicos
$ 1500
2
meses

61

Evaluacin de
la propuesta

Comparacin de
los datos obtenidos
Comprobacin
de los
resultados
obtenidos
comparados
con los de las
normas
tcnicas
ecuatorianas
INEN

Investigador

Humanos
Tcnicos
Econmicos

$ 1200

2
meses
David Luna
6.8. Administracin

La ejecucin de la propuesta estar coordinada por los responsables del
proyecto Dr. Roman Rodrguez y Egdo. David Luna.

Tabla 6-3 Administracin de la propuesta.
Indicadores a
mejorar
Situacin
actual
Resultados
esperados
Actividades Responsables

Verificacin del
cumplimiento
con las
normativas
tcnicas
ecuatorianas
del contenido
de metanol en
Bebidas
alcohlicas
mediante la
tcnica de
cromatografa
de gases

Inexistencia
de estudios
realizados
dentro del
pas que
determinen la
concentracin
de metanol
en bebidas
alcohlicas
Obtencin de
una base de
datos
confiables
que permitan
conocer la
concentracin
de metanol
en las
distintas
bebidas
alcohlicas y
la respectiva
comparacin
con las
normas
tcnicas
ecuatorianas
Determinar
de la
concentracin
de metanol
en las
muestras de
estudio.

Realizar
anlisis
comparativos
entre las
bebidas
alcohlicas y
las NTC-
INEN.

Dr. Roman
Rodrguez.
Egdo. David
Luna
David Luna.

62
6.9. Previsin de la Evaluacin
Tabla 6- 4 Previsin de la Evaluacin de la Propuesta
Preguntas Bsicas Explicacin
Quines solicitan evaluar?

Sector Cientfico.
Por qu evaluar?
Utilizacin de mtodos analticos
confiables en la cuantificacin de
metanol en bebidas alcohlicas
Para qu evaluar?
Determinacin de niveles de
confiabilidad de la calidad de las
bebidas alcohlicas
Qu evaluar?
Materia prima
Tecnologa empleada.
Muestras de anlisis.
Resultados obtenidos
Quin evala?
Director del proyecto
Tutor
Calificadores
Cundo evaluar?
El tiempo necesario desde las
pruebas preliminares, hasta los
anlisis finales de comparacin de
resultados.
Cmo evaluar?
Mediante instrumentos de
evaluacin.
Con qu evaluar?
Experimentacin.
y Normativas Y comparacin
con las normativas tcnicas
ecuatorianas existentes
David Luna
63
Bibliografa.
[1]. Monteiro, Maristela G. 2007. Alcohol y salud pblica en las Amricas: un
caso para la accin. Washington, D.C: OPS pgina 33, disponible en:
www.paho.org/spanish/dd/pin/A&SP.pdf

[2]. Consumo de bebidas alcohlicas.
Accedido el 20/02/2012
http://www.greenfacts.org/es/alcohol/l-2/02-alcohol-consumption.htm#1

[3]. 50 muertes por metanol
http://elcomercio.com/pais/muertes-metanol_0_547145479.html

[4]. Uribe, C. 1989. Manual de Toxicologa Clnica. Editorial Temis. Pgina 85,
86.

[5]. Bazau ngel. 1862. Estudios qumicos para el descubrimiento de las
adulteraciones de varias sustancias alimenticias. Numero 6 pgina 3.

[6]. ENCICLOPEDIA DE SALUD Y SEGURIDAD EN EL TRABAJ O Capitulo
industria de las bebidas Lance A. Ward Ginebra pgina 10

[7]. SKOOG, Douglas A.; WEST, Donald M. y HOLLER, F, J ames. 2005.
Fundamentos de Qumica analtica. Octava edicin. International Thomson
Editores, S.A. Pgina 218, 979

[8]. Valcarcel M, Gomez A. 1988. Tcnicas analticas de separacin editorial
Revert S.A. Barcelona Espaa pgina 615.

[9]. MAROTO, Alicia. 2002. Incertidumbre en mtodos analticos de rutina.
Universitat Rovira I Virgili. Departamento de Qumica Analtica y Qumica
Orgnica. Pgina 24

64
[10] Morrison y Boyd. 1990 Qumica orgnica 5ta edicin Addison Wesley
Iberoamericana, S.A. USA pgina 629.

[11] Merck Co. Inc. Rahway. The Merck Index. 1983 13. Edicin., NJ , USA.
1463 pgina 853.

[12] Primo Yfera Eduardo. 1996. Qumica orgnica bsica y aplicada: de la
molcula a la industria, Volumen 1 editorial revert. pgina 337.

[13] Rodrguez R. Uribe M. Obtencin de metanol propiedades usos editorial
universidad tecnolgica nacional Buenos Aires Argentina pgina 4, disponible
en:
http://www.edutecne.utn.edu.ar/procesos_fisicoquimicos/Obtencion_de_Metano
l.pdf

[14] Riesgo Qumico - Accidentes Graves Metanol Regin de Murcia Consejera
de Sanidad Direccin General de Salud Pblica Servicio de Sanidad Ambiental
2007. Disponible en: www.murciasalud.es/archivo.php?id=99967

[15] Snchez L. 2005. Determinacin de metanol en bebidas alcohlicas
fermentadas tradicionales y populares de mayor consumo en dos regiones de
la repblica de Guatemala por cromatografa de gases.
Tesis de Grado. Universidad de San Carlos De Guatemala Facultad De
Ciencias Qumicas Y Farmacia

[16] Norma Tcnica ecuatoriana NTE-INEN 362, 1992 07

[17] Norma Tcnica ecuatoriana NTE-INEN 368 1978 05

[18] Norma Tcnica ecuatoriana NTE-INEN 1837. 1997 07

[19] Norma Tcnica ecuatoriana NTE-INEN 366 ao1987-07

[20] Norma Tcnica ecuatoriana NTE-INEN 363 1992-07.
65

[21 Norma Tcnica ecuatoriana NTE-INEN 372 ao 1987-07.

[22] Norma Tcnica ecuatoriana NTE-INEN 374 ao 1987-07.

[23] Norma Tcnica ecuatoriana NTE-INEN 374 ao 1987-07.

[24] HARRIS, Daniel. 2007. Anlisis Qumico Cuantitativo. Grupo editorial
Iberoamrica. Volumen 1. Pgina 637

[25] CASTELLUCCI, Federico. 2005. Recomendaciones armonizadas para la
validacin de mtodos de anlisis en un solo laboratorio. Simposio sobre
armonizacin de sistemas de garanta de calidad para laboratorios analticos.
oiv: Organisation internationale de la vigne et du vin

[26] Norma INEN ISO/IEC 17025. 2002

[27] FDA. 2000. Guidance for Industry. Analytical Procedures and Methods
Validation Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation. /Center for
Drug Evaluation and Research.

[28] Crubellati R. ,[et.al.]. 2009. Aspectos prcticos de la validacin e
incertidumbre en medidas qumicas / - 1a ed. - Buenos Aires : Ciencia y
Tecnologa para el Desarrollo - CYTED, 2009. Pginas 20, 21, 5

[29] Skoog, Holler, Nieman, 2001. Principios de anlisis instrumental 5 edicin,
editorial Mc Graw Hill/ Interamericana de Espaa S.A.U. pgina 12.

[30] Laboratorios Ambientales. 2009. Directrices para la Acreditacin,organismo
de uruguayo de acreditacin, DINAMA, pgina 24.

[31] Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos Bilogos, (2002)].

66
[32] HARVEY, David. 2002. Qumica Analtica Moderna. Editorial McGraw-
Hill/Interamericana de Espaa, Madrid-Espaa. 542pgs.

[33] Alma, conocimiento, tica
http://www.biografiasyvidas.com/monografia/aristoteles/filosofia.htm

[34] tica
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%89tica#Edad_Contempor.C3.A1nea

[35] Constitucin de la republica del Ecuador. 2008

67

ANEXOS A

Tablas de resultados

68
Tabla A-1 Relacin de reas de metanol (A1) con n-butanol (A2) A1/A2

Tratamientos
Relacin de reas A1/A2
R1 R2 R3 Promedio
T1(a0b0) 0 0 0 0,0000
T2(a0b1) 0 0 0 0,0000
T3(a1b1) 0,0128 0,0116 0,0125 0,0123
T4(a1b2) 0,0116 0,0104 0,0114 0,0111
T5(a2b1) 0,0252 0,0246 0,0254 0,0251
T6(a2b2) 0,0259 0,026 0,025 0,0256
T7(a3b1) 0,1131 0,1112 0,12 0,1148
T8(a3b2) 0,1158 0,1235 0,1132 0,1175
T9(a4b1) 0,3166 0,3201 0,3145 0,3171
T10(a4b2) 0,3196 0,3111 0,3125 0,3144
T11(a5b1) 0,674 0,6599 0,6699 0,6679
T12(a5b2) 0,6698 0,66 0,6668 0,6655
T13(a6b2) 1,0885 1,0985 1,0835 1,0902
T14(a6b2) 1,1029 1,1134 1,1045 1,1069

Factor A: Concentracin mg/100ml.

Nivel a0: 0,00
Nivel a1: 1,57
Nivel a2: 3,15
Nivel a3:15,74
Nivel a4:47,21
Nivel a5: 94,41
Nivel a6:149,49

Factor B: Das

Nivel b1: Da 1.
Nivel b2: Da 2.

R1, R2 y R3: Rplicas.

69
Parmetros para la validacin:

Tabla A-2 Recuperacin en porcentaje.

N.- mg/100ml
Relacin
de reas
A1/A2
Promedio
reas
concentracin
de metanol
mg/100ml
(cromatgrafo)
% de
Recuperacin
1 0 0,0000
2 0 0,0000 0,0000 0,0000 0,000
3 0 0,0000
4 1,57 0,0128
5 1,57 0,0116 0,0124 2,3531 149,542
6 1,57 0,0128
7 3,15 0,0252
8 3,15 0,0259 0,0255 4,1515 131,915
9 3,15 0,0254
10 15,74 0,1131
11 15,74 0,1158 0,1138 16,2888 103,517
12 15,74 0,1126
13 47,21 0,3166
14 47,21 0,3196 0,3160 44,0567 93,328
15 47,21 0,3118
16 94,41 0,6740
17 94,41 0,6698 0,6679 92,3911 97,859
18 94,41 0,6598
19 149,49 1,0885

20 149,49 1,1029 1,0994 151,6699 101,461
21 149,49 1,1068

Ecuacin de linealidad de la curva de calibracin

Conccntrocin Jc mctonol
mg
100ml
=(

Arco Jc mctonol
Arco Jcl n butonol
+o
m 0I
FJ)

70

Tabla A-3 Curva de Calibracin

[metanol]mg/100ml
Da 1
Relacin
de
reas
A1/A2
Da 2
Relacin
de
reas
A1/A2
Da 3
Relacin
de
reas
A1/A2
0,00 0 0 0
1,57 0,0128 0,0116 0,0128
3,15 0,0252 0,0259 0,0254
15,74 0,1131 0,1158 0,1126
47,21 0,3166 0,3196 0,3118
94,41 0,674 0,6698 0,6598
149,49 1,0885 1,1029 1,1068
Tabla A-4. Promedios de la curva de calibracin

[metanol]
mg/100ml
Relacin de
reas A1/A2
0,00 0,000
1,57 0,012
3,15 0,026
15,74 0,114
47,21 0,316
94,41 0,668
149,49 1,099
Material de Referencia
Tabla A- 5 Grado Alcohlico Brandy FAPAS

RPLICAS
Grado Alcohlico
(GL)
1 38,4
1 38,4
1 38,4
2 38,3
2 38,3
2 38,3
3 38,6
3 38,6
3 38,6
71

Tabla A-6 Relacin de reas del Material de Referencia
FAPAS Brandy Concentracin de metanol de 13,49mg/100ml de alcohol
anhidro
CONC. mg/100ml
FAPAS Brandy
Relacin de reas mg/100ml de alcohol anhidro
DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 1 DIA 2 DIA 3
1
0,037 0,035 0,0376 14,75 14,10 15,05
0,034 0,037 0,0362 13,72 14,90 14,56
0,034 0,037 0,0357 13,74 14,87 14,39

Tabla A-7 Concentracin de metanol [mg/100ml] de muestras aleatorias
de bebidas alcohlicas

Muestra Grado alcohlico GL
Concentracin Metanol
[mg/100ml]
1 14 4,6663
2 15 No detectado
3 16 19,4109
4 11 No detectado
5 11 10,5218
6 11 588,2127
7 38 224,2472
8 17 4,5133
9 17 39565,4561
10 13 No detectado

72

ANEXOS B

Anlisis Estadstico

73

Curva de calibracin

Volumen final de estndares: 50 ml (con disolucin de
etanol 40 GL)
Disolucin de metanol al 10%: 7900 mg/100 cc)
Disolucin de n_butanol (Estndar Interno) al 10%: 81
mg/100 cc (terico)
Masa de 10 ml de metanol (99,9%) 7,8677
Masa de 10 ml
de n_butanol (99,5%) 8,0557
Concentracin de metanol al 10% 78,677
Concentracin de n-butanol al 10% 80,557

Tabla B-1 Curva de calibracin

V stock Butanol al 10% V stock Metanolal 10% [Metanol]
(L) (L) (mg/100 cc)
500 0 0
500 10 1,57
500 20 3,15
500 100 15,74
500 300 47,21
500 600 94,41
500 950 149,49

Esta curva fue realizada en funcin de la norma AOAC Official Method 972.11,
partiendo de una solucin patrn y llevando a las distintas concentraciones
indicadas en la tabla B-1.

Tabla B-2 Anlisis de varianza para la relacin de reas de la
concentracin de metanol A1 y n- butanol A2 (A1/A2).

74

Grfico B-1. Factores principales para la relacin a1/a2

Elaborado por David luna.

Tabla B-3 Anlisis de Tukey para diferencias significativas.

75
InteractionPlot
Concentraciones
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
r
e
l
a
c
i
o
n

d
e

a
r
e
a
s
1 2 3 4 5 6 7
Dias
1
2

Grfico B-2. Interacciones de la relacin de reas y las concentraciones


Grfico B-3 Interacciones de los factores relacin A1/A2.

Tabla B-4 Lmites de confianza
Lmites de confianza de la pendiente:

IC
b
=b tS
b

IC
b
=0,0073(2,57 0,0001
IC
b
=0,00730,00027

Lmites de confianza de la ordenada al origen:
IC
u
=o tS
u

76
IC
u
=0,0047(2,57 0,0074)
IC
u
=0,00470,0019
DETERMINACIN DE LA SENSIBILIDAD
Sensibilidad de calibrado:
Pendiente b =0,0073
Sensibilidad Analtica:
y =
Ss
m
Fc
y =
0,0014
0,0073
0,05
y =0,0195

DETERMINACIN DEL LMITE DE DETECCIN Y DEL LMITE DE
CUANTIFICACIN
Lmite de Deteccin:
I0 =
S y x
m
_
1
m
+
1
N
+
X
2
(Xi X
)
2 N
=1

I0 =
0,0014
0,0073
_
1
6
+
1
7
+
(44,509)
2
19881,09

I0 =0,6519
Lmite de Cuantificacin:
I0 =
S y x
k
m_
1
m
+
1
N
+
X
2
(Xi X
)
2 N
=1

I0 =
0,028
10
0,0073_
1
5
+
1
6
+
(44,509)
2
19881,09

I0 =4,40E-06

Corrida Material de referencia Brandy Fapas.


Hypothesis Tests
Sample means =13, 49 and 14,12
Sample standard deviations =1,032 and 0, 59
Sample sizes =1 and 3
95,0% confidence interval for difference between means: -0,63 +/- 2,93128 [-
3,56128,2,30128]
77
Null Hypothesis: difference between means =0,0
Alternative: not equal
Computed t statistic =-0, 924739
P-Value =0,452725
Do not reject the null hypothesis for alpha =0, 05.


Hypothesis Tests
Sample means =13,49 and 14,67
Sample standard deviations =1,032 and 0,45
3,41572,1,05572]
Computed t statistic =-2,27091
P-Value =0,151145
Do not reject the null hypothesis for alpha =0,05.


Hypothesis Tests
Sample means =13,49 and 14,71
Sample standard deviations =1,032 and 0,34
1,43427,-1,00573]
Computed t statistic =-11,228
P-Value =1,55431E-14
Reject the null hypothesis for alpha =0,05.

78

ANEXOS C

Grficas

79

Grfica C-1 Datos de la curva de calibracin de metanol y la relacin de reas
Metanol/n-Butanol.

Grfica C-2 Cromatogramas de Metanol a 0mg/100ml

y =0,0073x - 0,005
R =0,9987
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
0 50 100 150 200
R
e
l
a
c
i
r
e
a
s

(
M
e
t
a
n
o
l
/
n
-
B
u
t
a
n
o
l
Concentracin Metanol (mg/100cc)
Curva da calibracin Metanol
Curva da calibracin Metanol
80

Grfica C-3 Cromatogramas de Metanol a 1,570mg/100ml


Grfica C-5 Cromatogramas de Metanol a15,74 0mg/100ml

[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0
1
2
3
4
5
16_Feb_2012_st d_10
6
,
8
0
0

1
7
,
0
1
0

2
9
,
4
7
7

3
[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0
1
2
3
4
5
6
16_Feb_2012_st d_20
6
,
7
9
7

1
6
,
9
9
7

2
9
,
4
8
3

3
[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0
1
2
3
4
5
6
16_Feb_2012_st d_100
6
,
7
8
3

1
6
,
9
8
7

2
9
,
4
8
0

3
81


Grfica C-7 Cromatogramas de Metanol a 9 4,10mg/100ml


[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0
1
2
3
4
5
6
16_Feb_2012_st d_300
6
,
7
9
0

1
6
,
9
9
7

2
9
,
4
8
0

3
[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0
2
4
6
16_Feb_2012_st d_600
6
,
7
8
7

1
6
,
9
8
3

2
9
,
4
8
7

3
[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0
1
2
3
4
5
6 16_Feb_2012_st d_950
6
,
7
8
7

1
6
,
9
9
3

2
9
,
4
7
7

3
82




[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0
2
4
6
16_f eb_2010_f apas_1
5
,
8
9
3

1
6
,
3
5
0

2
6
,
7
4
0

3
6
,
8
3
0

4
7
,
0
2
7

5
8
,
1
3
0

6
8
,
6
3
0

7
9
,
5
3
3

8
9
,
8
0
3

9
1
0
,
3
9
0

1
0
[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
17_febr _2012_f apas_2
6
,
3
3
3

1
6
,
8
0
7

2
7
,
0
6
0

3
8
,
1
4
3

4
9
,
5
3
3

5
1
0
,
0
2
0

6
1
0
,
3
8
7

7
[min.]
Time
0 2 4 6 8 10
[V]
V
o
l
t
a
g
e
0
1
2
3
4
20_f eb_2012_f apas_3
4
,
6
5
0

1
6
,
4
0
0

2
6
,
8
8
3

3
7
,
1
0
3

4
8
,
1
8
7

5
8
,
7
3
0

6
9
,
5
7
0

7
1
0
,
0
4
7

8
1
0
,
4
2
0

9
83

ANEXOS D

Diagramas
D
0 2
[V]
V
o
lt
a
g
e
0
1
2
3
4
Diagrama D-1 Es
Time
4 6
4
,
6
5
0

1
6
,
4
0
0

2
6
,
8
8
3

3
7
,
1
0
3

4
FAPASBran
Cromatogram
standarizacin d
[min.]
8 10
20_f eb_2012_f apas_3
8
,
1
8
7

5
8
,
7
3
0

6
9
,
5
7
0

7
1
0
,
0
4
7

8
1
0
,
4
2
0

9
dy
a
del metanol.
Desttilacin
Inyeccin
cromatografo
gasesacoplado
de
FID
G
alc
Tomade
muestra
Grado
cohlico
Curvade
calibracin

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