Anlisis comparativo de estabilizacin y conformacin espacial

para la Hemoglobina en presencia de diferentes ligandos (COHb y

OHb) y en ausencia del mismo.
Informe Mauricio vila seminario 959 - Protenas.
Resumen
La Hemoglobina es la protena encargada
de transportar el oxgeno en la sangre, la
misma posee una coloracin roja
caracterstica que se debe al complejo
formado por el grupo Hemo y el oxgeno.
Dicha protena puede estar con el grupo
Hemo enlazado a un grupo CO (monxido
de carbono) con lo que puede causar
diferentes patologas, por ejemplo la
hipoxia tisular.
El siguiente artculo pretende analizar tres
estructuras de la Hemoglobina a decir:
desoxihemoglobina (DesOHb),
oxihemoglobina (OHb) y
carbomonoxihemoglobina (COHb).
Las mismas sern analizadas a nivel
estructural abordando su estructura
primaria, secundaria, terciara y cuaternaria
(haciendo nfasis en las primeras tres). As
como tambin el grado de desorden
presente en la secuencia y las interacciones
entre el grupo Hemo y los aminocidos
circundantes.
Introduccin
La hemoglobina es la protena
transportadora de oxgeno en la sangre; la
misma es una protena alostrica. Es un
tetrmero compuesto de dos tipos de
subunidades designadas y , con
estequiometria 22. Las cuatro
subunidades de la hemoglobina se sitan
en las cuatro esquinas de un tetraedro.
Cada una de las cuatro subunidades
contiene un grupo prosttico; el grupo
Hemo, los cuales le confieren a la
hemoglobina el color rojo.
Cada grupo Hemo contiene un tomo de
Fe
2+
; en los pulmones (donde el oxgeno es
abundante) una molcula de oxgeno se
une al hierro del grupo Hemo de la
protena para despus soltarlo (al oxigeno)
en los tejidos que lo precisen.
Ya que el siguiente informe est basado en
modelos bioinformticos, resulta
pertinente una breve definicin de dicho
campo de estudio; tomada del libro
Structural Bioinformatics de Bourne-
Weissig:
Basados en el uso actual de la literatura
cientfica, la bioinformtica puede ser
definida como el estudio de dos flujos de
informacin en la biologa molecular
(Altman, 1998).
El primer flujo de informacin se basa en el
dogma central de la biologa molecular:
Secuencias de ADN se transquiben a
secuencias de mARN, las cuales se traducen
a secuencias de protenas.
Las secuencias de protenas se pliegan en
una estructura tridimensional (3D) que
tiene funciones. Estas funciones son
seleccionadas por, en un sentido
Darwiniano, el ambiente del organismo,
que conduce la evolucin de la secuencia
de ADN dentro de la poblacin. La primera
clase de aplicaciones bioinformticas,
entonces puede direccionar la transferencia
de informacin a cualquier nivel en el
dogma central, incluyendo la organizacin
y control de genes en la secuencia de ADN,
la identificacin de unidades transcriptivas
de ADN, la prediccin de la estructura
proteica en base a la secuencia, y el anlisis
de la funcin molecular.
El segundo flujo de informacin se basa en
el mtodo cientfico: se crean hiptesis
respecto a la actividad biolgica, se
disean experimentos para probar estas
hiptesis, se evalan los datos resultantes
en busca de compatibilidad con la hiptesis
y extender o modificar la hiptesis en base
a estos datos. La segunda clase de
aplicaciones bioinformticas direccionan la
trasferencia de informacin dentro de este
protocolo, incluyendo sistemas que
generan hiptesis, disean experimentos,
almacenan y organizan datos de estos
experimentos en bases de datos, prueban
la compatibilidad de los datos con los
modelos y modifican la hiptesis.
Si observamos la hemoglobina se aprecia
que el grupo Hemo (grupo prosttico de la
protena) es estabilizado por los
aminocidos circundantes, y la interaccin
que vaya a tener con sus ligandos, o la
ausencia del mismo va a afectar esta
estabilizacin.
A su vez estas interacciones
(electroestticas, fuerzas de Van der
Waals, hidrofbicas, puentes de hidrgeno
y puentes salinos) van a determinar la
conformacin que va a tener la protena a
nivel terciario ms all de la protena.

Metodologa de trabajo
El abordaje que se hace es el siguiente:
- Se descargan los archivos PDBs de la base
de datos (Protein Data Bank), cabe decir,
libres y de uso comunitario.
- Los mismos se analizan con DS Visualizer
Studio (software tambin libre) con el fin
de determinar cuantitativamente las
distancias entre las protena que se ven
mayormente afectadas con la variacin del
ligando, as como los ngulos de los
mismos.
- Se analiza on-line por Ligand Explorer las
interacciones grupo Hemo-AA circundantes
a nivel 3D y con Receptor-Ligand
Interections (del DS Visualizer) a nivel 2D.
- Se determina el desorden de la protena
segn la secuencia aminoacdica (con
DISOPRED) con el fin de realizar una
primera evaluacin de si la protena sera o
no cristalizable, as como determinar la
confiabilidad de los modelos cristalizados.
- Se realiza una simulacin 3D de las
secuencias de las protenas en cuestin y
se los compara con los PDBs descargados
anteriormente.
Manipulacin Bioinformtica
Los modelos PDBs evaluados con DS
Visualizer fueron el 2DN1 (OHb), 2DN2
(DesOHb) y 2DN3 (COHb).
Los tres son modelos de hemoglobina
humana determinados con una resolucin
de 1.25 por cristalografa de rayos X.
En los mismos se pueden ver variabilidad
en la disposicin que tomarn algunos
aminocidos circundantes que se
evaluarn a decir: En la cadena : His58,
His87, Leu83 y Leu101; en la cadena :
His63, His92, Leu88 y Leu106.
Cabe destacar que las cadenas y en la
hemoglobina poseen esencialmente la
misma secuencia aminoacdica a pesar de
ello la cadena tiene cinco aminocidos
ms, por eso los aminocidos en cuestin
son los mismos, cinco posiciones corridos
los de la cadena respecto a la .
As como tambin el ngulo que tiene el
ligando en 2DN1 y 2DN3 de manera
comparativa; como se puede apreciar en la
siguiente tabla (tabla 1):
O-Hb desO-Hb CO-Hb
Cadena
Distancia Fe-O: 1,817 Distancia Fe-His87: 2,196 Distancia Fe-O: 1,817
Distancia Fe-His87: 2,071 Distancia Fe-Leu101: 5,661 Distancia Fe-His87: 2,071
Distancia O-Leu101: 4,096 Distancia His58-COOH1: 5,776 Distancia O-Leu101: 4,096
Distancia His58-COOH1: 4,107 Distancia His58-COOH2: 4,904 Distancia His58-COOH1: 4,107
Distancia His58-COOH2: 2,785 Distancia Leu83-COOH: 5,176 Distancia His58-COOH2: 2,785
Distancia Leu83-COOH: 4,393 Distancia Leu83-COOH: 4,393
rea His58: 44,00 rea His58: 46,17 rea His58: 44,00
rea Leu83: 55,91 rea Leu83: 48,62 rea Leu83: 55,91
rea His87: 38,72 rea His87: 29,02 rea His87: 38,72
rea Leu101: 32,56 rea Leu101: 33,81 rea Leu101: 32,56
rea Total del Pocket: 171,19 rea Total del Pocket: 157,62 rea Total del Pocket: 171,19

O-Hb desO-Hb CO-Hb
Cadena
Distancia Fe-O: 1,775 Distancia Fe-His92: 2,194 Distancia Fe-CO: 1,711
Distancia Fe-His92: 3,063 Distancia Fe-Leu106: 7,016 Distancia Fe-His92: 2,116
Distancia O-Leu106: 4,586 Distancia His63-COOH1: 4,847 Distancia O-Leu106: 4,490
Distancia His63-COOH1: 4,734 Distancia His63-COOH2: 6,531 Distancia His63-COOH1: 4,242
Distancia His63-COOH2: 4,867 Distancia Leu88-COOH: 4,560 Distancia His63-COOH2: 4,505
Distancia Leu88-COOH: 4,436 Distancia Leu88-COOH: 4,294
rea His63: 54,73 rea His63: 47,59 rea His63: 59,80
rea Leu88: 56,53 rea Leu88: 60,44 rea Leu88: 57,65
rea His92: 41,34 rea His92: 32,62 rea His92: 41,51
rea Leu106: 25,01 rea Leu106: 27,30 rea Leu106: 26,21
rea Total del Pocket: 177,61 rea Total del Pocket: 167,95 rea Total del Pocket: 185,17
Tabla 1 Distancias entre AA vecinos y grupo Hemo rea del pocket

Las distancias en la misma pueden ser apreciadas en las siguientes figuras:
Figura 1 - Distancias y ngulos relevantes en la COHb (cadena ).

Figura 2 - Distancias y ngulos relevantes en la COHb (cadena ).





Figura 3 - Distancias y ngulos relevantes en la DesOHb (cadena ).

Figura 4 - Distancias y ngulos relevantes en la COHb (cadena ).




Figura 5 - Distancias y ngulos relevantes en la OHb (cadena ).

Figura 6 - Distancias y ngulos relevantes en la OHb (cadena ).





Figura 7 - Zoom de las distancias y ngulos relevantes en la OHb (cadena ).

Figura 8 - Zoom de las distancias y ngulos relevantes en la OHb (cadena ).
En la anterior tabla (tabla 1) se puede
apreciar como vara la distancia en la
histidina de anclaje (87 en y 92 en )
segn la presencia o ausencia de ligando.
Dichas distancias se pueden apreciar de
manera comparativa en la anterior tabla,
as como en las imgenes que le siguen, a
modo de explicitacin grfica.
En dicha tabla se puede apreciar tambin
que las reas de los pockets contenedores
del grupo Hemo (determinados por
GetArea) tambin sufren modificaciones
segn el ligando en cuestin. Se puede
apreciar que el valor del rea expuesta de
los residuos (que es determinado por la
superficie de los mismos) se ve influenciado
en forma importante por la presencia del
ligando, lo que indica que la presencia del
mismo genera localmente cambios en la
disposicin de los residuos que definen la
cavidad que contiene al grupo Hemo. Se
puede apreciar que el rea del bolsillo que
contiene al grupo Hemo aumenta al
incorporar como ligando una molcula del
gas transportado, por tanto la DesOHb
posee el menor rea del bolsillo del grupo
Hemo (para ambas cadenas).
Estructura Secundaria
La estructura secundaria es la cantidad (en
porcentaje) de -hlices y lminas- que
hay en una protena. La misma fue
determinada por el PDB, ya que es parte de
la informacin anexa en las fichas de los
archivos en cuestin (2DN1, 2DN2 y 2DN3).

Dicha informacin se encuentra
esquematizada en la siguiente tabla:
O-Hb desO-Hb CO-Hb
Cadena
141 residuos 141 residuos 141 residuos
77% -hlices 76% - -hlices 75% - -hlices
10 hlices - 109 residuos 10 hlices - 108 residuos 10 hlices - 106 residuos
Cadena
146 residuos 146 residuos 146 residuos
75% -hlices 77% -hlices 76% -hlices
12 hlices - 110 residuos 10 hlices - 113 residuos 11 hlices - 111 residuos

En el caso de la hemoglobina la estructura
secundaria es esencialmente helicoidal
(como se observa en la tabla 2),
aproximadamente 75% indiferente al
ligando en cuestin (si bien hay una
variabilidad relativamente baja en dichos
porcentajes).
La DesOHb es en relacin - la que
mantiene ms constante el porcentaje de
-hlices, sugiriendo ser en si la ms
organizada de las tres estructuras en
cuestin.
A continuacin se presentan los esquemas
que explicitan dicha estructura
(secundaria) a lo largo de la secuencia
aminoacdica de las estructuras en
cuestin:
Figura 9 - COHb cadena .

Figura 10 - COHb cadena .

Figura 11 - DesOHb cadena .

Figura 12 - DesOHb cadena .

Figura 13 - OHb cadena .

Figura 14 - OHb cadena .
Mapas de interaccin 2D
En los mapas de interaccin 2D se puede
apreciar quizs el factor ms relevante en
la estabilizacin del CO como ligando de la
hemoglobina, y es la cantidad de
interacciones que tiene el grupo Hemo con
los aminocidos vecinos (de fuerza mayor o
igual a las fuerzas que existen entre los
grupos Hemo de los otros modelos de Hb
[OHb y DesOHb] con sus respectivos
aminocidos vecinos); predominantemente
por fuerzas de Van der Waals y enlaces de
hidrogeno.

Tambin se puede apreciar que si bien la
existe amplia similitud entre las cadenas
y , el grupo Hemo situado en tiende a
tener mayor cantidad de interaccin con
los aminocidos circundantes.

Dichas observaciones se muestran en las
siguientes imgenes:


Fig. 15 Interacciones grupo Hemo en COHb cadena
Fig. 16 Interacciones grupo Hemo en COHb cadena



Fig. 17 Interacciones grupo Hemo en DesOHb cadena

Fig. 18 Interacciones grupo Hemo en DesOHb cadena

Fig. 19 Interacciones grupo Hemo en OHb cadena
Fig. 20 Interacciones grupo Hemo en OHb cadena

En cuanto a la estabilizacin del CO como ligando de la hemoglobina y su cantidad de
interacciones con los aminocidos vecinos (figuras 15 y 16), los valores de las mismas se
pueden demostrar de manera comparativa entre los tres modelos (figuras 16, 18 y 20) , con los
siguientes valore e imgenes tomadas con Ligan Explorer:

Figura 21 - Interacciones COHb-AA

Figura 22 - Interacciones DesOHb-AA

Figura 23 - Interacciones OHb-AA
Prediccin de desorden de la protena
en base a secuencia aminoacdica
En la Bioinformtica Estructural, muchos
esfuerzos han sido dirigidos a la prediccin
de la estructura de protenas globulares,
sin embargo, hay una apreciacin
creciente en la importancia de las regiones
desordenadas en la funcin de muchas
protenas. Las regiones desordenadas son
dinmicamente flexibles y distinguibles de
los irregulares loops de las estructuras
secundarias (que en solucin son
estticos).





Fig. 24: Probabilidad de desorden COHb ()






Fig. 25: Probabilidad de desorden DesOHb ()






Fig. 27: Probabilidad de desorden OHb ()


Por tanto, la prediccin de desorden es una
herramienta importante para la
identificacin de regiones flexibles que
pudieran impedir la cristalizacin de
protenas.
Las siguientes imgenes fueron
determinadas por DISOPRED en base a la
secuencia FASTA obtenida de PDB.








Fig. 25: Probabilidad de desorden COHb ()






Fig. 26: Probabilidad de desorden DesOHb ()






Fig. 28: Probabilidad de desorden OHb ()


Como se puede observar en las anteriores
imgenes (figuras 24 a 28), y dado que, la
prediccin del grado de desorden en la
protena realizado por DISOPRED depende
de la secuencia aminoacdica, la misma no
vara en los tres modelos (2DN1 -OHb-,
2DN2 -DesOHb- y 2DN3 -COHb-) dentro de
una misma cadena (ya que poseen la
misma secuencia) sino que varan entre
cadena alfa y beta.
Esto se puede apreciar en las anteriores
imgenes ya que al desplazarnos en
direccin vertical no se aprecian
variaciones en el desorden (cadenas alfas
de los tres modelos en cuestin) y al
desplazarnos en direccin horizontal s
(cadenas alfa y beta de un mismo modelo).
Lo que se observa en los tres casos es que
la hemoglobina es una protena globular
sumamente organizada ya que en toda su
secuencia existe solo una leve seccin
(aminocidos 40 a 60 en alfa y 45 a 65 en
beta aprox.) cuya probabilidad de
desorden es apreciable, aunque apenas
rebasan el umbral de desorden; lo que
resulta lgico en cuanto a evolucin dada
su especializacin en cuanto a la funcin
que realiza (la cual ya fue definida
previamente).
Estas secciones de desorden se muestran a
continuacin (ambos casos para DesOHb)
en las siguientes imgenes:

Fig. 29 - Aminocidos 40-60 cadena alfa

Fig. 30 - Aminocidos 45-65 cadena beta
Como se puede observar en las anteriores
imgenes (figuras 29 y 30), y obedeciendo
lo esperado, la seccin que tanto en alfa
como en beta, predecimos como
desordenada, es en hecho, una seccin que
carece de organizacin secundaria bien
definida, lo que le confiere mayor
flexibilidad y por ende mayor variabilidad
de conformaciones posibles.
Prediccin 3D
Dado que la hemoglobina puede ser
cristalizada y por lo tanto estos modelos en
cuestin (2DN1 -OHb-, 2DN2 -DesOHb- y
2DN3 -COHb-) han sido determinados
experimentalmente a alta resolucin, la
prediccin se realiza nicamente con el fin
de comparar los modelos (figuras 31 a 34)
obtenidos a partir de la secuencia con las
determinaciones estructurales
experimentales de la estructura de los
dmeros de hemoglobina que fueron
descargados de la base de datos (PDB).

Prediccin cadena alfa OHb 100% confianza 99% acierto

Cadena alfa experimental resolucin de 1.25

Prediccin cadena beta OHb 100% confianza 100% acierto

Cadena beta experimental resolucin de 1.25
Conclusin
Como se puede apreciar a lo largo de todo
el informe la simple variabilidad en el
ligando de la hemoglobina puede generar
un cambio considerable en su estructura;
este cambio se corrobora a diferentes
niveles de estructura. A nivel primario la
estructura no sufre modificacin alguna ya
que la secuencia aminoacdica es la misma
para los tres modelos en cuestin (no hay
mutaciones).
A nivel secundario la cantidad de hlices
involucradas varan porcentualmente (en
las cadenas alfa y beta) y en cantidad de
hlices (en beta).
A nivel terciario el cambio que se puede
observar con los mtodos utilizados, es el
cambio en la cavidad del bolsillo que
contiene al grupo Hemo.
De la prediccin del desorden en base a la
secuencia aminoacdica se puede resaltar
discutido el alto grado de confiabilidad de
los modelos utilizados para el estudio, ya
que los mismos fueron cristalografiados, y
por la secuencia se demuestra que la
hemoglobina es sumamente organizada y
tiene sentido determinarla
experimentalmente por cristalografa;
donde queda justificado a nivel emprico la
realizacin de este estudio.
Bibliografa
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lobin
http://www.uniprot.org/
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http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/

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